Rongeurs

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections biquotidiennes puis, au vingtième jour, seize prélèvements sanguins sériés en une journée pour doser une hormone, avant d'être tuées le lendemain par perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde. Le porteur indique que ces manipulations peuvent provoquer douleur, perte de poids et perte de mobilité, atténuées par des analgésiques. Il affirme qu'il est "impossible" d'utiliser un modèle in vitro et que l'étude de la kisspeptine sur la reproduction "nécessite un système complexe et vivant".

Objectifs

Dans certains contextes physiologiques, les taux de prolactine (une hormone produite par les cellules lactotropes situées dans l’hypophyse) augmentent induisant ainsi une infertilité permettant le bon déroulement des processus physiologiques associés (notamment lors de la grossesse ou des périodes d’allaitement). Cependant, des phénomènes pathologiques peuvent également induire une augmentation importante des taux de prolactine sanguine, avec des valeurs supérieures à 25ng/ml (contre 5 à 10 ng/ml en situation non pathologique) et induisant alors une hyperprolactinémie. Parmi les symptômes associés, la fonction de reproduction se retrouve être le principal processus physiologique impacté. A ce jour, l’hyperprolactinémie est principalement traitée par des agonistes dopaminergiques La reproduction est principalement contrôlée au niveau du système nerveux central, notamment grâce à la kisspeptine, un neuropeptide produit et sécrété par des neurones spécifiques de l’hypothalamus. De nombreuses études rapportent un lien fonctionnel entre la prolactine et la kisspeptine dans le cerveau. L’une d’entre elle a d’ailleurs mis en évidence l’inhibition drastique de l’expression de kisspeptine en cas d’hyperproduction de prolactine, ce qui réduit la sécrétion de l'hormone gonadotrophique (GnRH) et, ainsi, un hypogonadisme hypogonadotrophique et l’infertilité. Dans notre laboratoire, nous avons produit un analogue de la kisspeptine (ayant une demi vie plus importante que la kisspeptine endogène) et qui a déjà démontré des effets positifs sur la reproduction des animaux d’élevages et les rongeurs. Nous suggérons alors d’utiliser cet analogue de la kisspeptine dans le traitement de l’hyperprolactinémie en utilisant un modèle de souris dans laquelle les taux de prolactine seront très nettement supérieurs à la normale (à l’aide de mini pompes osmotiques délivrant de la prolactine à haute dose de façon continue, pour mimer la pathologie). Dans ce modèle, déjà utilisé dans d’autres études, l’augmentation de la production de prolactine mime ce qui est observé en cas d’hyperprolactinémie hypophysaires avec notamment l’absence de fertilité, l’inhibition de l’expression de la kisspeptine et la baisse importante de la sécrétion des hormones liées à la reproduction.

Bénéfices attendus

Le présent projet vise à utiliser notre analogue de la kisspeptine, comme traitement d’une pathologie affectant la reproduction, l’hyperprolactinémie. En termes de bénéfices, le présent projet permettrait ainsi d’apporter une preuve de concept de l’efficacité de notre molécule dans le traitement d’une pathologie humaine (mimé par un modèle murin), qui pourrait, in fine, être appliqué à d’autres pathologies associées à un dysfonctionnement de la reproduction chez l’Homme.

Procédures

Les 168 animaux inclus dans cette procédure seront soumis à des injections répétées, de façon biquotidienne tous les jours ou tous les 2 jours. Au 20ème jour après le début du protocole, des prélèvements de sang sériés seront réalisés 40 et 20 minutes avant l'injection du traitement puis 20, 40, 60, 80, 100, 120, 180, 240, 300, 360, 420, 480, 540 et 600 minutes après l'injection pour un total de 16 prélèvements afin de doser la concentration plasmatique d'une hormone cible. Au 21ème jour les animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde.

Impact sur les animaux

En termes de manipulation des animaux, les injections et prises de sang sont des manipulations maitrisées par le laboratoire et réalisées par du personnel expérimenté. Cependant, des effets tels que des douleurs, perte de poids et perte de mobilité peuvent être observés mais sont anticipées par l'injection d'analgésiques au moment des procédures. De plus un suivi journalier sera mis en place pour prévenir ce genre d'effets et pouvoir traiter les animaux en conséquence.

Devenir

Afin de pouvoir réaliser des études immunohistochimiques sur tissus fixés, tout les animaux seront perfusés par la voie intracardiaque.

Remplacement

Il nous est impossible d'utiliser des modèles in vitro pour des études mécanistiques de ce type. L'étude de l'effet de l'analogue de la kisspeptine sur la fonction de reproduction en cas d’hyperprolactinémie nécessite un système complexe et vivant tel que le modèle murin afin d'avoir une compréhension complète des mécanismes mis en jeu (effet de la molécule sur la sécrétion des hormones liées à la reproduction, effet sur l’expression de gènes cibles dans des tissus périphériques, …). Aussi, ce genre d’étude n’à, à ce jour, aucun équivalent qui n’emploi pas de modèle animal.

Réduction

Notre protocole expérimental a été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. Ainsi, nous aurons besoin de 7 animaux par groupes afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Avec la formation de 24 groupes nous aurons donc besoin de 168 animaux au total.

Raffinement

Les animaux impliqués dans cette étude sont élevés dans les conditions d'élevage classique dans des cages en présence d'enrichissement (de type carton pour la mise en place d'un nid, petite cabane en carton...). De plus, les animaux seront visités au moins une fois par jour avec contact direct ou non (sans réalisation de procédure), permettant l'habituation de l'animal à l’expérimentateur et un suivi du bien-être des animaux. Aussi, une attention toute particulière sera portée aux points limites. Un suivi journalier sera mis en place tout au long de la période d'expérimentation pour évaluer l'état de bien-être des animaux en s'assurant que les points limites ne soient pas atteints. Le comportement et l'apparence des souris sera suivi avec attention et les animaux seront pesés tous les jours pendant 3 jours après les chirurgies, injections ou prises de sangs puis tous les 2 jours jusqu'aux prochains prélèvements sanguins. Ce suivi permettra d'évaluer le bien-être des animaux et de décider de l'euthanasie ou le soulagement de la douleur des animaux suivant le stade d'atteinte des points limites. Afin de de réduire le stress lié aux prélèvements de sang et permettre l'habituation des animaux à cette procédure, un morceau de nourriture appétente sera apporté aux animaux après chaque prélèvement sanguin.

Choix des espèces

La souris est un très bon modèle pour analyser les effets de composés sur la physiologie et le comportement tout en offrant la possibilité de réaliser des parallèles avec d’autres espèces qui permettront d’avoir un bon aperçu de l’effet de la kisspeptine sur le long terme. Les mécanismes d’action de la kisspeptine, de façon aigüe chez la souris sont très bien documentés au niveau de la physiologie de la reproduction et les mécanismes sous-jacents sont bien décrits et conservés chez les mammifères. Ces études font suite à des manipulations in vitro et permettront, in fine, de poursuivre avec des expérimentations sur l'espèce humaine et constituent alors un chainon essentiel au développement de notre approche de façon optimale et rigoureuse L'approche expérimentale nécessite un système reproducteur complètement développé et mature, les animaux employés devront donc avoir atteint la maturité sexuelle, avec un âge minimal de 9 semaines

12 rats Wistar vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Quatre plaies cutanées sont créées sur chaque animal sous anesthésie, avec des changements de pansement tous les deux jours sous anesthésie et un écouvillonnage répété, avant la mise à mort pour prélever le tissu cicatriciel. Le projet compare le pouvoir cicatrisant de trois miels régionaux de La Réunion, et le porteur suit la douleur au moyen de la Rat Grimace Scale. Il indique avoir déjà mené des tests in vitro et ex vivo sur explants de peau mais affirme "avoir besoin" d'un animal vivant pour étudier la cicatrisation dans son ensemble.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier l’amélioration du processus de cicatrisation par l’usage de miels de production régionale en application locale sur un modèle de plaies cutanée sur des rats Wistar. Le processus de cicatrisation comporte 4 étapes en condition physiologique : l’hémostase, l’inflammation, la prolifération et le remodelage. Ces étapes se succèdent grâce aux recrutements des cellules immunitaires et la migration de cellules résidentes qui vont sécréter des facteurs permettant d’aboutir à la complète réparation de la lésion cutanée. En situation pathologique, ce processus peut être altéré (infection, maladie métabolique, irradiation…) et entrainer un retard de la cicatrisation et/ou une cicatrisation de moins bonne qualité, avec un risque de réouverture récurrente des plaies qui deviennent alors chroniques. Il est donc important d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur l’utilisation de ressources naturelles ayant des propriétés anti-inflammatoires, antioxydantes et anti-microbiennes. A ce titre les miels très utilisés en médecine traditionnelle pour leur potentiel cicatrisant présentent un intérêt croissant. Cependant il manque encore des données scientifiques pour étayer cela. Dans ce projet, les propriétés cicatrisantes de 3 miels appliqués localement ; avec une composition, des propriétés physico-chimiques et biologiques différentes en comparaison à un sucre analogue, à un miel commercial de référence et à un contrôle sans traitement (miel remplacé par de la vaseline) ; seront évaluées sur un modèle de plaies cutanées sur rat Wistar. Dans un premier temps, nous souhaitons évaluer les propriétés cicatrisantes des miels sur des plaies aigües en condition non pathologique. Nous pourrons ainsi étudier d’une part la potentielle amélioration de la qualité de la cicatrisation (composition du tissu cicatriciel, force, tension, contraction et résistance) et d’autre part la possible accélération du processus de cicatrisation.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent principalement la santé humaine et vétérinaire. Les données scientifiques feront l’objet de publications dans des journaux internationaux permettant ainsi une valorisation de la biodiversité locale. De plus, cette étude participe au développement d’une nouvelle stratégie thérapeutique innovante, dans les cas de plaies chroniques retrouvées dans le cadre de complications associées à des pathologies comme l’obésité et le diabète, qui constitutent de véritables problèmes de santé publique sur le territoire réunionnais.

Procédures

Les différentes interventions réalisées sur les 12 rats de l'étude sont les suivantes : - Procédure chirurgicale sous anesthésie générale volatile (30 min) - Changement de pansement (tous les deux jours) sous anesthésie générale volatile (15 min) avec écouvillonnage des plaies (à J0, J+10, J+20) - Mise à mort des 12 rats à la fin de l'étude sous anesthésie générale volatile

Impact sur les animaux

Les principales nuisances sont celles imputables à la chirurgie à savoir : anesthésie, injections, réalisation des plaies, stress et douleurs. Le suivi des plaies se faisant tous les deux jours sous anesthésie, peut engendrer un stress lié à l’endormissement et au réveil de l’animal. De plus, le positionnement des pansements peut constituer une gène (risque de retrait du pansement, difficultés à se mouvoir). L’isolement des rats en cas d’atteintes de points limites peut également constituer une source de stress.

Devenir

Mise à mort pour récupération du tissu cicatriciel et analyses histologiques et biochimiques.

Remplacement

Des tests préliminaires in vitro de cytotoxicité ont été réalisés préalablement sur un modèle de cellules épithéliales humaines de la peau, afin d’extrapoler la concentration de miel à utiliser sur notre modèle animal. De même, les propriétés anti-inflammatoires et l’impact des miels sur la capacité de migration des cellules ont été évaluées in vitro. Par ailleurs, le potentiel anti-microbien des miels a été démontré sur des micro-organismes fréquemment retrouvés dans les plaies. Pour compléter cela et affiner les critères de séléction des miels, une étude ex vivo a été menée sur des explants de peau de rats, permettant de discriminer trois miels au potentiel cicatrisant remarquable. Afin de répondre à notre objectif scientifique, nous avons besoin d’évaluer les propriétés des miels sur un modèle animal vivant pour étudier le processus cicatriciel dans son ensemble, notamment des phases telles que l’angiogénèse et la réinnervation, avec les contraintes que peut subir la peau au quotidien à savoir étirement, relâchement, inflammation locale.

Réduction

Nous avons pu réduire le nombre de rats grâce à une revue systématique bibliographique et à l’utilisation de l’outil statistique R. De plus, la taille des plaies induites de 6 mm, ainsi que la taille des rats, permettront de réaliser 4 plaies par animal. Enfin, les analyses biochimiques et histologiques pourront être réalisées sur les mêmes plaies permettant de réduire encore le nombre d’animaux.

Raffinement

Notre protocole a été optimisé afin de minimiser au maximum les contraintes subies par les animaux. La procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie avec une couverture analgésique en respectant strictement les règles d’asepsie. Le matériel chirurgical utilisé sera rigoureusement stérilisé au préalable. Les miels utilisés sur les plaies induites auront été soumis à un contrôle microbiologique. Les animaux seront surveillés plusieurs fois par jour et seront observés tous les jours pour détecter tout inconfort lié aux procédures, avec un suivi post-opératoire renforcé dans les premières 48h ainsi que dans les phases de réveil faites en chambre de réveil thermostatée. Nous effectuerons également un scoring de la douleur via l’outil du Rat Grimace Scale.

Choix des espèces

Le modèle du rat WISTAR a été selectionné dans cette étude. Le rat est un modèle largement utilisé dans la recherche pré-clinique en chirurgie. La souche de rat choisie est reputée robuste et elle est peu couteuse. Il s’agit d’un modèle de référence dans les études sur la réparation de lésions cutanées et le modèle expérimental est donc très bien référencé. Par ailleurs, ce modèle possède une architecture de la peau proche de celle retrouvée chez l’Homme ; présence d’épiderme, lame basale, derme, hypoderme et présence de follicules pileux. La taille de l’animal nous permettra de faire plusieurs plaies par rat et donc de réduire notre nombre total d’animaux. Nous travaillerons avec des rats mâles adultes de 8 semaines (300 g en moyenne). Les jeune râts adultes ont une meilleure récupération post-chirurgicale et nous n’ajouterons pas de biais de cicatrisation lié à l’âge de l’animal qui aura une peau plus souple à 8 semaines. Cela permettra d’avoir un processus de cicatrisation optimal.

60 gerbilles de Mongolie vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est opérée des deux oreilles en une seule intervention de 45 à 60 minutes, pour recevoir un implant d'oreille moyenne chargé en dexaméthasone, et passe sous anesthésie générale, avant et après l'opération, trois ou huit enregistrements de son audition. Après un ou six mois, l'équipe prélève sous anesthésie le liquide de son oreille interne, puis la tue pour analyser ses cochlées. Le seul effet indésirable listé est une perte auditive due à l'implant, et le porteur décrit la chirurgie comme "peu invasive et peu douloureuse". Il affirme que seul un "modèle animale vivant" permet de suivre la diffusion du médicament dans l'oreille interne.

Objectifs

Selon l'OMS, 360 millions de personnes souffrent de déficience auditive handicapante (5 millions en France). Les traitements médicaux destinées a l’oreille interne par voie systémique sont limitées par l’existence de la barriere hémato-cochléaire qui empeche le principe actif d’atteindre sa cible. L’objectif de l’étude est le développement d’outils de délivrance de principes actifs via la fenêtre ronde.

Bénéfices attendus

Nous espérons que le prélèvement de liquide périlymphatique à l’apex cochléaire permettra une analyse précise et fiable de la pharmacocinétique du médicament. Nous nous attendons à mettre en évidence des concentrations plus élevées en dexaméthasone avec l’implant d’oreille moyenne, sans gradient de concentration baso apical et avec une concordance de gradient histo-biochimique. Nous espérons mettre en évidence une durée prolongée de délivrance de la dexaméthasone dans le groupe « long terme ».

Procédures

- Potentiels évoqués auditifs (PEA) réalisés sous anesthésie générale pour une durée totale de 20 à 30 minutes maximum. Toutes les gerbilles avant la chirurgie puis à 1 semaine et 1 mois post opératoire et à 2 mois, 3 mois, 4 mois, 5 mois et 6 mois pour le groupe "long terme". Cela correspond à 3 interventions dans le groupe "court terme" et 8 interventions dans le groupe "long terme". - Chirurgie d'implantation du dispositif d'oreille moyenne sous anesthésie générale pour une durée totale de 45 à 60 minutes selon la courbe d'apprentissage : toutes les gerbilles avec le dispositif chargé en dexaméthasone dans une oreille, la moitié des gerbilles bénéficiera du dispositif non chargé en dexaméthasone dans l'oreille controlatérale et l'autre moitié bénéficiera d'une injection transtympanique de dexaméthasone dans l'oreille controlatérale. Ainsi, chaque gerbille bénéficiera d'une seule intervention au cours de laquelle les 2 oreilles seront opérées. - Prélévement péri lymphatique à l'apex cochléaire sous anesthésie générale de chaque oreille soit une durée totale de 40 à 50 minutes : à 1 mois pour le groupe "court terme" et à 6 mois pour le groupe "long terme". Chaque gerbille bénéficiera d'une seule intervention au cours de laquelle le prélèvement sera réalisé sur les 2 oreilles.

Impact sur les animaux

Perte auditive lié à l'implantation du dispositif d'oreille moyenne.

Devenir

L'ensemble des 60 animaux seront mis à mort après le prélévement péri lymphatique afin de réaliser le prélèvement puis l'analyse en immunofluorescence des cochlées.

Remplacement

Il s'agit d'une étude de délivrance d'un produit au sein de l'oreille interne, il n'existe pas d'alternative non animale pour la réalisation de ce type d'étude. Seul un modèle animale vivant peut nous permettre d'étudier la pharmacocinétique du dispositif au sein de l'oreille interne.

Réduction

Un nombre d'animaux suffisant (30 par groupe) a été choisi pour pouvoir réaliser des tests statistiques paramétriques, qui sont plus robustes (Tests t de Student et ANOVA). Les deux oreilles de chaque animale sera utilisé : l'une bénéficiera du principe actif l'autre bénéficiera de la technique de référence ou sera utilisé comme controle négatif.

Raffinement

En cas de signe(s) de souffrance (hyperactivité ou isolement, indifférence par rapport au milieu extérieur, diminution du comportement exploratoire, fuite ou défense à la manipulation, poil hérissé par absence de toilettage, voussure dorsale, vocalises, perte de poids supérieure à 10 %) un traitement analgésique sera mise en place précocément par injection intrapéritonéale de Buprénorphine (Vétergésic® ou Buprécare®) à raison de 0,03 mg/kg toutes les 6 à 8 heures. Cette situation est peu probable car il s'agit d'une chirurgie peu invasive et peu douloureuse.

Choix des espèces

La gerbille de Mongolie est un excellent modèle animal en audiologie et otologie pour 4 raisons : - spectre auditif étendu aux basses fréquences, ce qui en fait le rongeur (avec le Chinchilla) qui présente le spectre auditif le plus proche de l'Homme, - bulle auditive (zone qui contient les oreille moyennes et internes) naturellement hypertrophiée, ce qui en fait un bon modèle chirurgical pour ces régions, - rareté des épisodes d'otites moyennes aiguës, ce qui en fait un bon modèle pour l'évaluation non infectieuse des chirurgies otologiques, - ancienneté d'utilisation du modèle depuis de nombreuses années par notre équipe nous permettant d'acquérir une certaine expertise le concernant. Les gerbilles de Mongolie auront environ 10 mois, ce qui constitue le meilleur compromis entre un âge adulte donnant des animaux de taille suffisante pour faciliter la microchirurgie et un âge suffisamment jeune permettant de s’affranchir des problèmes de presbyacousie. En effet, la gerbille de Mongolie est un excellent modèle animal de presbyacousie. Son audition est adulte à partir de 18 jours et la presbyacousie débute vers 18 mois, avec une élévation du seuil de 10 dB SPL vers 22-24 mois et une franche perte auditive (20 à 30 dB SPL) à 36 mois de vie.

1920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit un infarctus provoqué par l'obstruction d'une artère coronaire, l'implantation sous-cutanée d'une mini-pompe et deux échocardiographies sous anesthésie, avant d'être tué par exsanguination intracardiaque ou dislocation cervicale pour prélever le cœur. Le porteur reconnaît que l'insuffisance cardiaque provoquée par l'opération peut être une source de souffrance. Il décrit la souris comme un "modèle de choix" et qualifie cette étape d'"indispensable" avant l'homme, les retombées cliniques restant formulées au conditionnel.

Objectifs

​L’insuffisance cardiaque (IC) est une pathologie qui touche le muscle cardiaque et qui indique l’incapacité du cœur à assurer son rôle de pompe. L'IC touche plus de 1,2M de personnes en France et est caractérisée par une lourde mortalité. Les causes de l’insuffisance cardiaque sont nombreuses mais la cause la plus fréquente est l’infarctus de myocarde (IM). Celui ci est caractérisé par une perte de masse musculaire et qui est remplacé par un tissu fibreux qui ne peut plus se contracter. Ces modifications mèneront à l’IC avec une diminution de la capacité du coeur à pomper le sang dans la circulation. Actuellement, il n’existe aucun traitement efficace pour limiter cette fibrose cardiaque. L’objectif de ce projet est de tester de nouvelles molécules qui empéchent le développement de la fibrose et préservent le muscle cardiaque et son fonctionnement. Ces nouveaux principes thérapeutiques seront étudiés dans un modèle d’infarctus du myocarde chez la souris car il se rapproche beaucoup de ce qui est observé chez l'homme. Ces résultats seront considérés comme un programme de développement pré-clinique pouvant soutenir le passage ultérieur chez l’homme.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer le bénéfice d'une nouvelle approche thérapeutique limitant le développement de l’IC. Les résultats de ce projet pourront soutenir un futur projet chez l'homme.

Procédures

Dans le cadre de ce projet de recherche, nous allons réaliser 5 interventions : Dans un premier temps, réaliser une échocardiographie sous anesthésie générale sur tous les animaux afin de mesurer la fonction cardiaque de base (15 minutes par souris). Dans un second temps, implanter une mini-pompe osmotique en sous cutanée pour tous les animaux et sous anesthésie générale (10 minutes par souris). Deux jours après, induire une ischémique myocardique permanente par l’obstruction de l’artère coronaire sous anesthésie générale et locale. Cette intervention est unique, réalisée une seule fois sur chaque souris modèle et dure moins de 20 minutes. 7 jours ou 14 jours après la chirurgie (selon le protocole), réaliser une deuxième échocardiographie (15 minutes par souris) pour mesurer la fonction cardiaque post chirurgie et post traitement. Ce geste sera réalisé sur l’ensemble des animaux sous anesthésie générale. Un groupe d’animaux (160 souris) sera mis à mort par exsanguination intracardiaque et le cœur sera ensuite prélevé pour une étude histologique. Pour le reste des animaux (1760 souris), ils seront mis à mort par une dislocation cervicale (animal sous anesthésie générale profone à l'isoflurane 5%).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont liés à l’expérimentation, principalement l’inconfort lié à la préhension des animaux et la douleur au point d’injection. Il y a également les effets indésirables liés à la chirurgie comme l’insuffisance cardiaque. En effet, cette chirurgie pourrait être une source de douleur pour les animaux et l’insuffisance cardiaque engendrée par l’opération peut être également une source de souffrance pour la souris. Cependant, il n’y a aucun effet indésirable lié à l’échocardiographie.

Devenir

A l’issue des différents gestes techniques réalisés sur le même animal (imagerie échocardiographie, implantation d’une mini-pompe, infarctus du myocarde, exploration de la fonction cardiaque), tous les animaux seront mis à mort dans le but de prélever le cœur. Ceci nous permettera d’étudier l’efficacité du traitement à l’aide de différentes techniques (histologie, immunohistochimie, cytométrie en flux, western blot …).

Remplacement

Les molécules à étudier ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro qui nous ont permis d’identifier les cibles thérapeutiques impliquées dans la fibrose. Notre projet nécessite d'utiliser un modèle in vivo en raison d’une approche physiopathologique du système cardiovasculaire intégrée sur animal entier. La réalisation de ce projet constitue une des étapes précliniques indispensables avant l’application chez l’homme de ces approches thérapeutiques.

Réduction

La physiopathologie ainsi que la cinétique du modèle (infarctus du myocarde) sont bien connues et ont été bien étudiées ce qui permet de mieux définir la durée des expériences et éviter la mise à mort des animaux à différent temps après la chirurgie. Le nombre d'animaux nécessaire a été défini en fonction de type d’analyses nécessaires pour tester l’efficacité des traitements et nous avons pris en compte la mortalité des souris infarcies durant le protocole de telle sorte que les résultats obtenus soient suffisants statistiquement pour conclure sur l'efficacité de nos approches thérapeutiques. Les analyses sont généralement réalisées avec un nombre minimal de 6 animaux survivants par groupe. Les méthodes d'imagerie qui seront utilisées étant non invasives et non douloureuses, les animaux pourront être suivis au cours du temps et les paramètres étudiés seront mesurés chez le même animal. De plus les molécules seront, dans un premier temps, testées uniquement pendant 7 jours (post-op) afin de vérifier leur efficacité. Si nous remarquons que les traitements sont efficaces, nous continuerons les expériences avec une durée de traitement plus longue (14 jours post-op). Si nous ne voyons aucun effet du traitement à 7 jours, le projet s’arretera et nous n’utiliserons pas les souris dédiées pour une durée de traitement plus longue.

Raffinement

Le suivi quotidien des animaux par un personnel qualifié et la mise en place de points limites adaptés permettront d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur, d’abord par l’injection des antalgiques dans la limite du possible pour ne pas interférer avec l’expérience en cours et par une mise à mort anticipée selon les méthodes réglementaires, si nécessaire. L'ensemble des chirurgies de ce projet sera réalisé sous anesthésie générale associée à une analgésie pré-opératoire.

Choix des espèces

La recherche clinique sur la fibrose cardiaque chez l’homme est limitée pour des raisons éthiques, c’est pourquoi le recours aux modèles animaux est indispensable pour élucider les mécanismes mis en jeu. La souris est un des modèles les plus utilisés en recherche biomédicale. Au-delà de l’aspect pratique (reproduction rapide, connaissance du modèle, coût modéré), la proximité de son génome avec le génome humain (80% d’homologie) en fait un modèle de choix : par exemple la structure des tissus musculaires et cardiaques murins est très proche de celle de l’homme. Nous pouvons donc utiliser la souris comme modèle expérimental et les résultats observés permettront de mieux comprendre la fibrose et prédire l’efficacité du traitement chez l’Homme. Des souris jeunes adultes (agées de 8 à 12 semaines) car leur système cardiovasculaire est bien developpé.

96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat subit une chirurgie du fémur pour y greffer un biomatériau imprimé en 3D, puis quatre séances d'imagerie X et IRM sous anesthésie sur huit semaines, avant la mise à mort pour analyser l'os. Le porteur indique une douleur modérée liée à la chirurgie et prévoit la mise à mort si la perte de poids dépasse le seuil fixé. Il présente cette étape sur le rat comme un préalable à des essais chez de "gros animaux" puis en clinique, l'issue conditionnant de futures demandes de financement.

Objectifs

En raison des changements de mode de vie et du vieillissement des nations industrialisées, les lésions osseuses traumatiques et les fractures fragiles induites par l'ostéoporose représentent un énorme défi médical et socio-économique. Ce projet vise à créer une nouvelle approche de régénération osseuse qui combine l'administration de gènes et l'impression 3D pour la création de matrices personnalisées qui permettraient d'aboutir à une meilleur réparation osseuse ainsi qu'une meilleure régénération des nerfs et des vaisseaux sanguins de la zone.

Bénéfices attendus

Les résultats des expériences menées sur ce modèle animal sont un préalable à la poursuite des travaux sur d'autres modèles, notamment chez les gros animaux. De mauvais résultats obtenus avec ce biomatériau conduiront à son abandon. En revanche, des résultats positifs (régénération osseuse au moins partielle, supérieure à celle observée avec le matériau de référence) permettent d'envisager le dépôt de demandes de financement pour la poursuite des études : tests chez le gros animal, puis essais cliniques.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une chirurgie orthopédique (il s'agit d'un acte chirurgical unique d'une durée de 20 minutes), puis à 2 séances d'imagerie de rayons X (durée de l'examen: 15 minutes) et d'IRM (durée de l'examen: 30 minutes) à J1, J14, J28, J56. Toutes les séances d'imagerie se dérouleront sous anesthésie.

Impact sur les animaux

La chirurgie orthopédique peut entraîner une douleur modérée. La radiographie et l'IRM peuvent être considérées comme des actes expérimentaux de gravité légère , développées sous anesthésie générale.

Devenir

Ils sont tous euthanasiés à semaine 8 pour procéder à une analyse histologique des tissus dans la région opérée.

Remplacement

L'utilisation en clinique d'un nouveau procédé chirurgical avec un biomatériau nécessite impérativement une phase d'expérimentation pré-clinique. Des études in vitro ont été réalisées pour éliminer une éventuelle toxicité cellulaire du biomatériau et pour évaluer le potentiel de différenciation ostéoblastique de ce complexe. Aucune méthode in vitro actuelle (ex. organoïdes, sphéroïdes,...) n'a démontré la capacité ou ne présente de validation scientifique permettant d'étudier simultanément la formation osseuse, la vascularisation et l'innervation induites par les biomatériaux tout en tenant compte de la complexité d'un être vivant (système immunitaire, flux sanguin...).

Réduction

L'utilisation de systèmes d'imagerie non invasive (IRM et microtomographie de rayons X) permet de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés. En effet, le suivi de chaque animal permet d'obtenir des informations sur le processus de régénération et sur divers autres paramètres biologiques à différents temps, sans avoir besoin de euthanasier les animaux. Sans ces procédures, il faudrait envisager des groupes de rats pour chaque temps expérimental où une analyse est requise.

Raffinement

Toutes les interventions sont faites sous anesthésie générale et une analgésie adaptée sera appliquée en post-opératoire pour limiter la douleur. La chirurgie est faite dans les meilleures conditions d’asepsie, d’anesthésie, de prise en charge de la douleur. Surveillance accrue des animaux en post opératoire pour détecter tout signe de souffrance, et la soulager. L'itinéraire et les plans de voyage entre l'animalerie et les sites d'imagerie par rayons X et IRM seront optimisés afin de réduire la durée du voyage. Les animaux pourront s'acclimater après le transport afin de réduire leur détresse. Les conditions optimales d’hébergement sont garanties pour les animaux tout au long du projet. Toutes les modifications de comportement et d’aspect seront consignées dans un fichier informatique par les personnes impliquées directement dans ce projet. Les critères suivants seront prépondérants dans la détermination des points limites: en cas de isolement de l’animal, poil hérissé́, ou perte de poids hebdomadaire supérieure à 20 %, de la nourriture hydraté et de l’eau sera mise à disposition au fond de la cage, et un traitement antalgique par Buprénorphine sera également administré, cependant, en cas de persistance de un de ces points pendant plus de 3 jours, le vétérinaire ou le porteur de projet sera contacté pour prendre une décision sur la procédure à adopter (continuation/adaptation des soins ou mise à mort); la perte de poids pendant plus de 5 jours entraînera la mise à mort immédiate de l’animal; et la perte de poids pendant plus de 2 jours, associé à des problèmes de locomotion, et douleur évidente au niveau de la patte opéré, entraînera aussi la mise à mort immédiate de l’animal.

Choix des espèces

Le rat Sprague Dawley a été choisi à la suite de travaux réalisés dans notre laboratoire et par d'autres équipes portant sur l'analyse des propriétés histologiques et biologiques des membranes induites en site osseux fémoral chez le rat . Il est d'autre part décrit dans de nombreuses études dans le monde. Animaux adultes , poids 350-400 grammes. La croissance du squelette doit être arrivée à son terme. Il faut des animaux de poids suffisant pour supporter la procédure

300 rongeurs, 200 souris et 100 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce sont des animaux sains, soumis à des examens d'IRM sous anesthésie pouvant durer jusqu'à trois heures avec injection d'un agent de contraste, uniquement pour mettre au point des séquences d'imagerie. Le porteur indique que l'anesthésie provoque hypothermie, dépression respiratoire et cardiovasculaire, et présente pourtant l'IRM comme "en parfaite adéquation avec les 3R". Ces animaux sains sont tués à l'issue, jugés non réutilisables du fait de leur âge et des anesthésies répétées.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mettre au point, optimiser et développer de nouvelles méthodes d’imagerie par résonance magnétique (IRM) afin d'offrir le plus grand panel d'outil pour la caractérisation, la recherche de biomarqueurs de pathologies. L’IRM, technique d’imagerie biomédicale en perpétuelle évolution, est extrêmement attractive pour les études précliniques et cliniques. Elle est non invasive et non irradiante en parfaite adéquation avec les 3Rs. Elle permet : 1) de remplacer l’utilisation de techniques plus invasives pour l’obtention d’information similaire ; 2) d’avoir des informations anatomo-fonctionnelles complémentaires et/ou inaccessibles par d’autres techniques dans des conditions de bien-être animal sans comparaison. Ces nouvelles informations peuvent être intégrées dans une étude pour la raffiner comme nouveau critère d’inclusion ou d’exclusion. Cela permet d’obtenir une meilleure qualité des résultats qui n’auront pas besoins d’être répétés, réduisant ainsi le nombre d’animaux; 3) un suivi longitudinal individuel des modifications anatomo-fonctionnelles permettant ainsi de réduire très significativement le nombre d’animaux nécessaires ; 4) d’avoir accès à des informations déjà utilisées chez l’homme quotidiennement dans les services hospitaliers, permettant de développer des projets de recherche translationnelle.

Bénéfices attendus

L’IRM est une technique d’imagerie biomédicale non-invasive et non irradiante largement utilisée chez l’Homme. Son utilisation dans les projets précliniques permet de remplacer des techniques plus invasives, de réduire le nombre d’animaux avec des suivis longitudinaux, de raffiner en donnant accès à de nouveaux points limites précoces.

Procédures

Examen IRM sous anesthésie d'une durée maximum de 3h. Injection d'agent de contraste sous anesthésie (durée du geste 1 min max.).

Impact sur les animaux

L’anesthésie entraîne une hypothermie, une dépression respiratoire et cardiovasculaire.

Devenir

Dans la mesure du possible, afin de respecter la règle des 3Rs, les animaux de ce projet seront des animaux sains de réforme non au-préalable utilisés dans un autre projet. Ne pouvant pas être réutilisés au-delà de ce projet du fait souvent de leur âge (animaux de réforme), la répétition de l'anesthésie et surtout la présence d'agent de contraste, ils seront mis à mort à l'issue des procédures.

Remplacement

Des objets tests seront utilisés autant que possible pour limiter l’utilisation des animaux vivants. Malheureusement, à l’heure actuelle, aucun ne reproduit le tissu vivant et les contraintes pour l’IRM de ce dernier (mouvement respiratoire, cardiovasculaire, flux sanguin, hétérogénéité des tissus…). De ce fait, nous sommes contraints de valider nos paramètres sur des animaux vivants.

Réduction

Plusieurs stratégies vont être utilisées pour limiter au maximum le nombre d’animaux dans ce projet consistant à la mise au point de protocole : l’utilisation d’objet test, le passage à l’IRM à plusieurs reprises du même animal et, dans la mesure du possible, nous utiliserons des animaux de réformes.

Raffinement

Les animaux seront anesthésiés et monitorés durant les examens IRM et pour les injections limitant ainsi la douleur. Ils seront hébergés en groupe dans un milieu enrichi (tunnel, élément pour nidification, baton à ronger). A noter que le tunnel permettra la manipulation des animaux éveillés limitant ainsi le stress de la manipulation. Des points limites ont été définis et adaptés par procédure.

Choix des espèces

L’IRM préclinique est un appareil dédié aux études sur les rongeurs. Le rongeur (souris, rat) est depuis toujours le modèle de prédilection pour la recherche biomédicale, par sa taille, son coût, sa manipulation aisée et son taux élevé de reproduction. Il est utilisé comme modèle standard pour l’étude de la plupart des pathologies. Les organes ayant des tailles et des caractéristiques à l’IRM différentes au cours du développement, les animaux sains utilisés seront à différents stade de développement allant de quelques jours après la naissance à l’état adulte.