Rongeurs

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumises à un régime riche en graisse, elles reçoivent huit poudres de tomate différentes pendant douze semaines, avec prélèvements sanguins sur animal éveillé, tests de tolérance au glucose et à l'insuline, perçage des oreilles et isolements répétés. Le porteur décrit un objectif appliqué, améliorer les effets santé de la tomate en combinant choix de variétés, pratiques de culture et technologie alimentaire. Il affirme que l'étude d'une supplémentation alimentaire ne peut s'envisager que sur un modèle vivant.

Objectifs

La tomate est une des productions agricoles les plus importantes en termes de volume de production et de portée économique. Sa consommation, notamment sous forme de poudre de tomate, est associée à des effets bénéfiques pour la santé métabolique, mais son profil nutritionnel et sa teneur en micronutriments dépend du génotype et des conditions de production. L’objectif du projet est de mieux comprendre l’impact du génotype de tomate et du déficit d’irrigation sur la qualité nutritionnelle des poudres de fruit et les conséquences que cela va engendrer en terme de santé métabolique chez la souris. Pour ce faire, 4 génotypes de tomate ayant subit 2 niveaux d'irrigation et présentant des profils contrastés en phytomicronutriments seront lyophilisés (8 poudres différentes en tout) puis administrés à 180 souris C57Bl/6J (8 groupes de 9 souris mâles et 9 souris femelles supplémentés et 2 groupes de 18 souris contrôles) durant 12 semaines, dans le cadre d'un régime riche en graisse. Une prise de sang sera réalisée à 6 semaines, ainsi qu'un test de tolérance à l'insuline à la 9eme semaine et un test de tolérance au glucose ainsi qu'un test de perméabilité intestinale à la 10eme semaine. Les fèces seront également récoltés et le microbiote des animaux sera analysé.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux évaluer l’impact du génotype et des conditions de culture de poudre de tomate sur les effets sur la santé métabolique. Ce projet s’insère dans un projet plus large qui permettra in fine d’améliorer les effets santé de la tomate avec une combinaison innovante du choix de génotypes, de pratiques culturales et de technologie alimentaire.

Procédures

Des prélèvements de sang sur un animal vigile seront réalisés. Pour ce faire, les animaux seront mis sous contention durant environ 2 minutes. Un test de tolérance à l'insuline et un test oral de tolérance au glucose seront pratiqués. Le déroulé du test nécessite ensuite une mise en isolement des animaux de 2 heures afin de suivre l'évolution de leur glycémie. Un test de perméabilité intestinale sera réalisé. Lors de la procédure, 3 recueils de fèces nécessitant d’isoler temporairement (environ 30 minutes) l’animal seront effectués.

Impact sur les animaux

Stress social lié à l'isolement de l'animal de ses congénères. Douleurs possibles lors des interventions de prélèvements sanguins, de perçage des oreilles pour l'identification des animaux lors des injections d'insuline. Ces nuisances ou effets indésirables toutes temporaires et réversibles sont associés à des mesures de raffinement (enrichissement de la cage, manipulation régulière des animaux, soins apportés si nécessité).

Devenir

Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'intérêt seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques) et de démontrer les effets métaboliques de la supplémentation en poudre de tomate.

Remplacement

L’étude d’une supplémentation en poudre de tomate sur la santé métabolique ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Les souris C57Bl/6J sont un modèle largement utilisé et reconnu pour les études sur le métabolisme.

Réduction

Le nombre d'animaux (18 par groupe, soit 9 par sexe) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes de manière sexe-dépendante, notamment en ce qui concerne la prise de poids. Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé sur la base d’une étude similaire sexe-dépendante et déterminée avec la variation du poids (variable quantitative) comme résultat principal de l’étude.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 3, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en fonction des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arrêt.

Choix des espèces

Le modèle souris est un modèle reconnu pour les études portant sur l’obésité et les pathologies associées. Les mécanismes d’adaptation à une alimentation riche en matière grasse chez la souris sont très proches des mécanismes observés chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.

82 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des rats porteurs de la mutation de la myopathie de Duchenne et des rats sains reçoivent une injection intraveineuse d'un vecteur de thérapie génique, puis des prélèvements sanguins mensuels et un prélèvement terminal, pour tester de nouveaux promoteurs censés cibler le traitement sur les muscles. Le porteur justifie le choix du rat en écartant la souris, au phénotype jugé trop peu marqué, et le chien, jugé trop lourd à manipuler. Les bénéfices annoncés pour les patients, des doses plus faibles et moins de toxicité, sont renvoyés au conditionnel.

Objectifs

La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique liée au chromosome X affectant environ 1 garçon sur 5000 à la naissance. Elle est due à des mutations dans le gène DMD qui code pour une protéine appelée Dystrophine. La Dystrophine est essentielle au fonctionnement et au maintien de l’intégrité de l'ensemble des muscles de l'organisme (y compris le coeur). L’absence de Dystrophine dans les muscles provoque leur dégénérescence progressive, une faiblesse musculaire, la perte de la marche avant 15 ans, l’apparition de déficiences respiratoire et cardiaque, et, finalement une mort prématurée. Aucun traitement n’est disponible à ce jour pour la DMD. La thérapie génique, qui vise à corriger ou remplacer le gène DMD est aujourd’hui une approche prometteuse pour le traitement de cette maladie. Pour réaliser un transfert de gène efficace, il est possibile d'utiliser des vecteurs viraux dérivés des Virus Adéno-Associés (AAV) produits en laboratoire dans des systèmes cellulaires. Ils assurent un transfert de gène thérapeutique sûr et efficace dans différents tissus/organes (oeil, muscle, foie ou cerveau). Les AAV sont des produits thérapeutiques performants mais des essais précliniques et cliniques ont montré des limites à leur utilisation, avec notamment la nécessité d'utiliser de fortes doses, et un transfert de gène dans certains tissus non ciblés (tissus non musculaires), avec un risque de toxicité associé. Une approche pour contrer cet effet secondaire indésirable des vecteurs AAV repose sur l'utilisation, dans ces vecteurs AAV de séquences d'ADN particulières (appelées promoteurs "tissus-spécifiques"), qui vont permettre de restreindre le traitement uniquement dans les tissus ciblés dans la pathologie à traiter, soit, dans le cadre de la Dystrophie Musculaire de Duchenne, dans les muscles squelettiques et le coeur. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité et la spécificité de nouveaux promoteurs "muscle-spécifiques" portés au sein de vecteurs AAV. Cette évaluation se fera chez le rat DMDmdx, modèle animal pertinent de la DMD, mais également chez le rat sain, afin d'évaluer les potentielles différences d'activité de ces promoteurs entre un tissu pathologique et un tissu sain.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra d'identifier un (ou plusieurs) promoteurs "muscle-spécifiques" et de rendre les traitements utilisant les vecteurs de thérapie génique de type AAV beaucoup plus sécuritaires et plus efficaces: plus sécuritaires via le ciblage du traitement uniquement dans des tissus ciblés (ici les muscles), et plus efficaces car permettant d'obtenir un effet théraputique à une plus faible dose de vecteur AAV que celles actuellement utilisées. Une réduction des doses à injecter permettra de réduire la toxicité associée à l'injection de ces fortes doses, et de réduire le coût du traitement. L'identification de tels promoteurs "muscle-spécifiques" aura une application directe pour le traitement des patients atteints de DMD à l'aide de vecteurs AAV. De plus, si ces promoteurs montrent la même efficacité dans les muscles sains et dans les muscles dystrophiques, il pourra alors être envisagé de les utiliser dans des vecteurs AAV thérapeutiques visant à traiter d'autres types de maladies musculaires.

Procédures

(i) Injection intraveineuse réalisée dans une veine caudale: geste réalisé une fois par animal sous anesthésie. Durée de l'intervention: maximum 10min. (ii) Prélèvements sanguins au niveau d'une veine jugulaire le jour de l'injection, puis une fois par mois jusqu'à la mise à mort de l'animal (2 prélèvements pour les animaux suivis 2 mois post-injection, et 4 prélèvements pour les animaux suivis 4 mois post-injection). Prélèvements effectués sous anesthésie, pour un volume correspondant à 7.5% maximum du volume sanguin circulant de l'animal. Durée de l'intervention: maximum 10min. (iii) Prélèvement sanguin terminal au niveau de la veine cave. Ce prélèvement précèdera la mise à mort des animaux.

Impact sur les animaux

(i) L'injection intraveineuse réalisée dans une veine caudale se fera sous anesthésie et ne provoquera donc pas de stress ou de douleur aux animaux. Les animaux seront surveillés après leur réveil par un examinateur. La récupération devrait être rapide. Par ailleurs, l’injection intraveineuse d’un vecteur viral chez le rongeur est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable. Il a été en effet documenté dans de nombreuses études que l’injection systémique d'un tel vecteur chez le rongeur est très bien tolérée. (ii) Prélèvements sanguins mensuels au niveau d'une veine jugulaire: les animaux pourraient être stressés par les anesthésies, mais celles-ci seront espacées d'au moins 4 semaines, et les animaux seront surveillés après leur réveil par un examinateur. La récupération devrait être rapide. (iii) Prélèvement sanguin terminal au niveau de la veine cave : pas de stress ou de douleur pour les animaux, puisque cet examen sera réalisé sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Ce prélèvement précèdera la mise à mort des animaux.

Devenir

A l'issue de la procédure décrite dans ce projet, tous les animaux de cette étude seront euthanasiés afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses moléculaires et immunohistologiques nécessaires au projet. Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l'animal.

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l’efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n’est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires (différents tissus: muscle squelettique, coeur, foie et autres tissus majeurs). Ce projet, qui vise à évaluer l'efficacité et la spécificité d'éléments géniques régulateurs, à la fois dans un contexte malade (DMD) et un contexte sain, et dans plusieurs tissus différents, ne peut donc être réalisée in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Il est basé sur notre expérience précédente de précédents projets sur le modèle de rats DMDmdx, lors desquels des résultats d'analyses moléculaires et immunohistologiques cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de cette taille. Pour les rats DMDmdx, nous nous laissons la possibilité d'inclure un animal supplémentaire par groupe (avec un maximum de 10 animaux DMDmdx supplémentaires sur l'ensemble de l'étude), en cas de sacrifice prématuré d'un animal du fait de l'évolution de la maladie chez ces animaux avec phénotype dommageable.

Raffinement

Le bien-être animal passera notamment par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu (mise à disposition de tunnels en cartons ou PVC, frisottis de papier, bûchettes de bois), un hébergement à deux animaux (par groupe expérimentaux), accès à l’eau et à l’alimentation à volonté. 2) un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative) 4) Afin d'améliorer la réactivité du personnel animalier, une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates. 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).

Choix des espèces

Il existe un modèle de rat possèdant un défaut génétique dans le gène codant pour la protéine Dystrophine, le rat DMDmdx. Dans ce modèle animal de la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD), l’expression de la dystrophine est nulle et le phénotype sévère. Les modèles animaux atteints de cette maladie les plus classiquement utilisés : souris déficientes en dystrophine (souris mdx) et chien Golden Retriver déficient en dystrophine (chien GRMD), présentent des limites pour les projets pré-cliniques : -La souris mdx ne reproduit que partiellement les lésions tissulaires avec un phénotype peu marqué. -Le chien GRMD présente des lésions tissulaires proches de celles des patients atteints de la Dystrophie Musculaire de Duchenne et un phénotype sévère, mais reste un modèle "gros animal" lourd à manipuler. Le rat DMDmdx est donc un modèle intermédiaire avec un bon reflet de la pathologie humaine, tout en présentant moins de limitations. Afin de comparer les résultats obtenus dans un contexte sain et un contexte dystrophique, des rats sains de type Sprague Dawley (même fond génétique que les rats DMDmdx) seront utilisés. Les animaux seront injectés à l'âge de 1 mois au niveau de la veine caudale. C'est un âge auquel les animaux sont considérés comme "juvéniles", et mimant donc le stade auquel des patients DMD pourraient être injectés lors d'un futur essai clinique (enfants ou jeunes adolescents, pré-pubères). Les animaux injectés seront ensuite suivis sur une durée de soit 2 mois, soit 4 mois après injection pour documenter l’efficacité du traitement à 2 temps différents. Ce planning nous garantira de pouvoir effectuer l’intégralité du protocole chez tous les animaux inclus, sans atteindre un âge critique où la dégradation de l'état de santé due à la maladie pourrait devenir sévère. En effet, cette myopathie est associée à une dégradation progressive de l’état général de l’animal. Cette dégradation devient sévère (troubles locomoteurs, douleurs à la manipulation) pour la plupart des animaux au delà de 8-9 mois.

70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par une alimentation à 60 % de lipides, elles reçoivent chaque jour pendant douze semaines un composé par voie orale, avec prélèvements sanguins après jeûne et hébergement individuel, pour le compte d'un laboratoire client préparant un médicament contre l'obésité. Le porteur indique que la perte de poids peut devenir une nuisance si elle est trop rapide, et prévoit une mise à mort pour prélever les organes. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier ces régulations métaboliques.

Objectifs

L'obésité dans le monde a plus que triplé depuis 1975, pour atteindre plus de 1 milliard de personnes obèses aujourd'hui, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Dans ce contexte, notre client souhaite évaluer l'effet des nouveaux composés sur les symptômes liés à l'obésité chez les souris obèses (induites par une alimentation enrichie en graisses). Notre entreprise mènera, pour le compte de notre client, une étude in vivo visant à évaluer les effets des composés clients sur la prise alimentaire, le poids corporel et le métabolisme du glucose chez la souris obèse. Une première étude pilote, réalisée par le laboratoire pharmaceutique client de l'étude, a montré que ces composés induisent une perte de poids corporel associée à une diminution de prise alimentaire. L’objectif de la présente étude sera de confirmer et de compléter ces résultats préliminaires en évaluant l’impact à plus long terme de ces composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et la régulation glycémique chez des souris soumises à une alimentation enrichie en graisses (HFD; 60% de l'énergie fournie par les lipides). A termes, ces données seront incluses dans un dossier de demande d'autorisation d'essais cliniques dans le but d'obtenir une autorisation sur le marché d'une nouvelle classe de médicaments visant à traiter les troubles métaboliques.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour objectif de constituer un dossier de demande de premier essais cliniques chez l'humain dans le but d'obtenir une autorisation de mise sur le marché d'un composé thérapeutique luttant contre l'obésité et les troubles métaboliques associés.

Procédures

Les animaux seront pesés régulièrement et leur prise alimentaire mesurée. Ces mesures durent environ 2-3 minutes. Des prélèvements sanguins sont prévus après 4 heures de mise à jeun. Les prélèvements en eux même durent environ 3 minutes. Des mesures de composition corporelle non-invasives seront réalisées. Ces mesures sont rapides (

Impact sur les animaux

La nécessité de mesure individuelle de la prise alimentaire implique l'hébergement individuel des animaux. Etant donné leur phénotype attendu, les souris seront obèses. Toutefois, la perte de poids induite par l'administration des composés d'intérêt peut être une source de nuisance si celle-ci s'avère trop rapide. D'autre part, des prélèvements sanguins avec mise à jeun préalable de 4h, les administrations quotidiennes per os pendant 12 semaines, les mesures de composition corporelles et le test de tolérance au glucose (avec une mise à jeun de 8h préalable) peuvent être source de nuisance pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issu de l'étude afin de collecter des organes d'intérêt. Des analyses biochimiques seront réalisées a posteriori sur ces derniers.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et la régulation glycémique dans les cas de troubles métaboliques. En effet, les paramètres physiologiques impactés impliquent une communication hormonale et nerveuse entre différents organes qui produit des effets au niveau de l'ensemble des cellules de l'organisme et il n'existe pas à l'heure actuelle de modèle non animal capable de reproduire ou de prédire l'impact d'un composé sur ces phénomènes de régulation.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05. Les paramètres étudiés sont les suivants : poids corporel, gain de poids corporel (en g et %), prise alimentaire, prise alimentaire cumulée, efficacité alimentaire (Gain de poids en g/Prise alimentaire cumulée en g), composition corporelle (mesures de la masse de tissu gras, de la masse de tissu maigre et de la masse de fuides non liés), test de tolérance au glucose (glycémie, insulinémie et aires sous la courbe), glycémie à jeun, insulinémie, HOMA-IR et HOMA-b (résistance à l'insuline et fonction des cellules b du pancréas) et les poids des différents organes. Dans le cadre des groupes expérimentaux obèses, le nombre d'animaux a été fixé à 12/groupe en prenan également en compte l'hétérogénéité du modèle, certains animaux présentant naturellement une résistance à l'induction de l'obésité. Concernant le groupe témoin du modèle d'obésité (Groupe 1, nourri avec la nourriture sandard et traité au véhicule), nous avons réduit le nombre à 10 animaux.

Raffinement

Le modèle animal utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles mais conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos et de matériels de nidification. Concernant les prélèvements sanguins, un anesthésique local sera appliquée sur la queue des souris 30 minutes avant. Avant les mesures de composition corporelle, les animaux seront préalablement habitués au système. Pour les mesures de glycémie, la mise à jeun préalable sera limitée à 4h afin de limiter l'inconfort. Concernant les traitements, ceux ci seront réalisés par des expérimentateurs rodés à geste expérimental en utilisant des canules souples pourvues d'embouts en silicone. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6J nourries avec une alimentation enrichie en graisse (60%) est un des modèles de souris le plus classiquement utilisé et le mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge de jeune adulte adulte au début des traitements (7 semaines d'âge). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie, puis une seconde pour une mini-pompe délivrant de l'angiotensine, afin d'étudier le remodelage des artères sous hypertension et le rôle de gènes de la famille PI3K. Le porteur indique des douleurs modérées post-opératoires, minorées par des antalgiques, et une mise à mort pour prélèvement d'organes. Il présente la souris comme la "seule" espèce disposant des modèles génétiquement modifiés utiles et le recours à l'animal comme un "complément indispensable" des études in vitro.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires sont particulièrement incidentes chez les patients présentant des pathologies sous-jacentes telles que l'hypertension. Un des processus responsable de la grande majorité des accidents vasculaires est l'athérosclérose. L’athérosclérose va se développer dans différentes zones artérielles, obstruer le vaisseau et dans les étapes ultimes de la maladie provoquer des infarctus du myocarde ou des accidents vasculaires cérébraux. Afin de limiter ce risque, la technique d’angioplastie (pose de "stents") a alors été développée afin de rétablir la lumière du vaisseau. Elle consiste en la pose d’un stent actif, délivrant des substances médicamenteuses, dans le vaisseau endommagé. Cet acte chirurgical est associé à un traiement médicamenteux pour prevenir les rechutes en particulier chez les patients hypertendus. Cependant, des phénomènes de résistance à ces molécules ont été observés. Dans ce contexte, notre équipe se propose donc d'étudier le role des genes de la famille des PI3K dans le remodelage arteriel dans un contexte d'hypertension pour ameliorer ces traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence les cibles médicamenteuses pertinentes et efficaces pour lutter contre les complications cardiovasculaires régulièrement retrouvées chez les patients hypertendus.

Procédures

Les animaux seront soumis à une ou deux interventions chirugicales selon les cas. La première intervention chirurgicale pour implanter la puce de télémetrie dure environ 30min. 1 semaine apres la pose de la puce de la télémetrie, les animaux subiront une deuxième chirurgie de 15 min consistant à la pose en sous cutanné d'une mini-pompe.

Impact sur les animaux

Les deux procédures chirurgicales induisent la pose de 3 sites de sutures sur le thorax et 1 à l'arriere de la tête. Ces actes chirugicaux peuvent entrainer des douleurs modérées post-opératoires qui seront minorées par des antalgiques et les risques d'irritations et de demangeaisons seront minorés par utilisation d'antiseptique.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organe.

Remplacement

L'utilisation de ce modèle animal est un complément indispensable des études in vitro sur des lignées de cellules musculaires lisses que nous avons déjà réalisées au laboratoire. En effet, ces approches de culture cellulaire ne permettent pas d’étudier le remodelage artériel et de mesurer le bénéfice de nos cibles thérapeutiques dans un contexte physiopathologique intégrés prenant en compte l'ensemble des réponses cellulaires mise en jeu au sein d'une artère.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est réduit à son maximum en respectant les contraintes de publication, sans compromettre les objectifs du projet et pour permettre de bonne analyses statistiques. Le nombre de souris utilisé est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs et est donc précisé dans chaque procédure en fonction de la variabilité obtenue des protocoles expérimentaux mis en jeu. La télémetrie permet de diminuer le nombre d’animaux enrolés dans ce protocole en augmentant significativement le niveau de fiabilité et de reproductibilité des mesures de tension arterielle.

Raffinement

Quelle que soit la procédure utilisée, une observation des animaux en expérimentation est réalisée quotidiennement. L’état général de l’animal est évalué : prise de nourriture, toilette et mouvements habituels sont considérés comme des signes de bonne santé. La douleur est évaluée par les signes de prostration, de perte d’appétit ou de poids et de mouvements pénibles. L’environnement des animaux est enrichi (bandes de papier Sizzle-Nest pour la nidification, cube de bois pour usure des dents mais pas de tunnel ou d'igloo pour éviter à l'animal de se bloquer avec la pompe alzet), pour éviter l’angoisse et eventuellement faciliter l'acces à la nourriture et à l'eau en placant des croquettes humidifiées et de l'hydogel dans la cage. Si les points limites déterminés par le responsable de l'étude sont atteints, nous déterminerons avec la SBEA et le vétérinaire les soins ou l'action à appliquer pour réduire la souffrance animale.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris, seule espèce animale pour laquelle il existe des modèles animaux génétiquement modifiés pour nos cibles pharmacologiques. Les complications cardiovasculaires en condition d'hypertension font intervenir des mécanismes intégrés qui ne sont pas modélisables par des approches in vitro. L’expérimentation animale est donc une approche complémentaire aux études in vitro, permettant d’utiliser des modèles animaux susceptibles au développement des pathologies vasculaires. Enfin, plusieurs des cibles pharmacologiques potentielles seront validées en utilisant des modèles animaux génétiquement modifiés. Les souris seront utilisées à l'âge de 8 à 20 semaines, au stade jeune adulte car il est nécessaire que leurs systemes cardiovasculaire, immunitaire et métabolique soit entièrement developpé et mature.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire une ataxie cérébelleuse humaine, elles subissent un génotypage puis des tests comportementaux répétés, dont un passage dans un bassin de nage à 27 degrés, pour évaluer un composé pharmacologique avant et après l'apparition des symptômes. Le porteur indique une fatigue musculaire de courte durée et un stress liés aux tests, et suit les animaux sur plusieurs mois avant une mise à mort pour prélèvement de tissus. Il affirme que sa lignée avec délétion du gène est le "seul" modèle animal reproduisant la maladie.

Objectifs

Ce projet vise à étudier une ataxie cérébelleuse d’origine génétique qui se manifeste chez les patients par une ataxie cérébelleuse avec une évolution lente et progressive pouvant être associée à une intolérance à l’exercice, un retard mental faible à modéré, des crises d’épilepsie et des pseudo-épisodes vasculaires cérébraux. Le laboratoire a developpé un modèle de souris avec délétion totale du gène qui reproduit la pathologie humaine. Ainsi, l’objectif de ce projet est de tester sur ce modèle l’efficacité d’un composé pharmacologique dans deux approches pré- et post-symptomatiques.

Bénéfices attendus

Le bénéfice de ce projet est de mettre en place des essais pré-cliniques qui, s’ils s’avèrent concluants, déboucheront sur un transfert de ces essais vers la clinique dans le but de traiter les patients atteints de cette ataxie dégénérative.

Procédures

Ce projet comprend : - Une étape d’identification et génotypage des animaux qui aura lieu une fois entre l’âge de 2 et 3 semaines. - Une étape incluant des tests comportementaux sera réalisée sur les animaux vigiles. La durée de ces tests est comprise entre 30 secondes et 5 minutes.

Impact sur les animaux

Procédure avec degré de gravité modérée : Les animaux peuvent avoir une fatigue musculaire de courte période, seront mouillées après passage dans un bassin de nage à 27°C. Pourront avoir un stress lié aux tests comportementaux.

Devenir

Dans ce projet, les animaux qui seront etudiés à différents âges seront replacés dans leur cage entre chaque série de tests afin d’assurer l’étude longitudinale sur un même lot d’animaux. A la toute fin des études, les animaux seront mis à mort pour prelevement de tissus.

Remplacement

En parallèle de la création d’un modèle animal de la maladie, les alternatives non-animales (in vitro) ont été utilisées en première intention par notre équipe pour étudier les mécanismes pathologiques. Nous venons de démontrer l’efficacité du traitement proposé dans ce projet à l’aide d’une autre approche in vitro. Ces approches ne peuvent remplacer l’utilisation d’animaux et l’appréciation globale du bénéfice du traitement chez le modèle animal de la maladie car ce n'est que le reflet d'un seul type cellulaire, or la maladie impacte plusieurs organes (cervelet, muscles). La création du modèle animal et son étude in vivo permettra de définir les conditions optimales de transfert du traitement chez le malade. La souris avec délétion du gène que nous avons développé est le seul modèle animal reproduisant la maladie et permettant d’apprécier l’efficacité de traitements pharmacologiques.

Réduction

Toutes les procédures sont conçues pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, tout en tenant compte du nombre minimum nécessaire pour appliquer les tests statistiques adaptés. Les travaux de notre équipe et les données préliminaires nous permettent d’estimer le nombre de souris pour avoir une valeur statistique suffisante (10 souris par condition pour les différentes analyses). Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, autant que possible, nous effectuerons une étude sur un même lot d’animaux à différents âges et les mêmes animaux seront utilisés pour réaliser les différentes analyses.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans les conditions standard d’hébergement et l’environnement sera enrichi (igloo polycarbonate, rouleau de cellulose,...). Tout au long des procédures, un suivi régulier des animaux sera réalisé (une à deux fois par semaine). Il nous permettra de s’assurer du bon vieillissement des animaux au fil des mois. Ce suivi est basé sur la mise en place de points limites et méthodes de prise en charge d’éventuel stress et douleur spécifiques à notre projet. Certains prélèvements impliquent une mise à mort sous anesthésie générale et une fixation des tissus.

Choix des espèces

Avec 98% d’identité protéique avec l’Homme, la souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et la génétique sont bien connues. Les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. La nécessité d'utiliser des souris génétiquement modifiée est liée à l'absence de modèle mammifère naturel correspondant à la maladie humaine. Par ailleurs, nos données de l’étude du modèle murin avec délétion totale du gène montrent que ce modèle reproduit les caractéristiques pathologiques necessaires pour tester des solutions thérapeutiques. Les souris étudiées dans le cadre d’une administration pré-symtomatique de l’agent pharmacologique seront étudiées de l’âge de 1 mois à l’âge de 6 mois. Les souris étudiées dans le cadre d’une administration post-symtomatique de l’agent pharmacologique seront étudiées de l’âge de 4 mois à l’âge de 14 mois.