Rongeurs

660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur des voies aérodigestives leur est implantée, puis traitée par des virus oncolytiques et des anticorps, avec prélèvements sanguins répétés. Le porteur reconnaît que la croissance des tumeurs peut provoquer un inconfort et une perte de poids. Il présente ces données précliniques comme un jalon "indispensable" avant un éventuel passage chez l'Homme.

Objectifs

Les cancers des voies aérodigestives supérieures (VADS) affectent plus de 500 000 patients par an dans le monde. Ils sont souvent liés à la consommation de tabac et/ou d’alcool et, plus récemment, à l’infection par certains papillomavirus humains. D’une manière générale, ces cancers présentent un mauvais pronostic avec une survie à 5 ans d’environ 50%. Les traitements par chirurgie, radiothérapie ou chimiothérapie restent insuffisamment efficaces et sont associés à d’importants effets secondaires du fait notamment de la localisation de ces cancers. Ces données soulignent l’urgence de la mise au point de nouveaux traitements. Parmi ceux-ci, la virothérapie consiste en l'injection d'un virus dont le génome est modifié pour se répliquer sélectivement dans les cellules tumorales et les tuer tout en épargnant les tissus normaux. Ainsi, il a été montré que l’adénovirus oncolytique pouvait lyser des lignées de cellules de carcinomes de VADS et conduisait à une réduction de la croissance tumorale dans un modèle murin de xénogreffes de tumeurs humaines. Ces résultats ont été obtenus dans un modèle murin immunodéficient ce qui ne permettait pas d’aborder la question des propriétés immunostimulantes des adénovirus oncolytiques. Nos objectifs sont d’évaluer l’efficacité thérapeutique de différents adénovirus oncolytiques dans un modèle murin immunocompétent de tumeurs de VADS. Nous émettons l’hypothèse que l’administration in situ des adénovirus oncolytiques en (1) induisant la destruction des cellules tumorales et donc le relargage des antigènes tumoraux et en (2) reprogrammant le microenvironnement tumoral devrait favoriser l’induction de réponses immunitaires contre les antigènes tumoraux. De plus, (3) l’immunité préexistante contre l’adénovirus pourrait être mise à profit pour recruter et rediriger des lymphocytes au sein de la tumeur.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à apporter la preuve de concept de la capacité des adénovirus oncolytiques à déclencher, du fait de leur réplication dans les tumeurs, un remodelage de l’environnement tumoral dans les VADS et à favoriser l’établissement de réponses immunitaires anti-tumorales. Il permettra également de tester si une immunité anti-adénovirus préexistante peut être redirigée vers une, réponse immune anti-tumorale. Enfin, le projet permettra également d’établir l’intérêt de combiner la virothérapie à base d’adénovirus oncolytique avec une immunothérapie à base d’anticorps anti-point de contrôle du système immunitaire. Les données pré-cliniques obtenues dans les modèles murins syngéniques sont un jalon indispensable avant de pouvoir envisager l’utilisation chez l’homme, dans les cancers des voies aérodigestives supérieures, de combiner la virothérapie à base d’adénovirus oncolytique avec une immunothérapie à base d’anticorps.

Procédures

Tous les animaux recevront une injection de cellules tumorales après dépôt d’un anesthésique topique (durée 1 minute). Certains animaux auront des prélèvements de sang sous anesthésie à l’isoflurane (durée 3 minutes). Ces prélèvements auront lieu toutes les semaines avec un maximum de 4 prélèvements . Certains animaux auront d'autres injections après dépôt d’un anesthétique topique (durée 1 minute). Ces injections seront répétées sur 3 jours consécutifs et ensuite une fois par semaine . Certains animaux recevront une administration d’adénovirus ou d’anticorps après dépôt d’un anesthésique topique (durée 1 minute). Cette administration sera unique pour le virus et répétée chaque semaine pour les anticorps (avec un maximum de 3 injections).

Impact sur les animaux

Toutes les procédures impliquent l’administration de lignées tumorales chez la souris. Les injections de cellules tumorales ou de virus se faisant après anesthésie à l’isoflurane ou anesthésie locale à la lidocaïne, il n’est pas attendu de souffrance des animaux à ces étapes. Le développement de tumeurs après l’administration des lignées tumorales va conduite à la croissance de tumeurs. Ces tumeurs peuvent, lorsqu’elles atteignent une certaine taille, conduire à des effets secondaires, un inconfort, voire une perte de poids.

Devenir

Les animaux seront tous porteurs de tumeurs, ils devront donc tous être euthanasiés.

Remplacement

Le but de ce projet est de déterminer l'efficacité d'injections intratumorale d’adénovirus oncolytiques couplés ou non à des administrations d’anticorps afin de tuer les cellules tumorales et de remodeler l’environnement tumoral pour générer des réponses immunitaires anti-tumorales. Comme il n’est pas possible à ce jour de reproduire toutes les fonctions des molécules et cellules du système immunitaire du corps entier par des méthodes alternatives, l’utilisation de d'animaux vivants est indispensable.

Réduction

Dans toutes les expériences, nous avons cherhcé à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Compte tenu de la littérature et de notre expérience de l’utilisation des adénovirus et des modèles de tumeurs, nous avons pu déterminer le nombre mnimal d'animaux à utiliser par condition testée. Ce nombre nous permettra d’évaluer la significativité des résultats obtenus (comparaison entre plusieurs groupes faite par une analyse de variance suivie d’un post-hoc test pour les comparaisons entre 2 groupes). Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, les différentes procédures seront mises en œuvre séquentiellement. Ainsi, la première procédure permettra d’établir les paramètres de croissance des lignées et les procédures suivantes ne seront mises en œuvre pour une lignée tumorale donnée que si la première procédure a été concluante.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans un environnement enrichi (nid, maison, tunnel). Toutes les injections réalisées seront réalisées sous anesthésie locale. Les prélèvements sanguins seront tous réalisés sous anesthésie générale . Dans la mesure du possible, les souris seront déplacées de leur cage vers l’appareil à anesthésie en utilisant des tunnels pour éviter de les prendre par la queue. Les souris seront suivies quotidiennement. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Le modèle murin (souris), avec son génome similaire au génome humain à 99%, constitue, après les primates non humains, un modèle de référence pour les pathologies humaines. L’espèce utilisée est la souris. Le choix de cette espèce pour ce projet se base sur 2 arguments : - la disponibilité des lignées cellulaires caractéristiques nécessaires à ce projet, qui ont été développées dans cette espèce de souris ; - la possibilité d’analyser les réponses immunitaires anti-tumorales. Les animaux commandés seront des adultes de 6 à 8 semaines ce qui correspond à des animaux avec un système immunitaire mature. Ces animaux seront acclimatés durant une semaine avant d'être inclus dans le protocole.

112 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 62 tuées pour prélèvements et 50 ramenées en élevage. La moitié est isolée pendant sept jours pour accroître leur agressivité avant un test où les animaux peuvent se battre et se blesser, l'autre test mesurant l'anxiété. Le porteur reconnaît le risque de blessures physiques et le stress social de l'isolement. Il justifie l'usage d'un "organisme entier" par la détection de phéromones, l'application visée étant une apaisine commercialisable pour l'élevage et les animaux de compagnie.

Objectifs

Les phéromones apaisantes maternelles sont des substances chimiques libérées par les glandes sébacées situées dans la région mammaire de la mère, peu après la mise-bas et durant la lactation. Il a été montré que ces phéromones ont des effets apaisants sur la progéniture, et également à l’âge adulte. Leur identification a permis une application pratique de ces « apaisines » en élevage ou chez les animaux de compagnie, pour faciliter la gestion de situations stressantes.. Préciser et comprendre comment ces phéromones agissent, notamment au niveau neurobiologique, immunologique, et de l’expression des gènes est un axe de recherche important dans lequel s’inscrit ce projet et qui nécessite le choix d’un modèle animal sur lequel plusieurs études fondamentales peuvent être facilement menées compte-tenu des outils d’analyse disponibles et des connaissances scientifiques actuelles. La souris est apparue comme le meilleur modèle au vu de l’existence de kits de dosages de neurohormones utilisables et validés, de kits de séquençage des gènes préconçus et la connaissance de plusieurs gènes de référence, et de l’anatomie fonctionnelle du cerveau et du système immunitaire de cette espèce. Au préalable, il est nécessaire d’évaluer/vérifier l’effet des substances chimiques composant la formule des apaisines sur le comportement des souris, notamment leur anxiété et agressivité. Si cette étude s’avère concluante et qu’un tel effet apaisant est confirmé, le projet devrait être poursuivi afin d’investiguer les impacts des apaisines sur la physiologie des souris et les mécanismes qui y sont liés. Outre les connaissances biologiques apportées par une telle recherche sur le plan fondamental, le projet a également un but applicatif plus direct. En effet, les souris comptabilisent près de 64% des animaux utilisés pour la recherche dans des conditions de vie potentiellement anxiogènes (milieu de vie relativement pauvre, stress dû aux manipulations…). Pour une meilleure fiabilité des données scientifiques et pour des raisons tout simplement éthiques, il est important de s'assurer de leur bien-être et de raffiner au mieux leur qualité de vie : l’installation de diffuseurs de phéromones apaisantes dans les animaleries expérimentales pourrait contribuer à l’amélioration de leur bien-être. L’utilisation des apaisines pourrait également être étendue à la sphère domestique pour les souris détenues comme animaux de compagnie.

Bénéfices attendus

Ils sont de 2 natures. Au niveau fondamental, cette étude permettra ensuite la réalisation d’autres études visant à investiguer le mécanisme d’action des apaisines et plus généralement de la communication chimique. Les mammifères terrestres s’appuyant sur la détection et l’interprétation des signaux chimiques de leur environnement pour guider leur comportement, notamment sociaux, cela est primordial pour leur survie et leur reproduction. Il est donc essentiel de connaître et comprendre les mécanismes d’action de la communication chimique. Cela est aussi nécessaire pour conforter l’utilisation actuelle des apaisines chez les animaux de compagnie et de rente. Au niveau appliqué, la confirmation de l’effet apaisant des substances testées permettra de développer une apaisine de souris qui pourra être ensuite directement utilisée dans les élevages à des fins scientifiques ou dans la sphère domestique pour les souris détenues comme animaux de compagnie. En effet, en France, 64% des animaux utilisés à des fins scientifiques sont des souris. S’intéresser au bien-être des individus hébergés dans ce cadre est essentiel : les raisons sont non seulement éthiques, mais elles concernent également la validité des résultats scientifiques – tout stress pouvant influer sur l’état mental et physique d’un individu et ainsi biaiser les résultats obtenus. De plus, assurer le bien-être des animaux utilisés à des fins de recherche est une exigence réglementaire. En fonction des recherches menées sur les animaux (limitant plus ou moins l’enrichissement du milieu de vie), diverses améliorations peuvent être mises en place ; c’est notamment dans ce cadre que s’inscrit la présente étude. En effet, si celle-ci confirme les effets apaisants de la formule de phéromone testée sur les souris (en diminuant leur anxiété et agressivité), le produit pourrait être diffusé dans les animaleries de recherche et ainsi contribuer au raffinement des conditions de vie. Il est également possible d’étendre l’utilisation des apaisines à la sphère domestique, par exemple lorsqu’un particulier adopte une nouvelle souris, afin de faciliter son adaptation à son nouvel environnement.

Procédures

La moitié des animaux (n=56) seront exposés au traitement apaisine, pendant toute la durée de l'étude (7 semaines), mais il n'est pas attendu de nuisances suite à cette exposition. Tous les animaux (n=112) subiront une fois chacun deux tests comportementaux (l’un durant 10 min et mesurant le niveau d’anxiété, l’autre durant 5 min mesurant le niveau d’agressivité) : ils peuvent être source d'angoisse/anxiété, stress psychologique, voire blessures, même si des dispositions sont prises pour éviter ces dernières. La moitié des animaux (n=56) subiront un isolement rapport à leur condition d'hébergement pendant 7 jours, qui peut être source de stress psychologique, mais qui est nécessaire en amont du test comportemental mesurant l’agressivité Une partie des animaux (n=62, 12 provenant de l'étude pilote et 50 provenant de l'étude principale) subiront une anesthésie générale par voie gazeuse au cours de laquelle sera effectué un prélèvement sanguin juste avant leur mise à mort. Cette intervention ne devrait pas durer plus d'une minute.

Impact sur les animaux

Durant la présente étude, les souris sont hébergées dans des conditions standards de laboratoire, ce qui peut engendrer plus ou moins de stress en fonction des individus dépendant de leur sensibilité et de la compatibilité des groupes formés. Certaines souris (n=56) font exception, étant isolées pendant sept jours pour les besoins du test comportemental mesurant l’agressivité dans des cages similaires mais plus grandes : cet isolement peut engendrer un stress social également, ces animaux étant sociaux et ayant toujours vécu en groupe. Cette durée a été choisie car conseillée dans la littérature afin d’accroître leur territorialité et donc leur agressivité envers un intrus. Ce test dure cinq minutes et constitue un stress social aigu. L’agressivité probable des souris faisant consensus dans une telle situation, les individus peuvent se battre plus ou moins violemment ; il y a donc un risque de blessures physiques. L’autre test comportemental a quant à lui été conçu pour évaluer l’anxiété des souris : celles-ci seront donc dans un état potentiellement anxieux durant les dix minutes du test, le fait que le dispositif soit surélevé avec deux branches non protégées par des murs constituant une source d’anxiété. Durant les essais, il y a également un stress de manipulation à prendre en compte, les souris appréciant peu le contact humain Le traitement lui-même, diffusé dans les salles, n’est pas sensé créer d’effet indésirable sur les souris, bien que cela soit surveillé tout au long de l'étude. La manipulation précédant l’anesthésie gazeuse pourrait être source de peur et représenter une nuisance, de courte durée cependant avant la perte de conscience de l’animal.

Devenir

Tous les animaux de l’étude pilote (n=12) sont immédiatement mis à mort à la suite du 2nd test comportemental pour les besoins de la suite du projet, c’est-à-dire la mise au point de méthodes de dosages à partir du volume de sang prélevé. Pour l’étude principale, les 50 souris qui auront subi un isolement rapport à leur condition d'hébergement pendant 7 jours sont mises à mort immédiatement à la suite du 2nd test comportemental, pour l’évaluation des paramètres du projet c’est-à-dire la réalisation des dosages de corticostérone et sérotonine. Les 50 souris ayant continué à être hébergées en conditions standard sont gardées en vie : elles seront ramenées en élevage après le 2nd test comportemental et seront utilisées ultérieurement pour de nouvelles mises au point méthodologiques, en fonction des résultats obtenus dans la présente étude.

Remplacement

Il s’agit notamment d’une étude de recherche fondamentale investiguant les mécanismes d'action physiologiques de la phéromone apaisante maternelle (apaisine). En tant qu'étude de physiologie, elle doit nécessairement porter sur des êtres vivants, qui représentent des systèmes biologiques intégrés, où de multiples organes/tissus fonctionnent de façon associée et coordonnée. En effet, l’utilisation de traitement phéromonal est une stimulation sensorielle par exposition à des phéromones qui nécessite l’utilisation d’organisme entier pouvant détecter et réagir aux composés testés. La détection de ces composés peut engendrer une cascade de réactions physiologiques pouvant mener à une modification du comportement ou de la physiologie de l’animal. Cela ne peut être obtenu et observé que sur animaux entiers pouvant pleinement exprimer leurs comportements et physiologies naturels. Il n'existe pas actuellement de méthodes de remplacement pouvant simuler ces changements suite à une stimulation sensorielle. Cela nécessite donc l’implication d’êtres vivants, dans ce cas des souris.

Réduction

L’effectif des animaux utilisés a été défini grâce à des tests statistiques de calcul de taille d’échantillons nécessaires, avec une puissance statistique de 90%, à partir de données issues d’études publiées. Selon ces calculs, en moyenne, en fonction des données mesurées, un effectif de 44 souris par traitement doit permettre d’observer une différence significative (si elle existe) entre les 2 groupes de l’étude principale (placebo vs. apaisine). 6 souris par condition ont été ensuite ajoutées pour pallier les pertes qui pourraient survenir pendant l’élevage, aboutissant à 50 animaux/groupe, soit 100 animaux au total pour l’étude principale. Une étude pilote est aussi prévue en amont, permettant l’entraînement et l’ajustement logistique et organisationnel des équipes sur un petit nombre d’animaux, qui vise à optimiser les chances de réaliser un essai probant scientifiquement : un effectif de 6 souris/groupe est estimé suffisant pour s’entrainer à la procédure, soit 12 souris au total pour l’étude pilote. Un effectif total de 112 souris est donc nécessaire. Aussi, du matériel biologique prélevé sur les souris de l’étude pilote étant utilisé pour mettre au point les méthodes d’analyse, cela maximise l’utilisation des animaux et contribue à la réduction du nombre d’animaux impliqués dans la recherche.

Raffinement

Concernant l’hébergement, les cages sont nettoyées 1 fois/semaine et aménagées pour répondre aux besoins de l’espèce, comprenant notamment de la litière (copeaux), eau et nourriture ad libitum, des enrichissements comme brique en bois pour ronger, tunnel et cabane en carton pour se cacher, fibres de kraft et coton pour nidifier, et des tapis anti-bruit dans les salles d’élevage. Grâce à une grille d’évaluation du bien-être, les animaux sont surveillés quotidiennement par du personnel qualifié afin de s’assurer d’un état clinique normal et de l’absence de signes de souffrance (par exemple : état du pelage, évaluation de la nidification, présence du comportement fouisseur, absence de comportement anormaux). Un arbre décisionnel basé sur les critères d'arrêt de souffrance est mis en place au cas où des signes de souffrance seraient constatés et les points limites adaptés atteints. Pour manipuler les souris, l’utilisation d’un tunnel de manipulation a été choisie pour limiter le stress. Toutes les manipulations ont lieu pendant la période d’activité des souris au laboratoire (après-midi), et sous lumière rouge (imperceptible) pour respecter leur activité nocturne. Une période d’habituation pré-test à la salle de 30min est réalisée. La présence physique des expérimentateurs dans les salles d’expérimentation sera réduite à son minimum au cours des observations comportementales qui seront vidéo-enregistrées. La ponction sanguine est réalisée sous anesthésie générale. La mise à mort est effectuée sur animal anesthésié en emmenant chaque souris dans une pièce dédiée du laboratoire, hors de la vue/ouïe/odorat de congénères pour éviter toute communication de stress entre individus.

Choix des espèces

L’objectif est de valider les effets comportementaux (anxiété et agressivité) des phéromones apaisantes maternelles (apaisines) sur les souris, pour étudier ensuite leur mode d’action, notamment au niveau neurobiologique, immunologique, et de l’expression des gènes. La souris est apparue comme le meilleur modèle au vu de l’existence de kits de dosages de neurohormones utilisables et validés, de kits de séquençage de gènes préconçus et de la connaissance de plusieurs gènes de référence, de l’anatomie fonctionnelle du cerveau et du système immunitaire de cette espèce. Développer des apaisines chez cette espèce revêt également un intérêt. La souche choisie est connue pour son caractère plus manipulable, moins anxieux et agressif pour limiter les risques de blessures lors des tests comportementaux. Elles ont un comportement maternel plus prononcé, ce qui, pour les apaisines, semble plus pertinent. Aussi, rapport aux études immunologiques envisagées ensuite, ces souris développent une réponse immunologique plus variée et représentative. Les souris impliquées dans l’étude sont des adultes. Elles ont 2 mois pour 56 d’entre elles et 3 mois pour les 56 autres. Le fait qu’une partie d’entre elles soient plus âgées devrait permettre à ces souris d’être plus grosses et plus dominantes envers les autres, et donc d’exprimer plus fortement le comportement agressif/territorial recherché. Le choix de sélectionner des adultes permet également d’étudier des souris susceptibles d’exprimer une diversité de comportements de leur espèce. De plus, ces animaux auront déjà une expérience sociale : ainsi, un isolement pour les besoins du test comportemental mesurant l’agressivité aura hypothétiquement moins d’effets délétères que sur des souris tout juste sevrées; cependant, les recherches sur l’impact d’un isolement à cet âge sur le bien-être des individus manquent à ce jour pour confirmer cette hypothèse.

Pour caractériser la pharmacocinétique de produits destinés à la mise sur le marché, médicaments ou agents de contraste, 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit le produit testé une ou plusieurs fois, par la veine, sous la peau, dans le muscle, l'abdomen, la trachée, le nez, l'œil ou par la bouche, le porteur disant faire "un effort" pour ne pas dépasser cinq injections. Dans l'œil, l'injection peut provoquer un glaucome ou une perte de vision, et dans le coussinet de la patte, elle peut gêner la marche jusqu'à l'eau et la nourriture. Pour une partie des études, une souris peut subir le premier jour jusqu'à dix acquisitions d'imagerie sous anesthésie générale, puis trois par jour les trois jours suivants, une par jour jusqu'au dixième jour et deux par semaine ensuite. Le porteur juge l'expérimentation animale "nécessaire" faute de méthode capable de reproduire la biodistribution "dans un organisme vivant", et résume le bénéfice attendu en une phrase : contribuer "à la mise sur le marché de nouveaux produits".

Objectifs

L’autorisation de mise sur le marché (AMM) d’un produit (médicament, agent de contraste…) nécessite au préalable de caractériser notamment sa pharmacocinétique et sa pharmacodynamique. La pharmacocinétique consiste à évaluer l’absorption, la diffusion, la métabolisation et l’excrétion du produit par l’organisme. Elle permet notamment d’améliorer les dosages et la posologie du produit par l’étude de sa concentration sanguine au cours du temps. Elle permet également de déterminer les voies d’administrations optimales selon la métabolisation du produit dans l’organisme. La pharmacodynamique consiste quant à elle à évaluer les effets du produit sur l’organisme. Ce projet a pour objectif de caractériser la pharmacocinétique et la pharmacodynamique après administration de produits chez la souris. Le recours à l’imagerie médicale (imagerie à rayons X ou imagerie optique) dans ce projet permettra de suivre au cours du temps la distribution de produits radio-opaques, rendus fluorescents ou bioluminescents de manière quantitative et spatiale. Cette méthode d’analyse présente l’avantage d’être non-invasive, nécessitant seulement une anesthésie générale. Elle permet également de suivre un même animal au cours du temps et donc de diminuer l’impact de la variabilité individuelle sur les résultats et de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Il n’existe pas de méthode alternative à l’heure actuelle permettant de modéliser de manière fiable l’évolution et les effets d’un produit dans un organisme vivant. Le recours à l’expérimentation animale est donc nécessaire à l’objectif de ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à la mise sur le marché de nouveaux produits.

Procédures

Les animaux recevront une injection unique ou répétée (selon la voie) du produit test par voie intravasculaire (intraveineuse) ou extravasculaire (sous-cutanée, intramusculaire, intrapéritonéale, intratrachéale, intranasale, per-os ou intravitréenne) en respectant les volumes d’injections recommandés. Lors d’injections répétées, un effort sera fait pour ne pas excéder 5 injections maximum par animal. Sur animaux vigiles, les injections sont réalisées en quelques secondes (temps inférieur à 1 minute), en comptant l’anesthésie la durée est d’environ 5 minutes. Des examens micro-scanner ou d’imagerie optique pourront également être réalisés sous anesthésie générale. Un examen micro-scanner peut aller jusqu’à 20 minutes, celui de fluorescence est d’en moyenne 5 minutes, la fréquence des examens sera de : - maximum 10 acquisitions par jour le premier jour puis, - maximum 3 acquisitions par jour pendant les 3 jours suivants puis, - maximum 1 acquisition par jour jusqu’au 10ème jour puis, - maximum 2 acquisitions par semaine jusqu’à la fin de l’étude pour la procédure n°1. - Maximum 2 acquisitions par semaine jusqu’à la fin de l’étude pour la procédure n°2. Pour les examens de bioluminescence, la durée est d’en moyenne 5 minutes, les fréquences seront de : - maximum 2 acquisitions par jour les 3 premiers jours puis, - maximum 2 acquisitions par semaine jusqu’à la fin de l’étude pour la procédure n°1. - Maximum 2 acquisitions par semaine jusqu’à la fin de l’étude pour la procédure n°2. Une injection de luciférine sera faite avant chaque acquisition de bioluminescence. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés sur animaux anesthésiés au maximum 1 fois par semaine jusqu’à la fin de l’étude en respectant les volumes éthiques. Un prélèvement s’effectue en moyenne en 1 à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront présenter des réactions différentes selon les produits testés et selon les voies d’administration, pouvant entrainer l’apparition de signes cliniques (risque de déshydratation et pertes de poids liées aux éventuelles anesthésies répétées, inflammation des sites d’injection). Certaines voies d’administration sont plus inconfortables que d’autres et nécessitent une prise en charge analgésique pré et post injection : sous-cutanée dans le coussinet du pied qui peut gêner la locomotion de l’animal et donc l’accès à l’eau et la nourriture et les injections intravitréennes pouvant altérer la vision (glaucome ou perte de vision de l’œil injecté). Dans tous les cas, des mesures adaptées sont mises en place.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole. Tout organe pertinent pourra être prélevé après mise à mort de l’animal afin de réaliser une quantification des produits par imagerie ex-vivo (micro-scanner ou imagerie optique) ou par d’autres techniques in-vitro.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire afin de pouvoir caractériser la pharmacocinétique et notamment la biodistribution d’un produit dans un organisme entier vivant (modélisation d’une situation clinique). Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable la biodistribution d’un produit dans un organisme vivant.

Réduction

L’avantage de l’imagerie médicale est de suivre les mêmes animaux au cours du temps et donc de diminuer le nombre d’animaux utiles au projet. Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant d’étudier la biodistribution du produit testé, des groupes d’au moins 6 animaux seront constitués. Si nécessaire, des études pilotes pourront être réalisées sur un nombre limité d’animaux (3 par groupe minimum) afin de confirmer la visualisation d’un produit marqué en in-vivo par exemple.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 6 jours minimum sera respectée. Les animaux seront hébergés en cage de manière collective durant toute la durée de l’étude (sauf exception en cas de bagarre ou blessure et pour les animaux background (BKG)), avec des enrichissements appropriés (abris, matériel de nidation, bois à ronger…). Selon les études, les animaux BKG pourront être hébergés collectivement ou individuellement. Les souris BKG sont des animaux contrôles (généralement non injectés) utilisés comme référence pour mesurer le bruit de fond des acquisitions d’imagerie optique. En cas d’hébergement individuel, les cages seront organisées de manière à permettre à minima un contact visuel avec les animaux adjacents et un enrichissement supplémentaire (ex : mouchoir) sera apporté. Ce type d’hébergement présente l’avantage de mieux vérifier la prise alimentaire et l’abreuvement de chaque animal, et ainsi vérifier leur état général. Au cours de l’étude, les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout signe clinique anormal et ainsi prendre le plus rapidement possible, les mesures nécessaires : mesure de soutien (désinfection de plaies, isolement, réchauffement, etc…) ou la mise à mort des animaux ayant un état clinique jugé moribond. Le poids des animaux sera mesuré tout au long des études et pourra être complété par un scoring des signes cliniques généraux (comportement général de l’animal pour déceler une éventuelle apathie, la réponse à la stimulation, l’état de son pelage (soyeux ou en pilo-érection), présence d’écoulement nasaux et oculaires, difficultés respiratoires) ou en lien avec la voie d’administration pour les injections dans les coussinets (inflammation, lésion, nécrose du site d’injection, difficulté dans la locomotion et le déplacement pour atteindre l’eau et la nourriture) et intravitréenne (inflammation, lésion au site d’injection, gêne à l’œil injecté : œil-mi-clos, fermé ou glaucome). Ces observations serviront à établir un score total permettant d’évaluer l’état de santé général des animaux. Des examens cliniques approfondis pourront également être réalisés. Toute anomalie clinique sera rapportée au vétérinaire responsable du suivi. Les signes cliniques observés seront pris en charge (injection de fluides, analgésiques, antibiotiques, etc…) dans la mesure où les actions n’interfèrent pas avec les produits injectés (en fonction des connaissances des produits).

Choix des espèces

Le modèle souris a été choisi : - Pour sa taille réduite et parce qu’il permet l’utilisation de technique d’imagerie du corps entier, - Car il s’agit d’une espèce couramment utilisée pour étudier la pharmacocinétique et pharmacodynamique en expérimentation animale et permettant de travailler sur des lots homogènes (âge et sexe fixés). Des souris de plus de 6 semaines seront utilisées au cours de ce projet (stade jeune adulte) afin de s’affranchir de la période de forte croissance de l’animal et d’avoir des animaux présentant un poids d’environ 20g.

1 158 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées au plus tard 30 heures après leur infection. Sans anesthésie, chacune reçoit dans l'abdomen une injection d'Escherichia coli résistantes aux antibiotiques, qui déclenche une septicémie dès deux heures, puis une injection d'antibiotique sous la peau du cou toutes les deux heures pendant 24 heures. Les antibiotiques testés, dont le céfidérocol, sont déjà utilisés chez l'humain en dernier recours, et l'équipe veut vérifier qu'ils restent efficaces contre de grandes quantités de bactéries. Sa grille de points limites cote la posture voûtée, le poil hérissé et la prostration, et le porteur écrit qu'"Aucune douleur n'est à attendre".

Objectifs

Il est urgent de développer de nouvelles molécules antibiotiques pour lutter contre les bactéries ultrarésistantes. Parmi elles, Escherichia coli (E. coli) est la bactérie la plus fréquemment responsable d’infections urinaires et digestives et d’infections généralisées (septicémies) chez l’homme. Elle est aussi parmi les plus touchées actuellement par la résistance aux antibiotiques, avec parfois plus aucun antibiotique efficace (bactéries ultrarésistantes). De nouveaux antibiotiques ont été très récemment développés et ont montré leur efficacité pour tuer certaines bactéries ultrarésistantes. Ces antibiotiques ont montré leur efficacité au laboratoire dans des tubes à essai contre des souches de E. coli ultrarésistantes, mais chez l’homme, faute de données d’efficacité suffisamment nombreuses et du fait d’échecs de traitement rapportés chez certains malades, ces antibiotiques ne peuvent être utilisés qu’en dernier recours et lorsque le recours aux autres options disponibles n’est pas envisageable. On dispose actuellement de très peu de travaux de recherche sur l’utilisation de ces nouveaux antibiotiques, notamment peu de choses sur leur efficacité quand il y a une quantité importante de bactéries (appelé « inoculum important »). L’étude de l’efficacité des antibiotiques sur des quantités de bactéries différentes se fait au laboratoire « in vitro » c’est-à-dire dans des tubes à essai, mais l’utilisation de modèles vivants sont pour l’instant indispensables pour prendre en compte aussi les défenses immunitaires des êtres vivants et des paramètres de distribution dans le corps de l’antibiotique. C’est pourquoi avant de les tester chez l’homme il est nécessaire de faire des expériences chez l’animal, en l’occurrence la souris. L’objectif de notre travail est l’analyse de l’efficacité de ces nouveaux antibiotiques sur des quantités de bactéries différentes (ou inoculum différent) pour s’assurer qu’ils restent efficaces même pour tuer de grandes quantités de bactéries. Nous utilisions pour ces expériences un modèle d’infection intra abdominale de la souris qui provoque une septicémie et avec lequel on peut faire varier la quantité de bactéries. L’efficacité des antibiotiques sera évaluée en termes de survie des animaux infectés et nombre de bactéries présentes apres traitement au niveau de la rate des animaux (qui correspond à ce qui se trouve dans le sang).

Bénéfices attendus

Les résultats de ce travail pourront permettre de mieux définir les conditions de l’utilisation de ses molécules chez l’Homme et comprendre pourquoi parfois elles ne marchent pas.

Procédures

Les souris seront infectées par une injection dans le ventre (intra péritonéale) à l'aide d'une aiguille fine de 250μL contenant un mélange de bactéries sur animal vivant non anesthésié (durée du geste environ 5 secondes) et traitées par antibiotiques par une injection sous la peau du cou de 0,2mL toutes les deux heures (durée du geste 5 secondes). Elles seront surveillées de façon très rapproché puis euthanasiées si elles montrent le moindre signe de souffrance avant la fin de l'expérimentation. Aucun prélèvement ne sera réalisé sur souris vivante. Un prélèvement stérile de liquide péritonéal (2mL) et de la rate seront réalisés après euthanasie de la souris. Un prélèvement sanguin (2mL) par ponction intra-cardiaque sera également réalisé après l’euthanasie.

Impact sur les animaux

Ce modèle représente un modèle de sévérité modérée d’infection péritonéale bactérienne avec septicémie qui apparait à partir de 2h après l’inoculation bactérienne. Aucune douleur n’est à attendre, en revanche les souris peuvent être stressées, avec des signes tels que les poils hérissés et une fatigue.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées à la fin de l'experimentation ou avant en cas d'atteinte d'un point limite pour limiter au maximum des souffrances inutiles. La durée totale est de 30h au maximum (2h infection + 24h traitement + 4h post traitement). Tous les animaux seront mis à mort, car nous aurons à faire des prélèvements des organes et du sang, qui ne peut se faire sur animal vivant.

Remplacement

L’étude de l’efficacité des antibiotiques sur des quantités de bactéries différentes se fait au laboratoire « in vitro » c’est-à-dire dans des tubes à essai, mais l’utilisation de modèles vivants sont pour l’instant indispensables pour prendre en compte aussi les défenses immunitaires des êtres vivants et des paramètres de distribution dans le corps de l’antibiotique. C’est pourquoi, avant de les tester chez l’homme, il est nécessaire de faire des expériences chez l’animal. En effet, la complexité d'une infection in vivo rend pour l’instant le remplacement de ce modèle expérimental par des modèles in vitro (tube à essai) non réalisable.

Réduction

De nombreuses analyses seront réalisées en amont pour réduire les conditions testées et les animaux utilisés. Les analyses déjà réalisées au sein de l’équipe seront une base pour cibler les doses des traitements antibiotiques nécessaires, permettant de limiter le nombre d'animaux utilisés. Toutes les molécules testées sont des antibiotiques. Pour le cefiderocol, une étude de dose (pharmacocinétique) sera nécessaire car cette molécule n’a jamais été utilisée dans le modèle ; en revanche pour l’avibactam et aztreonam l’étude a déjà été réalisée dans notre laboratoire et ne sera donc pas refaite, pour limiter le nombre de souris utilisées. Des souris dites "contrôles", c'est a dire traitées avec des antibiotiques dont on sait qu'ils sont efficaces, seront utilisées, mais ces contrôles ne seront pas répétés à chaque experimentation pour limiter le nombre de souris utilisées. Les organes (rate, liquide péritonéal) seront congelés et conservés à -80°C pour permettre une analyse ultérieure en cas de besoin sans devoir recourir à nouveau à l'expérimentation chez la souris.

Raffinement

En ce qui concerne le raffinement, il sera obtenu grâce au respect d’un délai d’au moins 72h entre l’arrivée des souris au laboratoire et le début de l’expérimentation animale, le respect des conditions optimales d’hébergement des souris en animalerie en portoirs ventilés, c'est à dire en cages adaptées bien ventilées (5 souris par cage) et la surveillance des animaux toutes les 2 heures pendant toute l’expérimentation, avec accès facile à l’eau et à la nourriture. L’apparition de signes chez l’animal de souffrance avec un score de points limites sera surveillée de près. Les délais entre l’infection par les bactéries et le traitement antibiotique sont réduits à deux heures pour limiter le risque de souffrance. L’euthanasie sera programmée 4h après la fin du traitement antibiotique qui dure 24 h, sans attendre de décès spontané, ou avant si des signes de souffrance apparaissent (torpeur, poil hérissé ...). Un score de points a été établi, prenant en compte 3 paramètres, avec à chaque fois une gradation de 0 à 4: la posture normale voutée, voutée+ et voutée ++, la mobilité: normale, altérée, altérée + et prostrée et le poils: sans atteinte, hérissés, hérissés + et hérissés ++. Le point limite est atteint si la somme des points est > ou = à 6 ou si le score de 3 est atteint pour la mobilité ou la posture. En cas d’atteinte du point limite, l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

La souris est un animal vertébré dont l’anatomie et la physiopathologie de l’infection intrapéritonéale sont suffisamment proches de celle de l’homme pour autoriser l’étude des thèmes mentionnés plus haut. La souris est l’espèce la plus utilisée par la communauté scientifique internationale dans la thématique de l’infection intra-péritonéale. Les souris utilisées ont 8 semaines (environ 25 grammes). Ce sont des animaux adultes pour utiliser des souris de poids suffisant.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est immobilisé dans un tube de contention pendant quinze à trente minutes pour recevoir un aérosol, puis reçoit trois anesthésies et injections pour l'imagerie. Le porteur reconnaît que la contention et l'immobilisation répétées sont des sources de stress. L'objectif se limite à comparer deux types de générateurs d'aérosol pour le transfert de gènes vers le poumon.

Objectifs

Nous voulons ici optimiser notre système d'aérosol actuel pour évaluer l'efficacité de transfert de gènes chez le petit animal de formulations issues de nos recherches et de la littérature. L'objectif de ce projet est de pouvoir évaluer l'impact du générateur d'aérosol sur le transfert de gènes appliqué aux poumons. Sur les différents générateurs d'aérosol existants, deux grands types sont majoritairement utilisés en clinique, le générateur pneumatique et le générateur à tamis vibrant. La différence principale entre ces deux générateurs est le mécanisme mis en jeu pour générer l'aérosol. En effet, un générateur pneumatique permet, sous l'effet d'un gaz comprimé, de transformer une solution liquide en microgouttelettes alors qu'un générateur à tamis vibrant utilise une grille de maillage plus ou moins fin et vibrant à haute fréquence pour transformer une solution liquide en microgouttelettes. Dans le cas présent, ces différences physiques jouent sur l'efficacité de transfert de gènes de nos formulations à base de vecteurs synthétiques. Bien que des tests de comparaison d'aérosol des formulations sur culture cellulaire aient été réalisés, il reste nécessaire d'effectuer des tests chez le petit animal de ces mêmes formulations afin de prendre en compte toute la complexité des voies respiratoires pulmonaires lesquelles ne peuvent pas être reproduites en conditions in vitro.

Bénéfices attendus

Ce projet à pour but de déterminer quel générateur d'aérosol est le plus optimal pour l'introduction d'un gène contrôle (ici un gène de bioluminescence) grâce à des vecteurs non viraux dans des cellules du poumon. Les résultats obtenus nous permettraient d'optimiser notre système de nébulisation actuel afin d'obtenir les meilleurs résultats possibles et donc, à terme, diminuer le nombre d'animaux nécessaire pour nos prochaines expérimentations.

Procédures

Chaque animal subit une procédure d'aérosolisation dans un tube limitant ses mouvements. L'aérosol contient soit la solution contenant le gène d'intérêt ou soit du sérum physiologique pour les deux groupes contrôles. Le processus d'aérosol peut durer entre 15 à 30 minutes et donc l'animal devra rester immobilisé durant toute cette période. Une mesure de la lumière émise par les poumons sera réalisée au lendemain des aérosols puis au troisième et septième jour. Les animaux auront une injection d'une durée maximale de 30 secondes suivi d'une anesthésie et d'une mesure de la lumière à proprement parlé d'une durée de 10 minutes. Cette procédure sera réalisée trois fois (J1, J3 et J7). En fin de procédure, les animaux auront une injection d'une durée maximale de 30 secondes d'une solution contenant une anesthésie chimique et un anti-douleur cela afin de pouvoir faire un prélèvement de sang au niveau du coeur.

Impact sur les animaux

Du stress sera généré lors des phases d’habituation au système limitant les mouvements de l’animal. Ce temps d'habituation sera répété tous les jours pendant une semaine avant l'aérosol et ne durera pas plus de 30 minutes par souris. Un stress pourra également être induit lors de chaque geste de pesée d'une durée de 30 secondes. Chaque animal sera pesé 10 fois au total lors de la procédure. L'injection du produit de réaction engendrera aussi un stress ainsi qu'une légère douleur d'environ 15 secondes. Au total, chaque animal recevra 3 injections. L'étape d'aérosol est aussi une source de stress à cause du positionnement de l'animal dans le tube de contention limitant ses mouvements et durera entre 15 et 30 minutes en fonction de la solution aérosolisée et du générateur d'aérosol utilisé. Enfin, un stress de quelques secondes pourra être induit lors de la préhention des animaux pour les mettre dans la boite d'induction pour l'anesthésie préalable à l'imagerie. Comme il y a trois imageries (J1, J3, J7), chaque souris recevra au total trois anesthésies.

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements de tissus.

Remplacement

Des études préliminaires de nébulisation de composés à pouvoir transfectant sur des lignées cellulaires ont été réalisées afin de mettre en évidence l'impact du générateur d'aérosol sur l'efficacité de transfection. Cependant, la complexité pulmonaire (respiration, anatomie des poumons...) ne peut pas être obtenu in vitro et nécessite le passage à un modèle souris.

Réduction

Le nombre d'animaux est réduit au maximum pour réaliser cette étude sans nuire aux objectifs initiaux et à l'obtention de tests statistiques robustes.

Raffinement

Une période d'habituation des animaux sera réalisée avec le tube de contention afin de familiariser l'animal à un système qui limite ses mouvements. L'objectif de cette habituation est de diminuer le stress de l'animal et ainsi limiter tout phénomène d'hyperventilation lors des aérosols qui pourrait impacter la qualité des résultats. L'anesthésie gazeuse sera privilégiée à l'anesthésie chimique car elle permet une récupération plus rapide des animaux. Les animaux seront anesthésiés le temps de réaliser l'image soit environ 10 minutes puis remis dans leur cage afin qu'ils puissent récupérer. Sur l'ensemble du projet, les animaux sont anesthésiés une quarantaine de minutes. Les animaux seront surveillés tout le long de la procédure à l'aide d'une grille de soin adaptée.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans cette étude sont des souris. Il s'agit d'une espèce de référence pour ce type d'étude. Les animaux seront receptionnés à l'âge de 6 semaines à l'animalerie. A la suite d'une semaine d'acclimatation, ils pourront intégrer le projet. Les animaux des études précédentes étaient agés de 7 semaines, afin de pouvoir comparer les études entre elles, nous devons garder le même âge pour les animaux.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une neurochirurgie cérébrale, des tests sanguins après jeûne, un examen vaginal quotidien pour les femelles, et sont hébergées seules du début à la fin du projet. Le porteur reconnaît que l'isolement et le jeûne sont des sources de stress et de perte de poids. Il affirme que les interactions entre le cerveau et les organes ne peuvent être modélisées in vitro, l'objectif restant de comprendre le rôle d'un gène dans l'obésité.

Objectifs

Dans le cerveau, un liquide stérile circule dans des cavités appelées ventricules. Dans une region particulière du cerveau, la paroi du ventricule est constituée de cellules particulières que l’on nomme tanycytes. Or, les tanycytes jouent un role dans la balance énergétique, à savoir l’équilibre entre la prise, le stockage et et la dépense de calories, qui détermine le poids corporel. Ce rôle est particulièrement intéressant dans un contexte d’épidémie mondiale d’obésité. En outre, ces cellules produisent une molécule appelée Tbx3, dont le dysfonctionnement dans d’autres types cellulaires est connu pour favoriser le développement de l’obésité et du diabète. Cependant, le rôle de Tbx3 dans les tanycytes est encore mal connu. Notre objectif dans cette étude est d’empêcher la production de Tbx3 par les tanycytes, afin d’en étudier les conséquences sur le poids, la prise alimentaire et le contrôle de la glycémie (taux de sucre dans le sang), en particulier en situation d’alimentation hypercalorique. Nous souhaitons également en étudier les effets sur la maturité et le comportement sexuels, qui sont des fonctions biologiques influencées par les tanycytes.

Bénéfices attendus

Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre le rôle de Tbx3 dans les tanycytes dans le développement de l'obésité et du diabète, en réponse à un régime riche en calories, ainsi que les changements moléculaires associés au niveau cérébral. De plus, les tanycytes sont présents aussi bien chez la souris que chez l’Homme, ce qui renforce la portée translationnelle de ces résultats. Dans une perspective thérapeutique à plus long terme, ces données seront utiles pour des tentatives de restauration de la fonction des tanycytes pour lutter contre l’obésité, dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse.

Procédures

Les 400 souris de ce projet sont concernées par l’ensemble des gestes suivants (sauf indication contraire) : 1) Neuro-chirurgie : cette technique est réalisée sous anesthésie générale, pour une durée totale d’environ 1 heure. Une seule neuro-chirurgie sera effectuée durant toute l’étude. 2) Examen vaginal : cet examen d’une durée d’environ 10 secondes, légèrement invasif, est réalisé quotidiennement pendant 2 semaines, sur des souris adultes vigiles. Seules les femelles sont concernées, pour des raisons évidentes. 3) Analyse de la composition corporelle : cette analyse nécessite l’immobilisation de la souris dans un appareil, pour une durée maximale de 5 minutes, sans anesthésie. Les souris ne subiront cette analyse qu’une fois au cours de leur vie. 4) Tests sanguins : après un jeûne de 3 heures, les souris reçoivent une injection, puis 7 prélèvements sanguins (espacés d’au moins 15 min). Ces tests sont réalisés sans anesthésie. Deux tests seront réalisés sur les mêmes souris, séparés d’une semaine. 5) Hébergement : les souris de cette étude seront hébergées de manière individuelle. L’isolement débutera une semaine avant la chirurgie et se pousuivra jusqu’à la fin du projet.

Impact sur les animaux

L’hébergement individuel des animaux peut être sour ce de stress. Un stress d’immobilisation est également à prévoir lors de l’analyse de la composition corporelle. Les tests sanguins nécessitent au préalable un jeûne de 3 heures, pouvant engendrer une perte de poids le jour suivant. Les prélèvements sanguins réalisés à l’extrémité de la queue peuvent générer une légère douleur et un inconfort. Enfin, des douleurs post-opératoires sont attendues après la neurochirurgie.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort pour des pour réaliser des études moléculaires et biochimiques sur certains organes.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre l’effet de Tbx3 dans les tanycytes sur un ensemble de phénomènes, tels que le poids, la composition corporelle, la régulation de la glycémie, le cycle menstruel et les comportements sexuels. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec différents organes (foie, pancréas, organes sexuels…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante d’une communication entre tous ces acteurs. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire et sexuel nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.

Réduction

Nous avons utilisé un test de puissance statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons regroupé nos différentes expériences sur les mêmes animaux. Le nombre d’animaux que nous demandons est le nombre maximal dont nous estimons avoir besoin. Si nous nous rendons compte en cours de projet que ce nombre peut encore être réduit, il le sera bien évidemment.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 3 semaines et seront habitués pendant au moins 1 semaine. Cette période d’habituation permettra de diminuer le stress des animaux en réponse à l’expérimentateur. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres, de sorte que chaque souris garde un contact visuel avec ses congénères. 3) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier et de bâtonnets en bois pour ronger. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Notre étude nécessite une neuro-chirurgie, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole analgésique approprié. Durant la chirurgie, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Enfin, le traitement anti-douleur se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis, en fonction de différents critères cliniques et comportementaux. Une grille de scores permet de prendre des décisions adaptées en cas de modification de l’état de l’animal. Il peut s’agir soit de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude (après avis vétérinaire), soit de sa mise à mort si rien ne peut être fait pour le soulager.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et le contrôle de la glycémie sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. Enfin, la forte proximité biologique entre l’Homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de la souris un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de cette étude, les tanycytes sont un type cellulaire présent à la fois chez la souris et chez l’Homme, ce qui renforce le potentiel translationnel de nos résultats. Toutes les souris de cette étude arriveront dans notre animalerie juste après leur sevrage (3 semaines). Pour certaines souris, les expériences débuteront au début de leur adolescence (4 semaines) alors que pour d’autres, nous attendrons l’âge adulte (9 semaines), afin de différencier les résultats obtenus à ces différents stades de développement.

2 200 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tués à l'issue et 275 non greffés réutilisés pour de la formation. Une tumeur leur est induite par injection dans le péritoine, parfois précédée d'une irradiation, puis ils reçoivent des composés à tester par voies multiples, avec prélèvements sanguins et imagerie répétés. Le porteur indique que les prélèvements de sang sont le geste le plus stressant et que les animaux greffés ne peuvent plus servir à autre chose. Il décrit les reconstructions de tumeurs en 3D comme marginales et difficilement transposables à l'Homme.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Parmi les cancers, le cancer colorectal est le deuxième plus mortels (plus de 900 000 décès en 2020 pour environ 1,93 million nouveaux cas). Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer coliques déjà mis en place dans notre établissement ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter ces tumeurs viscérales coliques chez l’homme. Pour cela, nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques sur des cancers de la cavité abdomino-pelvienne ou des métastases. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera ainsi possible d’étudier, dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, les mécanismes d’évolution des cancers ou de métastases dans la cavité abdomino-pelvienne. Grâce à ces études et dans un environnement adapté (ajout de cellules immunitaires humaines ou dans un système immunocompétent), il sera aussi possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Un système d’identification sera mis en place sur tous les animaux, sous anesthésie générale (moins de 1 minute, une seule fois). - Selon les modèles, les animaux seront transportés vers le site où ils seront irradiés (une seule fois, 2 heures). - Selon les modèles, un implant sous cutané sera posé sous anesthésie (une seule fois, 5 minutes) - Induction tumorale de tous les animaux sous anesthésie (moins de 1 minute, généralement unique, mais pourra être répétée pour vérifier que la thérapie administrée peut empêcher des récidives). - Test de composés chimiques, biologiques ou traitement par rayons ionisants administrés sous anesthésie générale (moins de 1 minute). Administration orale, intraveineuse, intrapéritonéale et sous cutanée sous contention avec ou sans anesthésie générale (moins de 1 minute). Ces administrations peuvent être uniques ou répétées, comme peut l’être la prise de médicament chez le patient. - Pesée des animaux (moins de 1 minute) - Prélèvements de sang potentiellement répétés en respectant les volumes maximum tolérés : Prélèvements peu invasifs sous anesthésie générale (moins de 1 minute). Prélèvement par piqûre à la veine caudale et marginale de la patte sous anesthésie, possible sous contention (moins de 3 minutes). - Recueil d’urine en hébergement individuel (potentiellement répété, avec isolement (moins d’une heure)). - Techniques d’imagerie, potentiellement répétées : sous anesthésie générale entre 10 et 45 minutes (en fonction des techniques).

Impact sur les animaux

Les gestes techniques suivants induiront un stress léger à l’animal : -Identification des animaux : implantation d’un transpondeur, clips d’oreilles ou tatouage (1 minute) -Transport vers le site où est réalisée l’irradiation (2 heures) -Pose d’un implant Sous Cutané (5 minutes) -Induction tumorale par IP (1 minute) -Radiothérapie (1heure) -Traitements par voies orale, Intraveineuse, intrapéritonéale, sous cutanée (1 minute) -Suivi des animaux par imagerie (sous anesthésie, 1 heure) Les gestes suivants induiront une douleur plus marquée. -Les traitements par voie intramusculaire/intradermique (1 minute) Au début de l’étude, les animaux seront distribués dans des groupes de traitement. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger pendant 1 à 2 jours. La prise de mesure des animaux (poids) induira un stress pouvant être considéré comme faible qui diminuera avec l’habituation (30 minutes) Les prélèvements de sang en cours d’expérience induiront un stress plus important chez l’animal (5 minutes).

Devenir

Les animaux étant porteurs de tumeur et ayant fait l’objet de gestes techniques et reçu des traitements, aucune autre utilisation ne peut être envisagée. Tous les animaux greffés et inclus dans les groupes de traitement seront mis à mort à l’issue de chaque procédure (la méthode utilisée étant l’une de celles autorisées par la Directive 2010/63). Les animaux non greffés et surnuméraires peuvent être réutilisés pour formation.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est le plus faible possible en fonction des objectifs de l’étude et de la puissance statistique nécessaire. Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations des paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations interindividuelles. Entre 10 et 20 études sont réalisées chaque année, mais le nombre peut varier en fonction des demandes. Une étude peut être composée de 1 (dans le cas d’un développement d’un nouveau modèle ou d’amplification tumorale) à 15 groupes. Le nombre d’animaux par groupe peut varier généralement entre 3 et 15, ce nombre sera adapté en fonction de la connaissance interne du modèle ou en fonction des études réalisées dans la littérature. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal. Pour les modèles de cancer dont l’induction est réalisée en intrapéritonéale un nombre d’animaux surnuméraire de 5% pourra être utilisé (pour 100 animaux, 105 seront greffés).

Raffinement

De l’enrichissement sera utilisé dans toutes les cages dès l’arrivée des animaux dans l’animalerie. Les injections/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations vétérinaires en termes d’anesthésie, de volume, fréquence et antalgie. Ces actes seront réalisés sous anesthésie (sauf pour les administrations orales) avec l’analgésie appropriée pour les injections en intramusculaire/intradermique (opiacés). Les traitements par radiothérapie seront faits sous anesthésie générale. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. Les procédures techniques sur les animaux seront réalisées selon les standards validés par le comité éthique. Toutes les procédures seront réalisées par des techniciens formés et dont les compétences ont été validées. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Chaque animal sera observé quotidiennement. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance seront suivis par la structure chargée du bien-être animal. Sous l’autorité du vétérinaire, des antalgiques pourront être prescrits. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître les signes de souffrances et les points limites. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure. Un groupe contrôle d’animaux non porteur de tumeur sera utilisé pour monitorer la prise de poids moyen naturelle des animaux au cours de l’étude. La croissance tumorale de chaque animal sera suivie par la différence de prise de poids de l’animal de l’étude par rapport à la prise de poids moyenne d’animaux non porteur de tumeur. Un pourcentage de prise de poids supérieur à 10% constituera un point limite.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines (modèles xénogéniques) dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à partir de l’âge de 6 semaines afin que leur morphologie facilite l’injection des cellules tumorales. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets secondaires des composés à tester et le développement de la tumeur.