Rongeurs

331 animaux non-humains vont être utilisés, 200 souris et 125 rats tués à l'issue pour prélèvement d'organes, et six macaques à longue queue réaffectés à d'autres projets d'imagerie. Ils reçoivent par voie nasale et intraveineuse un candidat médicament contre un déficit congénital en créatine, les macaques subissant en plus une immobilisation en cadre stéréotaxique pour une IRM de trois heures et demie sous anesthésie. Le porteur reconnaît des douleurs au point d'injection, une perte de poids et une toxicité possible par voie nasale, et situe l'application chez l'humain et les essais cliniques à venir. Il affirme que les tests d'innocuité "ne peuvent être faits que chez l'animal" et les juge "plus que nécessaires".

Objectifs

Le contexte du projet est le développement d’un candidat médicament pour le traitement du déficit congéntial en créatine, maladie pour laquelle il n’y a à ce jour aucun traitement. L’objectif de ce projet est de: (i) - développer une méthodologie IRM pour évaluer la biodistribution et l’efficacité thérapeutique d’un candidat médicament après son administration in vivo par la voie nasale. -(ii) tester et valider le traitement et la méthode d’imagerie par IRM du deutérium chez le primate sur un IRM. -(iii) valider l’innocuité du candidat médicament et de deux autres molécules chez le rat.

Bénéfices attendus

La démonstration de la présence de créatine chez le primate après une administration intranasale du DCE (Dodecyl Creatine Ester) marqué au déteurium permet d’envisager cette voie d’administration chez l’homme. De même l’évaluation de l’innocuité du traitement DCE chez le rat permet d’envisager les études de toxicologie réglementaire et à terme des études cliniques de phase I ou phase de tolérance chez le volontaire sain et une phase clinique d’efficacité pharmacologique du candidat médicament DCE.

Procédures

Les animaux seront soumis à une administration pendant quelques minutes du candidat médicament DCE par voie nasale et intraveineuse. La durée de traitement est de 30 jours chez le primate et la souris pour le transporteur de la créatine. Cette durée de l’intervention est de quelques minutes et le de traitement est réduite à 15 jours chez le rat. Pour les études chez la souris et le rat, à la fin de chaque traitement les animaux seront mis à mort.. Une seule imagerie sera effectuée chez le macque sous anesthésie d’une durée de 3h30..

Impact sur les animaux

Douleur au site d’injection, stress lié à la durée du traitement, perte de poids, effets indésirables liés à l’inoculation et toxicité voie nasale

Devenir

Les souris et les rats seront euthanasiés à la fin de chaque expérimentation pour des prélèvements d’organes. Les primates seront affectés à d’autres projets d’imagerie avec l’accord du vétérinaire.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes permettant d’évaluer le passage cérébral de candidats par voie nasale en utilisant l’imagerie IRM. De plus, les tests d’innocuité du traitement DCE ne peuvent être faites que chez l’animal. Ces tests sont plus que nécessaires pour valider le mode d’administration du médicament qui sera administré chez le patient et garantir la non toxicité du médicament qui sera administré plus tard chez l’homme.

Réduction

Les procédures d’imagerie utilisées sont non-invasives. Ceci permet des mesures longitudinales, réduisant le nombre total d’animaux. Le nombre total de séances sera limité à 7, avec un minimum de 7 jours séparant les séances. Le nombre de souris (n=20/groupe) a été établi selon notre expérience de la sensibilité des mesures IRM pour détecter un effet sur de faibles concentrations de créatine. Le nombre de primates (n=6) est standard dans la littérature pour mettre en évidence un biomarqueur en mesurant une moyenne et un écart-type pertinent. Le nombre de rats par groupe (n=5) pour l’évaluation de l’innocuité du traitement par voie nasale est le nombre minimal utilisé pour l’évaluation des effets toxicologiques de candidats médicaments. Celui de 25 rats par ester de créatine (3 molécules) pour l’étude vie la voie iv est aussi un nombre minimum pour 5 groupes d’animaux.

Raffinement

L’hébergement animal est en accord avec l’annexe III de la directive 2010/63/EU : environnement enrichi selon nos procédures standards, hébergement en groupe social dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h, eau/nourriture ad libitum. Les animaux seront examinés quotidiennement par les techniciens animaliers, sous la supervision permanente du vétérinaire clinicien, également en charge du bien-être animal. La douleur liée à la fixation en cadre stéréotaxique pendant l’imagerie sera minimisée par l’application locale de xylocaïne (gel 2%) dans les oreilles. La douleur liée à la fixation en cadre stéréotaxique pendant l’imagerie sera minimisée par l’application locale de xylocaïne (gel 2%) dans les oreilles. Un suivi des paramètres physiologiques est assuré durant les anesthésies afin d’adapter les mesures compensatrices (soutien thermique, perfusion, anesthésique). Pour l’administration du traitement en spray ou en solution dans les narines, les animaux seront soit habitués à la contention vigile (souris), soit soumis à une anesthésie courte (primates, ~15 min). Des données préliminaires montrent qu’il n’y a pas de signe de gêne chez le rongeur suite à l’application quotidienne du produit

Choix des espèces

La maladie d’intérêt est une maladie grave avec des conséquences cognitives importantes chez l’enfant. Seul un modèle transgénique rongeur déficitaire en transporteur de la créatine existe à l’heure actuelle pour évaluer la distribution cérébrale et l’effet thérapeutique de l’apport en créatine exogène. La transposition de l’étude rongeur chez le primate permet de s’assurer et de valider le passage cérébral par voie nasale du candidat médicament l’ester dodécylique de créatine et donc de valider la stratégie thérapeutique qui sera utilisée chez l’homme, étant donné la similitude anatomique de la muqueuse nasale entre le primate non humain et l’homme. De plus, le modèle macaque permettra à terme d'intégrer des méthodes d'évaluation fonctionnelles, de comportement et de signes cliniques, qui peuvent être directement extrapolées à l'homme dans une démarche translationnelle. Le rat est l’animal utilisée dans l’évaluation des effets toxicologiques de candidats médicaments. Ce sera ensuite une des 2 espèces utilisées dans les études réglementaires. Les animaux adultes seront utilisés car le développement cérébral est achevé à ce stade. La maturation du cerveau peut avoir un impact sur la quantité totale de créatine

180 animaux non-humains, 90 souris et 90 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisés d'une séance à l'autre plutôt que tués, avec une adoption parfois envisagée. Chaque animal sert de support à des étudiants qui s'exercent à la préhension, à la contention et à des injections sous-cutanées, jusqu'à douze piqûres réparties sur six séances. Il ne s'agit pas de produire des connaissances mais de valider une formation réglementaire à l'expérimentation animale, le porteur soulignant qu'elle "confère un avantage décisif" aux diplômés sur le marché de l'emploi. Il indique que sur quatre séances une seule recourt à des animaux vivants, les autres utilisant vidéos, mannequins en silicone et cadavres.

Objectifs

L’objectif est de couvrir la partie pratique relative à l’obtention d’une formation spécifique en expérimentation animale, qui permettra à nos étudiants d’obtenir des compétences professionnelles dans le domaine. Dans le cadre d’une Unité d’Enseignement optionnelle, nos étudiants peuvent suivre une formation spécifique destinée aux personnes appliquant les procédures expérimentales aux animaux. Ce type de formation réglementaire à l’expérimentation animale doit permettre l’acquisition de compétences théoriques et pratiques permettant la manipulation d’animaux dans le respect de leur bien-être. Conformément à l’agrément de cette formation par le Ministère de l'Agriculture, il s’agira d’enseigner aux étudiants de bonnes pratiques pour la réalisation des méthodes de préhension, de contention et d’injections chez le rat et la souris de laboratoire. Tous ces actes sont de sévérité modérée pour l’animal. Les travaux pratiques que nous souhaitons réaliser permettent une familiarisation progressive des étudiants avec l’animal de laboratoire. Ils seront réalisés en effectif réduit, sous la tutelle d’enseignants et de techniciens expérimentés portant une grande attention au bien-être de l’animal. Des enseignements plus théoriques d’éthique, de réglementation, de physiologie nociceptive, de bien-être animal, de points limites, d’anesthésie et d’analgésie viennent compléter ces connaissances afin que les étudiants soient en mesure d’adapter leur pratique au comportement de l’animal qu’ils manipulent. Le choix des rongeurs s’explique par l’utilisation majoritaire de ces modèles animaux en expérimentation. Les travaux pratiques se dérouleront en 4 séances, dont 1 seule requière l’utilisation d’animaux vivants, les 3 autres séances se font par des méthodes alternatives. Cette formation est optionnelle dans le cursus des étudiants, seuls des étudiants volontaires seront amenés à manipuler des animaux. Nous formerons jusqu’à 96 étudiants par an, nous aurons recours à l’utilisation maximale de 90 rats et 90 souris soit 180 animaux pour ces travaux pratiques sur 5 années de formation. Ces chiffres correspondent à l’utilisation d’un animal de chaque espèce par étudiant et à un animal surnuméraire prévu pour la démonstration par l’encadrant. Les animaux utilisés seront tous des animaux de réforme. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, après évaluation pour chaque animal de la gravité réelle et sur avis vétérinaire, les animaux seront proposés à l’adoption.

Bénéfices attendus

Les objectifs pédagogiques des séances de travaux pratiques sont : - la familiarisation des étudiants avec les animaux, sensibilisation au respect du bien-être animal - l’acquisition des compétences techniques de préhension, contention et injection sous-cutanée sur animal vigile - l’apprentissage des règles d’hygiène et sécurité propres à la pratique de l’expérimentation animale - la connaissance du matériel nécessaire aux injections, préparation de ce matériel, notions d’asepsie - une mise en situation dans des conditions réelles de l’expérimentation animale De plus, l'obtention du diplôme de licence ou master incluant la certification à l'expérimentation animale confère un avantage décisif aux diplômés en recherche d'emploi sur des postes de R&D

Procédures

Chaque animal sera manipulé pour la préhension, la contention et une injection sous-cutanée à chaque séance. La durée de la séance de TP a une durée totale de 4h comprenant : - le temps d’équipement des étudiants (surchausse, blouse, etc), - la familiarisation avec la pièce de manipulation (odeur, température), - les explications et les démonstrations fournies par les encadrants, - la réalisation des gestes (durée contention / injection SC : max 1 min) - la validation des gestes (évaluation pratique de la formation réalisée à l’aide d’une grille). Un même lot d’animaux sera utilisé une fois par semaine pour ces TP, avec un minimum de 5 jours de récupération entre 2 séances. De plus, nous veillerons à alterner les sites d’injection droite et gauche pour limiter la douleur des animaux. Au total, les TP étant étalés sur 6 semaines, un lot d’animaux sera injecté 12 fois maximum en SC, à raison de 2 injections sous-cutanée par séance

Impact sur les animaux

Douleur momentanée due à l’introduction de l’aiguille lors de l’injection sous-cutanée. Inconfort des animaux selon les difficultés d’apprentissage des étudiants et stress dû au nombre d’étudiants dans la pièce. Ces éventuelles nuisances sont compensées par une surveillance des animaux dans les heures et jours qui suivent le protocole. Les actes pratiqués ici sont d’un degré de sévérité modérée, à moins d’un accident de contention trop forte ou de piqûre dans un organe conduisant à sa lésion accidentelle. Notre expérience nous indique cependant que ceci peut parfois se produire chez un étudiant malhabile et stressé, il nous faudra donc rester très vigilant. L’enseignant veillera au bien-être immédiat de l’animal si de tels accidents survenaient. De plus, le nombre d’injections sur chaque animal sera limité à 2 par séance et chaque séance de TP sera espacée de la suivante avec un intervalle minimum de 5 jours. Afin de réduire les nuisances possibles, chaque animal sera utilisé au maximum pour 6 séances. En parallèle, une grille d’évaluation du bien-être des animaux sera employée.

Devenir

Les animaux pourront être réutilisés après avis vétérinaire. Une adoption pourra être alternativement envisagée par le biais associatif

Remplacement

Le recours à l’animal vivant n’est prévu que pour la séance 4. Pour les 3 autres séances, des méthodes alternatives ont été retenues. La séance 1 est basée sur l’utilisation de vidéos illustrant des tests comportementaux. La séance 2 est prévue sur des rats Koken, mannequin grandeur nature en silicone. La séance 3 utilisera des cadavres d’animaux et des vidéos.

Réduction

Cette formation est proposée seulement en option et a effectif maximum de 96 étudiants, alors que le contingent total est compris entre 450 et 550 étudiants inscrits en troisième année de licence et en Master 1ère année. Cependant, afin de restreindre les effectifs animaux employés, et les actes pratiqués étant de sévérité modérée, ces animaux ne seront pas euthanasiés mais seront réutilisés pour d’autres travaux pratiques se déroulant au sein de notre établissement, ou dans le cadre de projets autorisés, ce qui va dans le sens d’une réduction du nombre d’animaux manipulés. De plus, nous réaliserons une utilisation en continu de 2 lots d’animaux de chaque espèce, chaque animal sera utilisé 6 fois avec un intervalle de 5 jours minimum entre chaque séance.

Raffinement

Les pratiques expérimentales proposées sont de gravité modérée et des points limites ont été définis afin d’éviter toute souffrance de l’animal. Un retour d’expérience sera dressé pour répertorier les réussites et les difficultés des apprenants, ainsi qu’une liste des incidents/événements liés aux animaux.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les animaux les plus utilisés en expérimentation. La souris et le rat sont les animaux modèles les mieux caractérisés dans des domaines variés (physiologie, neurophysiologie, pharmacologie et toxicologie, etc.). Adultes de plus de 6 semaines, plus faciles à manipuler que de jeunes animaux

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intradermiques et intraveineuses sous anesthésie, des sensibilisations à la gliadine, puis un test d'anaphylaxie passive consistant à injecter de l'histamine dans l'oreille pour en mesurer le gonflement, avant une mise à mort par ponction cardiaque au trente-cinquième jour. L'objectif est de préciser le rôle de la protéine PCSK9 dans l'allergie et d'élargir une piste thérapeutique, retombée que le porteur situe au conditionnel. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne permet d'évaluer ce traitement et que seul un modèle murin allergique le permet.

Objectifs

PCSK9 (Pro Protein Convertase Subtilisine/Kexine de type 9) appartient à la famille des proprotéines convertases et est sécrétée par les hépatocytes dans le sang. Elle est un régulateur naturel du récepteur au LDL en l’envoyant à la dégradation lysosomale. Depuis une dizaine d’années, différentes études se sont intéressées au rôle inflammatoire de cette protéine. L’allergie étant une maladie inflammatoire chronique, nous souhaitons étudier le rôle de PCSK9 dans le cadre de l’allergie. Par une précédente étude, nous sommes en train de caractériser l’effet de PCSK9 dans l’allergie alimentaire. Ayant pu déterminer son rôle sur certaines cellules immunitaires liées à cette pathologie, notamment les mastocytes, nous souhaitons poursuivre cette approche par une expérimentation qui ne peut s’effectuer que chez la souris : le test d’anaphylaxie passive. Ce test consiste en l’injection auriculaire d’un médiateur inflammatoire (l’histamine) et d’en mesurer les conséquences chez la souris par la mesure d’un changement anatomique de l’oreille (gonflement et hypervascularisation).

Bénéfices attendus

Actuellement, aucun traitement ne permet soigner la cause de l’allergie, de plus, les effets secondaires liés aux corticoïdes sont notables et la désensibilisation n’est pas efficace chez tous les patients. PCSK9 devient une cible de plus en plus privilégiée dans le cadre de maladies inflammatoires, de plus, notre première étude sur le traitement anti-PCSK9 soigne les symptômes de l’allergie alimentaire chez la souris. Cette étude permettrait de comprendre le mécanisme par lequel PCSK9 agit sur le mastocyte et ainsi, élargir la thérapeutique de l’anti-PCSK9.

Procédures

Les animaux seront soumis des injections intradermiques et intraveineuses sous anesthésie à l’isoflurane et à des sensibilisations à la gliadine par voie intrapéritonéale. Pour finir, un prélèvement du sang terminal sera effectué par ponction intracardiaque après anesthésie sous isoflurane.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont une perte de poids. Une observation régulière des souris sera effectuée, les souris serons également pesées 3 fois par semaine.

Devenir

A la fin du protocole d'allergie au jour 35 post sensibilisation, toutes le souris seront mises à mort pour analyses.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle cellulaire permettant d’évaluer le bénéfice du traitement anti-PCSK9 dans le cadre de l’allergie. Seul un modèle murin allergique nous permettra de mesurer l’amélioration des symptômes via ce traitement et comprendre les effets de PCSK9 dans la physiopathologie de l’allergie. Les principes de raffinement et de remplacement contribuent à réduire le nombre d’animaux utilisés tout au long du protocole. Le projet étudiera l’allergie respiratoire dans des modèles déjà établis dans le laboratoire.

Réduction

Le modèle animal utilise a été soigneusement conçu et évalué pour permettre de réduire au maximum le nombre d’animaux du fait de la connaissance et la précision des paramètres observés selon la règle des 3R. Le projet étudiera l'allergie dans des modèles déjà établis dans le laboratoire. Un test non paramétrique et non apparié de type Student test, Mann-Whitney ou une analyse de la variance par un test de Bonferroni sera realisé. Une p-value inferieur a 0.05 sera considérée comme significative.

Raffinement

Le projet étudiera l’allergie dans des modèles déjà établis dans le laboratoire. Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Une observation journalière des souris sera effectuée, les souris serons également pesées 3 fois par semaine. Ainsi, les souris seront hébergées 5 par cage ventilée maximum. Elles auront accès à l’eau et à la nourriture de manière illimitée et suivront un cycle de lumière et d’obscurité de 12h. Des frisottis seront placées dans les cages. Les souris seront anesthésiées à l’isoflurane au moment de l’anaphylaxie passive.

Choix des espèces

Au cours de cette étude seront utilisées des souris de souche C57/Bl6 et Balb/c. Ces souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire et du métabolisme lipidique du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. Des analyses métaboliques seront réalisées. L’utilisation de souris nous donne accès à de nombreux outils immunologiques, notamment les anticorps nécessaires aux marquages ainsi qu'à de nombreux outils de biochimie (ELISA, dosage colorimétrique...). Souris C57/B6 et Balb/c femelles âgées de 5 semaines au début du protocole ce qui correspond à des souris sevrées donc adultes ayant un système immunitaire mature ou quasi-mature.

864 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie intracérébrale sous anesthésie pour injecter une toxine détruisant les neurones à dopamine et reproduire la maladie de Parkinson, plusieurs séries de tests moteurs dont le détail n'est pas précisé, une mesure de conduction nerveuse sous quatre heures d'anesthésie, puis la mise à mort pour prélever le cerveau. Le porteur reconnaît un ralentissement de la locomotion et des difficultés de motricité fine liés à la dégénérescence induite. Il admet que des cultures cellulaires suffisent pour certaines questions mais affirme que seule l'étude de l'"animal entier" permet d'évaluer l'effet de la L-DOPA sur la motricité.

Objectifs

La maladie de Parkinson se caractérise par une destruction progressive des neurones produisant de la dopamine (neurotransmetteur essentiel) dans la substance noire du cerveau, intervenant dans le contrôle de la motricité et des mouvements volontaires. L’absence de dopamine va provoquer l’apparition de symptômes moteurs comme les tremblements de repos, la rigidité musculaire et le ralentissement des mouvements. Pour l’heure, le seul traitement efficace est la prise quotidienne du précurseur de la dopamine, la L-DOPA. En effet, les neurones de la substance noire produisent la dopamine à partir de la L-DOPA ; le conversion de la L-DOPA en dopamine nécessite l'activation d'un enzyme appelé AADC. Dans ce projet des souris génétiquement modifiées qui ont ou non l'enzyme AADC actif seront soumises ou non à l'administration intracérébrale d'une toxine qui provoque la dégénérescence des neurones de la substance noire. La motricité des souris sera évaluée ; la conduction nerveuse et différents paramètres cellulaires et moléculaires seront aussi étudiés au niveau du cerveau. A travers ces expériences, l'objectif du projet est donc d'identifier quels sont les effets propres de la L-DOPA (situation où l'AADC n'est pas actif) chez les animaux normaux et dans la situation pathologique mimant la maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d'étudier les propriétés de neurotransmission de la L-DOPA. Ainsi, les résultats permettront d'étayer les connaissances fondamentales sur l'importance de la L-DOPA seule dans le fonctionnement de structures cérébrales interconnectées spécifiques impliquées dans la planification et l’exécution des mouvements. Le projet apportera des connaissances également sur la contribution de la L-DOPA en condition pathologique dans un modèle animal de maladie de Parkinson. A long terme, les résultats de cette étude devraient contribuer à redéfinir et améliorer les traitements symptomatiques de la maladie de Parkinson

Procédures

En fonction des animaux, l'étude dure 10, 16 ou 22 semaines. Le nombre d'intervention listé est donné pour la durée de l'étude. 1) En fonction de la durée de l'étude, les animaux vigiles subiront 2, 3 ou 4 séries de 5 tests comportementaux permettant d'évaluer la motricité. Une série de 5 tests comportementaux se réalise sur 2 semaines ; chaque test comportemental est séparé du suivant par 2 jours. Chaque test comportemental dure au maximum 1h. 2) En fonction de la durée de l'étude, les animaux vigiles seront pesés 11, 17 ou 23 fois ; chaque pesée dure au maximum 1 minute. La pesée permet de suivre l'état de l'animal et prévoir la quantité d'antalgique et d'anesthésique à injecter. 3) En fonction des paramètres étudiés, les animaux vigiles subiront 1 ou 2 injections d'antalgiques et/ou d'anesthésiques. Chaque pesée dure au maximum 1 minute. 4) Les animaux seront tous anesthésiés deux fois. Les animaux anesthésiés subiront 1 chirurgie intracérébrale (anesthésie gazeuse) d'une durée d'1h30 nécessaire à l'inactivation de la L-DOPA et à l'induction de la dégénérescence des neurones de la substance noire. Certains animaux subiront une seconde anesthésie gazeuse d'une durée de 4h pendant laquelle la conduction nerveuse intracérébrale est mesurée. Tous les animaux seront anesthésiés avec une dose létale d'anesthésie fixe double dose et d'antagique à la fin du projet.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut induire une légère perte de poids transitoire et un stress notamment au réveil. L'induction de la dégénérescence neuronale permettant de modéliser la maladie de Parkinson va induire un léger ralentissement de la courbe de croissance des animaux ainsi qu'un ralentissement global de l'activité locomotrice et des difficultés dans la motricité fine.

Devenir

Tous les animaux de la procédure seront mis à mort en fin de procédure, afin de prélever les cerveaux pour les étudier.

Remplacement

Certaines recherches sur la maladie de Parkinson peuvent être effectuées à l'aide de modélisation basée sur des cultures cellulaires (in vitro) dans le cadre d'études sur les causes de la mort neuronale observée dans la maladie de Parkinson. En revanche, cette approche n'est pas adaptée lorsque l'on s'intéresse aux modifications comportementales qui nécessitent l'intégrité des réseaux neuronaux. Seules des études sur animal entier permettent d'étudier l'effet de la L-DOPA sur la motricité

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé a été calculé avec un test statistique approprié afin d'obtenir des résultats fiables malgré la variabilité interindividuelle. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques.

Raffinement

Les expérimentations sont réfléchies de façon à minimiser au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux au cours des différentes procédures de ce projet (actes réalisés par du personnel expérimenté, médicamentation définie avec le vétérinaire référent et les tests comportementaux basés sur le comportement spontané des animaux, ne nécessitant pas d’intervention directe de l’expérimentateur). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale (gazeuse, facilement modulable et permettant un réveil rapide) avec un contrôle des paramètres vitaux (température, fréquence respiratoire, fréquence cardiaque), additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgique. Le traitement antalgique sera poursuivi au lendemain de la chirurgie voire 48h post-opératoire si l'état de l'animal le nécessite. Des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites et à agir rapidement pour interrompre la souffrance. Les animaux sont hébergés quatre par cage, avec eau et nourriture ad libitum. L’hébergement en animalerie est réalisé en portoir ventilé, dans des pièces à température et hygrométrie régulées et contrôlées selon les normes en vigueur. Un enrichissement adapté à l'espèce est disposé dans les cages d'hébergement. Les animaux sont manipulés a minima de façon hebdomadaire. Une phase d'habituation aux expérimentateurs est prévue en amont de l'étude. Le binôme d'expérimentateurs reste le même tout au long de l'étude.

Choix des espèces

Ce projet nécessite l'utilisation de souris pour plusieurs raisons : la similitude des réseaux neuronaux entre ce modèle et l'humain ainsi que des altérations motrices similaires mais aussi, le modèle est largement décrit dans la littérature, les tests de motricité sont maitrisés chez la souris, et la modification génétique d'intérêt pour cette étude est réalisée sur des souris. Les animaux utilisés seront des animaux mâles et femelles adultes (8 semaines au début des tests comportementaux réalisés avant la chirurgie) de façon à se rapprocher du stade de développement de la maladie de Parkinson.

780 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des rates gestantes sont nourries d'un régime très pauvre en protéines, soumises à des frottis vaginaux quotidiens et à une injection intraveineuse, puis tuées par ponction cardiaque avant le terme pour prélever les fœtus et étudier le développement de leur hypothalamus. Le porteur présente son travail comme éclairant les risques de régimes "végétariens ou végétaliens" mal suivis pendant la grossesse, et reconnaît sacrifier les mères en gestation pour éviter le cannibalisme à la naissance. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne reproduit la gestation et le développement cérébral et juge le recours aux animaux "indispensable".

Objectifs

L'objectif du projet est d'étudier l'impact d'une restriction protéique sévère sur le développement fœtal de l’hypothalamus, une structure cérébrale qui joue un rôle clé dans la régulation de l’équilibre nécessaire entre apports et dépense énergétiques, indispensable au maintien d’un poids stable pendant toute la vie d’un être humain. Ce projet se situe dans le contexte de l’étude des origines précoces des maladies de l’adulte, ou DOHAD (Developmental Origins of Health and Adult Diseases) qui est au cœur des préoccupations de notre laboratoire. L’alimentation pendant la grossesse, en agissant sur les étapes précoces du développement fœtal, pourrait influencer de façon durable le fonctionnement cérébral et métabolique de l’organisme. La carence en protéines est une réalité pour de nombreux pays en voie de développement. Dans les pays industrialisés, sous l’influence des recommandations préconisées à juste titre dans les programmes alimentaires, la consommation de viande est en baisse. Cependant la végétalisation importante ou totale de l’alimentation comme lors des régimes végétariens/végétaliens ne permet pas toujours de couvrir les besoins en acides aminés essentiels qui augmentent pendant la grossesse (passant de 50 à 65 g/j). Les protéines végétales sont pauvres en lysine, thréonine et acides aminés soufrés et sont moins bien assimilées par l’organisme. Il est donc important d’évaluer les conséquences d’une carence en protéines pendant la grossesse et de comprendre comment la malnutrition pendant la vie fœtale contribue à la santé et à la maladie plus tard dans la vie. Les recommandations actuelles pour les femmes enceintes concernent essentiellement l’acide folique, le fer et éventuellement d’autres micronutriments, mais très peu voire pas du tout les macronutriments et en particulier les protéines. En utilisant le rat comme modèle, nous visons à déterminer quels processus cellulaires et moléculaires sont affectés par un régime pauvre en protéines, et si les conséquences sont irréversibles ou pas. L'objectif au niveau clinique est de fournir des données fondamentales sur les risques pour le développement du fœtus associés à certains régimes populaires lorsqu'ils sont poursuivis tout au long de la grossesse sans un suivi soutien nutritionnel professionnel. Nous voulons acquérir des données pertinentes sur les stades qui sont importants pour le développement normal du cerveau et sur les conséquences possibles pour le développement de l'enfant.

Bénéfices attendus

Nous connaissons déjà les effets d'un régime maternel restreint en protéines à 8% sur le développement de l’hypothalamus ; ils sont multiples mais légers. En utilisant un régime plus restreint à 4%, le but est d’induire des effets plus marqués au niveau cellulaire et moléculaire afin de mieux distinguer et comprendre les effets précis sur les étapes clés du développement, y compris la maturation des différents types de neurones hypothalamiques : Quel type de cellule est le plus vulnérable ? Comment sont-elles connectées les unes aux autres (i.e. le connectome). En outre, nous identifierons la fenêtre temporelle spécifique pendant laquelle la restriction protéique est néfaste pour le développement de l'hypothalamus. Grâce à une analyse au niveau de la cellule unique, une liste complète de gènes impliqués dans la malformation des réseaux neuronaux sera générée et nous aidera à identifier les cibles clés responsables des effets indésirables. Cet ensemble de résultats nous permettra de comprendre exactement comment et quand les noyaux hypothalamiques se forment, et comment cela entraîne des effets persistants avec un régime faible en protéines. À long terme, l'impact est multiple. Notre recherche fournira des données sur les risques pour le développement du fœtus associés à certains régimes populaires pauvres en protéines (c'est-à-dire végétariens ou végétaliens) lorsqu'ils sont poursuivis tout au long de la grossesse sans soutien nutritionnel rigoureux de la part d'un diététicien, et sur les conséquences possibles pour la santé et les maladies ultérieures. Nos résultats serviront à contribuer à l'établissement d'un cadre diététique qui puisse aider les gynécologues, les diététiciens et les femmes pendant la grossesse. Cela contribuera également à réduire les coûts économiques liés aux naissances prématurées, aux retards de développement et aux soins postnatals prolongés en raison de la restriction de croissance intra-utérine.

Procédures

Les femelles seront soumises à des prélèvements de cellules vaginales exfoliées tous les jours pendant 4 à 7 jours afin de déterminer la période de fécondité et le lendemain de l'accouplement. Ces prélèvements sont indolores, ne durent que quelques secondes et sont pratiqués sur les animaux vigiles. Certaines seront soumises à une injection intraveineuse dans la veine de la queue (5 à 10 secondes environ) au 14ème jour de gestation. Cette injection sera réalisée sous anesthésie générale. Avant la mise à mort, les femelles gestantes anesthésiées seront soumises à un prélèvement intracardiaque de sang (environ 10 secondes).

Impact sur les animaux

Nous avons fait le choix de nourrir les femelles avec un régime modérément carencé en protéines (8%) pendant la période préconceptuelle afin d’éviter une altération de la fécondité. Le régime carencé à 4% de protéines, administré pendant la gestation, ne devrait pas provoquer d’inconfort ou de souffrance. Nous avons déjà dans le laboratoire l’expérience de ce type de régime pendant la gestation. Ce régime apporte la même quantité d’énergie que le régime contrôle afin d’éviter des apports énergétiques insuffisants aux femelles gestantes, la carence en protéine étant compensés par une augmentation de la teneur en hydrates de carbone (essentiellement amidon, un peu de sucre). Nous avons montré précédemment que la quantité d’énergie ingérée par les femelles gestantes recevant un régime à 4% de protéines était similaire à celles recevant un régime contrôle. La carence en protéines a pour effet de réduire la croissance fœtale, les poids des fœtus et des placentas étaient réduits de 26% et 35% respectivement, mais étonnament, la taille des portées était légèrement supérieure. Par ailleurs, aucun effet négatif majeur, de type mort pendant la gestation, fausse couche ou malformation fœtale n’a été observé. Le fait de sacrifier les femelles pendant la gestation permet d’éviter des effets possibles comme le cannibalisme au moment de la naissance qui peut survenir en cas de dénutrition maternelle. Par ailleurs, les sacrifices pratiqués au plus tard à G17 surviennent en amont de la phase majeure de croissance fœtale qui a lieu les 3/4 derniers jours de la gestation.

Devenir

Aucun animal ne sera maintenu en vie à la fin du projet, les femelles seront commandées au fur et à mesure et le nombre prévu sera éventuellement réduit si tous les prélèvement requis ont pu être obtenus avant. S’il n’est pas possible d’obtenir une gestation dans le délai voulu pour certaines femelles, elles seront sacrifiées ou proposées pour d’autres protocoles. Cependant, cette éventualité est très limitée du fait des régimes expérimentaux avec lesquels les femelles auront été nourries.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est indispensable pour créer les conditions physiologiques caractéristiques de situation physiologiques complexes telles que la gestation et le développement cérébral. A ce jour, aucun modèle ex-vivo ou in-vitro ne permet de reproduire l’ensemble des interactions métaboliques, cellulaires et moléculaires. Cependant, ce modèle animal servira aussi à l’obtention de modèles cellulaires (cellules souches neurales prélevées sur les fœtus) qui permettront de tester des caractéristiques de certains types cellulaires et de développer à terme des modèles cellulaires qui permettraient par exemple de tester l’influence de certaines molécules ou nutriments sur le métabolisme cellulaire in vitro.

Réduction

Un calcul statistique d'effectifs nous permet d'établir qu’un nombre de 20 fœtus (10 mâles + 10 femelles) provenant de 10 mères différentes est nécessaire pour chaque analyse à chacun des 2 stades, ce qui fait un total de 20 femelles par régime. Nous prévoyons 10 femelles de plus par régime (soit 30 femelles) pour pallier aux éventuels problèmes de type gestation non détectée, nombre insuffisant de petits, etc. Ce nombre pourra être réduit dès que le nombre de fœtus prélevés par groupe sera atteint. Pour chaque portée, nous prélèverons un minimum de 12 fœtus (idéalement 6 males et 6 femelles) par portée afin d’avoir un nombre suffisant de fœtus des 2 sexes pour chaque analyse.

Raffinement

L’environnement des femelles avant et pendant la gestation sera enrichi (tunnel, bâton à ronger, frisottis). Les procédures envisagées sont classées « modérées » du fait de la teneur faible en protéines du régime 4% auquel seront soumises la moitié des femelles gestantes. Les animaux seront suivis par un personnel animalier compétent et observés quotidiennement pour détecter d’éventuels signes de souffrance. Leur prise alimentaire et leur prise de poids pendant la gestation seront mesurées 3 fois par semaine afin de détecter une éventuelle sous-alimentation ou perte de poids anormale. Les points limites définis conduiront, s’ils sont observés, à la mise à mort des animaux le cas échéant.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce utilisée dans notre laboratoire et bien d’autres depuis de nombreuses années pour les protocoles expérimentaux visant à étudier l’influence de la nutrition en période périnatale sur le développement fœtal et postnatal. Nous avons déjà obtenu de nombreux résultats sur cette espèce, qui est appropriée, par sa taille, aux études anatomiques, cellulaires et moléculaires que nous pratiquons. Le projet porte sur l’influence de la nutrition maternelle en période préconceptuelle et gestation sur le neurodéveloppement fœtal. Les animaux commandés au fournisseur seront des femelles vierges de 8 semaines et des mâles reproducteurs. Les analyses porteront sur des organes prélevés post mortem sur des rates gestantes, et des fœtus à différents stades de la gestation. Aucune analyse n’est prévue dans ce projet dans la période post-gestation.

800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des greffes sous-cutanées de cellules tumorales prostatiques, une partie subit une ablation des testicules, puis des injections quotidiennes de deux médicaments pendant vingt-huit jours et des gavages, avant la mise à mort au point limite ou pour prélever tumeur et organes. Le porteur reconnaît que le gavage comporte un risque de perforation de l'œsophage et de détresse respiratoire, et que les tumeurs peuvent devenir douloureuses. Il décrit des travaux préalables in silico et in vitro mais affirme être "contraint" de recourir à la souris, aucun système in vitro ne reproduisant selon lui la récidive tumorale après castration.

Objectifs

Le cancer de la prostate est le cancer le plus diagnostiqué chez les hommes en France et le second en termes de mortalité par cancer. Pour les cancers de la prostate invasifs, la seule thérapeutique proposée est la castration chimique (déprivation en androgène) qui est efficace, dans un premier temps, mais dans 100% des cas la tumeur récidive en étant agressive (métastases). Dès lors, il n’existe aucun traitement efficace conduisant inéluctablement au décès du patient. Une équipe de recherche a identifié des cellules potentiellement initiatrices de cette récidive tumorale dans la prostate chez la souris. Dans un modèle de souris génétiquement modifié développant un cancer de la prostate résistant à la castration, la proportion de ces cellules est fortement augmentée. Ces cellules ont pu être isolées et caractérisées, ce qui a permis de déterminer deux cibles thérapeutiques théoriques exprimées par ces cellules. En utilisant deux drogues, chacune agissant sur une de ces cibles, nous montrons que ces drogues sont très efficaces pour tuer ces cellules et que leur effet est additif dans un modèle de culture en 3D, et ce en présence et en absence d’androgène. Ces cellules ont aussi été identifiées chez l’Homme. Sur une lignée cellulaire humaine de ce type de cellules issue d’une tumeur prostatique de patient, nous avons montrés la même efficacité de ces drogues. L’objectif de ce projet est d’évaluer/confirmer l’impact thérapeutique de ces deux composés chimiques, administrés seul ou en combinaison, sur le développement et la récidive tumorale chez la souris ayant reçue préalablement une greffe de ces cellules tumorales. La première partie du projet est réalisée à l’EU 110, sous un statut conventionnel obligeant à utiliser des isocages. Pour préserver ses animaux immunodéficients de tout pathogène. La suite des expériences sera réalisée dans une animalerie SOPF, EU0054 permettant une manipulation sécurisée plus simple des animaux mais aussi l’utilisation d’un système d’imagerie par bioluminescence, finalement localisé dans l’EU0054.

Bénéfices attendus

Pour améliorer la survie des patients développant des cancers de la prostate résistant à la castration, il est nécessaire d’identifier les cellules responsables de la récidive tumorale et de les cibler de façon thérapeutique. Les études préliminaires in silico et in vitro nous ont permis d’identifier une nouvelle population cellulaire possédant les propriétés requises à l’initiation de la récidive et en faisant donc une population cellulaire candidate. Des expériences in vitro, qui inhibent les capacités progénitrices et prolifératives de ces cellules nous ont permis de trouver deux protéines cibles. Ce projet permettrait de définir in vivo, chez la souris, si leurs inhibiteurs, administrés seuls ou en combinaison, sont capables d’inhiber le développement tumoral et/ou faire régresser une tumeur déjà établie dans un contexte naïf (présence d’androgènes) ou d’hormonothérapie (castration). Ces tests seront faits sur des tumeurs d’origine murine mais aussi humaine.

Procédures

Les interventions subies par les animaux seront : - 1- Des injections sous-cutanées de cellules tumorales primaires ou de lignées humaines. - 2- Des observations des tumeurs sous anesthésie gazeuse durant 30 min (isoflurane) après maximum trois mois de développement tumoral. - 3- Des chirurgies (ablations de testicules) de 15 min sous anesthésie gazeuse et sous analgésique (injection sous cutanée 30 min avant l’intervention puis à J+1 et à J+2 si nécessaire). - 4- Des traitements en injections (de moins d’une minute) intra péritonéal de drogues quotidiennement pendant 28 jours. - 5- Des traitements en gavage (de moins d’une minute) tous les quatre jours pendant 28 jours. Chaque animal subira une combinaison de ces interventions au cours des procédures : Pour la première partie, l’ensemble des souris (32), réparti en deux lots, sera soumis aux interventions 1 et 2. Pour les deux autres parties, les animaux seront soumis aux interventions 1 et 2 et les autres interventions dépendront ensuite des groupes : - le groupe A (96 souris) subira une chirurgie de castration (intervention 3) puis les animaux recevront des traitements comme suit : • 32 souris seront soumises à l’intervention 4 uniquement ; • 32 souris seront soumises à l’intervention 5 uniquement ; • 32 souris seront soumises aux interventions 4 et 5. - le groupe B (96 souris) recevront des traitements comme suit : • 32 souris seront soumises à l’intervention 4 uniquement ; • 32 souris seront soumises à l’intervention 5 uniquement ; • 32 souris seront soumises aux interventions 4 et 5.

Impact sur les animaux

Toutes les souris de la demande d’autorisation recevront par voie sous cutanée (bas du dos) deux injections (une à droite et une à gauche) mais toutes n’auront pas de développement de tumeur. S’il y a prise de greffe et formation de tumeur sous cutanée, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer une certaine douleur lorsqu’elles dépassent un certain volume. La tumeur peut induire une tension de la peau à l’origine de démangeaison et d’irritation. L’ablation des testicules (procédures 2 et 3) est un acte non douloureux car réalisé sous anesthésie et analgésie mais il peut occasionner une hypothermie, une déshydratation et l’asséchement des yeux. Suite à la chirurgie, les animaux peuvent souffrir et la plaie chirurgicale peut présenter des signes d’inflammation ou d’infection. Les anesthésies lors des chirurgies et des séances d’imageries sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections intra péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection.

Devenir

Chaque animal sera mis à mort : - soit parce qu’il atteint avant la fin un score supérieur ou égal à 3 de la grille d’évaluation indiquant une souffrance nécessitant sa mise à mort. - soit parce qu’il a dû être exclue (pas de prise de greffe tumorale). En revanche il ne sera pas mis à mort tout de suite si sa présence peut éviter l’isolement d’un individu encore en procédure. - soit parce qu’il est un animal d’intérêt ou contrôle pour lequel il est nécessaire à la fin de la durée de la procédure de prélever différents organes et la tumeur afin d’évaluer l’efficacité du traitement testé. Cet animal pourra appartenir soit à la branche des animaux témoins servant de référence, soit à une branche d’animaux traités.

Remplacement

Nous avons dans un premier temps mené l’étude par différentes approches pour aborder ces questions, incluant, des études de prédiction par analyse bio-informatiques de données transcriptomiques, des cultures cellulaires 2D et 3D in vitro, selon le principe de Remplacement. Pour remplir nos objectifs, nous sommes contraints d’utiliser des modèles murins, car aucun système in vitro et aucun modèle d’organismes plus simples ne permet de reproduire les différents stades du développement tumoral prostatique et de sa récidive post-castration.

Réduction

Selon le principe de Réduction, le nombre d'animaux utilisé est calculé de manière à obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. En supposant une efficacité de greffe de cellules tumorales de 50%, il faudrait alors doubler l’effectif car une greffe sur deux ne se développera pas. Cependant, nous avons prévu deux injections de cellules par animal soit 1 prise de greffe par animal, ce qui compense cette efficacité faible. Comme indiqué précédemment, si la prise de greffe se montre plus élevée que 50%, nous ajusterons le nombre d’animaux à la baisse pour les étapes suivantes. Au contraire, si un des types cellulaires testés ne génère pas de tumeur, les expériences se basant sur l’injection de ces cellules ne seront pas réalisées. En revanche, des animaux pourraient être écartés de l’étude, il est donc nécessaire de prévoir un effectif supérieur à celui calculé dans cette section. C’est pour cette raison que nous avons fixé un nombre final de 16 animaux par condition, tenant compte de tous ces paramètres.

Raffinement

Pour s’assurer du bien-être des souris durant la croissance des greffes tumorales, elles bénéficieront de coton, de maisonnettes, de tunnels et de bâtonnets de bois à ronger afin de les occuper et afin qu’elles puissent se construire un nid. Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie et lors des mesures de tumeur par la personne en charge du protocole afin de détecter tout signe de douleur. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et un analgésique sera administré en pré- et post-opératoire. A la suite de la chirurgie la souris sera réveillée au chaud et surveillée pendant les heures qui suivent et la bonne cicatrisation sera observée tous les jours durant la semaine qui suit l’opération par la personne en charge du protocole. Des points limites spécifiques à chaque étape ont été définis. Tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort. Si, pour des raisons de protocole (mise à mort de certains congénères ayant atteint un point limite), une souris devait se retrouver seule dans une cage, l’enrichissement sera augmenté.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, les modèles animaux créent le lien indispensable entre les tests in vitro et les études cliniques. Le modèle ici utilisé est préféré aux autres modèles de souris car c’est le meilleur modèle connu pour éviter toute réaction immunitaire et rejet de greffe de cellules tumorales tout particulièrement pour les cellules humaines.