Rongeurs

48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont hébergés seuls pendant huit à dix-sept jours, reçoivent des repas enrichis en tannins pour simuler une mauvaise assimilation des protéines, passent sept heures en cage métabolique, puis sont tués par ponction cardiaque sous anesthésie pour prélever le contenu de leur tube digestif. L'objectif est de mettre au point un test peu invasif qui pourrait ensuite être adapté à l'être humain, notamment aux enfants souffrant de malabsorption, le porteur renvoyant cette application au conditionnel. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe aucun modèle in vitro capable de reproduire une malabsorption protéique.

Objectifs

La capacité d’assimilation des protéines alimentaires par l’organisme est un des déterminants de la satisfaction du besoin protéique de l’être humain, notamment pour les populations vulnérables. Dans les pays en voie de développement, un apport protéique satisfaisant en quantité et en qualité n’est souvent pas assuré, ce qui entraîne des retards de croissance chez l’enfant. Les affections intestinales liées à l’environnement, dont les affections parasitaires, peuvent détériorer l’assimilation des protéines et donc aggraver l’insuffisance d’apports en protéines. L’objectif global du projet est d’évaluer l’efficacité de suppléments protéiques chez les enfants atteints de ces affections, et pour cela, il faut développer des tests peu ou pas invasifs pour rendre compte d’une amélioration de l’absorption intestinale. Pour cela, nous mettons en œuvre une étude sur rongeurs. Nous faisons varier la digestion des protéines grâce à l’ajout de tannins dans l’aliment. En effet, les tannins, présents dans des produits végétaux, perturbent la digestion des protéines, ce qui permet de mimer une malabsorption protéique. Par ailleurs, nous incorporons des traceurs de la protéine dans le repas, suivis dans l’air expiré et dans les urines. Grâce à ces données ainsi que les analyses effectuées sur les organes et le sang, nous testerons l’hypothèse qu’une baisse de la digestibilité des protéines induite par les tannins va se traduire par une baisse de l’apparition des traceurs dans le sang et l’urine. Si le test s’avère concluant, il pourra être développé chez l’humain, en comparant des individus sains ou atteints de pathologies qui détériorent l’assimilation des protéines.

Bénéfices attendus

Les données obtenues permettront d’évaluer si ce test est sensible à une perte de digestibilité des protéines. Si c’est le cas, il pourrait être adapté chez l’être humain pour révéler des situations de malabsorption protéique liée à des dysfonctions du tube gastrointestinal, dont la dysfonction entérique environnementale qui est susceptible d’altérer l’assimilation protéique.

Procédures

→ Les animaux seront hébergés en cage individuelle en permanence (pendant une durée de 8 à 17 jours selon le jour du test métabolique) . Ils auront un régime alimentaire standard et des petits repas test le matin, dans lequel des tannins sont incorporés (afin de diminuer la digestion des protéines de ce repas). Lors de l’exploration métabolique , ils seront placés dans une cage individuelle cylindrique pour mesurer les échanges respiratoires pendant 7 heures . Le jour de la mise à mort, les rats reçoivent 10 minutes avant le prélèvement sanguin, une injection intra péritonéale de xylazine (10mg/kg), puis ils sont anesthésiés par l’isoflurane (masque) et analgésiés localement par administration sous-cutanée au point d’incision (lidocaïne). Nous réalisons une ponction cardiaque pour prélever du sang. Les rats sont euthanasiés par injection intrapéritonéale d’Exagon (180mg/kg).

Impact sur les animaux

Il sera nécessaire d’héberger les animaux en cages individuelles car nous devons contrôler leur prise alimentaire et les habituer à l’ingestion d’un repas-test. Le jour du test, le rat sera placé dans une cage métabolique individuelle (une cage spécifique pour mesurer les échanges gazeux) différente de sa cage habituelle, ce qui peut générer un stress modéré. L’introduction des repas tests contenant des tannins peut perturber la motivation des rats à consommer leur repas. Bien que peu probable au regard de la dose administrée, les tannins pourraient provoquer des perturbations intestinales, type diarrhée.

Devenir

Les 48 rats seront euthanasiés afin de collecter les contenus des différents segments du tube digestif et mesurer la digestibilité des protéines.

Remplacement

A l’heure actuelle il n’existe pas de modèle in vitro permettant de mimer une malabsorption protéique qui pourrait être détectée dans les produits de dégradation finaux

Réduction

Les résultats pour chaque groupe d’animaux seront comparés entre eux en utilisant une analyse de la variance. A partir des données déjà publiées sur le sujet et dans des conditions expérimentales comparables, le nombre minimum d’animaux requis pour atteindre une puissance statistique suffisante est de 8 par groupe.

Raffinement

Afin de limiter l'impact de l'hébergement individuel, les cages sont en plexiglas transparent permettant le plus d’interactions visuelles entre les animaux et elles seront enrichies avec des tunnels en plexiglas opaque ainsi que des billes. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permettra de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Les animaux seront regroupés lors des pesées et des prises alimentaires pour faciliter leur interaction, dans des cages avec des tunnels suspendus. Si une perte de poids de plus de 20% par rapport au poids de la dernière pesée, sans cause apparente et sans récupération, des diarrhées sans cause apparente ou des difficultés à uriner ou une modification de l’aspect des urines sont détectées grâce au suivi rapproché de chaque animal, il sera sorti du protocole expérimental et euthanasié si son état de santé ne s’améliore pas rapidement. A certaines étapes de la procédure, un traitement peut être envisagé (anti-inflammatoires gastro-intestinaux, etc., en conformité avec la posologie et voie d’administration indiquée par le référent vétérinaire). L e jour de la mise à mort, les rats reçoivent une injection intra péritonéale 10 minutes avant le prélèvement sanguin, puis une analgésie est pratiquée sous la peau au point d’incision. Nous réalisons une ponction cardiaque pour prélever du sang. Les rats sont euthanasiés par injection intrapéritonéale d’un produit léthal.

Choix des espèces

Le régime alimentaire et le système digestif du rat présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. De plus, le rat est une espèce de référence pour les études nutritionnelles quel que soit le stade de développement, ici le jeune rat post-pubère.

750 animaux, 500 souris et 250 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sur chaque animal, des apprenants s'exercent à la contention, aux injections sous-cutanée, intraveineuse et intrapéritonéale, aux prélèvements de sang et au gavage, non pour produire des connaissances mais pour former de futurs expérimentateurs. Le porteur reconnaît que l'inexpérience des apprenants est une source de stress et que la voie intrapéritonéale peut provoquer une perforation intestinale. Il présente cette formation comme un moyen de diffuser des gestes précis au service du bien-être des animaux non-humains, alors qu'elle se solde par leur mise à mort.

Objectifs

Les formations spécifiques pour les personnes appliquant/concevant des procédures expérimentales sont encadrées par l’arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques. Cet arrêté défini le programme de base et ce dernier doit comporter une partie : Procédure faiblement invasive : théorie et pratique. Ce projet décrit cette partie pratique.

Bénéfices attendus

Cette formation a pour objectif de former les futurs expérimentateurs. Dans cette formation leur sont enseigné les gestes précis, permettant de réduire au maximum le stress de l’animal. Par la formation aux bons gestes, cette formation participe au bien-être animal et permet la diffusion de gestes techniques précis et contrôlés.

Procédures

Durée des TP 4h, durée effective de manipulation 3h - la préhension / contention ( 10 min max) - une injection sous cutanée ( 2 minutes maximum) - une injection intraveineuse ( 10 min maximum)- une injection intrapéritonéale ( 2 minutes) - un prélèvement de sang submandibulaire ( 2 minutes) - une administration per-os (5 minutes)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur ses animaux peuvent être un stress généré par l’inexpérience des apprenants. Cette hésitation peut être source de stress pour l’animal. Le stress généré n’est cependant que transitoire et de courte durée. Par ailleurs les injections et les prélèvements peuvent entrainer une douleur notamment lors de l’effraction cutanée. La voie intrapéritonéale peut entrainer éventuellement dans de très rare cas des lésions digestives (perforation de l’intestin) dangereuses et douloureuses . Le gavage per-os peut également entrainer un inconfort pour l’animal et un risque de fausse route s’il n’est pas réalisé correctement. Le prélèvement submandibulaire peut entrainer éventuellement un risque d’hémorragie s’il n’est pas réalisé correctement

Devenir

Ils ne peuvent être réutilisés donc ils sont mis à mort

Remplacement

L’objectif de cette séance est d’une part de montrer aux stagiaires les bonnes pratiques en terme de contention et de prélèvements, puis de vérifier qu’ils mettent correctement en œuvre ces pratiques. Il est important pour cela, qu’ils soient confrontés à des animaux vivants, tout comme dans les futures procédures expérimentales qu’ils appliqueront.

Réduction

Le nombre d’animaux est choisi pour être réduit au minimum tout en gardant la possibilité à chaque apprenant de pouvoir effectuer les différents gestes techniques. Diminuer ce nombre ne ferait qu’augmenter les nuisances pour chaque animal, ainsi que le stress rendant les contentions plus difficiles et les apprentissages plus complexes.

Raffinement

Les manipulations se font sous le contrôle du/des responsables de groupe qui veille à l’exécution du bon geste pour le bien-être animal. La préhension des souris en évitant la prise par la queue sera enseignée (utilisation de tunnels et main en coupe). Avant chaque manipulation d'animal, les points limites seront vérifiés. Si un animal a atteind un point limite la procédure, il ne sera pas manipulé.

Choix des espèces

La souris reste le modèle le plus utilisé en recherche (60% des utilisations d’animaux), le rat, bien que moins utilisé (environ 10%) reste néanmoins très utilisé notamment dans le cadre des neurosciences, discipline très représentée au sein des chercheurs du CNRS. Les souris seront utilisées à 7 semaines de manière à n’être pas trop grosses afin de pouvoir entrer facilement dans la boite de contention pour l’IV. Les rats d’un poids de 250g et les souris de 7 semaines sont aussi utilisés à cet âge de manière à ne pas rendre trop compliquée la préhension et la contention pour les apprenants ayants de petites mains.

330 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection sous-rétinienne de nanoparticules puis subit des examens d'imagerie et un électrorétinogramme sous anesthésie, un test comportemental optocinétique sur animal vigile et une craniotomie terminale, avant d'être tué pour prélever les yeux. Le porteur indique que l'injection peut provoquer inflammation, décollement ou déchirure de la rétine et opacité de la cornée. Il présente les nanoparticules comme une piste de restauration visuelle pour les rétinites pigmentaires, les bénéfices pour les personnes restant à valider.

Objectifs

La rétinite pigmentaire désigne un ensemble de pathologies progressives et héréditaires de la rétine qui mène à une cécité incurable et qui atteint plus d'un million de personnes à travers le monde. Elle résulte de la mutation dans un gène spécifique des photorécepteurs à bâtonnets, la rhodopsine, qui provoque la perte de ces neurones. Cette disparition provoque par la suite la dégénérescence progressive et secondaire des photorécepteurs à cônes. Récemment, il a été montré chez un modèle de rat aveugle qu'il est possible de réactiver la rétine dégénérée par des implants constitués de nanoparticules. Les nanoparticules peuvent être délivrées dans l’œil par des injections et s’ancrer aux membranes des neurones cibles de la rétine pour convertir les stimuli lumineux en une stimulation électrique. Ainsi les photorécepteurs endommagés sont rendus à nouveau sensibles à la lumière grâce à ces nanoparticules. Cependant, il reste à comprendre quel champ de vision et quelle acuité visuelle sont réellement retrouvés. Cette étape est essentielle pour évaluer le bénéfice qui pourrait être apporté par ce type de thérapie chez des patients. Il est aussi important d’étudier la distribution et l’évolution de ces nanoparticules dans l’œil après injection et de s’assurer de leur biocompatibilité par l’absence de réactions inflammatoires. L'objectif de ce projet est d'évaluer ces paramètres (biocompatibilité, distribution, acuité visuelle) chez un modèle murin de rétinite pigmentaire. La validation fonctionnelle sera réalisée par des tests comportementaux (test optomoteurs), l’enregistrement de l’activité électrique de l’œil in vivo (electrorétinogramme) et par l'enregistrement de l’activité cérébrale des animaux en expérimentation terminale, soit par une technique d'imagerie fonctionnelle ultrasonore non invasive, soit par une méthode électrophysiologique (potentiels visuels évoqués) au niveau du cortex visuel.

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous cherchons à réactiver la vision au niveau de la rétine et à étudier si la thérapie choisie permet une transmission de l’information visuelle au cerveau. L’approche retenue pour notre étude est l’injection sous-rétinienne de nanoparticules. Il s’agit de remplacer les photorécepteurs absents par un système de stimulation électrique des neurones rétiniens restants. La finalité de l’étude est de valider un nouveau modèle d’implant basé sur des nanoparticules, plus performant et répondant au critère de biocompatibilité. Ces avancées biomédicales permettront de développer de nouvelles méthodes d'interfaçage des stimuli optiques avec le système nerveux pour le traitement des pathologies dans lesquelles la dégénérescence neuronale a induit une perte de fonction spécifique et irréversible. Le modèle murin présente un fort intérêt pour cette étude car l’architecture oculaire est très proche de celle de l’œil humain et le modèle de dégénérescence est similaire à celui rencontré dans les rétinites pigmentaires

Procédures

Procédures chirugicales (2): - Injection sous-rétinienne (1 fois par animal), sous anesthésie générale (gazeuse), 10 min; - Craniotomie + Enregistrement des potentiels évoqués visuels et Imagerie ultrasonore , (1 fois par animal, expérimentation terminale) sous anesthésie générale (fixe), 60 min; / Examens sous anesthésie générale:- Examen d’imagerie (2 à 6 fois par animal) sous anesthésie générale (gazeuse), 10 min; - ERG (1 fois par animal) sous anesthésie générale (fixe), 30 min;/ Test comportemental optocinétique (2 à 4 fois par animal) sur animal vigile, 15 min.

Impact sur les animaux

Les possibilités de nuisance sont essentiellement liées à : -Une mauvaise réaction à l’anesthésie (gazeuse ou fixe). -à l’injection : une éventuelle inflammation due aux nanoparticules (d’où l’étude) des problèmes de dégradation de l’œil : décollement de rétine, rétine déchirée, d’atteinte oculaire (inflammation, d’opacité cornéenne, paupières mi-closes, yeux gonflés etc.).

Devenir

L’euthanasie est requise pour permettre le prélèvement des yeux des souris, qui seront ensuite étudiés par des analyses histologiques. Tous les animaux des procédures seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Remplacement

Dans ce projet, l’évaluation des réactions inflammatoires (biocompatibilité des nanoparticules) et la restauration de la vision au niveau de la rétine ainsi que la transmission de l’information visuelle au cerveau ne peuvent pas être réalisées par des expérimentations ex vivo. L’acuité visuelle ne peut être évaluée que par des tests comportementaux chez l’animal in vivo. Les mécanismes physiologiques (dépolarisations corticales) et variations de flux sanguin au niveau du cortex visuel, ne peuvent être observés que sur un cerveau en fonctionnement. L’utilisation de l’animal est donc indispensable.

Réduction

Basé sur l’expertise du laboratoire et sur des projets proches, le nombre d’animaux (330) a été estimé pour obtenir un nombre minimum de résultats significatifs tenant compte des éventuelles pertes dues à une mauvaise injection, une mauvaise réaction à l’anesthésie, ou par atteinte des points limites durant les procédures expérimentales. La rédaction d’un protocole précis ainsi que la bonne maîtrise des outils de chirurgie et d’imagerie par les expérimentateurs correspondants permet de minimiser les pertes inutiles. Une analyse de puissance statistique a été faite et le nombre d’animaux utilisé par protocole expérimental a été estimé en vue d’atteindre un compromis entre une puissance élevée et un nombre d’animaux raisonnable. Des tests statistiques seront effectués (test t de Student, analyse de variance...) et permettront de minimiser le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux en provenance de l’extérieur observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum. Les animaux sont hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (cotons + tunnel en carton + bâton en bois) alimentation et abreuvement à volonté. Les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. L’atmosphère est contrôlée pour les conditions d’hébergement (température et hygrométrie stable). Les animaux bénéficieront si nécessaire d’une anesthésie gazeuse par inhalation ou d’une anesthésie fixe par injection intrapéritonéale. Des analgésiques seront administrés, pour que l’animal sous anesthésie ou en post-opératoire, ne ressente aucune douleur pendant les procédures expérimentales. Une observation régulière des animaux sera effectuées et suite aux procédures chirurgicales, une signalétique spécifique permettra une surveillance quotidienne adaptée des animaux. La structure de bien-être animal (SBEA) a mis en place des étiquettes indiquant "Suivi post-opératoire" qui sont à apposer sur le porte-étiquette de la cage juste après une intervention chirurgicale. Cela permet à la zootechnie lors de leur tour bien-être animal deux fois par jour d'avoir l'indication rapide que les animaux ont été opéré et ainsi ouvrir la cage et procéder à la vérification. L'expérimentateur qui vient faire son suivi post-opératoire est en charge de retirer cette dernière quand l'animal a complètement récupérer de l’opération. Tous signes d’inconfort ou de détresse sera pris en compte tels que l'apparence et la position anormale : poil ébouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, couché sur le côté; comportements anormaux : agressivité soudaine, abattement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit, changement des périodes de sommeil, réduction de la mobilité. Les points limites sont: État de choc, léthargie, inconscience, immobilité. Difficultés respiratoires. Toutefois, les critères absolus ne devraient pas être mis en évidence aux vues des procédures utilisées et de notre expérience sur ce modèle.

Choix des espèces

Le modèle murin présente une architecture de l’œil très proche de celui humain, une organisation de la rétine similaire. De plus l’existence d’un modèle génétique de rétinite pigmentaire proche du phénotype humain, avec une dégénérescence rapide (aveugle à 60 jours convient parfaitement à notre étude. Au contraire, le modèle de rat aveugle que nous utilisons pour d’autres études dégénère moins vite (environ 9 mois) entraînant des conditions d’hébergement plus compliquées. Les souris seront âgées de 6 semaines à leur entrée dans l’animalerie et respecteront 5 jours d’acclimatation minimum. La première procédure expérimentale sera l’injection à l’âge de 8 semaines. C’est à cet âge que la rétinite pigmentaire des animaux sera suffisamment avancée (animal considéré aveugle) pour nos études sur les nanoparticules.

4080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit un régime obésogène, des mises à jeun, un hébergement individuel de 48 heures, des gavages et des prélèvements de sang répétés à la queue, avant d'être tué pour prélever tissus et organes. Le porteur classe ces actes de léger à modéré tout en reconnaissant que le régime peut gêner les déplacements et que l'isolement génère du stress. Il présente le projet comme une meilleure compréhension des maladies métaboliques liées au vieillissement et à l'obésité, les perspectives médicales restant à venir.

Objectifs

L’inflexibilité métabolique, commune à l'obésité et au vieillissement, est associée à la progression du diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires représentant la première cause de mortalité dans le monde. Ces pathologies résulteraient d’un défaut de gestion des lipides par le tissu adipeux mais les mécanismes impliqués sont encore mal compris. Les travaux de la littérature soutiennent l'hypothèse selon laquelle les cellules endothéliales vasculaires des tissus adipeux jouent un rôle central via leur capacité de gestion des flux lipidiques en fonction de l'état énergétique et que l’altération de cette fonction serait un événement précoce de l’altération de l’homéostasie lipidique systémique. Nous étudierons la contribution de signalisations cellulaires propres aux cellules vasculaires. Notre objectif est d’identifier des mécanismes propres aux cellules endothéliales vasculaires du tissu adipeux et d’évaluer l’impact de la modulation de leur phénotype sur l’expansion, la fonctionnalité du tissu adipeux et sur la progression des pathologies associées au vieillissement naturel et accéléré par l’obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux définir la contribution des altérations du système vasculaire dans la genèse des maladies métaboliques et cardiovasculaires associées au vieillissement naturel et accéléré par l’obésité et ce, en tenant compte du sexe. En particulier la complétion de ces travaux ouvrira de nouvelles perspectives médicales personnalisées pour diagnostiquer et traiter les individus à risque de développer un diabète de type 2 et les maladies cardiovasculaires associées.

Procédures

Les animaux seront soumis à des interventions de classes légère à modérée. -Prélèvements d’une goutte de sang à la veine caudale : maximum 1 fois 8 prélèvements espacés de 15 à 30 minutes (2 secondes par prélèvement) -Prélèvement de sang à la veine caudale par capillaire : maximum 4 fois sur 24 heures (15-30 secondes par prélèvement) -Gavage : maximum 1 fois par animal (10 secondes) -Mise à jeun : maximum 1 fois pour 12 heures effective (phase active) -Hébergement individuel : maximum 1 fois pendant 48 heures

Impact sur les animaux

Les expérimentations réalisées dans ce projet sont peu invasives indolores (pesée, régime riche en lipides, jeûne) ou de classe légère et modérée (test de tolérance au glucose, gavage, placement en environnement nouveau et seul pendant 48h pour la calorimétrie par exemple, mesure de la composition corporelle). Elles peuvent être associées aux nuisances suivantes : - Régime obésogène peut induire une prise de poids pouvant gêner les déplacements - Hébergement individuel de 48h peut générer du stress - L’analyse de la composition corporelle peut générer un stress pendant le maintien immobile dans la cage de lecture (90 secondes) - Gavage peut générer du stress et inconfort durant la procédure (quelques secondes) - Prélèvement à la veine caudale peut générer du stress et une douleur légère - Mise à jeun peut entrainer du stress

Devenir

Les procédures d’études phénotypiques et métaboliques (Calorimétrie indirecte, Composition corporelle, Tolérance au glucose) sont des mesures faites sur l’animal au cours de la procédure de régime obésogène. Les animaux seront alors remis dans leur cage d’origine et seront soit euthanasiés à la fin du temps de régime défini afin de prélever les tissus et organes pour les analyses histologiques et cellulaire des tissus, soit étudiés lors des procédures terminales d’adaptation au jeûne/réalimentation ou challenge lipidique aigue. Au terme de ces procédures tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever les tissus et fluides pour des études multi-omiques permettant de répondre aux questions scientifiques énoncées.

Remplacement

L’utilisation du modèle murin nous permettra d’identifier et de quantifier les changements progressifs et dynamiques impactant le système vasculaire qui surviennent avec le régime alimentaire, la prise de poids et le vieillissement. Les prélèvements humains représentent un point fixe de l’état individuel et ne permettent pas de contrôler l’historique de perte et/ou gain de poids. Aucun système de culture cellulaire n’a pu reproduire les variations circadiennes des apports en lipides qu’auront à subir les cellules endothéliales chez des souris alternant des phases d’apport nutritif et de repos. Notre objectif est d’identifier les mécanismes moléculaires et cellulaires mis en place avant l’apparition des désordres métaboliques et cardiovasculaires.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux pour cette étude, nous avons réalisé une veille bibliographique, tenu compte de nos expériences passées et conçu les expériences afin d’obtenir un pouvoir statistique suffisant avec un nombre minimum d’individus. Pour réduire au maximum le nombre d’animaux, plusieurs procédures expérimentales de classe légère puis modérée seront réalisées sur les mêmes groupes d’animaux dès lors que les animaux auront recouvré un bien-être général et dans la mesure où les procédures ne peuvent pas interférer entre elles.

Raffinement

Lors de leur arrivée en zone expérimentale les souris sont placées en salle d’acclimatation et y resteront pendant 1 semaine en présence de ouate pour réduire le stress qui pourrait être causé par le transport. Dès leur arrivée, les animaux sont pris en charge par le personnel de la zootechnie compétent qui vérifiera leur état et bien-être. Les animaux issus de différentes cages de transport ne sont jamais mélangés dans les cages d’hébergement. Critères d'arrêt par rapport à la souffrance : dans le cas où l’animal ne répond plus à des besoins physiologiques énoncés ci-dessous, l’arrêt de l’expérimentation sera préconisé par l’expérimentateur ou toute personne en charge du suivi des animaux. Les animaux sont observés quotidiennement par les zootechniciens et par les expérimentateurs du projet. Ce suivi aura pour but de détecter de la douleur, d’évaluer la capacité de s'alimenter, de boire, de se déplacer. Dans le cas où l’animal ne répondrait plus à ses besoins physiologiques, il sera anesthésié puis, après perte de conscience, l’animal sera euthanasié par dislocation cervicale. Observation quotidienne pendant la durée de la procédure. Dans nos connaissances actuelles, les procédures ne doivent pas modifier le comportement général des animaux ni altérer leur bien-être, même si les animaux sont gardés jusqu’à un âge avancé.

Choix des espèces

La souris de fond C57BL6/J est un modèle reconnu dans l’étude du métabolisme et de l’obésité. Nourrie en alimentation riche en gras, elle développe des anomalies similaires à celles associées au syndrome métabolique chez l’Homme. Animaux âgés de 8 semaines et 12 mois en début de protocole. Nous souhaitons utiliser des animaux à maturité et nous affranchir de la phase exponentielle de croissance. L’utilisation de 2 tranches d’âge (8 semaines et 12 mois + 1, 4, 12 semaines) nous permettra d’évaluer si l’adaptation vasculaire peut avoir des effets variables en fonction de l’âge.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal, immunodéficient, reçoit une greffe de cellules tumorales dans la glande mammaire puis des injections péritumorales et péritonéales répétées et des prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire, avant d'être tué pour prélever tumeur et rate. Le porteur indique que la pousse tumorale et les injections répétées peuvent provoquer nécrose, œdème et douleurs. Il présente l'activation des cellules NK comme une "piste thérapeutique intéressante" contre le cancer, les retombées restant conditionnelles.

Objectifs

Le cancer est un problème majeur de santé publique etant la première cause de décès en france. Il est maintenant avéré que le système immunitaire est capable de reconnaitre et d’éliminer les cellules tumorales. Cependant, certaines tumeurs mettent en place des mecanismes de resistance afin d'échapper à cette surveillance du système immunitaire. L'avancée de ces connaissances ont permis le développement de nouvelles thérapies très efficaces pouvant réactiver le système immunitaire et ainsi éliminer les cellules tumorales. Toutefois,ce type de thérapie ne fonctionne pas chez de nombreux patients, c'est pour cela qu'il est necessaire d'identifier de nouvelles voies thérapeutiques activant d'une autre manière le système immunitaire. Parmis les cellules immunitaires, les cellules naturelles tueuses (cellules NK) jouent un rôle majeur dans la réponse anti-tumorale. mais leur activité est souvent altérée. Ainsi, l’identification de molécules capables d’activer les fonctions anti-tumorales des cellules NK représentent une piste thérapeutique intéressante.

Bénéfices attendus

Les cellules NK font partie de la première ligne de défense contre le développement de tumeurs. Ainsi, l’identification de molécules capables d’activer leurs fonctions anti-tumorales représente une piste thérapeutique intéressante. Nous pensons que cette étude devrait déboucher sur l’identification d’un nouveau mécanisme de surveillance immunitaire et potentiellement d’une nouvelle cible thérapeutique permettant de moduler positivement l’immunité dans les cancers.

Procédures

Rasage des souris sur le flanc sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane (1x5min/souris) - Injection de cellules tumorales en position intra mammaire sur le flanc des souris sous anesthésie gazeuse (1x4min/souris) - Injection péri-tumorale de molécules (14x30sec/souris) - Injection intrapéritonéale (4x20sec souris) - Prélèvement de 100µl de sang au niveau du sinus retro-orbitaire sous anesthésie locale et gazeuse (3x5min /souris)

Impact sur les animaux

Souris Immunodeficiente = Possible infections pouvant entrainer l'apparition de maladie Injection de cellules tumorales et pousse tumorale = piqure/necrose de la tumeur pouvant entrainer des douleurs chez l'animal Injections répétées = piqure/oedeme/infection pouvant entrainer des douleurs chez l'animal Multliple contentions et anesthésie gazeuse pouvent engendrer un stress répété chez l'animal. Prélèvement de sang au niveau du sinus retro-orbitaire peuvent entrainer des douleur chez l'animal.

Devenir

A l'issu de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort et des organes (tumeur, rate) seront prélevès pour des analyses en laboratoire

Remplacement

Nous avons tout d’abord effectué un certain nombre d'expériences in vitro. Cependant, la validation de nos résultats nécessitera une série d'expériences in vivo afin de determiner un nouvel axe thérapeutique impliquant des cellules du système immunitaire dans le traitement du cancer du sein. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, l'étude de la pathologie, en particulier les interactions entre les cellules tumorales et leur microenvironnement immunitaire, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique se base sur des données bien établies de la littérature. Nous avons ainsi calculé une taille d'échantillon de 10 souris par groupe. Chaque procédure expérimentale sera réalisée en 2 expériences indépendantes, avec dans un premier temps 5 souris par groupe. Ainsi, la deuxième expérience ne sera réalisée uniquement si la première montre des résultats encourageants. De plus chaque procédure sera réalisée uniquement si la procédure précédente à montré les résultats attendus validant notre hypothèse. Il n’y a pas de double emploi des souris.

Raffinement

Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus, un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs (2 fois par semaine), et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage et le cas échéant du DietGel et/ou de l’HydroGel sera utilisé en cas de douleur et angoisse de l'animal. Par ailleurs, de la litière en cellulose sera également utilisée pour les souris porteuses de tumeur afin de diminuer l'inconfort lié au frottement.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation in vivo chez la souris est justifié par l’existence de la ligné tumorale et des réactifs qui à notre connaissance n’ont pas été développés dans d’autres modèles pré-cliniques. De plus, notre laboratoire a développé une expertise unique dans l'analyse du système immunitaire et du cancer chez la souris, et a tous les réactifs nécessaires à disposition. Pour atteindre la maturité du système immunitaire, les souris seront âgées de 7 semaines.