Rongeurs
Déterminer si l’autophagie, un mécanisme cellulaire de dégradation, est impliqué dans la résistance aux traitements anti-cancéreux dans les leucémies.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit un préconditionnement, une greffe de cellules leucémiques par voie intraveineuse et des traitements répétés par gavage ou injections, une partie étant euthanasiée pour prélèvement et les autres gardées en vie jusqu'à un point limite terminal. Le porteur indique que l'installation de la leucémie provoque un amaigrissement, une paralysie des membres postérieurs, une prostration et une hypothermie. Il affirme l'absence de corrélation entre la réponse aux chimiothérapies in vitro et in vivo pour conclure au caractère "indispensable" du modèle murin, tout en ne justifiant le nombre d'animaux que par des "tests statistiques appropriés".
Objectifs
Malgré un taux élevé de rémission après un traitement conventionnel par chimiothérapie, les rechutes reflet d’un mauvais pronostic, sont fréquentes chez les patients atteints du cancer du sang le plus commum, les leucémies. La principale raison est que certaines cellules ont résisté à ce traitement et ont pu proliférer et ainsi reconstituer la maladie. Comme cela a été montré dans d'autres types de cancer, les cellules cancéreuses résistantes sont les cellules qui ont la capacité d’adapter leur métabolisme. L’autophagie, processus impliqué dans la dégradation et le recyclage de composés cellulaires endommagés est un régulateur du métabolisme. Nous émettons maintenant l’hypothèse que cette adaptation soit contrôlée par l’autophagie, un mécanisme également impliquée dans de nombreuses maladies telles que le cancer. En effet, l’autophagie favorise la croissance de nombreuses cellules cancéreuses en leur fournissant tout ce dont elles ont besoin pour se multiplier. Elle participe aussi à la résistance aux traitements. Ainsi, ce projet s’intéresse à l’étude de l'implication de l’autophagie dans les mécanismes de résistance aux traitements anti cancéreux dans les leucémies.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera une meilleure compréhension du rôle de l'autophagie dans le développement et la résistance des leucémies. Cette connaissance précise permettra l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et conduira au développement de médicaments ciblant directement l'autophagie ou bien ses régulateurs. De nouvelles combinaisons thérapeutiques avec des chimiothérapies ou thérapies ciblées existantes pourront alors émerger dans le but d'améliorer la prise en charge et le traitement des patients atteints de leucémie.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis une fois par jour pendant 3 jours à une injection dans la cavité abdominale (intrapéritonéal) de quelques secondes, d'un composé permettant de supprimer le mécanisme d'autophagie dans l'ensemble des organes de la souris. Les animaux seront tout d’abord préconditionnés avec un agent qui va éliminer les cellules de moelle osseuse afin de pouvoir par la suite injecter en une seule fois les cellules leucémiques par voie intraveineuse de quelques secondes dans la veine de la queue (caudale) sur animal vigile c’est-à-dire non endormi, puis à des prélèvements de sang au niveau de la mâchoire (en mandibulaire) de moins de 1 minute espacés d’au moins 1 semaine (4 au maximum) afin d'évaluer la prise tumorale et de récolter du matériel biologique pour des analyses ultérieures. En cas de non-diffusion des cellules leucémiques, nous ferons une ponction osseuse d’environ 5 min en intra-fémoral de cellules sous anesthésie et analgésie adaptée. Une fois l'invasion des cellules établie, les animaux vigiles recevront un traitement journalier de durée variable selon le type de thérapie par voie orale en gavage (pendant 7 jours consécutifs) ou bien par une injection dans la cavité abdominale en intra-péritonéal (pendant 5 jours consécutifs) ou en intra-veineuse (pendant 3 jours non consécutifs). Dans le cas de combinaisons thérapeutiques, il pourra y avoir deux administrations par jour, par exemple gavage + injection intrapéritonéale.
Impact sur les animaux
Les animaux lorsqu’ils sont traités avec les différentes molécules, lors de la greffe ou lors du suivi de prise de greffe (gavage, intra-péritonéal, intra-veineux) pourraient être confrontés à des effets indésirables tels que du stress et/ou une perte de poids. Une gêne physique en cas d'administration orale quotidienne peut également survenir. De plus, la greffe de cellules leucémiques va, comme attendu, permettre l’établissement de la maladie et donc entrainer au bout de plusieurs semaines (variable selon le type de cellules leucémiques injectées) un amaigrissement, une paralysie des membres postérieurs empêchant l’animal d’être mobile et de s’alimenter, une perte d’activité, une prostration, une déshydratation et/ou une hypothermie. De manière plus exceptionnelle, en cas de ponction osseuse, les animaux peuvent ressentir une gêne temporaire au niveau de la mobilité. Très rarement, il peut y avoir également apparition de masses tumorales solides, d’origines leucémiques, dans diverses localisations (organes, tête).
Devenir
Une partie des animaux sera euthanasiée afin de prélever la moelle osseuse, la rate et le foie (et potentiellement le tissu adipeux) afin de caractériser les cellules leucémiques résistantes aux traitements, 3 jours après la fin du traitement. Pour les autres souris, l'objectif sera de savoir si le traitement améliore leur survie. Dans ce cas les animaux post-traitements seront gardés en vie et ils ne seront euthanasiés que lorsqu'ils présenteront un point limite terminal.
Remplacement
Dans le but d’évaluer la contribution de l’autophagie dans le développement leucémique et la résistance aux traitements anti-cancéreux, des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèle in vitro permettant de récapituler de façon fidèle l’évolution du cancer au sein d’un organisme vivant. Bien que certains modèles in vitro permettent d’obtenir un premier niveau de compréhension, ils ne sont pas suffisants car ils ne tiennent pas en compte de l’environnement des cellules cancéreuses comme lorsque celles-ci sont au sein d’un organisme en entier car ce dernier peut modifier leur comportement. Par exemple, nous avons montré une absence de corrélation entre la réponse aux chimiothérapies in vitro et celle in vivo, rendant nécessaire l’utilisation de modèle in vivo. Afin d’appliquer nos résultats au stade clinique chez l’homme, il est indispensable d’avoir des preuves d’efficacité in vivo dans des modèles murins.
Réduction
Le nombre minimum de souris nécessaires par groupe a été établit grâce aux études antérieures du laboratoire et notamment à l’utilisation de tests statistiques appropriés.
Raffinement
L'expérimentation fait l'objet d'une procédure de suivi du bien-être des animaux adaptée au modèle et aux potentiels effets indésirables des procédures : les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les études antérieures ont permis de mieux appréhender les points limites et ont permis l’établissement d’une liste de différents points limites qui seuls ou cumulés vont nécessiter l’euthanasie de l’animal. Un suivi de la présence de cellules cancéreuses dans le sang ou dans la moelle sera réalisée (toutes les une à deux semaines à partir de 4 semaines après la greffe), une pesée et une évaluation hebdomadaires du comportement et de l'aspect physique permettra de mettre en place des actions précoces et adaptées.
Choix des espèces
Le modèle souris est à la base de la compréhension du développement du cancer chez l’homme. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à comprendre pourquoi les cellules cancéreuses résistent aux traitements. Ils présentent des avantages pratiques tels que la croissance rapide, un cycle de reproduction court, la facilité de transport, de manipulation et d’adaptation aux différentes conditions expérimentales. Dans cette étude, nous utilisons des souris âgées d’environ 6 à 11 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe.
Etude de l’effet de faibles doses de rayonnements ionisants externes de type gamma et d’un régime riche en lipides sur la microvascularisation cérébrale et cardiaque chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies animales
736 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal est irradié aux rayons gamma sur le corps entier pendant une contention d'un quart d'heure, une partie recevant un régime riche en lipides, avec des échographies sous anesthésie et un prélèvement d'organes terminal. Le porteur affirme que l'irradiation à faible dose n'entraîne ni douleur ni brûlure et se limite à un stress de contention. Il présente l'étude comme une contribution aux normes de radioprotection, en complément d'études épidémiologiques jugées insuffisantes.
Objectifs
L’objectif de notre étude est d’identifier la réponse de la microvascularisation cardiaque et cérébrale à une exposition aigüe à des doses faibles à modérées de RI, associée ou non à un facteur de risque tel qu’un régime riche en graisse. Pour cela, l’évaluation de potentielles conséquences sur les troubles moléculaires, physiopathologiques, phénotypiques et fonctionnels cardiaque et cérébral sera réalisée. L’objectif de ce projet sera d’évaluer cette hypothèse par un modèle expérimental d’exposition externe unique aux rayonnements gamma corps entier. Les effets des doses faibles à modérées de rayonnements ionisants gamma à long terme sur le les vaisseaux du cœur et du cerveau seront évalués afin d’apporter des réponses très attendues quant aux questions des effets biologiques pouvant induire des pathologies non-cancéreuses comme les pathologies cardiovasculaires pour permettre d’alimenter le système de radioprotection. En mimant une exposition à des doses faibles à modérées, ce projet sera complémentaire aux études épidémiologiques et permettra d’apporter des réponses notamment dans les gammes de doses où les études épidémiologiques manquent de puissance statistique
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’obtenir de nouvelles connaissances sur les effets à long terme d’une exposition de doses faibles à modérées sur la microvascularisation (cardiaque et cérébrale), afin de participer à la détermination des normes en radioprotection pour des institutions du domaine de la radioprotection.
Procédures
Pour les animaux exposés aux rayonnements gamma, l’irradiation durera maximum 10 minutes. Ainsi la durée de contention des souris en boîte d’irradiation sera maximum de 15 (10 min d’irradiation + 5 minutes de préparation). Certains lots recevront un régime alimentaire riche en lipides pendant toute la durée de l’étude. Pour tous les animaux, les échographies sont non invasives et effectuées sous anesthésie. L’ensemble des prélèvements sera réalisé en terminal.
Impact sur les animaux
L’irradiation à de faibles doses n’entraine pas de douleur ni de brulure aux animaux, seules des modulations d’expression protéique et une légère diminution de la fonction cardiaque a été observée à long terme. Néanmoins un stress des animaux est possible lors de la mise en boite d’irradiation même s’il y a habituation au tube à contention. L’ajout d’un régime riche en graisse n’impact pas le bien-être des animaux. Cela peut pour les temps longs les faire prendre du poids.
Devenir
A la fin de la procédure, toutes les souris seront euthanasiées pour prélever des organes (cœur et poumons) qui permettront une analyse histologique complétant les analyses fonctionnelles réalisées sur tous les animaux de ce projet.
Remplacement
Pour mimer l’exposition corps entier de résidents vivants en zone contaminée ou les travailleurs (après un accident nucléaire par exemple celui de Tchernobyl ou Fukushima), il est nécessaire d’avoir recours à une exposition externe à des doses faibles de rayonnements ionisants gamma (imitant les rayonnements ionisants du CS137) sur un modèle intégré (microvascularisation cardiaque et cérébrale). De plus, les études in vitro présentent des limites pour l’évaluation des mécanismes au niveau cellulaire après une exposition à des doses faibles à modérées et ne permettent pas d’identifier des processus physiologique et/ou physiopathologique, il est de plus très difficile de maintenir des cultures cellulaires au-delà de 3 semaines dû au vieillissement cellulaire et aux cycles limités des cellules.
Réduction
Au total, 736 animaux seront utilisés dans ce projet. Le nombre de 20 à 26 animaux par groupe a été établi avec l’utilisation d’outils statistiques permettant d’optimiser la puissance de l’étude et avec notre expérience concernant ce type d'analyses et ces modèles murins pour être au minimum. Il n’y aura pas 20% de mortalité mais la puissance statistique sera supérieure à celle attendue avec 20 souris. Si nous n’observons pas de mortalité tous les animaux seront pris en compte pour nos résultats.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe, mais en cas de bagarres, les animaux pourront être isolés. Les souris seront suivies quotidiennement. Elles seront pesées régulièrement une fois par mois. Tout signe de prostration de l’animal, de blessures importantes dues aux bagarres entrainera l’euthanasie anticipée. Les infections ou blessures éventuelles seront traitées localement par application de Vétédine, crème antibiotique ou par administration d’antibiotique.
Choix des espèces
Ce projet vise à déterminer un seuil dose pour lequel on observe le développement de pathologies microvasculaire (raréfaction au niveau cardiaque ou cérébrale) et également des troubles du rythme cardiaque chez des souris irradiées en corps entier avec des rayonnements gamma à faible dose et ce afin de mimer des effets secondaires à long terme de l’exposition des personnes en territoire contaminé post accident nucléaire. Les souris seront âgées de 2 mois (8 semaines) au moment de l’irradiation car à cet âge leur système nerveux sympathique cardiaque est mature. Des souris C57BL/6 males seront utilisées pour notre projet afin de pallier les effets cardioprotecteurs des hormones comme les œstrogènes. Néanmoins lorsque nous aurons des résultats sur les mâles et si ceux-ci sont significatifs, nous pourront prévoir la réalisation de ces mêmes expériences sur des souris femelles.
Etude de la fonction de différents variants de gènes durant le développement du cerveau dans des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2850 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent sous anesthésie une chirurgie pour injecter et modifier génétiquement les embryons par électroporation in utero, avec un risque d'avortement, puis les femelles et les souriceaux de 7 à 21 jours sont euthanasiés pour prélever les cerveaux. Le porteur décrit une recherche fondamentale sur les gènes du développement cérébral, menée en parallèle sur la drosophile et des cellules humaines, mais affirme qu'une approche in vivo chez le mammifère est "indispensable". Les bénéfices cliniques éventuels sont présentés comme un "socle pour de futures découvertes", sans application directe.
Objectifs
Le développement du cerveau se produit par une succession d’étapes de prolifération et de différenciation cellulaire très contrôlées dans le temps par différents facteurs. Nous nous intéressons aux mécanismes cellulaires et moléculaires qui contrôlent la façon dont les cellules sont générées au cours du temps. Notre objectif est de comprendre le rôle de certaines protéines et donc les gènes dont elles sont issues, dans ces processus et de les étudier dans un contexte in vivo, au cours du développement d’un cerveau de Mammifère. Certaines de ces protéines présentent des modifications qui peuvent modifier son mode de fonctionnement. De plus, certains gènes vont pouvoir compenser la perte d’autres gènes. Ce sont tous ces mécanismes et ces dynamiques que nous voulons étudier. Dans ce but, nous réaliserons au cours du développement embryonnaire, c'est-à-dire lors de la gestation, des transferts de gènes...par une technique que l'on appelle l'électroporation. Nous pourrons ainsi étudier l’effet de la version modifiée sur le développement des cellules du cerveaux (neurones et des cellules qui les accompagnent que l’on appelle cellules gliales) et comprendre les mécanismes fins mis en jeu. Ces échanges de gènes se feront à des moments précis du développement embryonnaire, lors de la génération de populations de cellules précises, dans le cortex cérébral et le cervelet. Nous étudierons la prolifération des cellules, le nombre de cellules générées, les différents type-cellulaires, la morphologie et la taille des neurones…) Cette étude chez la souris permettra de compléter avec un modèle in vivo de mammifère, des études réalisées chez la drosophile et sur des modèles in vitro sur cellule humaine.
Bénéfices attendus
Cette étude in vivo permettra d’acquérir des connaissances précieuses sur les mécanismes mis en jeu dans la régulation de la génération des différentes cellules du cerveau lors du développement. Elle sera mise en perspective avec d’autres études menées en parallèle chez la drosophile et dans des cultures in vitro de cellules humaines ou organoïdes, afin de comprendre comment ces mécanismes se sont ajustés au cours de l'évolution, dans différentes espèces. De plus, cette étude constituera un socle pour de futures découvertes permettant de comprendre certaines maladies développementales du cerveau. Par exemple, la microcéphalie qui peut être due à des altérations de la durée de certaines étapes clés lors du développement. De plus en plus d’études montrent que des conditions comme le syndrome du chromosome X fragile et les troubles du spectre autistique seraient dus à un déséquilibre des neurones excitateurs et inhibiteurs. Il est probable que ce déséquilibre soit dû à des altérations subtiles dans la chronologie de la génération de ces neurones. Les mécanismes explorés dans cette étude pourraient donc apporter des pistes de réflexion voire des réponses pour parvenir à mieux expliquer ces troubles du développement.
Procédures
Pour ce projet, il est prévu d’utiliser 2850 animaux. Des interventions sous anesthésie générale sont réalisées sur les femelles gestantes pour faire des injections aux embryons en cours de développement dans l’utérus. Une prise en charge de la douleur est assurée lors de la chirurgie des femelles gestantes par l’utilisation d’analgésiques. La chirurgie doit durer au maximum 30 min. Des injections intrapéritonéales de produits seront aussi réalisées sur animal vigile, en contention afin de permettre de figer les cellules en train de se diviser pour ensuite pratiquer des analyses de l’ADN. Cette injection unique doit durer quelques secondes.
Impact sur les animaux
Lors de l’électroporation in utero, les animaux seront anesthésiés, ce qui entraine un potentiel risque pour l’animal (hypothermie, non récupération d’une pleine vigilance) et les embryons (risques d’avortement). Un risque hémorragique, infectieux est possible au niveau du site de chirurgie. Une douleur lors des injections est possible, elle ne doit pas durer plus que le temps de l’injection. La contention pourra, elle aussi, générer un stress à l’animal.
Devenir
Les femelles gestantes seront euthanasiées dans le but de prélever et d’analyser les cerveaux des embryons afin d’étudier le développement des cellules. Les souriceaux (P7-P21) seront euthanasiés dans le but de prélever et d’analyser leur cerveau afin d’étudier le développement des cellules.
Remplacement
Notre projet vise à comprendre les mécanismes de développement du cerveau en prenant en compte toute sa complexité (diversité des types cellulaires, interactions cellulaires, contraintes physiques, signalisations…). Suivant le principe de remplacement, des études sur drosophiles, ainsi que sur cellules humaines, un travail in vitro ou encore l’utilisation d’organoïdes sont réalisées et permettent de disséquer certains aspects et mécanismes impliqués dans les processus étudiés. En revanche, il est indispensable dans le cadre de cette étude, de passer par une approche in vivo chez le Mammifère afin de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. De plus, les outils génétiques disponibles chez la souris nous permettent de contrôler avec précision le moment d’inactivation du gène d’intérêt.
Réduction
Le nombre d’animaux (2850) utilisés sera limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement robustes et sera calculé pour chaque type d’analyse. Toutes les quantifications se feront en aveugle. Nous travaillons en étroite collaboration avec des statisticiens présents dans notre unité pour définir toutes les tailles d'échantillons et les tests statistiques appropriés. Nous comptons observer de nombreux paramètres (stade différentiation des cellules selon le stade développement, longueur des axones, morphologie des cellules, …) qui pourront être analysés sur les mêmes échantillons.
Raffinement
L’animalerie est agréée, les conditions d’hébergement en portoirs ventilés (température, hygrométrie, éclairage et espace) et les conditions d’enrichissement de l’environnement (maison et matériel pour faire un nid, papier kraft), d’alimentation et de soins quand nécessaires, seront contrôlées. Une période d’acclimatation d’une semaine sera effectuée avant toute procédure expérimentale pour les animaux arrivant de l’extérieur. Les femelles gestantes seront regroupées (2 par cage) afin d’éviter leur isolement et auront une alimentation adaptée à leurs besoins physiologiques. Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie (pré- et post-opératoire) ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. En cas d’observation de la moindre douleur post-opératoire, les souris recevront un traitement analgésique, et si cette douleur persiste, les animaux seront euthanasiés pour éviter toute souffrance. Durant toute la période d’anesthésie, l’animal sera placé sur tapis chauffant afin de maintenir sa température. Toute injection sera réalisée avec une seringue adaptée et une aiguille très fine. Des points limites ont été établis : En cas de non-récupération de la complète vigilance suite à la chirurgie, l’animal sera examiné par la structure chargée du bien-être animal et le vétérinaire. Si aucun signe d’amélioration n’est visible après 24h (prostration, état du pelage, réduction de mobilité, absence de prise de poids lors de la gestation, etc), l’animal sera euthanasié car un état de stress prolongé pourrait compromettre le bon déroulé de l’expérience. Si des signes d’avortement (saignements, expulsion de fœtus morts, écoulements vaginaux anormaux…) sont observés, l’animal sera euthanasié. Tout au long de la vie des animaux, un suivi rigoureux sera réalisé pour s’assurer de leur bien-être en collaboration avec la structure chargée du bien-être animal et du vétérinaire.
Choix des espèces
Les animaux utilisés seront des femelles gestantes d’au moins 2 mois y compris leurs embryons et des souriceaux. Afin d’inactiver ou intégrer nos gènes d’intérêt au stade embryonnaire, les interventions sont réalisées sur les femelles gestantes sous anesthésie générale pour faire des injections aux embryons en cours de développement dans l’utérus. Une injection supplémentaire d’agents intercalants de l'ADN sera réalisée sur ces femelles gestantes dans le cas où les tissus seront prélevés au stade embryonnaire. Dans le cas où les tissus seront prélevés sur souriceaux, l’injection se fera sur les souriceaux (P7, P21). Ces produits permettront de marquer les cellules en train de se diviser pour ensuite pratiquer des analyses. Pour notre étude, nous utiliserons des modèles de mouches, ainsi que des modèles in vitro de cellules humaines et organoïdes. Cependant, il est indispensable de comparer ces données avec un modèle in vivo de cerveau de Mammifère. Nous avons fait le choix de la souris car les outils génétiques et moléculaires développés dans notre domaine de recherche ont été réalisés pour des travaux chez la souris. Les animaux génétiquement modifiés qui sont nécessaires à cette étude sont uniquement disponibles chez la souris. Notamment, les lignées génétiquement modifiées qui vont nous permettre d’explorer les stades de développement qui nous intéressent disponibles chez la souris nous permettent de contrôler avec précision l’inactivation de nos gènes d’intérêt.
Étude du rôle global de PDL1 et de MCT4 dans la métastase osseuse de cancer pulmonaire. Effets immunitaires et non immunitaires.
- Recherche appliquée
- Cancers
402 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une injection de cellules cancéreuses dans le tibia, suivie d'un suivi radiographique hebdomadaire pendant douze semaines et de traitements par voie intraveineuse ou orale. Le porteur indique un développement tumoral attendu, une douleur se manifestant par une boiterie, et une sortie de l'étude avant que le volume tumoral ne dépasse 10 % du poids de l'animal. Il affirme que l'environnement tumoral est impossible à recréer in vitro et conclut au caractère "indispensable" du modèle murin pour étudier les protéines PDL1 et MCT4.
Objectifs
Le cancer pulmonaire est une cause fréquente de mortalité chez l’homme. 40 % des patients vont présenter des métastases osseuses qui assombrissent leur pronostic. Lorsque le cancer est métastatique, il est incurable et diminue drastiquement la survie des patients. Les cellules cancéreuses sont caractérisées par l’expression différentes de nombreuses protéines impliquées dans le fonctionnement cellulaire ce qui permet aux cellules cancéreuses de se multiplier anormalement. Parmi les protéines augmentant l’agressivité du cancer, MCT4 et PD-L1 jouent un rôle important dans plusieurs cancers dont le cancer pulmonaire. En revanche, il n’y a pas de données chez les patients porteurs de métastases osseuses. MCT 4 est la principale protéine qui exporte l’acide lactique des cellules tumorales dans leur environnement. Dans l’os, ce lactate soutient le développement des métastases osseuses en stimulant la lyse osseuse (principale caractéristique des patients souffrants de métastases osseuses d’origine pulmonaire) et en favorisant une immunité pro-tumorale. L’inhibition pharmacologique de MCT4 sur des modèles murins montre une diminution du développement tumoral de plusieurs cancers. Néanmoins, dans les métastases osseuses, cette approche n’a jamais été essayée alors qu’elle s’avère prometteuse. PDL1 est une protéine impliquée dans l’inactivation des cellules immunitaires anti tumorales (lymphocytes T CD8+). Son rôle est documenté dans les cancers pulmonaires et les métastases des tissus mous mais inconnu au sein de la métastase osseuse des cancers pulmonaires. Les immunothérapies PD-1/PD-L1 sont une avancée majeure dans le pulmonaire métastatique. Dans les métastases osseuses l’efficacité de ces traitements n’est pas connue. Aussi, nous souhaitons étudier le rôle de ces protéines dans la métastase osseuse en réalisant des injections intra tibiales de cellules cancéreuses qui expriment en forte quantité ou sans expression de ces protéines. Nous étudierons également des traitements inhibant ces protéines et observerons l’effet sur les métastases osseuse.
Bénéfices attendus
Le bénéfice est de comprendre le rôle de PDL1 et MCT4 dans la métastase osseuse ainsi que déterminer si l’utilisation de traitement ciblant pharmacologiquement ces protéines présente un intérêt thérapeutique dans un modèle de recherche pré-clinique.
Procédures
Les animaux ne seront pas soumis à des prélèvements vigiles ni de procédures chirurgicales. Les animaux seront anesthésiés une fois lors de l’injection des cellules cancéreuses dans le tibia (5 min) puis une fois par semaine pour le suivi radiographique (5 min) des lésions osseuses pour une durée maximale de 12 semaines. Les animaux traités par voie intra veineuse auront 9 injections de traitement ou de contrôle au total sur 3 semaines (1 min). Les animaux traités par voie orale auront une prise quotidienne de traitement pendant 3 semaines (15min).
Impact sur les animaux
Les modèles expérimentaux de cancérologie sont des modèles dommageables et il est attendu un développement de cancer chez les animaux. La douleur peut survenir et se manifester par une boiterie chez les souris. Aussi, nous utiliserons un protocole strict de suivi des animaux en utilisant des échelles de points limites. Ces points limites sont les situations prédéfinies à ne pas atteindre pour respecter le bien-être animal. Les animaux seront sortis de la procédure avant atteinte des points limites expérimentaux et les pilotes expérimentaux permettrons de suivre le délais d’apparition de ces situations sur un petit nombre d’animaux avant utilisation d’un plus grand nombre. Les injections de traitement répétées peuvent conduire à un inconfort momentané et des blessures chez les animaux et pour y remédier, nous procèderons à des injections à différents endroits.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole. A la fin de la procédure, les tumeurs osseuses, ainsi que les organes des souris qui sont le siège de métastases (généralement poumons, os, foie) seront prélevés pour peser les tumeurs. Les tumeurs et les organes métastatiques seront ensuite fixés et inclus en paraffine afin de réaliser des études histologiques.
Remplacement
Remplacement : Bien que l’étude in vitro permette la compréhension de nombreux processus du cancer, cela ne prend pas en compte l’environnement tumoral, dont l’impact est majeur. L’étude d’une tumeur in vivo permet la considération des cellules tumorales, immunitaire, osseuses, fibroblastiques (autres cellules de l’environnement tumoral) ainsi que la vascularisation de l’hôte, leur interactions et fonctionnement ensemble. Un tel modèle est impossible à recréer in vitro, ainsi, l’utilisation d’un modèle murin est indispensable à notre étude. Tous les organes des animaux seront prélevés à la fin de la procédure.
Réduction
Réduction: Nous avons utilisé une approche statistique et consulté la littérature pour déterminer la taille des groupes d’animaux nécessaire à la réalisation à chaque protocole de l’étude. Pour chaque groupe, nous allons réaliser une analyse du tissu osseux qui nécessite 10 animaux, une analyse de l’expression des gènes qui nécessite 4 animaux et une analyse des populations cellulaires qui nécessite 4 animaux soit 18 animaux.
Raffinement
Raffinement : Les souris cohabiteront par groupe de 3, dans des cages à couvercles filtrants de 424 cm² avec un milieu enrichi (objets partagés par les animaux, frisottis, épaisseur de litière importante, copeaux doux) et aucun nouvel animal ne sera introduit dans des groupes déjà formés. Afin de réduire le stress des animaux, une période d’acclimatation de deux semaines sera observée à la suite de leur réception. La litière sera changée de moitié toutes les semaines pour réduire le stress des animaux. Pendant cette période les animaux seront uniquement manipulés afin de les habituer au contact de l’utilisateur et réduire leur stress, nous les familiariserons à boire à la pipette afin de pouvoir leur administrer le traitement anti MCT4 de cette manière plutôt que de réaliser un gavage afin de limiter leur stress. Lors de l’injection des cellules tumorales, les cellules seront stériles, vérifiées sans champignons et sans bactéries, les souris seront anesthésiées et la température des animaux sera maintenue grâce à l’utilisation de coussins chauffants. L’état de bien-être des souris sera évalué quotidiennement en évaluant la qualité de la fourrure de l’animal, un isolement ou manque de dynamisme. En cas de douleur les animaux seront traités avec de la rimadyl (carprophène) associée à la buprénorphine (à la posologie adaptée et par voie sous cutanée). Les soins et traitements des animaux seront réalisés par le personnel compétent de l’animalerie définis avec le vétérinaire désigné. L’identification d’un point limite (perte de poids, respiration pénible, réticence à se déplacer, volume tumorale supérieur à 10% de du poids de l’animal) entraînera la sortie de l’animal de l’étude et sa mise à mort. Lors des injections de traitements anti-PDL1, nous privilégierons l’injection intra veineuse (différents sites d’injection caudale, jugulaire et saphène) aux injections intra péritonéales afin de limiter l’inflammation du péritoine. Tous les organes des animaux seront prélevés à la fin de la procédure.
Choix des espèces
Les souris C57/Bl6 et C57/Bl6 nude sont couramment utilisées en recherche cancérologique. Les souris nude présentent une déficience en lymphocytes T. Le phénotype dommageable est dû à la mutation génétique qui prévient le rejet des cellules tumorales humaines par la souris. Dans le contexte de notre étude, les protocoles seront réalisés avec des souris âgées de 6 semaines. A cet âge, l’ensemble des fonctions sont matures.
Etude biochimique, histologique et pharmacologique chez la souris modélisant des malformations corticales génétiques épileptogènes chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
32 256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des femelles gestantes subissent une chirurgie pour modifier génétiquement le cerveau des embryons par électroporation in utero, et leur descendance développe des crises d'épilepsie, provoquées si besoin par injection d'un agent épileptogène, avec des traitements par injections, gavage ou injection intracérébrale. Le porteur décrit des crises pouvant être quotidiennes, des œdèmes cérébraux, de l'agressivité et des avortements, et prévoit la mise à mort dès l'atteinte de points limites ou dans les deux heures suivant l'injection épileptogène. Il affirme que la culture cellulaire ne reproduit ni les crises ni les interactions cellulaires et conclut au recours à des "organismes entiers".
Objectifs
L'épilepsie touche plus de 50 millions de personnes dans le monde. Les épilepsies focales sont parmi les plus fréquentes et sévères des épilepsies, et sont souvent liées à une malformation cérébrale, en particulier ce que l’on appelle les dysplasies focales corticales. Les dysplasies focales corticales sont caractérisées par une désorganisation locale du cortex cérébral et la présence de cellules neurales anormales et de taille anormalement grande. Ces anomalies du développement sont responsables d’épilepsies qui résistent aux traitements médicamenteux sont associées à des déficits cognitifs et des pathologies psychiatriques précoces. Les dysplasies focales corticales sont induites par plusieurs gènes d’une voie de signalisation particulière appelée mTOR (mechanistic target of rapamycin, cible de la rapamycine chez les mammifères). Ces anomalies du développement cérébral peuvent être dues à des mutations génétiques présentes uniquement dans une population neuronale restreinte et apparaissant précocement au cours du développement du cerveau. Il est nécessaire de mieux comprendre l’origine des crises épileptiques suite à ces mutations afin de pouvoir développer de nouveaux médicaments antiépileptiques, et potentiellement proposer une médecine personnalisée. Afin de modéliser ces épilepsies focales d’origine génétique, nous proposons d’induire ces mutations dans le cerveau au cours du développement en travaillant directement sur les embryons au niveau de l’utérus de souris en gestation. Cette technique dite « d’électroporation » permet d’induire l’expression de gènes mutés ou d’en inhiber d’autres dans une sous-population de neurones, mimant ainsi les mutations (c’est-à-dire présentes uniquement dans la partie du cerveau affectée par cette épilepsie). Ce travail de recherche permettra de mieux comprendre les mécanismes à l’origine des crises épileptiques en fonction des différents gènes mutés. Nous évaluerons, tout d’abord, ces nouveaux modèles génétiques de malformations cérébrales à l’origine des crises d’épilepsie d’un point de vue histologique et biochimique. Puis nous testerons différents traitements antiépileptiques innovants sur nos modèles par voie injectable, orale ou intracérébrale. Enfin, nous testerons l’effet de ces traitements sur des crises provoquées par l’injection d’un agent qui génère des crises d’épilepsie dans nos différents modèles si les crises n’arrivent pas spontanément.
Bénéfices attendus
Le projet de recherche permettra de créer de nouveaux modèles de malformation corticale épileptogène induite par des mutations génétiques. Ces pathologies sont rares, graves et orphelines. En effet, la majorité des patients atteints par ces mutations présente une épilepsie pharmaco-résistante qui nécessite donc le recours à une ou plusieurs chirurgies couteuses et invasives (tant sur le plan physique que psychologique) pour contrôler les crises. Il est donc urgent d’utiliser des modèles reproduisant la physiopathologie de ces maladies afin de : - tester des thérapies innovantes afin de permettre à court terme de diminuer voir d’abolir le recours à ces chirurgies mais également de proposer une thérapie aux patients présentant une forme non opérable. - découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter à la fois l’épilepsie mais également les comorbidités associées à ces pathologies (autisme, dépression, troubles de l’hyperactivité, …) - mieux comprendre le lien entre voie mTOR (mechanistic target of rapamycin, cible de la rapamycine chez les mammifères) et épilepsie afin d’ouvrir de nouvelles perspectives de recherches et de thérapies pouvant potentiellement être utilisées pour des patients atteints de différentes mutations.
Procédures
Chirurgie sous anesthésie et analgésie sur les mères gestantes afin d’induire des mutations dans le cerveau des embryons à travers la paroi utérine (électroporation in utero), afin de générer les groupes d’animaux génétiquement modifiés pour la suite de notre étude. Durée maximale 1h, une seule fois. Pour les souris électroporées (différents lots) : -Euthanasie sans traitement préalable (souris n’ayant pas de modification génétique ou simple observation clinique). -Traitement intrapéritonéal : injection intrapéritonéale de molécules thérapeutiques (1 injection de 30s tous les 2 jours pendant 2 semaines). -Traitement par voie orale (Gavage) : Administration par gavage de molécules thérapeutiques (1 gavage de 1 min tous les 2-3 jours pendant 3 semaines maximum). -Traitement par injection intracérébrale : injection unique sous anesthésie générale en analgésié, durée maximale 1h10. -Traitement et Pentylènetétrazole : injection intrapéritonéale de molécules thérapeutiques (1 injection de 30s tous les 2 jours pendant 2 semaines) OU Gavage de molécules thérapeutiques (1 gavage de 1 min tous les 2-3 jours pendant 3 semaines maximum) OU Injection intracérébrale (1 injection unique sous anesthésie et analgésie) PUIS Injection intrapéritonéale d’un agent épileptogène (1 injection de 30s).
Impact sur les animaux
1) Pour l’opération permettant d’induire des mutations dans le cerveau d’embryons d’une femelle gestante (électroporation in utero, procédure 1) : Isolement de la femelle préopératoire et jusqu’à la naissance des embryons. Risques de déficience respiratoire, cardiovasculaires et hypothermiques durant l’anesthésie. Possible douleur au niveau du site d’ouverture et utérin, inconfort général durant les heures suivant la chirurgie, perte d’embryon(s), mise-bas prématurée. Possible risque d’infection au niveau du site d’ouverture. 2) Pour les souris génétiquement modifiées issues de la procédure 1 : Le développement prédit de crise d’épilepsies avec potentiellement plusieurs crises par jour. Possible agressivité des souris envers leurs congénères pouvant entrainer stress et blessures. 3) Injection chronique intra-péritonéales : stress durant la manipulation des souris, perte de poids et possible douleur (œdème, hématome) dus à l’insertion répétée de l’aiguille sur le site d’injection. 4) Gavage oral : stress durant la manipulation des souris, perte de poids et possible douleur au niveau de l’œsophage due à l’insertion répétée de la sonde dans le système digestif. 5) Injection intracérébrale : Injection intracérébrale sous anesthésie. Risques de déficience respiratoire, cardiovasculaires et hypothermiques durant l’anesthésie. Possible douleur au niveau du site d’ouverture et inconfort général durant les heures suivant l’injection. Possible risque d’infection au niveau du site d’ouverture. Œdème cérébral dû à l’injection. 6) Injection de Pentylènetétrazole : stress durant la manipulation des souris, perte de poids, crises épileptiques et possible douleur sur le site d’injection.
Devenir
Femelles gestantes opérées afin d’induire des mutations cérébrales dans le cerveau des embryons : les femelles gestantes seront euthanasiées après le sevrage des souriceaux. Du fait de la chirurgie, elles ne peuvent être réutilisées pour des accouplements. Procédures exploratoire, traitements et injection de Pentylènetétrazole (agent inducteur de crises épileptiques) : les souris seront euthanasiées dès qu’un point limite sera atteint, ou dans les 2 heures suivant l’injection de Pentylènetétrazole ou en fin de procédure (âge maximum 1an). Nos analyses nécessitant le prélèvement du tissu cérébral, aucune souris ne peut être gardée en vie en fin de procédure.
Remplacement
Les résultats attendus de cette étude ne peuvent être obtenus par modélisation informatique car celle-ci nécessite des données expérimentales encore manquantes. De même, la culture cellulaire ne reproduit pas les interactions cellulaires, les voies de migration cellulaires, ni les crises d’épilepsie. La modélisation in vitro n’est donc pas indiquée dans notre type d’étude. De plus, nous ne pouvons éthiquement pas reproduire les modifications cérébrales nécessaires à notre étude chez des patients sains, ni tester nos traitements expérimentaux sur les patients atteints de ces troubles sans études précliniques préalables. Enfin l’utilisation d’organismes entiers, à la physiologie proche de l’humain et communément utilisé en étude préclinique nous permettra de tenir compte de la pharmacodynamie et de la pharmacocinétique de nos potentiels traitements. Nous pourrons ainsi rapporter les éventuels effets indésirables, la durée de traitement, la dose efficace et les effets attendus de nos traitements lors de nos discussions avec les cliniciens en charge des patients atteints de ces troubles avec lesquels nous travaillons étroitement.
Réduction
Nous ferons une planification rigoureuse des expériences en testant préalablement la faisabilité des expériences, en combinant différents protocoles au cours d’une même expérience et en réalisant une exploitation maximale des données à l’aide de l’utilisation appropriée de tests statistiques. Le calcul du nombre d’animaux est fait suivant les recommandations internationales par calcul de puissance statistique afin d’obtenir des résultats fiables. Il nous faut donc au moins 10 souris par groupe traitement. Ce calcul de puissance sera ajusté selon les premiers résultats, car nous ne pouvons pas encore prédire les différences de moyennes entre nos groupes (soit 5760 souris). La première procédure comprend un groupe exploratoire (288 souris), pour lequel, nous avons prévu 3 souris par groupe afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, tout en obtenant des résultats fiables. Nous ne sélectionnerons que les souriceaux positifs aux mutations génétiques induites au stade embryonnaire. Dans la mesure du possible, nous utiliserons les souris contrôles (non mutées) comme contrôles de plusieurs modifications génétiques. Cependant, ne connaissant pas la physiopathologie de ces mutations induites, nous ne pouvons pas d’avance connaitre l'âge des souris utilisées dans les groupes de traitement. Nous ne pouvons donc pas être certains de la possibilité de ce double-emploi des contrôles. Nos calculs du nombre de souris se basent donc sur le scénario utilisant le nombre maximal de souris où aucun des pathologies induites par les 4 mutations prévues ne présenterait un décours concomitant à un autre et où chaque groupe aurait donc son propre groupe contrôle. Enfin, nous avons prévu un groupe exploratoire, nous permettant d’identifier le stade de traitement le plus adéquat afin de limiter les groupes d’études des différents traitements. Enfin nous commanderons nos souris gestantes à un stade permettant de vérifier l’état de gestation. Notre période d’acclimatation sera donc réduite (2 à 7 jours) mais la livraison à un stade de gestation plus précoce permettant le temps d’acclimatation recommandé engendrerait la livraison de femelles potentiellement non gestantes, inutilisables, à euthanasier. La souche que nous utilisons étant peu sensible au stress, nous préférons donc utiliser une période d’acclimatation courte afin de réduire le nombre d’animaux. Dans ces conditions, le taux de survie des mères à ce type de chirurgie est très proche de 100 pourcent.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans des cages ventilées (maximum 6 par cage) avec accès à l’eau et à des croquettes à volonté, enrichies d’un nid de coton, et d’une maison en cas d’inconfort (animal isolé) ou pour les souris gestantes. Les souris injectées avec un convulsivant seront isolées pendant une période de 10 à 120min (selon durée des symptômes) dans une cage de grande dimension afin de limiter les risques de commotions ou de blessures lors des convulsions, après 30min de familiarisation à la cage. Le phénotype de nos lignées est encore inconnu. Les premiers lots de souris seront donc observés 3 fois par semaine du stade P10 (afin de limiter les risques de rejet de la mère par de trop nombreuses manipulation du nid) et jusqu’à 3 mois, puis quotidiennement après apparition de la première crise épileptique du lot. Les lots suivants seront surveillés quotidiennement au stade d’apparition des crises. Si une souris fait une crise de plus de 15 minutes ou présente une posture hypertonique post-crise, elle sera euthanasiée. De plus, lors des injections avec le convulsivant, si une souris fait plus de 15 crises, elle sera euthanasiée. Les souris feront donc l'objet d'une surveillance étroite par le personnel de soin animalier et de l’équipe de recherche. Le poids, l'apparence physique et des changements de comportement seront les facteurs pris en compte. En cas d’apparition d’un comportement d’agressivité envers les congénères, la cage sera enrichie (maisonnette, boule de papier, séparateurs) et ne sera changée que partiellement afin de conserver la hiérarchie de dominance au sein du groupe. En cas d’inefficacité de ces mesures, la souris agressive sera isolée dans une cage enrichie afin d’éviter le risque de blessure. Avant le début de la chirurgie, nous administrons une dose d’analgésique. En cas de souffrance post-chirurgicale, la souris recevra une nouvelle dose toutes les 24h, jusqu’à la mise-bas des souriceaux. Après cette mise-bas, nous surveillerons les signes de douleur de la femelle, et si les souriceaux sont bien nourris par observation de la présence de lait dans l’estomac à travers la peau. Dans les groupes de traitement et injection de convulsivant : les mouvements, le poids, le grimace-score, la respiration et les réflexes tels que le retrait de la patte seront observés attentivement jusqu’à euthanasie de fin de procédure (maximum 2h). S'ils révèlent une dégradation ou une souffrance de l'animal, celui-ci sera euthanasié plus précocement.
Choix des espèces
Notre choix a été motivé par des raisons scientifiques : (1) Nos études portent sur des modèles génétiques d'épilepsie nécessitant des modifications génétiques ciblées, possibles chez la souris (2) Les souches des souris que nous utiliserons ont été majoritairement utilisées pour modéliser les crises d’épilepsies. Elles ont donc été explorées de manière exhaustive de la molécule au comportement, permettant une solide base scientifique sur laquelle baser nos travaux. (3) Les rongeurs ont un cerveau suffisamment élaboré pour générer des activités épileptiques dont les mécanismes pathologiques aux niveaux cellulaire et moléculaire sont similaires à l'humain. Les femelles gestantes seront utilisées à l’âge adulte (plus de 2 mois). Leurs embryons seront génétiquement modifiés au cours de la gestation. L’efficacité de notre méthode de modification génétique des souris utilisées par la suite est vérifiée visuellement par la présence ou non de tache fluorescente à l’aide d’une lampe. Pour le groupe exploratoire, les souris seront euthanasiées à 4 stades différents avant et après sevrage : -un stade postnatal précoce afin de caractériser le développement cérébral de nos modèles -un stade précoce à l’apparition des crises épileptiques -un stade tardif après l’apparition des crises -un stade supplémentaire selon les symptômes observés chez les premiers lots Pour les traitements, les souris seront utilisées après sevrage et au stade déterminé par le groupe exploratoire, jusqu’à l’âge d’un an maximum.
Rôle du stress oxydant mitochondrial et de la sénescence dans l’insuffisance cardiaque post-ischémique chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
180 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie cardiaque de 70 minutes avec ligature d'une artère coronaire pendant 30 minutes pour provoquer un infarctus, puis un traitement pharmacologique et une échocardiographie à 28 jours. Le porteur indique des risques d'hypotension, de refroidissement et de douleurs postopératoires aux nerfs intercostaux, et prévoit la mise à mort pour prélever les tissus cardiaques. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative ni de modélisation possible" pour l'ischémie-reperfusion myocardique et décrit un "besoin" urgent de nouveaux traitements.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont la seconde cause de mortalité en France (environ 150 000 morts/an). Elles ont le plus souvent pour origine une atteinte ischémique (déprivation en oxygène) du myocarde, pouvant évoluer à plus long terme vers une insuffisance cardiaque (IC), ou le cœur n’est plus capable d’assurer la perfusion des tissus. Alors que l'incidence de l’IC augmente continuellement du fait du vieillissement de la population, les traitements demeurent insuffisants. Une meilleure connaissance des mécanismes à l’origine du développement de l’IC pourrait ainsi permettre de proposer des nouvelles thérapies. La recherche dans ce domaine demeure un enjeu majeur de santé publique. Notre projet vise à identifier des nouvelles interventions pour contrer le développement de l’IC, dans des modèles murins expérimentaux mimant la pathologie humaine. L’équipe s’intéresse en particuliers au stress oxydant qui est augmenté suite à un infarctus du myocarde. Cela entraine des effets délétères sur le coeur, pouvant altérer sa fonction de contraction. Notre projet consistera donc à évaluer le rôle préventif de l’inhibition des voies du stress oxydant, sur un modèle d’IC induit de manière chirurgicale chez le rat mimant un infarctus du myocarde. Nous étudierons ainsi les effets protecteurs de plusieurs composé sur le développement de l’IC par échocardiographie et analyse des tissus.
Bénéfices attendus
Malgré les progrès réalisés ces dernières années dans la prise en charge de l’infarctus du myocarde, qui a permis de diminuer considérablement la mortalité grace à la revascularisation, il existe toujours un risque élevé pour les patients de développer une IC dans à long terme. L’arsenal thérapeutique disponible actuellement a permis des progrès cliniques mais la mortalité reste élevée (50 % de mortalité à 5 ans) et les traitements ne sont pas curatifs. A ce jour, l’IC post-infarctus constitue un problème majeur de santé publique en France et il apparait indispensable de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Cela nécessite de mieux comprendre les mécanismes qui régissent l’altération de la fonction cardiaque à partir de modèles expérimentaux qui reproduisent les différentes composantes de la pathologie humaine. Ceci est un gage d’une meilleure transposition vers la clinique dont le besoin de nouveaux traitements est urgent.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d’ischémie-reperfusion myocardiaque (ligature coronaire). La durée totale de l’intervention est de 70 min, dont 15 min entre l’intubation oro-trachéale et l’accès au coeur, 30 min de ligature coronaire et 15 min pour la fermeture du thorax. Pour les groupes traités, un traitement pharmacologique sera mis en place 24 h après la chirurgie. A l’issue des 28 jours, les rats seront soumis à une échocardiographie non invasive et non douloureuse.
Impact sur les animaux
Au cours de la procédure chirurgicale, les nuisances ou effets indésirables (qui seront surveillés) sont l’hypotension et le refroidissement corporel. Après la chirurgie thoracique, d’éventuelles douleurs post-opératoires au niveau des nerfs intercostaux pourront être réduites par injection d’analgésiques. A plus long terme, le développement d’une insuffisance cardiaque sera surveillé (au vu des points limites).
Devenir
Mise à mort de tous les animaux pour récupérer les tissus cardiaques pour analyser les effets bénéfiques des traitements sur le développement de l’insuffisance cardiaque.
Remplacement
Le développement des pathologies est un processus complexe et intégré qui est mieux reproduit dans un modèle animal. Par exemple, le développement de l’insuffisance cardiaque met en jeu, entre autres, des systèmes hormonaux, des adaptations des systèmes circulatoire, rénal, central si bien que seul un système intégré in vivo permet de reproduire toutes les composantes. Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative ni de modélisation possible pour l’ischémie-reperfusion myocardique. De plus, les études in vivo répondent mieux au potentiel thérapeutique de la cible même si elles ne présagent pas des résultats qui vont être obtenus dans d’autres espèces ou en clinique.
Réduction
La stratégie d’expérimentation repose sur l’hypothèse d’une modification du développement de la pathologie par les interventions pharmacologiques. Pour calculer le nombre d’animaux utilisés pour chaque expérimentation nous utilisons nos résultats d’expériences préliminaires. D’après l’ensemble de nos estimations, chaque groupe (malade, sain, traité) comportera 15 rats. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous réaliserons toute une série de collecte de données sur un même rat: fonction cardiaque par échocardiographie, histologie, expression génique et protéique.
Raffinement
Notre objectif est d’offrir aux animaux la meilleure qualité de vie possible et de garantir que toute nuisance ou souffrance due aux procédures scientifiques soit détectée et réduite le plus rapidement possible. Une période d’acclimatation d’au moins 7 jours sera respectée après réception des animaux. Pour éviter tout stress, les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur : - dans des cages aux normes suivant leur âge et leur poids - en groupe social au sein de l’animalerie - en leur mettant à disposition un enrichissement du milieu (cabannes, tunnels, papier, coton pour la confection de nids). Les animaux seront élevés avec une attention particulière (passage du personnel minimum 2 fois/jour et observation de l’état général). Les manipulations seront réduites au minimum afin de limiter le stress des animaux. La souffrance de l’animal sera réduite au maximum ou supprimée par l’utilisation d’anesthésiques avant la chirurgie et d’analgésique à différents temps (avant la chirurgie, après la chirurgie et si l'animal montre des signes de douleurs). Une grille d’évaluation des points limite sera mise en place pour évaluer l’état de l’animal après la chirurgie et mettre en évidence un éventuel point limite. La décision de garder en vie les rats sera prise par le responsable du projet en concertation avec la structure de bien-être animal (SBEA). La mise à mort sera réalisée par un protocole adapté en vue des prélèvements post-mortem.
Choix des espèces
Le modèle d’infarctus du myocarde chez le rat est bien maitrisé au laboratoire et mime le développement de la pathologie humaine. Il existe dans cette espèce une grande disponibilité d’outils d’étude biologiques nécessaires à l’évaluation de l’insuffisance cardiaque. Nous utiliserons des rats de 8-10 semaines pour réaliser les interventions chirurgicales de manière optimale chez des animaux matures et pour éviter la mortalité liée au vieillissement.
Effet neuro protecteur et neuro régénérateur de nouvelles biomolécules dans un modèle souris de glaucome
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
2670 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un pincement du nerf optique leur provoque une cécité d'un œil, suivi d'injections de biomolécules dans l'œil ou par voie intraveineuse, le porteur indiquant que le pincement et les injections oculaires causent une douleur. La mise à mort est justifiée par la récupération des rétines et des nerfs optiques, aucune souris ne pouvant selon le porteur être réutilisée, replacée ou adoptée. Il présente l'effet neuroprotecteur et régénérateur de ces molécules comme une piste pour éviter la cécité dans le glaucome, au conditionnel.
Objectifs
Le glaucome est une des principales causes de déficit visuel. Les neurones présents dans la rétine (RGC, Cellules Ganglionnaires Rétiniennes) transmettent les informations captées par les photorécepteurs sous forme de signal électrique par via leur fibre nerveuse (axone) qui parcourt le nerf optique (NO) jusqu’au cerveau. Dans le glaucome, ces axones et les RGC dégénèrent, provoquant une cécité irréversible. Un modèle robuste de cette pathologie est obtenu chez la souris par un pincement maitrisé du NO provoquant la dégénérescence des axones qui le composent. Nous souhaitons tester dans ce modèle les propriétés neuroprotectrices et neurorégénératrices de biomolécules « NV » Sur des cultures de neurones, les NV favorisent la survie des cellules, l’élongation des prolongements cellulaires qui permettent les connections entre neurones et leur repousse après lésion. Ces résultats suggèrent que les NV pourraient être utilisés pour protéger les RGC de la mort cellulaire (effet neuroprotecteur) dans le glaucome et favoriser la repousse de leurs axones dans le NO (effet neurorégénérateur). Nos études ont montré que l’injection intraoculaire de vecteurs AAV2 (virus adéno-associé 2) codant pour le peptide NV de première génération (AAV2-NV1) favorise la survie des RGC et la repousse de leur axone, efficacité renforcée en présence de CNTF (ciliary-derived neurotrophic factor), un facteur de croissance neuroprotecteur et neurorégénérateur (effet synergique d’AAV2-NV1 et AAV2-CNTF). De plus, ces travaux ont permis de montrer l’absence de toxicité ou d’effets secondaires lors de l’injection intraoculaire d’AAV2-NV1. Nous avons développé de nouvelles générations de NV, modifiées pour augmenter leur affinité pour leur cible et donc leur efficacité, et conjuguées à des CPM (Cell Penetrating Molecules) tels que les VHH (molécules dérivées de chaines lourdes d’immunoglobulines de lama capables de franchir les membranes cellulaires) ou des peptides étiquettes (ciblage préférentiel des neurones en fixant le récepteur de l’acétylcholine) afin d’augmenter leur stabilité et leur adressage aux neurones. Nous souhaitons tester ces nouvelles générations de NV dans le modèle souris de glaucome afin d’identifier la molécule ayant l’efficacité maximale avec une toxicité minimale pour ensuite développer ce candidat comme médicament pour le glaucome en l’amenant à l’essai clinique.
Bénéfices attendus
Les biomolécules NV développées dans notre laboratoire possèdent des propriétés neuroprotectrices et neurorégénératrices susceptibles d’apporter une réponse à de nombreuses pathologies dégénératives. Dans le glaucome, l’augmentation de la pression intraoculaire cause une dégénérescence des axones dans le nerf optique, une mort des cellules ganglionnaires rétiniennes et à terme la cécité. Dans le cadre de ce projet, l’administration de ces molécules a pour but d’induire la régénération des fibres axonales dans le nerf optique après lésion, ce qui aura pour bénéfice de reconnecter l’œil au cerveau et donc d’éviter la cécité causée par cette lésion. Leur effet neuroprotecteur devrait quant à lui permettre la survie des cellules ganglionnaires rétiniennes dans la rétine, dont les axones forment le nerf optique.
Procédures
Afin d’étudier l’effet neuroprotecteur et neurorégénérateur de nos biomolécules NV, un pincement du nerf optique sera pratiqué chez des souris. Ce pincement provoquera une cécité unilatérale. Ce geste technique est rapide (moins de deux minutes) et est réalisé sous anesthésie profonde et analgésie. L’injection intravitréenne de nos biomolécules NV est réalisée sous anesthésie profonde et analgésie. Ce geste technique est rapide (moins de deux minutes). L’injection intraveineuse de NV est réalisée sous anesthésie profonde et analgésie. Ce geste technique est rapide (moins de deux minutes).
Impact sur les animaux
Afin d’étudier l’effet neuroprotecteur et neurorégénérateur des biomolécules NV, un pincement du nerf optique sera pratiqué chez des souris. Ce pincement provoquera une cécité unilatérale. Il est attendu que le pincement du nerf optique et l’injection des biomolécules NV dans l’œil causent une douleur chez la souris.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, toutes les procédures requièrent la récupération de tissus (rétines, nerfs optiques) destinés à être analysés en vue de démontrer l’effet thérapeutique de notre molécule NV.
Remplacement
Les biomolécules NV utilisées dans ce projet sont préalablement validées in vitro pour leur efficacité et leur absence de toxicité sur des cultures de cellules neuronales, des cellules épithéliales rétiniennes et des explants de rétines. Les cellules neuronales et épithéliales rétiniennes ne nécessitent pas l’utilisation d’animaux (lignées cellulaires). Les explants de rétine, réalisés à partir de rétines de souris, permettent de tester plusieurs constructions et concentrations de NV avec un nombre réduit de souris, ce qui permet par la suite de ne tester in vivo que les molécules NV efficaces in vitro. Les explants de rétine constituent un modèle in vitro très proche du modèle in vivo (même espèce, même tissu) et facilite l’extrapolation.
Réduction
Le nombre d’animaux requis pour établir l’efficacité des biomolécules dans ce modèle a été calculé par un test de puissance statistique à partir de nos résultats antérieurs. La mise à mort des animaux pour la récupération des yeux et des nerfs optiques étant nécessaire au projet, la réutilisation des animaux n’est pas envisageable. Les deux yeux des souris seront valorisés quand cela sera possible afin de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Les techniques de chirurgie de l’œil nécessaires à la réalisation du projet ont été acquises auprès d’un laboratoire de référence. La maîtrise des bons gestes chirurgicaux limitera les risques d’altération de la lentille lors des injections intraoculaires et augmentera la probabilité de créer des lésions du nerf optique bien calibrées et donc exploitables. Les animaux recevront des antalgiques avant et après lésion ainsi qu’une anesthésie locale juste avant le pincement du nerf optique. Les gestes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie générale à l’isoflurane. La surveillance des animaux sera quotidienne durant les 3 jours suivant les pincements/injections, puis bihebdomadaire. Les animaux seront mis à mort en cas de dépassement des points limites fixés pour les différentes procédures. Après le réveil des animaux, les animaux sont remis dans leur cage et gardés pour une durée variable dépendante de la procédure (entre 1 heure et 44 jours pour la procédure la plus longue).
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle souris pour sa taille et son anatomie, particulièrement adaptées à la chirurgie ophtalmique. De plus, certains de nos tests seront réalisés avec des souris génétiquement modifiées existantes. Souris adultes âgées de 8 semaines. Les expériences sont réalisées à un stade où les rétines sont matures et dans lesquelles les neurones ont une capacité régénératrice minime afin de reproduire des conditions semblables à celles de la pathologie chez l’homme.
Ischémie reperfusion rénale sur souris uninephrectomisées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
390 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une microchirurgie de 45 minutes, avec ablation d'un rein puis clampage de l'artère et de la veine du rein restant pendant 30 minutes pour provoquer une ischémie, suivie de prélèvements sanguins et de traitements quotidiens pendant sept jours. Le porteur indique que la chirurgie peut entraîner des douleurs, une perte de poids et la mort sous anesthésie chez les animaux âgés, les souris perdant plus de 20 % de leur poids étant mises à mort. Il affirme que la complexité physiologique ne peut être reproduite in vitro et présente ce modèle comme un moyen de réduire l'échec des candidats médicaments en clinique.
Objectifs
10% de la population mondiale est atteinte de maladie rénale chronique (CKD). Cette condition pathologique caractérisée par de nombreuses atteintes tissulaires au niveau rénale conduisent à la perte de fonction de l’organe et des décès prématurés due à des problèmes cardiovasculaires. Cependant, les mécanismes et facteurs impliqués dans l’accélération de la maladie sont encore mal identifiés. A ce jour, il n’existe encore aucune thérapie permettant de soigner ou de limiter l’avancement des maladies rénales chroniques. Malgré une intensification des efforts de recherche dans le développement de nouveaux médicaments, les industriels pharmaceutiques font face à un taux très important d’échec dans les phases de tests cliniques sur l’Homme. Une raison avancée à ces taux d’échec clinique élevés est une faible pertinence des modèles expérimentaux utilisés lors des phases précliniques. En effet, les modèles utilisés couramment ne permettent pas de reproduire les conditions observées chez l’Homme et manque de pertinence physiologique. L'objectif de ce projet est de mettre en place un nouveau modèle expérimental de souris afin d'évaluer l'efficacité de médicaments ciblant les lésions rénales aïgues. Le modèle de souris développé dans ce projet permettra d'améliorer la prédiction d'efficacité de nouveaux candidats médicaments afin de limiter la progression des maladies rénales chez l'Homme.
Bénéfices attendus
La mise en place et le succès de ce projet permettra de proposer un nouveau modèle expérimental in vivo qui exprime une série de désordres physiologiques retrouvés chez l’Homme. Ainsi les tests précliniques d’efficacité de nouveaux candidats médicaments pour le traitement des maladies rénales, pourront être réalisés sur un modèle pertinent d’un point de vue physio-pathologique avec le but de réduire le taux d’échec d’efficacité des candidats médicaments pendant les phases cliniques.
Procédures
Chaque animal subira : - 1 seule procédure de microchirurgie d'une durée totale d'environ 45 min: Laparotomie, ablation du rein droit, puis clampage de l'artère et de la veine rénale du rein gauche pendant 30 minutes (ischémie). Déclampage puis suture de l'abdomen (muscle et peau). - prélèvements sanguin quotidien (sur 7 jours) de 20 à 100 ul de sang par légère incision au niveau de la queue ou via une ponction de la veine faciale (durèe environ 1 min par animal). - traitements quotidien par les candidats médicaments pendant 7 jours consécutifs (durèe inférieure à 1 min par animal).
Impact sur les animaux
Les animaux qui interviendront dans ce projet subiront des effets indésirables liés à la procédure de microchirurgie. Ces effets indésirables ont été classés par ordre décroissant de gravité et de probabilité : - Lésions du rein ayant subit la procédure d’ischémie reperfusion. La conséquence est une réduction significative de la fonction de ce rein après quelques semaines. - Douleurs liées à la microchirurgie, notamment à l’incision cutanée et musculaire pour l’accès au rein à clamper - Anesthésie profonde pouvant entraîner la mort chez les animaux âgés - Perte de poids après chirurgie - Lésions vasculaires au niveau du clamp pouvant entraîner une mauvaise reperfusion de l’organe
Devenir
Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort et disséqués afin de collecter le rein pour des analyses histologiques.
Remplacement
En parallèle des modèles expérimentaux basés sur l'utilisation d'animaux (rongeurs), nous travaillons au développement de modèles in vitro basés sur la culture de cellules rénales humaines. Cependant, ces modèles in vitro ne peuvent pas substituer l'importance des observations réalisées par les tests sur animaux. En effet, la complexité physiologique et les réponses systémiques aux candidats médicaments ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Réduction
Les procédures chirurgicales et expérimentales seront basées sur les protocoles détaillés dans la littérature. Sur la phase de test de produits pharmaceutiques, un nombre de 13 souris par groupe de composé testé sera utilisé. Ce nombre a été déterminé en fonction du risque de perte lors de la procédure chirurgicale, et de l'efficacité hétérogène des interventions chirurgicale. Celui-ci est estimé à 30% de perte ou absence de réponse. De ce fait, avec 13 souris par groupe au départ, nous pourrions envisager un nombre de 9 souris par groupe en fin de procédure de traitement. Ce nombre sera suffisant pour effectuer des observations scientifiquement et statistiquement pertinentes. Les effets des candidats médicaments seront évalués par comparaison avec les groupes traités par le solvant seul. Les données enregistrées seront analysées par des tests statistiques appropriés : - Pour des données uniques en fin d'expérimentation, il seront analysés par ANOVA 1-way ou par le test de Kruskal-Wallis (en fonction de l'analyse des variances). - Pour des données enregistrées en longitudinales, celles-ci seront analysées par ANOVA 2-way + Bonferonni’s post-test.
Raffinement
Afin de réduire au maximum les douleurs et l'inconfort aux animaux, un manipulateur expérimenté en microchirurgie sur rongeurs sera responsable de la procédure chirurgicale. De plus, les procédures de microchirurgies seront réalisées sous anesthésie générale (Kétamine 100mg/kg +Xylasine 10mg/kg) en IP. L’animal recevra aussi une dose d’analgésique Buprénorphine (1mg/Kg) pour réduire les douleurs au réveil. Un control quotidien avant, pendant et jusqu'au terme de l'experimentation sera effectué par les expérimentateurs afin de garantir la propreté des cages, des quantités suffisantes d'eau et de nourriture ainsi qu'un enrichissement adéquat dans les cages d'hébergement (igloo polycarbonates autoclavables et réutilisables + carton) . Pendant les périodes de traitement par les candidats médicaments, les expérimentateurs conduiront un suivi quotidien du poids corporel, de la comsommation d'eau et de nourriture ainsi que de l'état général des animaux. Ces observations seront enregistrées et analysées. Les animaux qui auront perdu plus de 20% de leur poids initial ou dont l'état général est dégradé (isolement, baisse d'activité, entretien de la fourrure, perte de poils, respiration anormale) sur 2 jours consécutifs seront retirés de l'expérimentation et mis à mort. A noter que les candidats médicaments qui seront testés pour leur efficacité auront déjà été évalués pour leur toxicité au préalable, et que le risque d'effets secondaires liés au traitement est minime. De plus, l'étude sera conduite par des personnels qualifiés et formés au respect des conditions du bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris est largement utilisée par la communauté scientifique dans le cadre de l’étude de la fonction rénale après une ischémie-reperfusion. L’avantage de ce type d’animal est qu’il répond très bien à la procédure d’uninephrectomie + ischémie-reperfusion et constitue un excellent mime pathophysiologique des conditions retrouvées chez l’Homme. De plus, grâce à leur système immunitaire spécifique, les souris ne présentent pas de risque d’infection post-opératoire. La procédure sera réalisée sur des animaux disponibles auprès d’élevages agrées (Charles River). Les animaux utilisés auront atteint l'age adulte, c'est à dire plus de 8 semaines
Mise en place d’un modèle de stress infantile chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
D'anciens reproducteurs mâles, retenus pour leur agressivité, infligent à des souris mères des défaites sociales de 10 minutes répétées sur six jours, afin d'exposer indirectement leurs souriceaux à l'agression physique de leur mère. 532 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, d'autres mères étant aspergées d'urine de mâle ou séparées de leurs petits 10 minutes par jour pendant six jours. Le porteur indique que la défaite sociale induira une "douleur physique" chez les mères et que la "douleur psychique" est "la base du modèle", puis exclut toute analgésie qui pourrait interférer avec l'étude. 160 souriceaux passent ensuite, à l'adolescence et à l'âge adulte, des tests de comportement social, d'anxiété, d'anhédonie et de résignation, sans que ces tests soient nommés. 270 souris restent en vie, 200 souriceaux et 40 femelles réaffectés à l'élevage si le comportement maternel n'est pas atteint, et 30 mâles agressifs gardés pour de futures défaites sociales, les 262 autres étant mises à mort.
Objectifs
Les expériences de vie précoce pendant l’enfance, qu’elles soient positives ou négatives, peuvent laisser des traces indélibiles sur le cerveau et le développement psychologique. En effet l’exposition précoce à des traumatismes psychosociaux, incluant entre autres la maltraitance infantile, est indiscutablement l’un des plus importants facteurs prédicteurs de pathologies psychiatriques à l’adolescence et à l’âge adulte, notamment de la dépression et du suicide. Différents modèles animaux chez la souris ont été mis en place pour étudier les conséquences du stress précoce sur le développement cérébral et psychologique, mais ces modèles se concentrent principalement sur des périodes tardives du développement (après le sevrage), et nos connaissances des effets à long terme sur le cerveau du stress infantile sont extremement limitées. Nos connaissances des mécanismes cellulaires participant à la formation et à la persistance des mémoires traumatiques précoces sont aussi très lacunaires. Afin d’étudier ces mécanismes, nous nous proposons ici de mettre en place et de tester la validité d’une procédure de stress indirect (l'expositition indirecte de souriceaux à l'agression physique de leur mère) basée sur l’experience sensorielle et la contagion émotionnelle, pouvant mimer chez la souris un traumatisme psychologique infantile avant le sevrage des animaux. Nous testerons finalement comment cette expérience peut precipiter la survenue de comportements de type anxieux et dépressifs à l’adolescence et l’age adulte.
Bénéfices attendus
Il n’existe actuellement aucun modèle animal permettant d’étudier les conséquences du trauma infantile sur le cerveau. Pour autant, l’adversité précoce est sans conteste le premier facteur de vulnérabilité pour les maladies psychiatriques telles que la dépression, les troubles anxieux, le syndrome de stress-posttraumatique, et pour le suicide. Outre la souffrance morale induite par ces pathologies, elles constituent un enjeu majeur de sante publique compte tenu du fardeau socio-économique engendré. Ces pathologies sont difficiles à prendre en charge, avec des traitements qui sont actuellement peu satisfaisants en termes de cout et d’efficacité. La mise en place d’un modèle pertinent de trauma psychosocial infantile permettrait dans ce cadre de mieux comprendre, d’un point de vue fondamental, comment le stress précoce affecte le cerveau et son développement. Cela permettrait également de disposer d’un outil pertinent pour étudier les mécanismes cellulaires mis en jeu dans la formation et la persistance des mémoires traumatiques précoces, et comment elles influent notre comportement. Si l’objectif à court terme de cette recherche fondamentale n’est pas la mise au point d’un outil thérapeutique visant à améliorer la prise en charge de populations cliniques victimes de trauma psychosocial pendant l’enfance, il est certain qu’une étape indispensable vers cet objectif est la compréhension des mécanismes neurobiologiques mis en jeu.
Procédures
- 8 mères ne subiront aucune manipulation (groupe contrôle) - 16 mères subiront une aspersion d'urine de mâle. - 16 mères subiront une séparation de leurs petits de 10 min pendant 6 jours. - 16 mères seront exposées à une défaite sociale durant 10 min et répétées sur 6 jours - 16 mères seront aspergées d'urine de mâle et isolées 10 min de leur petit, et cela, à un rythme d'une fois par jour sur 6 jours. - 60 mâles seront utilisés pour sélectionner des individus agressifs. - 40 souris sentinelles seront utilisées pour sélectionner des individus agressifs. - 360 petits seront pesés soit entre 3 et 8 jours postnatal soit entre 14 et 21 jours apres la naissance. - 160 petits seront utilisés dans des tests comportementaux, deux fois par test (une fois pendant l'adolescence, l'autre fois à l'age adulte). Ces tests sont effectués au cours de sessions uniques, allant de 3 à 10 minutes, et visent à mesurer les comportements sociaux, les conflits motivationnels et l'anxieté, l'anhédonie et la résignation des animaux.
Impact sur les animaux
Le modèle de défaite sociale (DS) induira de la douleur physique chez les mères sujettes directement au modèle. Il induira également de la douleur psychique, un état de stress aigu pendant la procédure mais aussi durable, en induisant possiblement un phénotype anxiodépressif chez les souris exposées au modèle. Cette douleur psychique est la base du modèle, l’objectif étant d’étudier comment ces changements comportementaux sont transmis aux souriceaux des mères exposées ou modifient leur comportement. L’exposition indirecte à la défaite sociale des souriceaux n’aura aucune incidence d’un point de vue physique, puisqu’elle n’est effectuée que sur les mères. Il est possible cependant que dans l’éventualité où la DS perturberait le comportement maternel, cela induise une détresse physiologique et sensorielle des souriceaux en diminuant la qualité des soins fondamentaux promulgués par leur mère. C’est pour cette raison qu'une attention particulière sera donnée au monitoring des souriceaux et du comportement maternel tout au long du protocole. Par ailleurs si notre hypothèse est validée, il est possible que le modèle induise chez les souriceaux une détresse psychique liée au stress, ce qui est notre objectif, afin d’étudier les substrats neurobiologiques et conséquences comportementales de ce stress. Etant donné que les tests de comportement sont basés sur des mesures quantitatives ou qualitatives d’exploration dans des dispositifs nouveaux et donc possiblement anxiogènes, il est possible que les tests utilisés puissent induire un stress léger chez les animaux. Ces tests sont cependant de courtes durées (10 minutes maximum), et ne sont pas basés sur des situations hautement aversives. Ces tests ne sont d’ailleurs pas connus pour induire de changements physiologiques ou comportementaux durables chez les animaux.
Devenir
Pour la validation du modèle, tous les animaux experimentaux (200 souriceaux et 40 femelles) seront réaffectés à notre élevage de souris (à condition que nos résultats ne montrent aucune atteinte au comportement maternel), afin de permettre la génération de nouveaux souriceaux. Les souris agressives utilisees pour la defaite sociale (nous estimons à la moitié le nombre de souris qui rempliront les critères d'agressivité, soient 30 souris) seront par ailleurs maintenues en vie pour de futures experiences de défaite sociale. Les souris sentinelles servant à selectionner les souris agressives, les souris non agressives, et toutes les souris utilisées pour etudier les effets du modèle sur le comportement seront mises à mort à la fin des expériences.
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro ou in silico n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. La souris est par ailleurs un choix pertinent de par les homologies structurelles qui existent avec l’homme dans l’organisation des zones cérébrales impliquées dans la réponse au stress et les émotions.
Réduction
Nous souhaitons ici pouvoir évaluer une taille d’effet forte et être confiants dans les effets que nous observons, garantissant ainsi la fiabilité de nos conclusions et la reproductibilité future du modèle. Nos effectifs intègrent donc le fait de pouvoir comparer statistiquement les groupes expérimentaux pour les différentes variables comportementales (témoins, DS susceptibles : c’est-à-dire qui ont un comportement altéré à la suite du modèle de DS, DS résilients : qui ne présentent pas de modification comportementale à la suite du modèle). Basé sur la literature des effets comportementaux du stress et des changements neurobiologiques qui y sont associés, un dimorphisme sexuel est suspecté. C’est pourquoi nous utiliserons à la fois des males et des femelles en considerant ici le sexe comme une variable d’analyse. Seuls les mâles agressifs sélectionnés pourront être réutilisés pour la suite des expériences. Les effets du modèle sur le comportement des souriceaux sera testé à la fois à 22 jours et à l’âge adulte (63 jours) sur les mêmes souris, plutôt que d’utiliser des cohortes différentes pour ces différents temps de mesure, diminuant ainsi le nombre d’animaux utilisés. En l’absence d’effet délétère sur le comportement maternel et la survie des souriceaux, les animaux utilisés pour la validation du modèle pourront réintégrer l’élevage. Les tests statistiques seront adaptés à de petits effectifs expérimentaux.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimisées avec la mise à disposition de plusieurs supports pour la construction des nids (carton, coton, papier) et de bâtons de bois pour favoriser le comportement de ronger qui est important pour cette espèce (Raffinement hébergement). Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure seront réalisées avant les tests comportementaux. Les mères seront habituées à la manipulation au moins une semaine avant la naissance des petits. Les jeunes seront manipulés avec douceur et par des personnes habituées à manipuler des jeunes souriceaux. Nous incluons ici une procédure pilote en trois étapes pouvant chacune donner lieu à un arrêt total des expériences. La phase du projet étudiant l’impact de la DS indirecte sur les jeunes sera uniquement lancée si nous n’observons aucune surmortalité des petits par rapport aux mères contrôles au cours de cette procédure pilote (Raffinement des procédures). Des grilles d’évaluation de la douleur physique et de la qualité des soins maternels ont été créées pour définir précisément les points limites. Ce modèle visant à induire des atteintes psychiques, l’analgésie et le renforcement positif, ou tout traitement pouvant interférer avec l’étude ne peuvent être envisagés (réduction des douleurs physiques et psychiques associées aux procédures).
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris et la possibilité d’utiliser des animaux transgéniques permettant l’utilisation d’outils de neurosciences intégratives font de la souris le modèle animal le plus pertinent. Des souris OGM (phénotype non-dommageable) seront utilisées permettant d’induire l’expression permanente d’un rapporteur fluorescent dans les neurones activés pendant une fenêtre temporelle précise. Le choix de cette lignée est donc motivé par le fait que si notre modèle induit un phénotype robuste chez la descendance des souris exposées à la défaite sociale, elle nous permettra de visualiser les neurones activés pendant la défaite sociale, et d’étudier plus en avant la formation, la consolidation et le rappel de cette trace mnésique, ce qui est un objectif à long terme de ce projet. Les mâles agressifs seront d’anciens reproducteurs adultes, car c’est à cet âge que le comportement agressif est le plus marqué. Les souris femelles « sentinelles » seront âgées de 8 semaines (même âge que les mères qui seront utilisées pour la validation du modèle et la mesure de ses effets comportementaux). Mères expérimentales: jeunes adultes (8 semaines) ce qui est nécessaire pour la mise à la reproduction. Progéniture des mères expérimentales : de 3 jours après la naissance à l’âge adulte, car le modèle vise à induire un stress postnatal très précoce, pendant la période infantile. Les effets comportementaux du modèle seront testés après sevrage (à 21 jours) et à l’âge adulte (à 63 jours), puisque nous souhaitons connaitre les conséquences comportementales à long terme du modèle.
MISE EN PLACE D’UN MODELE VIVO D’ETUDE DE DEGRANULATION DES CELLULES MASTOCYTES AU NIVEAU LOCAL : PASSIVE CUTANEOUS ANAPHYLAXIS (PCA)
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
2920 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées pour prélèvement d'organes et une vingtaine réutilisées dans un autre projet. Chaque souris reçoit sous anesthésie deux injections intradermiques dans les oreilles, un anticorps IgE puis l'antigène, provoquant une inflammation de l'oreille, suivies d'administrations de candidats médicaments et de prélèvements sanguins répétés. Le porteur décrit ce modèle d'anaphylaxie cutanée passive comme un outil de "screening" de molécules pour les maladies auto-immunes et indique n'avoir pas relevé de signe de douleur au-delà de l'inflammation locale. Il affirme qu'un modèle substitutif in vitro n'a pas abouti et revendique le recours à l'"organisme" complet de la souris.
Objectifs
L’objectif de cette demande d’autorisation est de mettre en place un modèle d’anaphylaxie passive cutanée (PCA : Passive Cutaneous Anaphylaxis) permettant d’étudier rapidement l’impact de candidats médicament sur la dégranulation des cellules mastocytes in vivo, mécanisme impliqué dans certaines maladies auto immunes. Pour cela un anticorps au format IgE dirigé contre un antigène du non soi est injecté sous anesthésie générale dans le pavillon de l’oreille en intradermique pour sensibiliser la souris, puis quelques heures plus tard l’antigène (et un colorant physiologique et indolore pour la souris permettant de suivre la perméabilité vasculaire) est injecté provoquant dans les minutes qui suivent un gonflement de l’oreille et une coloration bleue de l’oreille (deux paramètres que nous suivrons) due à une activation des cellules mastocytes qui vont relarguer de nombreux granules comme l’histamine notamment. L’évaluation de candidats médicaments dans ce type de modèle vise à évaluer si le traitement par ces candidats permet de diminuer l’anaphylaxie (réaction allergique survenant rapidement après contact avec l’agent inducteur) observée au niveau cutané, mécanisme impliqué dans certaines maladies auto-immunes. Dans le processus de développement d’un candidat médicament, ce type d’étude se situe en aval des études in vitro et in silico. Il permet de sélectionner les candidats sur la base de leur capacité à diminuer l’activité du système immunitaire dans le domaine des maladies auto-immunes et également d’étudier la biodisponibilité de ces candidats (distribution de la molécule dans le corps durant les traitements). Les études incluses dans ce projet prévoient des évaluations cliniques et biologiques (prélèvements sanguins pour notamment doser la présence des anticorps en cours d’étude et prélèvements d’organes terminaux pour valider l’expression des cibles thérapeutiques). Ces prélèvements sont adaptés en termes de volume/fréquence conformément aux standards éthiques et réalisés avec les méthodes les moins contraignantes possibles (ex : prélèvement de petit volume sanguin à la veine saphène)
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont de pouvoir évaluer l’impact de nos candidats médicaments sur la dégranulation des mastocytes dans un modèle préclinique en amont de toute étude clinique.
Procédures
Selon la phase de développement du modèle et la procédure expérimentale associée mise en oeuvre : -chaque souris reçoit deux injections intradermiques (une dans chaque oreille) réalisées sous anesthésie générale (moins d'une minute) ; +/- 23h plus tard et selon la phase de la mise au point : administration du véhicule, composé de référence ou candidat médicament en per os, Intra veineuse, sous cutanée ou intra péritonéale sur souris vigile (moins de 30 secondes) ; suivi 1 heure plus tard d’une injection en intraveineuse en vigile (moins de 30 secondes) ; photographies de la coloration de l’oreille et mesures de l’épaisseur de l’oreille par pied à coulisse sur souris vigile (au maximum 4 mesures - moins d'une minute à chaque mesure) ; Durée totale des études de 48h heures maximum.Tout au long de l’étude chaque souris pourra se voir prélever un petit volume de sang par µsampling (prélèvement de petit volume sanguin à la veine saphène - moins de 30 secondes).
Impact sur les animaux
Inflammation locale de l’oreille de la souris durant de la durée de l’étude (1 heure à 24 heures) -Administration de composés candidats médicaments selon les voies classiques intra-péritonéale intra-veineuse sous-cutanée ou per os
Devenir
Les souris incluses dans la première phase de mise au point de ce modèle ne nécessitant pas de prélèvements de tissus pourront être réutilisées dans le cadre d’un autre projet. A l’issue de chaque procédure, les animaux seront sinon euthanasiés pour collecte des organes et tissus et analyses in vitro des échantillons (immohistochimie, etc).
Remplacement
La recherche de nouveaux médicaments dans la prise en charge des maladies auto-immunes repose sur une première phase d’identification de candidats médicaments efficaces sur leur cible au moyen de modélisations in silico et in vitro. L’efficacité thérapeutique d’un candidat médicament ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal, dans le contexte d’un organisme complet et complexe incluant l’ensemble des mécanismes physiopathologiques. Les pathologies auto-immunes sont par essence multifactorielles et impliquent un grand nombre de types cellulaires et de médiateurs, qu’il n’est donc pas possible de modéliser complètement in vitro. Seules les molécules les plus abouties et les plus avancées dans leur développement sont administrées in vivo. Dans le cadre plus spécifique de ce projet, les tentatives de mise en place d’un modèle substitutif à ce modèle in vivo n’ont pour l’instant pas abouti et nous ne disposons pas d’un modèle de dégranulation in vitro suffisamment fiable et permettant le même niveau de prédictibilité que celui mené dans l’organisme de la souris avec toute sa complexité et l’intégralité des différents composants du système immunitaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera affiné au fur et à mesure de la mise en place de ce modèle. Les conditions expérimentales des premières étapes sont directement basées sur les données de la littérature pour ce modèle très communément réalisé. Un accompagnement par le service Biostatistique sera assuré afin d’affiner les designs expérimentaux, d’estimer la variabilité des paramètres et in fine le nombre d’animaux nécessaire par groupe pour les procédures 2 et 3 à l'aide d'un t test. De plus pour les premières phases chaque animal sera son propre contrôle, une seule des deux oreilles recevant l’agent inducteur et la seconde étant le contrôle.
Raffinement
L’administration de l’antigène par voie systémique va entrainer une inflammation locale du pavillon de l’oreille ayant reçu l’anticorps au forma IgE de cet antigène. Dans le cadre de cette DAP les doses utilisées du couple Anticorps/Antigène sont basées sur une analyse bibliographique et pour lesquels il n’a pas été relevé de souffrance ou de signes de douleur (si ce n’est l’inflammation locale de l’oreille qui est le paramètre étudié dans ce modèle) Des prélèvements de sang répétés en cinétique sont réalisés à différents temps afin de mesurer les paramètres biologiques d’intérêt et/ou le taux plasmatique du médicament. Les prélèvements de sang sont effectués selon la technique du « multisampling » à la veine latérale de la patte, méthode systématiquement privilégiée par rapport aux autres techniques usuelles car rapide, réalisable plusieurs fois sur un même individu, et respectant les volémies et les conditions physiologiques de la souris. Cette technique permet également de réduire considérablement le nombre d’animaux inclus par étude Les administrations intradermiques dans chaque oreille sont réalisées sous anesthésie générale. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé par les expérimentateurs et le personnel assurant leur soin. Ce suivi permettra d’identifier tout signe de souffrance et d’appliquer les mesures nécessaires au soulagement des souris en cas d’atteinte de points limites prédéfinis. Les souris seront hébergées en groupes sociaux et disposeront de matériel de nidification dans leur cage d’hébergement.
Choix des espèces
La souris présente certains traits caractéristiques similaires à l’Homme dans la biologie des réactions immuno-inflammatoires rendant ainsi pertinente son utilisation. De nombreux modèles ont montré un fort parallélisme dans les différents médiateurs mis en jeu lors des maladies auto-immunes (auto-anticorps, cellules du système immunitaire, cytokines, …). Par ailleurs l’utilisation de candidat médicament comme les anticorps nécessitent souvent l’utilisation de modèles murins dits humanisés, dans lesquels le gène cible a été remplacé par manipulation génétique par le gène cible humain sans incidence sur le phénotype. La protéine humaine exprimée pourra alors être détectée par le ou les anticorps candidats Idéalement, les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 8-9semaines, soit un poids corporel d’environ 18-20g. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés dans la sélection des candidats médicaments.
Prévention du rejet par la combinaison d’une immunothérapie et d’une thérapie cellulaire dans des modèles murins.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des nouveau-nés reçoivent des cellules souches humaines pour reconstituer un système immunitaire humain, puis les souris subissent des greffes de peau avec deux greffons suturés en environ 90 minutes, des greffes d'îlots pancréatiques, l'induction d'un diabète par injection d'alloxan et une imagerie intravitale répétée. Le porteur indique que ces greffes peuvent provoquer des douleurs postopératoires et une perte de poids. Il affirme que l'efficacité de la thérapie cellulaire ne peut être évaluée qu'in vivo et présente les bénéfices pour les patients au conditionnel et à terme.
Objectifs
Aujourd'hui, la greffe d'organe est souvent le dernier recours pour les patients dont les organes vitaux sont défaillants. La greffe permet de retrouver une qualité de vie et d’améliorer la survie des patients. Néanmoins, les traitements anti-rejet ont de nombreux effets secondaires (infections et cancers). Le but de ce projet de recherche, prévu sur une période de 5 ans, est de développer une thérapie cellulaire et génique pour supprimer le besoin en anti-rejets. Il s’agit de modifier génétiquement les cellules régulatrices du système immunitaire du receveur pour qu’elles neutralisent la réaction de rejet. L’efficacité in vitro et in vivo de ces cellules régulatrices modifiées a été établie. Il est désormais indispensable de démontrer et d'optimiser leur efficacité dans des modèles précliniques de greffe pour mieux garantir un effet protecteur à long terme, une étape nécessaire pour son utilisation future chez l'homme. Seul un modèle murin de transplantation est capable de récapituler la complexité des phénomènes de rejet. Quatre types de modèles murins seront utilisés pour tester et optimiser l'utilisation d’immunothérapies dont les CAR-Tregs : 1- un modèle de greffe de peau chez des souris 12 semaines après la reconstitution de leur système immunitaire par des cellules souches humaines (souris humanisées) 2- un modèle de greffe de peau chez des souris 12 semaines après la reconstitution partielle du système immunitaire par des cellules mature humaines (souris semi-humanisées) 3- un modèle de greffe d’ilots chez des souris 12 semaines après la reconstitution de leur système immunitaire par des cellules humaines (souris humanisées) et 4-un modèle de maintien de la tolérance immune avec deux greffes de peau successives chez la souris humanisée. Au total, deux lignées immunodéprimées seront utilisées.
Bénéfices attendus
A terme, ces expériences permettront : - de démontrer la synergie d'une immunothérapie ciblant les cellules dirigées contre les greffons et de CAR-Tregs - de montrer la possibilité d’expandre les CAR- Tregs in vivo, - et d'établir l'efficacité des CAR-Tregs à prévenir le rejet aigü et chronique de greffe de peau et d’ilots dans des modèles précliniques de souris humanisées. Cette nouvelle stratégie thérapeutique ambitionne d’améliorer la prévention des rejets en transplantation d’organe, tout en s’affranchissant de la toxicité des drogues immunosuppressives administrées au long cours. La prévention des réactions de rejet dans ces trois modèles complémentaires serait un argument préclinique très robuste et convaincant pour porter cette nouvelle stratégie vers une utilisation clinique.
Procédures
Injection des cellules souches: Des nouveaux nés recevront des cellules souches humaines par voie intrahépatique sans anesthésie. Ce geste est réalisé une fois et dure quelques secondes. Injection et prélèvement sanguin: réalisés dans le sinus rétro-orbitaire en alternance sur chacun des yeux sous une courte anesthésie gazeuse
Impact sur les animaux
Les greffes de peau et d’îlots peuvent induire chez les animaux des douleurs les jours suivant la chirurgie accompagnée d’une perte de poids (>10%) et une perturbation de la mobilité par le bandage. L’injection d’alloxan risque d’induire une hypoglycémie transitoire avec une augmentation du taux d’insuline plasmatique due à la destruction du pancréas.
Devenir
A l’issus de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour le prélèvement d'organes.
Remplacement
Des études fonctionnelles in vitro ont été réalisées avec des cellules humaines afin d’optimiser la préparation de la thérapie cellulaire. Toutes les étapes visant à améliorer l’efficacité de la modification génétique des cellules régulatrices ont été mises au point in vitro. Toutefois, les expériences in vitro ne permettent pas d’évaluer la biodisponibilité, des CAR Trégulateurs dans les différents organes, ou leur capacité à migrer dans les greffons, et à induire une tolérance. En effet, lorsque les cellules sont greffées, elles se transforment en réponse à leur environnement, en particulier l’environnement inflammatoire induit pas la réaction de rejet, ce qui peut complètement modifier leur persistance et leur activité tolérogène. L’efficacité des approches de thérapie cellulaires ne peut être évaluée in fine que in vivo dans un modèle mimant la maladie humaine. Les expériences sur l’animal sont donc justifiées avant leur application chez l’homme.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, les scores d’évaluation clinique les plus objectifs, prédictifs et robustes seront privilégiés. Le suivi par imagerie intravitale permet un suivi longitudinal des animaux et donc une réduction de leur nombre. Le nombre total de souris impliquées dans les expériences a été réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisantes tout en s’assurant d’une interprétation statistique fiable des résultats pour évaluer l’effet thérapeutique des produits testés. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Les résultats seront partagés avec la communauté scientifique pour éviter les doublons.
Raffinement
Afin de limiter la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance rapprochée et l’utilisation d’antalgiques (buprénorphine) sont prévues. Une grille de score permettant d’évaluer objectivement les éventuelles souffrances, douleurs et détresses a été établie pour définir des points limites permettant d’anticiper l’administration d’analgésiques ou la mise à mort de l’animal si nécessaire. Une anesthésie gazeuse sera pratiquée pour chaque geste invasif (injection iv, prélèvement sanguin, chirurgie). Pour toute anesthésie prolongée, les animaux seront placés sur une plaque thermostatée permettant de maintenir leur température corporelle et du gel oculaire sera appliqué. La contention nécessaire pour l’imagerie in vivo sera accompagnée d’une anesthésie sous forme gazeuse par isoflurane. Dans le cas de l’anesthésie gazeuse, la vigilance de l’animal sera surveillée par pincement de la palme plantaire, mobilité des vibrisses et suivi du mouvement thoracique respiratoire et ce, jusqu’au réveil complet de l’animal. Pour réduire le stress éventuel engendré par la procédure, les animaux seront hébergés dans un environnement exempt d’organisme pathogène, enrichi à l’aide de coton (pour la nidification), de tunnels de polycarbonate (pour les activités journalières) et de bâtons en bois (pour développer leurs exigences naturelles comme ronger, grimper et se cacher). Les souris seront élevées en communauté. Cependant si cela n’est pas possible (agressivité entre deux souris par exemple), d’autres outils seront disponibles à la demande pour éviter l’ennui si des animaux se retrouvant seuls dans les cages. Pour réduire le nombre de manipulations et limiter le stress des animaux, l’imagerie in vivo sera faite en même temps la mesure du score.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus utilisé car sa génétique est proche de celle de l’homme et elle permet d’avoir des nombres d’animaux suffisants pour faire des tests statistiques. De plus, la souris est un modèle permettant d’effectuer des modifications génétiques relativement facilement. Ces modifications nous permettent d’avoir des modèles immunodéficients nécessaires pour la création de lignée dites humanisées, qui se rapprochent du système immunitaire humain. Pour la constitution des souris humanisé par injection de cellules souche humaines, les animaux seront âgés de 1 à 3 jours car c’est une période durant laquelle la greffe de cellule humaine est la plus efficace. Concernant les greffes de peau/ilots, elles seront réalisées 14 semaines post injection des cellules humaines pour permettre une reconstitution complète du système immunitaire humain. Pour le modèle de greffe d'ilots sur souris partiellement humanisées, les animaux seront greffés à l’âge de 8 à 12 semaines.
Mise en place d’un modèle murin de xénogreffes de lignées humaines de myélome multiple (MM) pour étudier l’impact de molécules à visée thérapeutique dans le MM.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
664 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent un conditionnement chimique par hydroxyurée ou busulfan, une greffe de cellules humaines de myélome par voie intra-fémorale ou intraveineuse, puis quatre semaines de traitements par gavage quotidien et injections, avec prélèvements sanguins hebdomadaires et imagerie sous anesthésie, pour tester des molécules ciblant la protéine PIM2. Le porteur décrit un suivi du développement tumoral jusqu'à l'apparition de signes comme la perte de poids et la léthargie, sans détailler de test comportemental. Sur le remplacement, il affirme que le microenvironnement tumoral ne peut être reproduit in vitro et conclut au caractère "indispensable" du recours à la souris, les retombées pour les patients restant au conditionnel.
Objectifs
Le myélome multiple (MM) est un cancer du sang (hémopathies) parmi les plus fréquents, en deuxième position après les lymphomes. Il représente 1% de la totalité des cancers et environ 10% des hémopathies. Malgré l’apparition de nouveaux traitements, le MM reste aujourd’hui une maladie incurable avec une médiane de survie moyenne à 6 ans (Rapport InVS 2018). Des travaux ont montré que la surexpression de la proteine PIM2 dans les cellules tumorales du MM était associée à une maladie plus agressive et à une survie réduite pour les patients. Le ciblage thérapeutique de la protéine PIM2 ouvre donc de nouvelles perspectives thérapeutiques dans cette maladie. Des tests in vitro ont été réalisés au sein du laboratoire montrant l’efficacité de molécules pour inhiber la protéine PIM2 dans les cellules de MM et induire la mort des cellules. L'expérimentation animale est cependant rendue indispensable du fait de l'impossibilité de reproduire le microenvironnement tumoral in vitro et de mener ce type d'exploration directement chez l'Homme. Notre projet a pour objectif d’utiliser un modèle murin de xénogreffe de lignées de MM pour tester différentes molécules ciblant la protéine PIM2. Les traitements que nous voulons tester sont d’une part des inhibiteurs chimiques de la protéine PIM2 (utilisés seuls ou en association avec d'autres inhibiteurs) et, d’autre part, une thérapie de type ARN qui inhibe le gène PIM2. Globalement, ce projet consiste à implanter, chez des souris immunodéprimées, des cellules de lignées de myélome multiple (MM) humaines dans le but de pouvoir étudier la progression tumorale après injection de molécules à visée thérapeutique dans le MM.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’établir de nouveaux modèles murins de myélome pertinents pour reproduire la pathologie humaine et pour tester de nouvelles thérapeutiques dans le MM. La première étape permettra de déterminer les meilleures conditions d’implantation des cellules de MM chez une souris immunodéficiente avec une prise de greffe permettant un développement tumoral durable, et la deuxième étape caractérisera précisement la progression et dissémination tumorale dans les conditions définies comme optimales à l’étape 1. Enfin, grâce à ces étapes d'optimisation, nous pourrons évaluer à l’étape 3, l'impact de traitement inhibant la protéine PIM2 sur la progression tumorale. Nous testerons deux nouvelles possibilités de traitement ciblant cette protéine, soit au moyen d'association d'inhibiteurs chimiques, soit au moyen d'une thérapie ARN originale, toutes deux jamais testés à ce jour dans le MM. Ces stratégies thérapeutiques pourraient trouver leur place dans la prise en charge des patients atteints de MM.
Procédures
Pour obtenir des modèles murins fiables et robustes des myélomes humains, les souris devront recevoir un conditionnement unique par traitement chimique par hydroxyurée ou busulfan (20 sec par voie intrapéritonéale) puis une greffe unique de cellules tumorales humaines par voie intra-fémorale (5 minutes) ou à défaut, dans le sang par voie intraveineuse en rétro-orbital (20 sec) ou caudal (1 minutes). Les traitements évalués seront administrés sur une durée totale de 4 semaines selon des protocoles différents. L'une des molécules (les anti-MCL1) sera administrée 1 fois par semaine par voie intraveineuse en rétro-orbital (20 sec) ; l'autre molécule (les inhibiteurs de PIM) sera administrée quotidiennement par gavage (30 sec). Enfin dans le cadre du suivi de ces animaux greffés, des prélèvements de sang hebdomadaires en submandibulaire (1 minutes) à partir de la 2eme semaine post-greffe seront réalisés ainsi que des analyses par imagerie bioluminescence, méthode non invasive réalisée après injection intrapéritonéale du substrat (20 sec) dès l'étape 2, au plus tôt une semaine après la greffe et au maximum une fois par semaine.
Impact sur les animaux
Le maintien de ces souris en hébergement protégé permettra de prévenir tous les risques d’infection. Egalement le développement tumoral peut engendrer un affaiblissement de l'animal, c'est pourquoi les souris expérimentées seront observées très régulièrement pour détecter l'apparition de signes de myélome (perte de poids, léthargie, dos courbé...).
Devenir
A l'issue de toutes nos expérimentations (une fois toutes les procédures cumulées réalisés sur les animaux), tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les organes d'intérêt pour mener nos investigations en terme de dissémination et infiltration tumorale chez l'animal.
Remplacement
Le projet est basé sur des études préliminaires in vitro ayant démontrées l'efficacité de nos différentes molécules (inhibiteurs chimiques et oligonucléotide) pour induire la mort des cellules de MM (cellules de lignées de MM et cellules primaires de patients atteints de MM). Le microenvironnement tumoral ne peut être reproduit in vitro du fait de sa complexité, de nombreux acteurs impliqués dans le développement tumoral et la résistance aux traitements. Il est par ailleurs impossible de conduire ce type d’expérimentation chez l’Homme rendant indispensable le recours à des modèles murins.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (moelle osseuse, rate et sang) pour réaliser les différentes analyses sur un même animal. Aussi, avant de mener les expérimentations à visée thérapeutique nécessitant des lots d’animaux importants (10 animaux par lots), les choix des conditions expérimentales seront étudiés en amont sur des lots réduits mais suffisants (6 animaux par lots) afin de trouver la technique la plus optimale en termes de prise de greffe : choix du type de souris (NSG, RagGC ou BRGS), du type de conditionnement (hydroxyurée, busulfan ou irradiation) et enfin du type d’injection (intra-veineuse ou intra-fémorale). Des combinaisons de conditions vont être testées successivement à l'étape 1 (en commençant par les plus relevantes au regard de notre expérience) et si une s'avère pertinente et validée, nous ne testerons pas les autres. Les tailles des groupes de souris sont choisies de façon à permettre une interprétation des données statistiquement valides, que l’expérimentation soit donc réalisée de façon productive et sans nécessiter d’avoir à refaire ces tests. Les statistiques seront réalisées à l’aide de tests non paramétriques car la normalité de la loi sur la population considérée n'est pas certaine. Pour les échantillons indépendants, le test de Mann-Whitney sera appliqué. Pour les échantillons appariés, le test de Wilcoxon sera utilisé. Pour les comparaisons de plus de 2 groupes, les tests non-paramétriques de Kruskal-Wallis (pour les échantillons indépendants) ou de Friedman (pour les échantillons appariés) seront utilisés avec le test de comparaison multiple de Dunn pour comparer chaque groupe par rapport à un groupe contrôle.
Raffinement
Afin de raffiner les conditions de vie des animaux, un suivi régulier et adapté des souris a été instauré afin de soulager voire supprimer l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Pour cela des soins pré-, per- et post-opératoires adéquats seront réalisés. Les interventions de chirurgie sont réalisées sous anesthésie générale et des traitements analgésiques seront systématiquement utilisés pour prévenir toute douleur. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des conditions adaptées et bénéficient d’un enrichissement adapté, à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, de l'eau et de la nourriture ad libitum, ainsi qu'un maximum de 5 animaux/cage (aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage). La technique de suivi non-invasif par imagerie bioluminescente nous permettra de réaliser une caractérisation en cinétique de nos modèles de façon non douloureuse tout en réduisant le nombre d'animaux nécessaire à une caractérisation en cinétique. Aussi, un suivi strict sera établi afin de détecter toute souffrance animale potentielle avec une surveillance quotidienne de l’état général des animaux (posture et comportement) réalisé par le personnel de l’établissement et une surveillance bihebdomadaire de l’état de santé (suivi du poids et score de grimace) réalisé par le responsable du projet.
Choix des espèces
Seul un modèle à l'échelle d'un organisme vivant peut reproduire la complexité des interactions entre les cellules tumorales et les cellules du microenvironnement et permet d'être au plus près de l'effet obtenu chez l'homme lors du test de nouvelles thérapeutiques. Les souris sont de bons modèles d'étude, notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-tumoraux, de par leurs facilitées d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leur similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Le développement de xénogreffes de tumeurs humaines chez la souris nécessite l’utilisation de souris sévèrement immunodéprimées pour permettre la prise tumorale. Plusieurs lignées murines sont parfaitement adaptées à ce type de greffes, notamment les RagGC (RAG2-/- IL2 gammaC-/-), les NSG (NOD SCID IL2gammaC-/-) ainsi que les BRGS (BALB/c RAG2-/- IL2gammaC-/- SIRPA.NOD) que nous testerons à l’étape 1. L’espèce avec laquelle nous obtenons la meilleure prise de greffe sera alors utilisée pour l’ensemble des expérimentations aux étapes 2 et 3. L’expérimentation sera commencée sur des animaux à partir de 6 semaines jusqu'à 5 mois de vie. La durée de l’expérimentation chez ces animaux n’excèdera pas 12 mois.