Rongeurs

53 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit deux greffes de tissu adipeux humain sur les flancs, est anesthésiée à quatre reprises pour la chirurgie et des scanners, puis tuée au bout de deux mois pour analyser le greffon, afin de tester un dispositif de lipofilling destiné à être commercialisé. Le porteur relie le projet à un "réel besoin" en chirurgie reconstructrice. Il affirme qu'un modèle in vitro ne peut pas reproduire la rétention du greffon dans un organisme vivant.

Objectifs

Le but de ce projet est de tester le dernier dispositif de lipofilling de notre sponsor. Un modèle de xénogreffes sur souris immunodéprimées a été choisi, en s’appuyant sur la bibliographie existante. 100 xénogreffes (2 par souris, sur 50 souris) seront réalisées à partir du tissu adipeux prélevé sur 10 patients par lipoaspiration à l’aide du nouveau dispositif testé. Un lot de 5 souris sera utilisé pour chaque lipoaspiration. Nous avons décidé de travailler sur un modèle de souris nude, athymique et donc immunodéprimée. Ceci nous permettra de nous abroger des risques de rejet de la greffe. Notre étude bibliographique a permis de mettre en avant divers obstacles au maintien des xénogreffes. Ainsi, tous les paramètres physiques liés aux étapes d'aspiration, de préparation du tissu adipeux mais aussi d'injection influencent la prise de greffe. Les paramètres physiques choisis par notre sponsor seront donc ici testés. De même, divers paramètres biologiques influencent la prise de greffes : le statut des donneurs et la présence de maladies métaboliques notamment. De même, la mise en place d’une vascularisation de qualité améliore la rétention de la greffe et donc son maintien. Les donneurs prélevés lors des liposuccions seront donc exempts de maladies métaboliques et seront tous d’un IMC inférieur à 30. La vascularisation mise en place au niveau de la greffe sera observée après récupération du tissu et coloration. D’autres paramètres seront alors étudiés en histologie (quantité et diamètre des adipocytes dans le tissu greffé, qualité et quantité de la matrice extracellulaire mise en place, présence de zones de nécrose éventuelles, …). Enfin, l’emplacement de la greffe ainsi que son suivi par imagerie a fait l’objet d’une recherche bibliographique. Nous souhaitions pouvoir suivre son évolution et quantifier son éventuelle résorption au fil du temps. Le suivi par micro-CT (examen tomodensitométrique par rayons X) a été mis au point sur un modèle de xénogreffes au niveau du calvarium. Nous souhaitions cependant garder les flancs comme zones de xénogreffes car celles-ci présentent plusieurs intérêts. Cette zone sera donc testée lors d'un premier screening, réalisé sur un premier groupe de 3 souris. L'étude utilisera donc un total de 3+50 = 53 souris sur l'ensemble du projet.

Bénéfices attendus

Cette étude pourrait permettre de valider le nouveau dispositif de lipoaspiration, dans le but de le commercialiser. La technique de lipofilling serait alors utilisée en médecine humaine à la suite d'interventions chirurgicales délabrantes (Tumeurs mammaires par exemple, retrait de masses, ...) pour des chirurgies reconstructrices et répond donc ici à un réel besoin. Une étude clinique sera réalisée en complément de cette étude préclinique afin de valider l'utilisation du nouveau dispositif chez l'homme.

Procédures

Chaque souris sera anesthésiée une première fois (Durée : 30 minutes), dans le but de réaliser les deux xénogreffes (une sur chaque flanc). 4 injections sous-cutanées seront réalisées :1 injection SC d'analgésique sera réalisée le jour de la chirurgie et 3 injections SC d'antibiotiques seront réalisées à raison d'une par jour à partir du jour de la chirurgie. Les souris seront anesthésiées 3 fois de plus (Durée : 10 minutes), afin de les imager (CT-scan). Elles seront enfin mises à mort à la suite de la dernière imagerie donc au bout de 2 mois afin de récupérer le tissu greffé pour analyses.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues de cette étude sur les 53 souris utilisées seront : - Les deux xénogreffes réalisées sur les souris, à raison d'une greffe par flanc sur chacune des 50 souris - La douleur éventuelle associée à cette chirurgie - Les anesthésies réalisées (1 pour la chirurgie (Durée : 30 min) et 3 pour les imageries (Durée : 10 minutes)) et l'hypothermie éventuelle en résultant - 4 injections sous-cutanées minimum (1 pour l'analgésie, 3 pour l'antibiothérapie) - Le stress éventuel tout au long des différentes étapes de la procédure - La mise à mort en fin d'étude pour la récupération du tissu greffé. Une attention particulière sera cependant portée aux animaux : tout signe de douleur, stress, et/ou tout comportement anormal sera pris en compte. De plus, la chirurgie se déroulera sous anesthésie volatile (Isoflurane) et analgésie (Buprénorphine 0.05mg/kg) et une antibiothérapie permettra d'atténuer voire d'éviter tout risque d'infection (Amoxicilline 15mg/kg, durant 3 jours)

Devenir

Les souris seront maintenues en vie à la suite de la chirurgie et des différentes imageries. Elles devront cependant être mises à mort dans les jours suivant la dernière imagerie afin de récupérer le tissu adipeux greffé et d'en faire une analyse histologique.

Remplacement

Remplacer : Pour répondre à notre objectif scientifique, un modèle in-vitro ne peut être mis en place. Nous avons en effet besoin d’un modèle animal afin d’étudier le processus de rétention des greffes dans son ensemble, avec les contraintes que ce tissu peut subir dans un système vivant (Inflammation locale, nécroses éventuelles, …).

Réduction

Réduire : L’utilisation de l’imagerie nous permet de suivre la rétention de la xénogreffe sans avoir besoin de sacrifier l’animal, ce qui nous permettra de réduire le nombre total d’animaux utilisés. De plus, le nombre d’animaux utilisés a été minimisé grâce au calcul préalable effectué sur R à partir de la bibliographie et de la fonction power.t.test, nous permettant ainsi d’utiliser un nombre réduit de 5 animaux par groupe. De même, le nombre d'animaux nécessaires à l'étape de screening a été minimisé.

Raffinement

Raffiner : Une étude pilote (screening) sera réalisée afin d’optimiser les protocoles de chirurgie, d’imagerie et d’histologie, sur un premier groupe de 3 souris. Elle nous permettra ainsi d’affiner les techniques utilisées pour l'étude. Ainsi, les expérimentateurs pourront s’entraîner à la technique chirurgicale et les comportements anormaux éventuels des animaux suite aux différentes procédures seront pris en compte. La liste des points limites sera de même actualisée si besoin. Elle comprend pour points limites spécifiques au projet : - Mauvaise cicatrisation cutanée suite à la xénogreffe et/ou Infection cutanée suite à la xénogreffe - Hypothermie persistante, avec une température inférieure ou égale à 34°C de façon durable - Réveil incomplet supérieur à 2h à la suite de la chirurgie - Perte de poids supérieure à 20% Afin de diminuer les éventuelles douleurs pouvant survenir suite à la chirurgie et le risque d'infection, une analgésie et une antibiothérapie seront mises en place (par injection sous-cutanée). De plus, les souris seront étroitement surveillées pendant la phase de réveil puis dans les jours qui suivront la chirurgie. Elles seront hébergées en cages groupées afin de satisfaire leurs besoins sociaux, sur des portoirs ventilés afin de tenir compte de leur phénotype dommageable. Un enrichissement adapté à l'espèce (paille, tunnels, dômes, ...) sera mis dans les cages afin de leur laisser exprimer les comportements naturels de l'espèce (enfouissement par exemple).

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour cette étude est la souris. C’est une espèce largement utilisée dans la recherche préclinique, en chirurgie notamment. La lignée nude choisie pour cette étude est une lignée de souris sans poils et athymique. Ceci nous permettra notamment de nous abroger des risques d’incompatibilité inter-espèces et donc de rejet de la xénogreffe. La lignée choisie est de plus facile à élever et à manipuler. Elle est peu coûteuse et largement utilisée dans toutes les disciplines de la recherche médicale. C’est également une lignée ne présentant pas de phénotype dommageable à l’état basal. La physiologie de la souris ressemblant à celle de l’homme, ceci facilitera la translation. De plus, la souris nude étant peu grasse, il sera plus simple de constater l’évolution des xénogreffes de cellules adipeuses sur cette souche. Enfin, le modèle de la souris immunodéprimée est un modèle standard connu pour la xénogreffe. A leur arrivée, les souris seront âgées de 6 semaines. La greffe sera réalisée 2 semaines après réception, afin d'effectuer une semaine de quarantaine puis d'habituation des animaux. Ainsi, les souris nude seront âgées de 8 semaines au moment de la chirurgie, pour un poids moyen de 20 grammes. A ce stade de développement, les organes des souris seront matures. De plus, nous nous abrogeons des problèmes éventuels liés à la vieillesse de notre modèle.

1780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chirurgies cérébrales avec injections stéréotaxiques et pose de fibres optiques ou de lentilles, une restriction d'eau pouvant leur faire perdre jusqu'à 20 % de leur poids sur quatre semaines et un isolement pouvant durer deux mois, pour étudier des circuits neuronaux de l'apprentissage olfactif. Les retombées thérapeutiques évoquées contre les maladies neurodégénératives restent lointaines. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative aux techniques in vivo.

Objectifs

Ces dernières années, de nombreuses études ont mis en évidence l’existence d’un phénomène de production de nouveaux neurones dans le cerveau adulte, dont la déficience semble être liée à des maladies neurodégénératives ou à certaines formes de dépression. De plus, il a été mis en évidence que ces cellules étaient impliquées dans des phénomènes d’apprentissage et de mémoire. Ces découvertes ont suscité un grand espoir dans la communauté biomédicale, celui de pouvoir un jour développer des thérapies basées sur cette capacité du cerveau à produire de nouveaux neurones fonctionnels à tout âge. En particulier, le bulbe olfactif, premier relai central du système olfactif et le gyrus denté de l’hippocampe sont des structures où la neurogenèse à l’âge adulte peut être identifiée dans les conditions constitutives du cerveau sain chez la plupart des mammifères. En conséquence, parmi tous les systèmes sensoriels, le système olfactif se distingue par sa grande plasticité, comprenant entre autres la capacité de renouvellement de ses constituants cellulaires, et ceci y compris à l’âge adulte. Chez les rongeurs, des dizaines de milliers de nouveaux neurones sont intégrés chaque jour dans le bulbe olfactif. Ces cellules sont générées à partir d’une région précise, la Zone Sous Ventriculaire, puis acheminées vers le bulbe olfactif par un Courant de Migration Rostral, pour se connecter avec les circuits bulbaires. De nombreuses études ont décrit les modalités de transmission du message olfactif de l’épithélium olfactif au cerveau, permettant notamment l’établissement d’une mémoire olfactive par l’apprentissage d’une odeur, souvent associée à un autre stimulus sensoriel de contexte pouvant lui-même posséder une valeur émotionnelle. Ainsi, une fois une odeur associée à une situation, une nouvelle rencontre avec celle-ci pourrait raviver les souvenirs inscrits dans les circuits neuronaux et permettre de reconnaître ce même contexte. Nous cherchons donc à déterminer pourquoi les neurones générés chez l’adulte dans le bulbe olfactif jouent un rôle si particulier dans l’apprentissage olfactif et comment ils permettent de modifier la perception ultérieure d’une odeur déjà rencontrée.

Bénéfices attendus

De nombreuses études expérimentales ont étudié les modalités de transmission du message olfactif de l’épithélium olfactif au cerveau, permettant notamment l’établissement d’une mémoire olfactive par l’apprentissage d’une odeur, le plus souvent associée à un autre stimulus sensoriel de contexte pouvant lui-même posséder une valeur émotionnelle. Ainsi, une fois une odeur associée à une situation, une nouvelle rencontre avec celle-ci pourrait raviver les souvenirs inscrits dans les circuits neuronaux et permettre de reconnaître ce même contexte. Dans notre équipe de recherche, nous nous intéressons à un aspect particulièrement inexploré de ces mécanismes : Pourquoi les neurones générés chez l’adulte dans le bulbe olfactif jouent-ils un rôle si particulier dans l’apprentissage olfactif et comment permettent-ils de modifier la perception ultérieure d’une odeur déjà rencontrée ? Pour cela, nous souhaitons étudier une sous-population de neurones inhibiteurs du cortex olfactif innervant les neurones nouvellement générés du bulbe olfactif et leur potentielle modification à la suite d’un apprentissage associatif. En effet, un contrôle à distance de l’activité des nouveaux neurones pourrait être le substrat permettant de définir une nouvelle forme de perception subjective, propre à chaque individu et découlant des expériences personnelles antérieures de chacun. Finalement, une meilleure connaissance des mécanismes de neurogenèse adulte pourrait alors permettre dans le futur la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques pour contrôler cette production neuronale, dans le but de restaurer les fonctions cérébrales de patients accidentés ou atteints de maladies neurodégénératives ou psychiatriques. Dans le domaine complexe des neurosciences modernes, un défi majeur des chercheurs est alors de comprendre précisément les mécanismes qui assurent l’intégration fonctionnelle de ces nouvelles cellules dans un réseau neuronal actif, et de déterminer les conséquences physiologiques de cette production neuronale permanente.

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales (injections stéréotaxiques, implantations de fibres optiques ou de lentilles à visée micro-endoscopiques dans le cerveau). Ces interventions ne durent pas plus de 2hs et chaque animal sera soumis à un maximum de deux interversions séparées par un minimum de 30 jours. Ils seront également soumis à des tâches d’apprentissage olfactif de type associatif avec renforcement positif. Ce type d’apprentissage a une durée maximal de 1 mois, avec une session de 30 à 60 minutes par jour, chaque jour.

Impact sur les animaux

Notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux tout en évitant au maximum tout stress et inconfort de l’animal. Cependant, au cours de nos expériences les animaux pourront subir quelques effets indésirables comme le stress hydrique, la perte de poids associée (< a 20% du poids original pendant un maximum 4 semaines) et le stress dû à l’isolement (maximum 2 mois). Des implants seront introduits par chirurgie sous anesthésie générale chez les animaux. La présence de ces implants pourrait générer un stress, une douleur légère et de l’inconfort (maximum 2 mois). Cependant, tous les moyens seront mis en place pour éviter toute douleur à la suite des chirurgies.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car il est nécessaire de réaliser des études histologiques sur les tissus à l’issue de chaque procédure.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative aux techniques in vivo pour étudier les circuits neuronaux impliqués dans l’apprentissage olfactif. Toutefois, notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux tout en évitant au maximum tout stress et inconfort de l’animal.

Réduction

L’étude statistique impose des cohortes comprenant un nombre suffisant d’animaux afin d’avoir une évaluation pertinente de l’effet des différentes conditions expérimentales sur le comportement. Le nombre de souris minimum par groupe a été calculé pour pouvoir utiliser des tests paramétriques, plus puissants que les tests non paramétriques grâce à des expériences similaires déjà réalisées dans notre laboratoire. Nous utiliserons des tests statistiques pour comparer les groupes avec un risque de p=0.05 et une puissance statistique >80. L’électrophysiologie sur tranche de cerveau permet de changer rapidement le milieu dans lequel baignent les cellules. Il est donc possible d’appliquer successivement et/ou de rincer plusieurs molécules au cours de l’enregistrement d’une cellule donnée. Ceci permet de réaliser des tests statistiques appariés et de réduire le nombre de cellules nécessaire à l’évaluation de l’effet d’un agent pharmacologique. Pour cette partie, deux personnes travailleront en parallèle sur deux postes d’électrophysiologie, ce qui permettra d’optimiser l’utilisation des tissus, de doubler le nombre de cellules enregistrées, et de réduire d’autant le nombre d’animaux nécessaires. Dans la même optique, les expériences d'imagerie permettent d’analyser l'activité des neurones avant et après l’apprentissage, permettant l’utilisation des tests statistiques appariés et le nombre de cellules nécessaire à l’évaluation de l’effet, et ainsi le nombre d’animaux utilisés dans le projet.

Raffinement

Tous les efforts seront mis en place pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance et angoisse de l’animal. La durée d’acclimatation à l’animalerie sera d’une semaine minimum. Durant la chirurgie, des anesthésiques et antalgiques seront utilisés, ainsi que des antalgiques de nouveau en post-chirurgie. Ceci est indispensable pour le bien-être de l’animal ainsi que pour notre projet qui est principalement basé sur le comportement : il est nécessaire que l’animal puisse effectuer une tâche de comportement sans biais. Les animaux seront donc observés minimum deux fois par semaine, et tous les jours en post-opératoire. Cette surveillance sera coordonnée entre l’expérimentateur et le personnel de l’animalerie. Pour les souris montrant des signes de douleur (absence de toilettage, posture anormale, défaut de nidification, défaut dans le comportement moteur général et du comportement exploratoire dans la cage, accompagnée ou non d’une perte de poids >20%), l’administration de l’antalgique sera renouvelée 12 et 24h après la chirurgie. Ces animaux seront l’objet d’une surveillance quotidienne accrue. En cas de détresse après l’administration des antalgiques les animaux seront mis à mort (événement très rare). Pour réduire le stress associé à l'isolement (parfois nécessaire lors de combats entre les individus ou en présence d’implants), les cages d’hébergement seront enrichies (igloo, coton extra). Dans le cas des souriceaux, après la chirurgie, le poids de chaque animal sera mesuré deux fois par semaine pour vérifier la bonne croissance des animaux. Le comportement maternel vis-à-vis des souriceaux après la chirurgie sera aussi évaluée (allaitement, toilettage, nidification, signes d’agressivité).

Choix des espèces

On étudie le phénomène de contrôle afférent chez l’adulte dans le système olfactif des souris car ce système est impliqué dans une modalité sensorielle très importante chez les rongeurs : l’olfaction. En conséquence, l’utilisation de cette espèce nous permettra d’obtenir des résultats éthologiquement satisfaisants. De plus, les stimuli olfactifs peuvent participer à l’enrichissement de l’environnement des animaux et donc favoriser leur bien-être durant le temps des expériences. Notre objet d’étude étant les fibres afférentes qui contrôlent l’activité des cellules produites par la neurogenèse chez l’adulte, on utilise dans ces expériences des jeunes souris adultes (8 semaines). Cependant, il faudra comparer l’impact de ces fibres sur les cellules produites dans le cerveau post-natal (neurogenèse post-natale). Pour ce faire, des souriceaux de 6 jours seront utilisés.

48 souris diabétiques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur inflige des plaies cutanées chirurgicales sur le dos puis on les anesthésie tous les trois jours pendant 21 jours pour suivre la cicatrisation, afin de tester des biopansements et des molécules bioactives. Le porteur situe les retombées à court terme, les produits étudiés étant déjà commercialisés pour d'autres usages. Il affirme avoir besoin d'un animal vivant pour étudier la cicatrisation dans son ensemble, avec les contraintes que subit la peau au quotidien.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier l’amélioration du processus de cicatrisation par l’usage de molécule bio actives et de nano biomatériaux sur un modèle de plaies cutanées dans un contexte diabètique en utilisant une lignée de souris qui exprime les paramètres physiologiques de la maladie (diabète). Le processus de cicatrisation comporte 4 étapes en condition physiologique : l’hémostase, l’inflammation, la prolifération et le remodelage. Elles se succèdent grâce aux recrutements des cellules immunitaires et la migration de cellules résidentes qui vont sécréter des facteurs permettant d’aboutir à la complète réparation de la lésion cutanée. En situation pathologique, ce processus peut être altéré (infection, maladie métabolique, irradiation…) et entrainer un retard de la cicatrisation et/ou une cicatrisation de moins bonne qualité, avec un risque de réouverture récurrente des plaies qui deviennent alors chroniques. Il est donc important d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur l’utilisation de molécules ayant des propriétés anti-inflammatoires, antioxydantes et anti-microbiennes. A ce titre certaines molécules semblent être de bons candidat innovants. Nous testerons ici deux molécules : les HDL reconstitués (rHDL) ainsi que l’Alpha 1 Antitrypsine (AAT). Ces deux molécules seront incorporées dans un gel neutre miscible (gel neutre Cooper) afin de pouvoir les appliquer et les maintenir sur les plaies. Cependant il manque encore des données scientifiques pour étayer cela. Nous voulons également tester en parallèle deux scaffolds : un scaffold solide et un scaffold sous forme d’hydrogel que nous avons déjà testé sur un modèle de plaies cutanés sur des Rats Wistar, non diabétiques, en amont du projet et dont les résultats préliminaires nous amènent à penser qu’ils peuvent être de bon candidats dans le processus de cicatrisation cutanée dans un contexte pathologique comme le diabète. Nous souhaitons évaluer les propriétés cicatrisantes des rHDL , de l’AAT , de la synergie de ces deux molécules ainsi que certains nano bio matériaux sur des plaies aigües en condition hyperglycémique liée au diabète. Nous pourrons ainsi étudier d’une part la potentielle amélioration de la qualité de la cicatrisation et d’autre part la possible normalisation du processus de cicatrisation.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent principalement la santé humaine, et en particulier les personnes souffrant de retard de cicatrisation comme les diabétiques. Les données scientifiques feront l’objet de publications dans des journaux internationaux permettant ainsi une valorisation d’un développement d’une nouvelle stratégie thérapeutique innovante. Ces bénéfices auront une échéance à court terme puisque les molécules actives étudiées sont déjà commercialisées (pour d'autres applications), et les scaffolds étudiés sont accessibles pour une fabrication industrielle.

Procédures

Les animaux seront tous soumis à une procédure chirurgicale sur le tissu cutanée, d'une durée de 15 minutes environ, sous anesthésie et analgésie. Ils seront tous anesthésiés brièvement (5 minutes) pour l'examen des plaies, tous les 3 jours. La procédure totale aura une durée de 21 jours pour tous les animaux.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances sont celles imputables à la chirurgie à savoir : anesthésie, injections, stress et douleurs. Le suivi des plaies se faisant tous les deux jours sous anesthésie, peut engendrer des réveils difficiles et augmenter le risque d’hypothermie. De plus, le positionnement des pansements peut constituer une gène (risque de retrait du pansement, difficultés à se mouvoir). L’isolement des animaux en cas d’atteinte de points limites peut également constituer une source de stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour analyser les tissus étudiés.

Remplacement

Des tests préliminaires in vitro ont été réalisés préalablement sur un modèle de cellules épithéliales humaines de la peau (HaCat), en condition huperglycémique(MGO) afin d’extrapoler la concentration des molécules à utiliser sur notre modèle animal. De même, les propriétés anti-inflammatoires et de migration cellulaire ont été évaluées in vitro. Afin de répondre à notre objectif scientifique, nous avons besoin d’un modèle animal vivant pour étudier le processus cicatriciel dans son ensemble, notamment les phases telles que l’angiogénèse et la réinnervation, avec les contraintes que peut subir la peau au quotidien à savoir étirement, relâchement, inflammation locale.

Réduction

Nous avons pu réduire au maximum le nombre de souris grâce à une revue systématique bibliographique et à l’utilisation de l’outil statistique R. La taille des plaies induites de 6 mm permettra de réaliser 2 plaies par animal ce qui permettera d’avoir un contrôle négatif pour chaque animal.

Raffinement

Notre protocole a été optimisé afin de minimiser au maximum les contraintes subies par les animaux. La procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie avec une couverture analgésique en respectant strictement les règles d’asepsie. Le matériel chirurgical utilisé sera rigoureusement stérilisé au préalable. Le gel utilisé comme matrice pour les molécules à tester est un gel neutre et sera appliqué en plus de la plaie sur une partie de la peau du dos rasée préalablement comme contrôle de biocompatibilté. Les animaux seront surveillés et manipulés tous les jours pour détecter tout inconfort lié à la procédure, avec un suivi post-opératoire renforcé dans les premières 48h ainsi que dans les phases de réveil faites en chambre de réveil thermostatée. Nous allons également effectuer un scoring de la douleur.

Choix des espèces

Le modèle souris Db/Db (dabiétique) a été selectionné dans cette étude. La souris Db/Db est un modèle largement utilisé dans la recherche dès lors que nous devons travailler sur un modèle pathologique de diabète. Par ailleurs, la souris possède une architecture de la peau proche de celle retrouvée chez l’Homme : présence d’épiderme, lame basale, derme, hypoderme et présence de follicules pileux. La taille de 6mm de la plaie effectuée nous permettra de faire 2 plaies par souris et donc de réduire notre nombre total d’animaux. Nous travaillerons avec des souris mâles adultes de 8 semaines. Les jeunes souris adultes ont une meilleure récupération post-chirurgicale et nous n’ajouterons pas de biais de cicatrisation lié à l’âge de l’animal qui aura une peau plus souple à 8 semaines. Cela permettra d’avoir un processus de cicatrisation optimal.

650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un morceau d'os du crâne leur est retiré par chirurgie, puis elles reçoivent trois injections. Le porteur reconnaît des douleurs post-opératoires liées au défaut osseux, à la coupe du périoste et aux sutures. Il indique qu'il faut prélever l'os pour l'analyser, ce qui impose de tuer les animaux, et présente le modèle du défaut de crâne comme largement validé.

Objectifs

Ce projet a pour but de mieux comprendre comment l'os se répare physiologiquement, afin de pouvoir à plus long terme créer des solutions efficaces pour la réparation osseuse de fractures qui ne se réparent pas seules. Dans un premier temps, des ablations d'un morceau de calvaria (crâne) seront réalisés sur des souris adultes. Les "trous" seront soit laissés vides, soit comblés avec un morceau d'os de calvaria contenant des cellules ostéocytes, soit comblés avec un morceau de calvaria sans ostéocytes, car les cellules seront tuées grâce à une technique de changement de température à plusieurs reprises. L'efficacité et la rapidité de la réparation de ces trous sera comparée à de l'os natif, sur des animaux qui n'auront pas subi de chirurgie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre si les ostéocytes jouent un rôle dans la réparation osseuse. Des études récentes montrent que tel est le cas. Les données apportées par ce travail permettront de créer des biomatériaux et des solutions thérapeutiques efficaces pour mieux traiter les défauts osseux critiques chez les patients malades ou atteints de trauma. Les ostéocytes ont été peu étudiées, bien qu'elles représentent 90 à 95% des cellules osseuses, et les différents biomatériaux permettant de réparer l'os à l'heure actuelle ne sont pas très efficaces.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie (durée de 5 minutes environ ) et à 3 injections intra-péritonéales à différents temps (durée 1 minute pour chaque injection, espacées de plusieurs jours).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir du stress lors de l'anesthésie au gaz (phase d'induction dans la boite) avant la chirurgie et des douleurs pourront être perçues après la chirurgie, dues au défaut osseux réalisé, à la coupe du périoste et/ou aux points de suture réalisés pour refermer la peau.

Devenir

Nous travaillons sur la réparation osseuse. Nous avons donc besoin des pièces osseuses pour pouvoir les analyser. De ce fait, comme il n'est pas possible de prélever les os de calvaria et de laisser les animaux vivants ensuite, ils seront tous euthanasiés avant le prélèvement.

Remplacement

Il n'est pas possible de remplacer l'étude in vivo par de l'in vitro. Des expérimentations in vitro seront menées en même temps sur de la co-culture de cellules mais cela ne remplacera pas la compréhension in vivo de la réparation osseuse et ne permet pas de comprendre le rôle des ostéocytes dans ce processus complexe, faisant intervenir différents types de cellules à différents temps de la réparation.

Réduction

Afin d'utiliser moins d'animaux, deux défauts seront créés sur chaque animal, de chaque côté de la suture sagittale. Nous effectuerons les deux premières études sur des mâles et des femelles car leur physiologie est différente. Pour les études suivantes, et afin de nous affranchir du rôle des hormones sexuelles qui affectent l'os, nous utiliserons uniquement des mâles. Cela évite de doubler le nombre d'animaux utilisés pour ce projet, qui nécessitera beaucoup de temps d'analyse par la suite. Les femelles âgées et transgéniques seront étudiées dans un projet ultérieur.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe et dans des cages avec de l'enrichissement naturel afin de leur offrir le meilleur cadre pendant l'étude. Nous utiliserons du gel lacrymal si les chirurgies durent plus de 5 minutes. Celles-ci seront réalisées sous anesthésie au gaz avec de l'isoflurane car le réveil est ensuite très rapide. Afin de diminuer le temps de la chirurgie, nous utiliserons le fait que la souris C57Bl6 est une lignée syngénique. Ainsi, les premiers volets osseux du groupe 3 (défauts laissés vides) seront traités (congélation/décongélation) par une tierce personne présente dans la salle de chirurgie, et réimplantés sur des souris du groupe 1 opérées ensuite. Ainsi, nous éviterons l'attente d'une quinzaine de minutes nécessaire pour tuer les ostéocytes du volet osseux. Il n'y aura pas de couverture chauffante car la table de chirurgie contient des plaques chauffantes que nous règlerons sur 37°C. La douleur sera réduite au maximum grâce à l'utilisation d'analgésique avant et après l'opération si besoin (buprénorphine). Une anesthésie locale type lidocaine pourra également être utilisée ainsi que des AINS. Cette analgésie multimodale sera discutée en SBEA avec le vétérinaire référent. Le stress sera également réduit en manipulant régulièrement les animaux avant l'anesthésie pour qu'ils s'habituent aux expérimentateurs. En cas de signes de douleurs persistantes en dépit des analgésiques, un score sera établi grâce à une échelle spécifique tenant compte des signes d'apparence, de comportement, d'hydratation et de signes cliniques bien spécifiques. Si le score est supérieur à 14 sur un total de 19 points, ce seuil limite entraînera l'euthanasie de l'animal pour abréger ses souffrances.

Choix des espèces

Le défaut de calvaria (ablation d'une petite partie de l'os du crâne) chez le rongeur est un modèle largement utilisé au laboratoire et validé dans la littérature. Ce sont des modèles de choix pour étudier l'influence des cellules et biomatériaux sur la réparation osseuse. Plusieurs lignées de souris seront utilisées dans ce projet: animaux avec ou sans mutations génétiques. Les mutations génétiques utilisées servent à voir les vaisseaux en vert en microscopie et d'autres animaux permettront de comprendre le rôle de la contrainte mécanique sur la réparation osseuse. Nous travaillerons sur des animaux adultes, et âgés car ce sont dans ces populations que l'on retrouve le plus de problèmes de réparation osseuse chez l'homme, en raison de trauma ou d'opération visant à extraire des tumeurs cancéreuses.

129 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats reçoivent un implant de céramique dans l'os par chirurgie, les souris un implant sous la peau, avec suivi par micro-scanner. Le porteur reconnaît des douleurs post-chirurgicales au site opératoire. Il affirme qu'aucun modèle de formation osseuse in vitro ou in silico ne reproduit la complexité de la cicatrisation, et vise à tester des céramiques comme alternative à l'autogreffe.

Objectifs

La réparation du squelette après perte de substance osseuse demeure un problème lorsque les défauts sont de grande taille. Si le traitement par autogreffe (prélèvement d’os chez le même patient) reste la référence, il a cependant des inconvénients. Les matériaux à base de céramiques en phosphate de calcium (CaP) sont une bonne alternative à l’autogreffe osseuse car supportent bien la repousse osseuse mais, généralement qu’aux abords des berges osseuses limitant leur efficacité à des défauts de faible volume. Une stratégie prometteuse pour améliorer le potentiel régénératif de ces matériaux est de mieux mimer la composition chimique de l’os (partie minérale), qui contient de nombreux oligo-éléments sous formes d’ions (tels carbonates, fluor, magnésium, manganèse…). L’insertion d’ions dans les céramiques de CaP est une approche de plus en plus étudiée permettant de moduler les propriétés physico-chimiques et microstructurales du matériau, et ainsi ses propriétés biologiques. Parmi les éléments ‘traces’ présents naturellement dans l’os, le silicium (principal élément composant le sable) joue un rôle essentiel dans le développement, la croissance et la calcification du tissu osseux (une alimentation déficiente en silicium engendre un retard de croissance accompagné d’un développement crânien anormal chez le rat alors qu’un régime enrichi en silicium améliore leur croissance squelettique). Le silicium est présent dans le corps sous forme d’ions silicates. Des études in vitro démontrent que les ions silicates favorise la différenciation de cellules qui produisent le tissu osseux et inhibe les cellules osseuses qui résorbent l’os. L’incorporation d’ions silicates dans ces matériaux a été déjà étudiée ces dernières années mais en raison de la faible dégradation des céramiques de CaP in vivo, les ions Silicates (qui pourraient influencer les cellules osseuses) ne sont en fait jamais libérés. L’incorporation d’ions carbonates, (ions naturellement présents dans le tissu osseux à 5-8%) dans les céramiques augmente leur dégradation in vivo. Considérant les avantages de chacun, l’incorporation simultanée d’ions silicates et carbonates dans la structure des céramiques rendrait le matériau dégradable, libérant ainsi les ions Silicates bioactifs pour stimuler les cellules osseuses et promouvoir l’ostéogénèse. L’objectif de ce projet est d’évaluer la dégradation des différentes céramiques (+/- ions) in vivo et leur potentiel à réparer un défaut osseux.

Bénéfices attendus

Plusieurs données de la littérature ont montré le bénéfice de céramiques contenant des ions silicates sur la formation osseuse ; mais une controverse persiste dans la communauté scientifique en raison de la faible/absence de dégradation des céramique in vivo, limitant la libération des ions silicates bioactifs. Le co-insertion d’ions carbonates et silicates a pour objectif d’obtenir des matériaux dégradables et donc plus bioactifs. Ce projet permettra de valider (ou invalider) l’intérêt d’insérer des ions silicates dans une biocéramique pour la réparation osseuse. Le bénéfice attendu à plus long terme est l’optimisation de la synthèse et fabrication d’implants en biocéramique pour le comblement de grands défauts osseux en remplacement de l’autogreffe.

Procédures

Pour les souris : 1-Implantation sous cutanées de matrices ( 1X ; durée ~20 min) 2- Imagerie micro-scanner (μCT) in vivo (max 7X; durée 15 min) Pour les rats : 1- Implantation intraosseuse au niveau du condyle (1X, durée 40 min) ; 2- Imagerie micro-scanner (μCT) in vivo (6X; durée 15 min) 3- Injection d'agent fluochromes (2X ; durée 5 min)

Impact sur les animaux

Nuisances attendues causées durant les actes expérimentaux : stress dû à la contention puis lors de la perte de connaissance par le gaz anesthésiant (souris et rats) ; Injection en sous cutané (souris et rats); Injection en intrapéritonéal (souris et rats); Chirurgie en sous-cutané (sous analgésie et anesthésie) (souris) ; Chirurgie en intra-osseux (sous analgésie et anesthésie) (rats). Nuisances attendues engendrés suite aux expérimentations : douleurs post-chirurgie (niveau du site opératoire) (souris et rats)

Devenir

Mise à mort car fin de protocole ; les explants seront récupérés et traités selon l’étude (analyse expression génique, histologie, analyse au scanner à plus haute résolution, mesure de la masse de la céramique restante).

Remplacement

Aucun modèle de néoformation osseuse in vitro n’est disponible aujourd’hui. La cicatrisation osseuse est un processus séquentiel orchestré complexe impliquant l’interaction de nombreuses populations cellulaires différentes : cellules osseuses, cellules vasculaires, cellules du système immunitaire et cellules des tissus environnant tels que le périoste ou le tissu musculaire ; à cela s'ajoute l'impact d'un système hormonal complexe. Les modèles in silico actuels ne peuvent pas reproduire cette complexité cellulaire et moléculaire, d’autant plus que tous les processus intervenants dans la réparation osseuse ne sont pas encore connus. Les modèles in vitro (organoide, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions matrice-cellules ou cellules-cellules, mais n’incluent que 2 ou 3 interactions (ostéoblastes/macrophages par exemple). Les modèles ex vivo (explants osseux) sont les plus proches de la situation physiologique et permettent d’étudier la physiologie osseuse sur quelques jours. Ces modèles, cependant, sont dénués de système vasculaire qui joue un rôle clé dans la réparation osseuse. Pour toutes ses raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier la réparation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

4 ou 2 implants seront implantés par animal pour diminuer le nombre d’animaux utilisé. L’imagerie non-invasive pour petits animaux (suivi de la formation osseuse par micro-scanner) sera utilisée pour suivre les mêmes animaux dans le temps et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisé. Une analyse statistique en préalable a permis de déterminer qu’il nous fallait 10 animaux par groupe testé pour espérer obtenir une différence statistique entre au moins 2 groupes.

Raffinement

Une période d’acclimatation d’une semaine sera effectuée entre l’arrivée des animaux et la chirurgie. Le manipulateur viendra les voir et manipuler au minimum 3 fois avant la chirurgie. En vue d’éviter le stress, les souris et les rats initialement hébergés ensemble (3 animaux/cage) le resteront du début à la fin du protocole. La souffrance sera limitée par analgésie pré- et post-opératoire pendant les 3 premiers jours. Après anesthésie et avant chirurgie, un gel sera est appliqué sur chaque œil pour éviter le dessèchement des yeux. Après chirurgie, les animaux seront surveillés en per-opératoire puis régulièrement jusqu'à la fin de l'expérimentation. Pour chaque analyse par micro-scanner, les souris et rats seront anesthésiées par inhalation d’un gaz anesthésiant dont les effets se dissipent 1 à 2 minutes après l’arrêt du contact direct avec le produit. Les points critiques (plaie, démarche..) seront surveillés, notés et reportés sur une feuille de score permettant de quantifier la douleur ou la gêne de l’animal. Les mesures à prendre pour chaque situation clinique (Perte de poids, Comportement général altéré, Apparence extérieure altérée, Site d’implantation infecté) et si les points limites sont atteints, sont listées sur cette feuille de score. Un environnement enrichi sera fourni avec briques de bois (usure des dents), dômes (pour souris) et papier afin de contribuer au fouissement des animaux. La température sera maintenue et contrôlée entre 20 et 22°C et le rythme veille/sommeil sera de 12h/12h. Eau et nourriture seront fournies ad libitum.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour les implantations sous-cutanées est la souris immunodéprimée Nude (ayant un système immunitaire adaptatif altéré, mais inné non-altéré) car une procédure implique l’association de céramiques avec des de cellules humaines formatrices de tissu osseux; son poids à 8 semaines (~30 g) permet l’implantation de 4 implants par souris ou 2 chambres de diffusion par souris sans problème. Le modèle animal choisi pour les implantations intra-osseux est le rat Wistar. La taille du rat est plus pertinente que la souris pour évaluer la réparation d’un grand défaut osseux. La souche Wistar est non consanguine ayant une variabilité génétique plus importante qu’un modèle consanguin.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois injections d'un candidat vaccin dans le muscle de la patte, puis deux prélèvements sanguins au sinus situé derrière l'oeil. Le porteur reconnaît que la douleur musculaire peut pousser l'animal à se mordre et que le prélèvement rétro-orbitaire peut provoquer des douleurs oculaires. L'objectif est de valider que des changements dans le procédé de fabrication n'altèrent pas l'activité du vaccin, le recours à l'animal étant présenté comme "incontournable".

Objectifs

Les cytokines sont des protéines naturelles qui assurent la communication intercellulaire et orchestrent les réponses immunitaires, inflammatoires ou allergiques. Leur surexpression ou dérégulation conduit à l’apparition ou au développement de pathologies auto-immunes, inflammatoires ou cancéreuses. Ces pathologies sont aujourd’hui de véritables enjeux de santé publique. C’est pourquoi, une nouvelle stratégie d’immunothérapie active a été développée, reposant sur la production d’anticorps anti-cytokine, par le système immunitaire du patient, après administration d’un candidat vaccin. Ce dernier est composé d’une protéine porteuse couplée à une cytokine. Un test d’activité chez la souris permet de sélectionner les meilleurs candidats vaccin lors de la phase de développement. Il n’existe pas, à ce jour, de méthodes in vitro permettant d’évaluer la réponse immunologique à ce vaccin. Cette limitation rend incontournable le recours à l’expérimentation animale, pour tester l’efficacité de nouveaux candidats vaccins. Cette étude sert à valider la conformité des lots de vaccins produits pour les études précliniques, ainsi qu’à valider les évolutions du procédé inhérentes au développement jusqu’aux études cliniques. A terme ce test chez la souris sera standardisé pour être utilisé comme test de contrôle qualité pour la libération des lots de vaccins.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider que les modifications apportées au cours du développement du procédé de fabrication du vaccin (changements de tampon, changement de température ou de temps, changement d’équipement…) n’affectent pas l’activité in vivo de ce dernier qui à terme sera administré chez l’homme au cours d’un programme d’évaluation clinique.

Procédures

1) Administration du vaccin : L'injection du vaccin est réalisée sur animaux vigiles maintenus par contention pendant 30 secondes. Les 600 animaux recevront 3 injections de vaccin aux jours 0, 7 et 28 par voie intramusculaire (50 à 100 μL). 2)Prélèvement sanguin: Les animaux sont anesthésiés à l'isoflurane pendant 5min. Ensuite, le prélévement de sang est réalisé en moins de 30 secondes. L’ensemble des 600 souris subira 2 prélèvements sanguins aux jours 41 et 55.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables généralement observés sont principalement dus à l’injection ou au prélèvement au sinus retro orbitaire. Les effets secondaires liées au candidat vaccin ne sont pas attendus. Le principe du vaccin étant de provoquer une réponse immune, des effets indésirables de type inflammatoire peuvent se produire principalement au site d’injection et se manifester par des oedèmes et érythèmes pouvant durer quelques heures à quelques jours. L’injection par voie intramusculaire se faisant dans le muscle de la patte arrière, une douleur musculaire localisée pourra être détectée quand l'animal a tendance à se mordre au niveau de la zone douloureuse. Les prélèvements sanguins se faisant au niveau du sinus rétro-orbitaire, des effets indésirables sur l’oeil peuvent se produire. La survenue de contractions répétées et involontaires des muscles des paupières (blépharospasme), la sécrétion lacrymale éventuellement accompagnée de photophobie, les écoulements, la survenue d'oeil rouge ou opaque seront examinés, puisqu'ils traduisent des douleurs oculaires et l'état des yeux.

Devenir

Le système immunitaire des souris utilisées ayant été stimulé par les candidats vaccin, celles-ci conserveront une « mémoire » des vaccinations précédentes. Nous ne serons donc plus dans la possibilité d’obtenir chez ces souris, une réponse immunitaire comparable à des animaux nouvellement vaccinés. De surcroit les souris ont une durée de vie assez courte et l’utilisation d’animaux âgés n’est pas recommandé pour l’obtention d’une bonne réponse immunitaire. L'ensemble des animaux sera donc mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

La stimulation du système immunitaire par vaccination ne peut s’effectuer que sur animaux vivants. Il n’existe pas à ce jour de méthode in vitro permettant de remplacer le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Ce protocole suit la condition pour laquelle un nombre de 10 animaux par groupe procure une puissance statistique suffisante (tests statistiques classiques).

Raffinement

Les animaux disposent d'une période d'acclimatation conséquente (minimum 7 jours), avant l'initiation de tout protocole, afin de limiter leur angoisse. Ils subissent ensuite des contraintes très modérées. Les injections réalisées en intramusculaire (sur souris vigiles) et les prélèvements sanguins (sous anesthésie gazeuse) ont lieu de façon ponctuelle et n’induisent pas de modification de leur bien-être. Enfin, des points-limites avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis. De plus, des antalgiques sont prévus si l’animal présenté un signe de souffrance. Si un animal présente l'un des points limite à un seuil critique, il est mis à mort afin d'abréger sa souffrance. Une attention particulière sera portée aux conditions d’hébergement des animaux. Le bruit dans les zones d’hébergement ainsi que dans la zone d’expérimentation sera réduit au maximum. Les souris seront hébergées par groupe de 5 souris maximum par cage. Ce milieu sera enrichi (tunnel + coton) et la nourriture et l’eau seront fournis ad libitum afin de s’assurer du bien-être de l’animal.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus approprié du fait de sa physiologie proche de l’Homme (taux d’homologie 90 %) et de la grande quantité de données disponibles dans la littérature et au sein du laboratoire. Souris adulte, c’est-à-dire de 7 à 9 semaines, soit environ 20-25g. En effet, nous souhaitons que les souris aient un système immunitaire mature pour tenir compte de la réponse humorale.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des régimes chargés en phosphate, passent deux fois 24 heures en cage métabolique et reçoivent des injections de tétracycline. Le porteur décrit ces contraintes comme des stress légers déjà bien supportés lors d'un projet antérieur. L'objectif se limite à confirmer des résultats précédents et à tester si la source du phosphate alimentaire modifie le métabolisme phospho-calcique.

Objectifs

Le premier objectif est de confirmer les résultats issus des études précédentes réalisées dans le laboratoire sur l’homéostasie du métabolisme phospho-calcique. La première étude était constituée de souris sauvages et génétiquement modifiées (pour l’expression de protéines impliquées dans la régulation de la minéralisation osseuse) pour la BSP (Bone Sialoprotein) et/ou l’OPN (Osteopontin), ces souris recevaient un régime classique. La seconde étude a été réalisée avec ces mêmes souris, cependant, les souris recevaient des régimes avec diverses concentrations de phosphate (Pi) : standard, riche ou pauvre en Pi. Etonnamment, la régulation du métabolisme phospho-calcique des animaux a été impactée par le type de régime reçu : régime classique ou régime standard. Pourtant dans ceux-ci, la quantité de Pi est sensiblement égale (0.55%vs0.58%), mais, la source d’apport du Pi était différente (minérale vs organique). De ce fait, nous souhaitons valider que la source de Pi alimentaire (organique/minérale) modifie le contrôle du métabolisme phospho-calcique dans nos modèles. Le second objectif est de visualiser l’impact du fond génique des souris sur la régulation du métabolisme phospho-calcique. En effet, l’absorption intestinale est la voie d’entrée du Pi dans la circulation sanguine générale. Elle peut être effectuée par voie paracellulaire ou transcellulaire, le choix de la voie est dépendant de la charge alimentaire en Pi. En effet, la littérature démontre, qu’en condition d’apport faible en Pi, la voie transcellulaire domine, via une activation majeure d’un transporteur de Pi dans l’intestin : Npt2b. Lors d’une étude antérieure nos souris ont reçu un apport alimentaire faible en Pi, cependant le niveau d’expression du récepteur Npt2b a été réduite par rapport à un apport de Pi dit standard. Cette observation est donc en total contradiction avec les résultats de la littérature obtenus sur des souris C57Bl/6. Plusieurs hypothèses : la source de Pi du régime (minérale ou organique – objectif 1), ou alors le fond génique des souris (CD1/129sv) ne possède pas les mêmes mécanismes de régulation du métabolisme du phosphate. Pour répondre à cette hypothèse, des souris contrôles (C57Bl/6) et des souris (CD1/129sv) seront soumis aux mêmes régimes dans les mêmes conditions. Si la régulation est différente, cela signifie que le fond génique impact la réponse aux changements de l’apport alimentaire en phosphate.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de valider nos résultats préalablement obtenus sur les souris sur fond génique CD1/129sv, mais également de déterminer si les données divergentes avec la littérature, proviennent du fond génique ou de la source de phosphate dans l’alimentation.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une charge alimentaire en phosphate via des régimes spécifiques. De plus, les animaux passeront par deux, 24h en cage métabolique de manière à récupérer les urines et les fèces pour doser les marqueurs du métabolisme phospho-calcique. De plus, les animaux recevront deux injections de Tétracycline en intrapéritonéale (5 secondes par injections-30mg/kg) à 5 jours d’intervalle. La tétracycline est un antibiotique utilisée comme marqueur en histologie (marquage des fronts de minéralisation).

Impact sur les animaux

Les injections de tétracycline par voie intrapéritonéale, le passage en cage métabolique inférieur à 24h et le changement de régime alimentaire peuvent êtres des sources de stress pour les animaux. On s’attend donc à une légère modification du comportement (agitation/baisse de la consommation de la nourriture). Cependant, ces expériences ont déjà été effectuées lors de projet antérieur, et tous les paramètres (contrôle du poids/comportement) indiquent que les animaux supportent très bien les différents stress légers de ce projet. Enfin, la mise à mort des animaux sera effectuée par une personne habilitée et compétente et sur des animaux préalablement anesthésiés (anesthésie gazeuse (Isoflurane)) pour qu’aucune douleur ne soit ressentie.

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale, tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissu biologique et de sang.

Remplacement

Nous souhaitons investiguer la régulation du métabolisme phospho-calcique, et ce contrôle est effectué à travers divers organes : l’intestin, l’os et le rein. La relation entre ces organes va nous permettre d’étudier le métabolisme minéral et surtout celui du phosphate. Seul un modèle in vivo permet de réaliser cette étude.

Réduction

5 génotypes de souris seront nécessaires à l’étude et 4 régimes seront testés : classique, standard, pauvre et élevé en phosphate. Il y a donc 4 conditions par génotype et 5 génotypes ce qui fait 20 groupes expérimentaux. D’après nos études antérieures, un nombre de 8 points est jugé robuste et suffisant, mais sachant que les souris sont placées par 2 en cage métabolique pour réduire leur stress (permettant une meilleure homogénéisation des données, et une amélioration du bien-être notamment en réduisant la sensation de froid des animaux), il faut donc 16 souris par groupe. De ce fait, 16*4 (régime)*5 (génotype)= 320 animaux. En prenant compte, des expériences complémentaires/répétées qui pourront être nécessaires, 400 animaux seront nécessaires. Ainsi, le nombre d’animaux est réduit au juste nécessaire pour obtenir une puissance statistique robuste en tenant compte de la variabilité inter-individu.

Raffinement

Les animaux proviennent de l’élevage du laboratoire, ils sont donc habitués aux expérimentateurs et au personnel de l’animalerie, notamment via le change toutes les semaines. Les animaux sont dans la salle d’hébergement avec de la musique, un passage quotidien, ils ont également de l’enrichissement physique et sociale : cage transparente, 3-4 animaux par cage, bâtons de bois, et copeaux pour les nids. Les actes qui pourront produire un stress chez les animaux (cage métabolique/injections) seront réalisés dans des salles dédiées et par un expérimentateur habilité. La nourriture et l’eau seront à volonté. L’acte de mise à mort sera réalisé sur des animaux préalablement anesthésiés (Isoflurane) et réalisé rapidement par un manipulateur expérimenté. Les animaux qui proviennent de fournisseur agréé recevront la même attention que les animaux issus de l’élevage interne. De plus, ils seront inclus dans l’étude uniquement après une période d’acclimatation dans l’animalerie.

Choix des espèces

Les précédentes études de notre laboratoire ont été effectuées sur ces même souris avec le fond génique CD1/129 sv. L’ajout des souris sur fond génique C57BL/6 provient des résultats obtenus dans les données de littérature. L’étude sera menée sur des animaux âgés de 20 semaines. A cet âge, le phénotype des animaux est suffisamment établi pour obtenir des résultats représentatifs d’une population. De plus, c’est à cet âge que les précédentes expériences ont été menées.

2 528 souris vont être utilisées, tuées à l'issue ou mourant en cours d'étude pour les cohortes de longévité, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent injections, gavages, régimes gras sur plusieurs mois, tests métaboliques avec jeûne et prélèvements sanguins répétés, et passages en cage de calorimétrie. Le porteur reconnaît que régime gras, jeûnes, contention et transport sont des sources de stress. Il justifie l'espèce par l'espérance de vie courte de la souris, qui permet une étude de vieillissement en cinq ans, et présente le bénéfice thérapeutique comme lointain.

Objectifs

L’étude de la longévité et de l’espérance de vie en bonne santé est un enjeu actuel majeur. En effet, de par leurs forts impacts sur la santé publique, le vieillissement et les maladies chroniques font parties des thématiques prioritaires en recherche. Réduire le vieillissement et étendre l’espérance de vie en bonne santé est un enjeu économique majeur, en diminuant les maladies chroniques associées à l’âge. Ce projet de recherche s’inscrit dans cette thématique, en décrivant de façon originale le rôle méconnu des glucocorticoïdes (hormones circulantes impliquées notamment dans le métabolisme glucidique) dans le vieillissement des tissus sensibles à l’insuline, en particulier le tissu adipeux et le muscle squelettique ; et dans le vieillissement physiologique. Notre projet vise donc à définir l’impact des glucocorticoïdes sur le vieillissement.

Bénéfices attendus

Ce travail permettra in fine de proposer une approche thérapeutique ciblée afin de limiter l’impact métabolique néfaste des glucocorticoïdes et traiter les troubles métaboliques liés à l’âge pour étendre l’espérance de vie au global et/ou l’espérance de vie en bonne santé. De plus, ce projet déterminera si l’âge modifie la sensibilité aux glucocorticoïdes, notion importante sachant que les individus de plus de 65 ans sont surreprésentés dans la population traitée par les glucocorticoïdes.

Procédures

Au cours de ce projet les animaux seront exposés à différents gestes techniques afin de répondre aux objectifs scientifiques. Les interventions sont majoritairement peu invasives. Les différentes séries de gestes réalisés sur les souris pourront être au choix selon les questions scientifiques : 1-Injections intrapéritonéale (1 fois par jour pendant 5 jours, 5 sec animal vigile), Administration de traitement dans l’eau de boisson (4 semaines maximum), Tests dynamiques d’exploration du métabolisme glucidique (mise à jeun de 5h, 1 injection intrapéritonéale ou 1 gavage unique, 6 prélèvements sanguins de très faible quantité (une goutte), 2h pour chaque tests, 2 tests espacé d’une semaine minimum), Prélèvement sang sous anesthésie et analgésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). 2-Injections intrapéritonéale (1 fois par jour pendant 5 jours, 5 sec animal vigile), Administration de traitement dans l’eau de boisson (4 semaines maximum), Prélèvement sang sous anesthésie et analgésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). 3-Utilisation de régimes spéciaux (20 semaines de régime maximum), Mesure de la pression artérielle (30 minutes pendant 5 jours, 2 fois au cours de la vie), transport optionnel vers un autre établissement, Mesure de la composition corporelle (5 à 10 minutes, animal vigile) et cages calorimétrie (5 jours maximum), Tests dynamiques d’exploration du métabolisme glucidique (mise à jeun de 5h, 1 injection intrapéritonéale ou 1 gavage unique, 6 prélèvements sanguins de très faible quantité (une goutte) (2h pour chaque tests, 2 tests espacé d’une semaine minimum), Prélèvement sang sous anesthésie et analgésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). 4-Deux prélèvements sanguins espacés de 7 jours (20 secondes par prélèvement, 2 fois au cours de la vie sur animal vigile), Injection intrapéritonéale unique (5 sec par animal sur animal vigile), Prélèvement sang sous anesthésie et analgésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). 5-Etude de longévité incluant uniquement le maintien des animaux à long terme en conformité avec la réglementation et incluant un suivi avec établissement d’un score (5 min par animal, 1 fois toute les 6 semaines à partir de 18 mois et jusqu’à la fin de vie) Chaque point représente une trajectoire de vie pour un groupe d’animaux et donc le maximum d’actes effectués sur ce même groupe.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet les animaux seront impliqués dans différents actes pouvant induire un stress ou une douleur qui sera systématiquement prise en compte. Pour la quasi-totalité des animaux du projet, les administrations/prélèvements entraineront une contrainte/stress liée à la contention, au gavage et/ou à la piqure de l’aiguille pour les injections qui sont légers et de courte durée. Certains animaux seront exposés à des traitements aux glucocorticoïdes ou seront exposés à un régime gras pouvant induire une obésité et/ou une insulino-résistance. Ils seront également amenés à suivre des challenges métaboliques pouvant entrainer un stress ou des effets physiologiques tels qu’une hypo- ou une hyperglycémie. Les animaux seront impliqués dans des mesures de la composition corporelle, de la pression artérielle et aux mesures de calorimétrie qui peuvent induire un stress de courte durée lié à leur placement en boites de contention ou de durée plus longue lors de l’isolement en cage de calorimétrie. De même, le transport possible des animaux vers un autre établissement qui pourra être mis en œuvre sera également source de stress pour les animaux. Enfin, les animaux inclus dans les cohortes de longévité pourront ressentir une contrainte/stress liée à la contention lors de l’évaluation de l’index de fragilité. Les animaux seront également exposés aux effets indésirables inhérent au vieillissement.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés à l’issus des actes mis en œuvre par une méthode réglementaire effectuée selon les bonnes pratiques. L’euthanasie des animaux est requise pour limiter la souffrance animale et pour l’étude histologique ou biochimique des tissus sensibles à l’insuline des animaux. Dans le cadre de l’étude de vieillissement certains animaux seront susceptibles de décédés naturellement au cours de cette procédure de longévité ou seront euthanasiés par une méthode règlementaire en cas d’atteinte des points limites définis.

Remplacement

Il s’agit d’un travail de physiologie intégrée qui permettra de comprendre les communications inter-organes et les régulations métaboliques entre différents tissus. Aucun modèle cellulaire ne permet de reproduire les interactions inter-organes et la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. D’un point de vue évolutif, le récepteur aux glucocorticoïdes apparait chez les vertébrés terrestres et plus particulièrement chez les mammifères, justifiant l’utilisation d’un modèle mammifère dans ce projet. Enfin, l’utilisation d’un modèle rongeur tel que la souris, se justifie par l’espérance de vie relativement courte de ces animaux, permettant la réalisation du projet dans le temps imparti (5 ans).

Réduction

Le projet impliquera un total de 2528 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte-tenu des données de la littérature et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l’utilisation inutile de souris. En effet, les procédures expérimentales et les tests statistiques ont été validées dans des études précédentes. L’effet de l’âge sur la mortalité des animaux et la variabilité des résultats a été pris en compte en augmentant le nombre d’animaux dans les groupes les plus âgés afin d’obtenir des résultats valides. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, soins, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux tout au long de leur vie grâce à une surveillance attentive (scoring, points limites) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Nous avons inclus dans les protocoles de longévité des grilles d’évaluation spécifique, incluant des observations cliniques détaillées et le suivi du poids des animaux. Les animaux fragiles identifiés seront suivis avec une vigilance accrue. En cas d’atteinte d’un point limite préalablement défini, cela entrainera l’euthanasie de l’animal dans les plus brefs délais afin de limiter la contrainte au maximum.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Le récepteur aux glucocorticoïdes, tel que présent chez l’homme, est spécifique des mammifères et ne permet pas l’utilisation d’autres organismes modèles plus simples. Les expériences de longévité justifient l’utilisation de petits mammifères présentant une espérance de vie courte, tels que la souris. Plusieurs modèles murins transgéniques seront utilisés au cours de notre projet afin de répondre aux différentes questions scientifiques. Justification des stades de développement : Des souris commerciales et transgéniques seront utilisées de 10 semaines à 60 semaines afin d’étudier les adaptations métaboliques des animaux en cours de vieillissement. De plus, des animaux « gériatriques » (24 mois et plus) seront utilisés afin d’évaluer l’espérance de vie maximale des individus et leur sensibilité aux glucocorticoïdes. Justification du sexe : Les glucocorticoïdes sont connus pour induire un dimorphisme sexuel. Nous étudierons donc dans ce projet des animaux des deux sexes afin de déterminer si le dimorphisme sexuel en réponse aux corticoïdes est présent aussi avec l’âge.