Rongeurs

48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux trous sont percés dans la voûte crânienne de chaque animal sous anesthésie, puis la reconstruction est suivie par imagerie pendant douze semaines, pour tester des implants en titane destinés à la réparation du crâne. Le porteur annonce des douleurs post-opératoires, des infections locales et une ulcération de la plaie possibles, les rats étant tués pour analyser l'os reconstruit. Il retient le rat comme "l'espèce animale la moins évoluée" de taille suffisante pour la chirurgie et juge ces essais nécessaires avant tout passage chez l'humain.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'étudier le potentiel de nouveaux implants en titane pour aider à la reconstruction osseuse du crâne.

Bénéfices attendus

Les implants en titane permettent une reconstruction osseuse complète du defect, sans complications. Ils limiteront également les complications de reconstruction liées aux infections post-opératoires.

Procédures

Les animaux subiront une création de défauts osseux au niveau de la voûte crânienne (sous anesthésie chimique). La durée de l'intervention est estimée à 20-25 minutes. Il y aura deux defauts osseux par rat. La reconstruction osseuse sera suivie, par imagerie tomodensitométrique, pour tous ces animaux à 2, 4, 6, 8, 10 et 12 semaines après l'opération (sous anesthésie volatile). La durée de l'imagerie est estimée à 15 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables qui pourraient être observés sont : douleurs post-opératoires, infections locales de la zone opérée, ulcération de la plaie. L'intégrité de la dure-mère sera particlulièrement surveillée lors de l'intervention. A la moindre atteinte, l'animal sera écarté de l'étude. Si des effets non attendus surviennent, ils seront évalués et pris en charge par l'expérimentateur.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en vue d'effectuer des analyses histologiques de l'os reconstruit et de la zone environnante.

Remplacement

Les tests in vitro permettront de réduire le nombre de structuration à tester et d'évaluer le risque potentiel d'inflammation post-implantation. Les informations de biocompatibilité et d'efficacité de reformation osseuse sont obtenues uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques.

Réduction

L'expérimentation se déroulera en 2 séries d'animaux successives. La première série comprendra 8 animaux de chaque configuration. Le nombre d’animaux total pourra être réduit si l’effet attendu est suffisamment important, pour obtenir des résultats statistiquement exploitables, après la première série. Les groupes expérimentaux sont constitués de n = 12 individus afin de disposer d’une puissance statistique suffisante pour l’évaluation des différentes structurations. Si la normalité est respectée (test de Shapiro), le test statistique utilisé sera soit un Test T soit une ANOVA. Si l’ANOVA est significative (p < 0,05), elle sera suivie d’un post hoc de Tukey. Si la normalité n’est pas respectée, un test de Mann-Whitney ou un test de Kruskal Wallis sera effectué.

Raffinement

Le rat est une espèce animale très proche de la physiopathologie humaine et de taille suffisante pour permettre des études de chirurgie. Les différentes étapes de chirurgie seront réalisées sous anesthésie chimique profonde. La douleur post-opératoire sera gérée par l’administration de substances antalgiques de façon systématique pendant les 48h suivant la chirurgie, puis de façon optionnelle en cas de signes de douleurs observés. Les animaux seront anesthésiés par anesthésie volatile pendant les sessions d'imagerie tomodensitométrique. Les points limites seront particulièrement surveillés dans les 48 à 72h qui suivront les expérimentations. Parmi ceux-ci le poids et le comportement seront les premiers contrôlés. Ceci permettra d’intervenir immédiatement en cas de souffrance (administration de substances antalgiques), et/ou d’appliquer les critères d’arrêt prédéfinis de l’étude le cas échéant. Tous les résultats obtenus lors de ces études seront exploités.

Choix des espèces

Le rat est l’espece animale la moins evoluee et de taille suffisante pour permettre des études de chirurgie. En effet, la physiologie de la reconstruction osseuse et des réactions inflammatoires chez le rat sont proches de celles de l’humain. Ce modele permet ainsi la realisation d’etudes precliniques de chirurgie reconstructrice avec evaluation radiologique et histologique. Rats matures, âgés de plus de 22 semaines pour exclure un effet potentiel de croissance.

104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections provoquant une blessure des cellules filtrantes du rein, une partie étant gardée jusqu'à 32 jours au risque de développer une insuffisance rénale, pour étudier l'influence du rythme circadien sur la réparation rénale. Le porteur annonce une hématurie et une perte de poids possibles, les souris étant tuées par perfusion intracardiaque ou asphyxie pour analyser leurs reins. Il affirme que seul l'animal permet d'étudier le fonctionnement d'un organe entier, les pistes thérapeutiques restant à ouvrir.

Objectifs

Le rein assure des fonctions cruciales qui permettent de filtrer le sang afin d'éliminer les déchets de l'organisme dans les urines. La filtration rénale dépend de cellules spécialisées nommées podocytes. Ces cellules sont blessées chez 90% des patients souffrant de maladies chroniques rénales. Des résultats récents suggèrent que le rythme circadien joue un rôle important pour permettre aux podocytes de se réparer suite à une blessure. Dans ce projet, nous allons déterminer comment le rythme circadien influence la capacité des podocytes à répondre à une blessure. Les résultats obtenus grâce à ce projet fourniront des connaissances cruciales pour le développement de stratégies thérapeutiques permettant de traiter les patients atteints de maladies rénales.

Bénéfices attendus

Les résultats générés par ce projet permettront d'ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour favoriser la protection et la réparation des podocytes face aux blessures accumulées au cours de la vie adulte. Ce travail permettra à terme de tester des approches thérapeutiques innovantes visant à stimuler la capacité des podocytes à répondre à une blessure.

Procédures

Pour les analyses moléculaires (séquençage), les animaux recevront 3 injection intrapéritonéales (1 injection par jour pendant 3 jours consécutifs). Ils vont ensuite recevoir une injection intraveineuse. Ils seront euthanasiés 5 jours après l'injection intraveineuse par perfusion intra-cardiaque après avoir reçu 2 injections intrapéritonéales (analgésie et anesthésie). Pour les analyses histologiques, les animaux vont recevoir une injection intraveineuse. Ils seront euthanasiés 18 ou 32 jours après cette injection un automate par asphyxie au CO2. Durée des injections intrapéritonéales: environ 3 secondes. Durée des injections intraveineuses: environ 5 secondes. Durée des perfusions intracardiaques: environ 5 minutes. Les collectes d’urines se feront par une méthode non-invasive, à savoir par miction spontanée lors de la préhension des souris. Si les souris n’urinent pas lors de la préhension, elles seront placées individuellement, pendant 2 à 3h, dans des boîtes en plastique dans lesquels nous avons percé de petits trous pour permettre une bonne respiration. Ces boîtes sont dépourvues de litière, boisson et aliment, et le fond a été recouvert avec des plaques en plastiques type « 96 puits ». A l’issue de cette période, les animaux seront replacés dans leurs cages d’origine avec leurs congénères et l’urine excrétée par miction spontanée de l’animal sera alors collectée dans les puits.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet ne présentent aucun phénotype dommageable. L'injection intraveineuse va entrainer une blessure des podocytes. Cette blessure peut avoir des conséquences sur l'état de santé général des souris.Toutefois, les animaux seront euthanasiés 5 jours après l’injection pour les analyses moléculaires, un temps beaucoup trop court pour développer des symptômes suite à une insuffisance rénale. Pour les analyses histologiques, les animaux seront maintenus vivant jusqu’à 32 jours suite à la blessure, et seront donc susceptibles de développer une insuffisance rénale caractérisée par une hématurie. Une perte de poids transitoire est fréquemment observée dans les 10 jours qui suivent l'injection intraveineuse.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de permettre d'analyser par séquençage et histologiquement les résultats obtenus.

Remplacement

Bien que les techniques de culture cellulaire aient fortement évoluées, les études in vitro ne permettent pas d’étudier des processus biologiques complexes. Seuls les modèles animaux permettent d’aborder des questions relatives au fonctionnement d’un organe dans son ensemble et à l’influence de l’environnement. Aussi, par définition, notre objectif scientifique nécessite le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

En tenant compte des exigences de réduction imposées par la législation, nous avons choisi d’utiliser un nombre minimum de souris par groupe expérimental qui nous permet d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Aussi, pour les analyses moléculaires, les animaux seront soumis à l'expérimentation de manière séquentielle, ce qui nous permettra de stopper cette expérimentation dès que nous aurons collecté des échantillons de qualité́ suffisante pour réaliser un séquençage et ainsi de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Pour réaliser ce projet, nous utiliserons un maximum de 104 animaux.

Raffinement

Pour les analyses moléculaires (séquençage), les animaux sont euthanasiés par exsanguination. Ces animaux sont tout d’abord anesthésiés profondément par administration d’un mélange d’anesthésique et de sédatif. Avant toute intervention, la profondeur de l’anesthésie est vérifiée par l’absence de réflexe de retrait suite au mincement des orteils. Cette approche garantit que l’animal ne souffrira pas pendant la perfusion. De plus, les animaux seront analgésiés afin de réduire au maximum la douleur potentiellement subie par les animaux. Pour les analyses histologiques, l’évolution de la dysfonction de la filtration rénale sera surveillée étroitement dès le début de l'expérimentation. Aussi, nous avons mis en place un suivi strict et régulier de la douleur et du stress potentiellement engendrés par l'expérimentation grâce à l’utilisation d’une grille de score. Si un problème est détecté́ sur un animal lors de ces observations, la complétion de la grille permettra de déterminer de façon objective le devenir de l’animal (suivi rapproché, euthanasie).

Choix des espèces

La réalisation de ce projet permettra de comprendre comment le rythme circadien influence la réponse des podocytes au stress. La souris apparait comme un excellent modèle pour répondre à cette question car elle présente de grandes similitudes avec l’Homme. En effet, le rein des souris est histologiquement et physiologiquement similaire à celui des humains. Dans ce projet, nous allons utiliser des animaux jeunes (2 à 6 mois). En effet, les animaux de cette tranche d’âge ont un fonctionnement rénal optimal qui n’est pas encore altéré par le vieillissement.

1 716 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de cellules cancéreuses pour provoquer des métastases, dans un modèle génétiquement modifié de cancer du sein triple négatif. Le porteur annonce des tumeurs pouvant s'ulcérer et saigner, une gêne respiratoire et des fractures spontanées liées aux métastases osseuses, les souris étant tuées pour prélever les organes colonisés. Il reconnaît écarter les souris au mauvais génotype issues de l'élevage et juge une étape in vivo "nécessaire", les débouchés thérapeutiques restant hypothétiques.

Objectifs

Les principaux obstacles de l'étude des métastases sont qu'elles se produisent dans un délai inconnu, qu'elles sont visuellement et expérimentalement inaccessibles, qu'elles sont généralement complexes, et qu'il est difficile de maintenir cette complexité dans un système in vitro. Par conséquent, la plupart des études sur les maladies métastatiques se sont concentrées sur le stade ultérieur du développement métastatique, une fois que les métastases sont déjà formées. Bien que ces études aient amélioré nos connaissances sur la capacité des cellules cancéreuses à métastaser, elles ne nous ont pas informés sur la façon dont les cellules cancéreuses s’adaptent à leur nouvel environnement pour former des tumeurs. Décrypter les mécanismes cellulaire et moléculaire de la colonisation métastatique est essentiel pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour limiter la récidive métastatique. L’objectif de ce projet est d’étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires de la colonisation métastatique des cancers du sein triple négatifs. Pour cela, nous proposons d’utiliser le modèle murin génétiquement modifié C3(1)-Tag qui développe des tumeurs et des métastases similaires aux patients. L’étude de la colonisation métastatique de ce modèle nous permettra de caractériser des acteurs moléculaires pertinents pouvant être cibler par une thérapie innovante. Le projet global consiste à étudier la formation de métastases de carcinomes mammaires, de l’arrivée des cellules cancéreuses dans un nouvel organe à la formation de tumeurs secondaires afin de définir : 1. Les différents phénotypes cellulaires présents au cours de la formation métastatique par séquençage à ARN des cellules cancéreuses à différents temps. 2. Le rôle des marqueurs mésenchymateux dans les cellules cancéreuses au niveau du site métastatique. 3. Les différences de colonisation métastatique entre les organes distants (poumons, foie, os). 4. L’impact du système immunitaire sur la colonisation métastatique.

Bénéfices attendus

Les patientes atteintes du cancer du sein triple négatif (TNBC) connaissent souvent une récidive métastatique et ont donc un pronostic plus sombre. Ces cancers agressifs constituent un groupe de cancers caractérisés par l'absence de récepteurs hormonaux (progestérone et œstrogènes) et de la protéine HER2 à la surface de leurs cellules. Ils ne sont donc pas éligibles aux traitements ciblant ces trois types de marqueurs. Pour atteindre l'objectif ultime de guérir les TNBC, il est important de développer des stratégies qui préviennent ou guérissent la maladie métastatique. Une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à la formation et au développement des métastases de TNBC est une première étape cruciale vers le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour cibler la maladie métastatique. Le projet de recherche proposé a un potentiel important pour faire progresser notre compréhension des métastases de TNBC et donc de réduire la mortalité des patientes. La réussite de ce projet fournira de nouvelles informations sur la manière dont les cellules cancéreuses se disséminent au niveau des sites distants et si différentes stratégies thérapeutiques doivent être développées en fonction du site métastatique. De plus, les résultats obtenus ouvriront de nouvelles voies de recherche pour identifier des thérapies ciblées contre la maladie métastatique des TNBC.

Procédures

Les animaux pourront recevoir l’une des procédures suivantes : - Une injection de cellules cancéreuses C3(1)-Tag dans les veines caudales latérales (durée : 5 minutes) - Une injection de cellules cancéreuses C3(1)-Tag dans l’artère caudale (durée : 5 minute) - Une injection de cellules cancéreuses C3(1)-Tag dans la veine porte sous anesthésie générale (durée : 30 minutes)

Impact sur les animaux

Le modèle C3(1)-Tag est un modèle de cancer mammaire montrant une croissance tumorale rapide mais rarement métastatique (moins de 15% des animaux développent des métastases spontanées). La croissance de la ou des tumeurs primaires peut provoquer des effets indésirables sur les animaux. Particulièrement, l’animal peut subir une nuisance mécanique de la tumeur par son volume pouvant compliquer sa mobilité et son activité. La tumeur primaire, par sa croissance rapide, peut montrer une nécrose centrale par hypoxie, associée à des remaniements cutanés ulcératifs et hémorragiques entraînant une douleur pour l’animal. L’induction de métastases par injection chez la souris peut entrainer des difficultés fonctionnelles au niveau des organes colonisés. Notamment, au niveau du poumon une dyspnée peut être observée due à la présence mécanique des métastases. Des fractures spontanées peuvent être observées due à la présence mécanique de la masse dans le fût osseux. De manière plus générale, l’animal peut être touché par des signes plus généraux de mauvais état général comme la perte de poids et d’appétit. Des observations et examens cliniques seront réalisés tous les deux à trois jours afin de mettre en lumière les animaux montrant des signes cliniques. Si des signes cliniques sont détectés, les animaux seront alors surveillés tous les jours afin de leur administrer un analgésique en cas de signes de douleur (opioïdes) ou procéder à une mise à mort anticipée en cas d’atteinte de points limites majeurs.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés après chaque procédure. Pour la procédure 1 (élevage des souris C3(1)-Tag), les souris n’ayant pas le bon génotype seront euthanasiées (car elles ne peuvent être utilisées dans d'autres procédures).Lles souris femelles développant des tumeurs mammaires seront euthanasiées pour le prélèvement des tumeurs, les souris mâles trop âgées pour le croisement ou présentant des tumeurs seront euthanasiées. Pour les procédures 2 et 3 les souris seront euthanasiées aux différents temps nécessaires à notre étude sur la formation de métastases (de la colonisation d’un nouvel organe à la formation d’une tumeur secondaire) afin de collecter les organes contenant des métastases pour analyse.

Remplacement

Le projet s’intéresse à la caractérisation des mécanismes de colonisation métastatique. Il est très compliqué de mimer in vitro une implantation métastatique ectopique complexe dans un terrain pulmonaire ou autre, riche en divers éléments micro-environnementaux. Une étape in vivo est donc nécessaire pour se rapprocher au plus près des conditions de clinique humaine, afin d’observer finement les mécanismes d’action des cellules tumorales au niveau la niche métastatique. De plus, il est compliqué de maintenir in vitro l’hétérogénéité phénotypique des cellules cancéreuses in vivo. Toutefois, avant implantation in vivo dans la souris, le phénotype des cellules cancéreuses sera étudié ex vivo sur des cultures en 3 dimensions d’organoïdes fraichement isolés et en culture de tranches de poumons. Par exemple, l’effet de l’amplification ou délétion de gènes d’intérêts sera évalué ex vivo afin d’éliminer les cibles n’ayant pas d’effet sur le phénotype des cellules cancéreuses.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombres d’animaux utilisés, le personnel est formé aux outils statistiques appliqués à l'expérimentation animale (planification, randomisation et analyse) par l’utilisation de traitements statistiques des données (ANOVA, Bartlett,…). Les protocoles d’injection issus de la bibliographie sont validés et robustes permettant une prise tumorale optimale sur l’ensemble des individus de la cohorte, limitant l’utilisation d’animaux dont les prélèvements se révèlent non analysables. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en se basant sur notre expérience de ce modèle et pourra être réduit en fonction des résultats préliminaires qui seront obtenus ex vivo. L’ensemble du protocole expérimental sera précisément défini en amont afin de limiter les biais de non-homogénéité entre lots de souris. De plus, nous allons utiliser le modèle de culture de tranches de poumons. Brièvement, après injection des cellules cancéreuses par voie intraveineuse au niveau de la queue de souris, l’animal est euthanasié et les poumons sont rapidement récupérés et coupés en tranches fines puis mis en culture. Pour chaque poumon isolé, nous pouvons générer environ 20 tranches ce qui permet de tester in vitro jusqu’à 10 conditions différentes en utilisant un seul animal. En effet, selon notre expérience, au moins la moitié des tranches de poumons présentent des cellules cancéreuses. Cet essai est particulièrement utile pour étudier l’effet de molécules sur les cellules cancéreuses et le tissu pulmonaire en amont de test in vivo.

Raffinement

Le bien-être des animaux de l’étude sera particulièrement porté à l’attention du personnel qui veillera aux meilleures conditions d’élevage possible, notamment via un maintien des groupes sociaux (4- 5 animaux par cage) et l’enrichissement de l'habitat (frisottis de papier ajoutés aux cages). La gestion du stress des animaux sera maximisée, par une contention la plus rapide et la moins fréquente possible. Nous avons une grande expérience des injections intraveineuse caudales qui nous permet de les réaliser rapidement en limitant le stress chez l’animal. La douleur des animaux utilisés sera fréquemment monitorée par un examen clinique des animaux tous les 2-3 jours afin de déterminer la présence de signes cliniques puis quotidiennement si l’état générale des animaux se dégrade afin d’adapter le plus précocement possible les points critiques chez un animal et d’adapter le protocole d’anesthésie.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour ces essais : - Le modèle C3(1)-Tag de cancer du sein décrit précisément dans la bibliographie. - Concordance du modèle C3(1)-Tag murin avec les observations cliniques chez les femmes atteintes de cancer du sein triple négatif. - Similitudes de la physiologie et de la taille du génome entre la souris et l'homme - L'organisme évolue rapidement (courte durée de vie) et permet des analyses compatibles avec les impératifs de progrès thérapeutiques à apporter en clinique humaine - Certaines souches sont génétiquement modifiées, permettant la création de modèles tumoraux particuliers (absence du système immunitaire pour mettre en lumière le rôle de ce dernier dans la colonisation métastatique). - Modèle C3(1)-Tag : les souris C3(1)-Tag développent des tumeurs spontanées à partir de 16 semaines avec des tumeurs d’environ 17 mm de diamètre (1500 mm3, point limite) aux alentours de 22 semaines. Afin de récupérer un maximum de tissu cancéreux, les souris seront utilisées lorsqu’elles présenteront au moins une tumeur de 17 mm de diamètre (environ 1500 mm3), sauf si un point limite est atteint avant. - Modèle NSG : les souris seront utilisées entre 10 et 12 semaines, âge adulte permettant aux souris de supporter le développement de métastases. - Modèle REAR : similaire au modèle NSG, les souris seront injectées avec des cellules cancéreuse C3(1)-Tag entre 10 et 12 semaines pour permettre le développement de métastases.

340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un sepsis leur est provoqué par chirurgie, puis elles reçoivent des séances d'électrostimulation musculaire sous anesthésie, pour évaluer un protocole d'exercice contre la fonte musculaire des patients en réanimation. Le porteur annonce une faiblesse et une fonte musculaires, un cumul d'anesthésies, un isolement de 72 heures et une restriction alimentaire imposée aux témoins, les souris étant tuées pour analyser leurs muscles. Il juge le modèle animal "indispensable" car le sepsis touche plusieurs organes, les retombées pour les patients restant annoncées.

Objectifs

Le sepsis, une infection généralisée pouvant conduire les patients en réanimation et sous ventilation mécanique, a des conséquences désastreuses sur le muscle squelettique conduisant à une faiblesse et à une fonte du tissu musculaire. A ce jour, il n’existe pas de traitement pour lutter contre ces dysfonctions musculaires sévères. Nos travaux montrent que l’augmentation de l’activité musculaire à l’aide de stimulations électriques répétées, contrôlées et non-traumatiques a des effets bénéfiques sur le muscle normal. Ce projet a pour but d’évaluer les effets d’un protocole d’exercice induit par des stimulations électriques musculaires chez des souris atteintes de sepsis. Des analyses de force musculaire, de taille des fibres musculaires couplées à des investigations cellulaires sont réalisées pour objectiver l’efficacité du protocole d’exercice.

Bénéfices attendus

Les patients atteints de sepsis et admis en réanimation présentent une fonte du tissu musculaire et une réduction de la force, responsables d’atteintes fonctionnelles pouvant perdurer jusqu’à 5 ans après la sortie de réanimation. Ce projet permettra de développer un traitement permettant d’améliorer la fonction musculaire de patients atteints de sepsis

Procédures

Les animaux sont soit soumis à un sepsis soit à une procédure contrôle. La durée de l’anesthésie pour la procédure chirurgicale est d’environ 30 minutes. Les animaux reçoivent des injections sous cutanées 4 injections par jour pendant 3 jours. La durée de la contention et des injections est inférieure à 1 minute. Une première procédure permettra de raffiner le protocole de sepsis grâce à un traitement antibiotique et d’évaluer les conséquences des anesthésies indispensables au protocole d’exercice par stimulations électriques musculaires sur la proportion des animaux atteignant les points limites éthiques. Si le traitement antibiotique permet de limiter la proportion des animaux atteignant les points limites éthiques, une seconde procédure sera réalisée et visera à évaluer les effets d’un protocole d’exercice par stimulations électriques sur le système musculaire. Le protocole d’exercice sera réalisé sous anesthésie générale soit dans la phase aiguë (soit au 1er jour post-chirurgie) soit dans la phase tardive (au 4ème post-chirurgie) de l’induction du sepsis. Un protocole contrôle (sans stimulations électriques musculaires) sera également inclus. Dans les deux cas, la durée d’anesthésie générale est de 20 minutes. Six séances d’exercice (ou contrôle) sont réalisées sur une période de 7 jours.

Impact sur les animaux

Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (chirurgie, injections sous cutanée, stimulations électriques musculaires, anesthésies). La procédure de sepsis a pour conséquence d’induire une faiblesse et d’une fonte musculaires. La procédure contrôle induit également un stress pour les animaux. Pour les deux groupes, le stress des animaux inclut également : 1) la contention lors des injections sous cutanée de buprénorphine, d’antibiotiques, de sérum salé et de solution glucosée (durée inférieure à 1 minute) et de la prise de température, 2) l'anesthésie lors de la procédure chirurgicale (sepsis et contrôle, durée inférieure à 30 minutes) 3) l'anesthésie lors des séances d’exercice par stimulations électriques musculaires ou la procédure contrôle (durée 20 minutes), 4) l’anesthésie avant la mise à mort (durée inférieure à 2 minutes), 5) la réduction de la prise alimentaire pour le groupe sham afin de mimer l’anorexie du groupe sepsis. L’isolement en cage individuelle pendant 72 heures pour faciliter la cicatrisation post-chirurgie

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse détaillée du tissu musculaire qui ne peut pas être réalisée sur animal entier vivant.

Remplacement

Pour ce projet, les modèles animaux sont indispensables car le sepsis impacte plusieurs organes, dont les conséquences sur le système musculaire sont impossibles à modéliser in vitro. Aussi, la procédure implique un exercice par stimulations électriques musculaires qui est impossible à reproduire in vitro. Enfin, les études de physiologie nécessitent l'utilisation de modèles animaux car seule l'analyse du tissu, voire de l'organisme entier permet d'identifier le réel impact de ces interactions moléculaires et cellulaires sur la fonction de l'organe

Réduction

L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures. Nous proposons un traitement antibiotique qui permet de minimiser les conséquences fonctionnelles du sepsis. Nous utilisons un dispositif expérimental totalement peu-invasif qui permet de réaliser des protocoles d’exercice par stimulations électriques musculaires et de mesurer la force musculaire de manière simultanée sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Si le traitement antibiotique n’est pas efficace pour raffiner le protocole de sepsis, la seconde procédure ne sera pas effectuée. Aussi, en l’absence d’effets du protocole d’exercice sur la force musculaire ou sur la taille des fibres musculaires, les analyses biologiques proposées ne seront pas effectuées.

Raffinement

Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. Les procédures expérimentales utilisées incluent un recours systématique aux antalgiques, à l’injection de sérum physiologiques et de solution glucosée ainsi qu’à l'anesthésie générale adaptée lors de l’exercice de stimulations électriques musculaires. Aussi, le sepsis est traité par un traitement antibiotique. Des fibres de peuplier, du coton et un igloo seront placés dans les cages d’hébergement pour favoriser la nidification des souris et leur bien-être. De la nourriture et un hydrogel seront déposés à même la litière afin de prendre en compte la réduction de la mobilité de l’animal et le risque de ne plus pouvoir accéder facilement à la nourriture dans les 72 heures post-chirurgie. Une grille de score et une prise de température sont utilisées pour déterminer les points limites. L’expérience de l’équipe montre que cette stratégie est suffisamment prédictive pour que 93% des animaux soient inclus dans l’étude.

Choix des espèces

Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'homme dans sa structure et son fonctionnement. Les processus physiologiques impliqués dans l’homéostasie du muscle squelettique ont été largement décrits chez des animaux adultes. Les animaux seront utilisés entre 8 et 12 semaines d'âge.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer des déficits de mémoire, elles reçoivent deux molécules par gavage ou injection pendant 21 jours, puis subissent des tests comportementaux dont des épreuves de nage dans une eau à 22 degrés. Le porteur n'annonce qu'un inconfort lié à la contention et attend des molécules qu'elles restaurent la mémoire, les souris étant tuées pour analyser leur cerveau. Il affirme qu'aucune alternative cellulaire ne peut remplacer l'animal entier, un passage en clinique restant conditionné aux résultats.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’identifier l’effet bénéfique de molécules pharmacologiques à potentiel thérapeutique dans des maladies du cerveau (démence fronto-temporale, maladie d’Alzheimer, tauopathie). Deux molécules seront testées et elles seront injectée par deux voies d’administration différentes dans deux lignées de souris modèlisant ces maladies du cerveau (et de leurs contrôles). Nous mènerons ensuite une série de tests comportementaux visant à évaluer si ces différents traitements (molécules actives, molécules contrôle) favorisent la formation de la mémoire chez ces animaux. Des analyses du tissus cérébral (obtenu post-mortem) permettront d’avancer sur la compréhension des effets de ces traitements au niveau cellulaire. Pour comprendre leurs mécanismes d’action, des études moléculaires seront menées en parallèle sur ces tissus obtenus post-mortem à partir d’autres groupes d’animaux traités. Ces études permettront de démontrer si l’administration de ces molécules par voie orale apporte un bénéfice sur le cerveau et s’il l’un de ces traitements (ou les deux) peuvent être ultérieurement appliqués à l’Homme pour des études cliniques.

Bénéfices attendus

En utilisant des modèles animaux de pathologies humaines, cette étude permettra de mettre en évidence si l’administration par voie orale (per os) de nouveaux médicaments est efficace contre les maladies du cerveau. En effet, la validation du mode d’administration oral pour le traitement pharmacologique avec l’une ou l’autre de ces molécules (ou les 2), permettra leur exploitation vers les phases cliniques chez l’Homme. Ainsi, ces études apporteront des bénéfices en santé humaine car elles apporteront des pistes et des preuves d’efficacité pour aller vers les études cliniques chez l’Homme. De plus, en apportant des bases mécanistiques à leur mode d’action, ces études permettront d’étayer les connaissances plus fondamentales de l’effet bénéfique de ces molécules sur le cerveau.

Procédures

Le gavage oral sera réalisé sur 360 animaux vigiles, à raison de 1X/jour pendant 3X5 jours suivi de 2 jours de repos, sur une période de 21 jours. Les injections intra-péritonéales seront réalisés sur 240 animaux vigiles, à raison de 1X/jour pendant 3X5 jours suivi de 2 jours de repos, sur une période de 21 jours. Le gavage oral nécessite une habituation à la contention de 30 secondes 1X/jour pendant 3 jours, suivie des contentions répétées 1X/jour pendant 15 jours (sur les 21 au total). Chaque contention est faite sur animal vigile et dure entre 10 et 15 secondes. Comportement réalisé sur 360 animaux vigiles hébergés en cage individuelle avec nid sur une période de 41 jours/animal: Test1 : 48h dans une cage avec peu de litière et sans nid, Test2 : 15min de test/jour dans une boite d’open field sur 5 jours, Test3 : 3X 1min/jour dans de l’eau à 22° C sur 6 jours + 1 min dans l’eau (22°C) 24h après l’entrainement + 1 min dans l’eau (22°C) 21 jours après l’entrainement. Chaque test est séparé du suivant par 3 jours. Les souris transgéniques développent des déficits mnésiques (souris THY-Tau22 à l’âge de 9 mois et souris Thy1-hSNCA à l’âge de 12 mois).

Impact sur les animaux

Les procédures exécutées ne provoqueront qu'un inconfort léger liées au stress de la contention des souris au moment de l’administration de molécule. Cependant celui-ci sera minimisé par la mise en place d’une habituation à la contention, réalisée 1X/jour pendant 3 jours avant les différents types d’administration. La voie d'administration par gavage oral a été retenue car il s'agit de celle qui serait utilisée chez l’Homme dans les phases cliniques. La voie d'administration intrapéritonéale est la voie qui a déjà été utilisée chez l’animal dans des études pilotes et servira de contrôle à l’administration par gavage oral. L’inconfort ne durera que très peu de temps, juste pendant et après l’injection. Ces deux modes d’administration sont opérés par une personne qualifiée et spécialement formée sur ces gestes techniques, minimisant ainsi le stress auquel les animaux sont soumis. Enfin, aucun effet secondaire (indésirable) n'est attendu avec les deux molécules testées, car des études antérieures ont déjà montré qu’elles n’avaient pas d’effet toxiques, même lors d’injections répétées/chroniques. Cependant, les animaux seront observés et pesés quotidiennement par du personnel spécialement formé lors des administrations des molécules et lors des tests comportementaux. Les souris transgéniques développent des déficits mnésiques entre 9 mois et 12 mois. Notons que l’administration des molécules devraient, selon notre hypothèse de travail, minimiser ces nuisances (par exemple, restaurer la mémoire).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements et analyses post-mortem.

Remplacement

Dans la mesure où nos travaux portent sur les caractérisations comportementales et moléculaires suite à un traitement pharmacologique, il n’est pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier. Nous ne pouvons pas utiliser d’alternative cellulaire. Notons que les modèles murins (souris) récapitulent les symptômes majeurs de la maladie (déficit de mémoire) et restent ainsi des outils uniques pour l'étude des mécanismes physiopathologiques, la validation de cibles thérapeutiques et la réalisation de tests précliniques.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux pour permettre des analyses statistiques sur des groupes incluant mâles et femelles, soit 18 souris/groupe (9 mâles et 9 femelles) pour le comportement et 12 souris/groupe (soit 6 mâles et 6 femelles) pour les approches moléculaires. L’efficacité de chaque traitement sera effectuée à l’aide de tests statistiques adaptés. Les calculs fait tiennent compte de la variabilité interindividuelle. Ainsi, pour toutes nos analyses, nous utiliserons à la fois des animaux mâles et femelles dans nos expériences de manière à ne pas biaiser nos résultats, et les sexe ratios seront conservés entre les différents groupes (voir chronogramme décrivant les groupes d’animaux). Enfin, nous avons créé les lots d’animaux de cette étude en tenant compte des études antérieures qui avaient déjà montré l’impact de ces molécules sur les groupes contrôles et cela nous permet de réduire le nombre total d’animaux de 720 à 600.

Raffinement

Afin de raffiner les conditions de vie des animaux, ceux-ci bénéficieront de soins appropriés pour optimiser le bien-être des souris, tels que des éléments d’enrichissement (matériel de construction du nid, barre à ronger) et d’un suivi quotidien. De plus, ils seront maintenus en groupe sociaux, sauf pour la durée des tests de comportement où ils seront isolés (1/cage). Dans ce cas, plusieurs cages (3 au minimum) seront maintenues côte à côte sur les rayonnages des racks de stabulation. Les souris seront manipulées à l’aide de tubes spécifiques pour réduire le stress lors des changes (permet de nettoyer les cages sans toucher la souris). Des points limites prédictifs sont mis en place pour limiter la souffrance si un problème devait survenir après l’administration d’une molécule : la surveillance des souris est journalière (observation visuelle, suivi de l’aspect général et de la posture) et elles sont pesées avant chaque administration de molécule, permettant de s’assurer du bien-être des souris. Les souris sont habituées à la manipulation par l’expérimentateur pour réduire le stress lié à la manipulation lors de l’administration des molécules. Les animaux sont testés dès le début de l’apparition des déficiences mnésiques afin de réduire le temps d’hébergement des animaux en animalerie.

Choix des espèces

Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des maladies du cerveau ayant une origine génétique. En effet, les maladies du cerveau que nous étudions dans ce projet apparaissent à l’âge adulte (40-50 ans) lorsque ce sont des formes génétiques. Elles apparaissent plus tardivement, quand leur origine n’est pas connue, le vieillissement étant un facteur de risque majeur de ces pathologies. Ainsi, les animaux étudiés seront utilisés à l'âge adulte, soit 9 et 12 mois selon les modèles, cela correspond environ à la moitié de la vie d’une souris de laboratoire. Nos études antérieures ont montré que cela correspond également au moment où les premiers signes de déficits mnésiques apparaissent dans ces modèles. De plus, ces modèles permettent de répondre à la question posée car les souris possèdent des structures neuro-anatomiques comparables à celles du cerveau humain.

64 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit dans le cerveau, par chirurgie stéréotaxique, une injection d'extraits issus de cerveaux de patients Alzheimer, puis subit des tests comportementaux, pour étudier la propagation de la protéine Tau par des vésicules. Le porteur annonce une douleur post-chirurgicale et une réduction des capacités cognitives, les souris étant tuées pour analyser les lésions cérébrales. Il affirme qu'aucun modèle ne reproduit cette dynamique in vitro et présente une preuve de concept pour de futures thérapies, restée hypothétique.

Objectifs

L’envahissement progressif du cerveau par des dépôts protéiques anormaux est l’une des causes principales de la maladie d’Alzheimer, maladie neurodégénérative affectant plus d’un million de personnes en France. En particulier, des formes toxiques de la protéine Tau sont véhiculées de cellule en cellule. Ce faisant, elles « contaminent » les cellules réceptrices en provoquant la transformation des protéines Tau normales en formes toxiques. L’accumulation de ces protéines toxiques est liée au développement des signes cliniques de la maladie d’Alzheimer. La propagation dans le cerveau des formes toxiques de Tau repose sur différents modes de transport. Notre projet se focalise sur les modalités du transfert de Tau par des vésicules extracellulaires, des petites capsules microscopiques produites par les cellules. Notre projet vise à comprendre comment des sucres, des héparanes sulfate produits spécifiquement dans les neurones et présents à la surface des vésicules extracellulaires et des cellules, affectent la diffusion des protéines Tau via les vésicules extracellulaires. Nos objectifs sont, dans un premier temps, d’obtenir par purification des vésicules extracellulaires à partir d’échantillons de tissus cérébraux obtenus post-mortem à partir de patients Alzheimer ou de sujets sains. Ces vésicules seront caractérisées par des méthodes biochimiques et de microscopie, en particulier pour identifier leur contenu en protéine Tau et en héparanes sulfate. Deuxièmement, à l’aide de modèles cellulaires permettant de modifier les niveaux d’expression de la protéine Tau et des héparanes sulfate, nous allons évaluer le rôle de modifications de ces sucres sur le comportement de vésicules extracellulaires et l’agrégation de la forme toxique de Tau. Enfin, à l’aide d’un modèle de souris dans lequel est supprimée l’enzyme HS3ST2, impliquée dans la production d’héparanes sulfate neuronaux, nous allons évaluer in vivo le rôle des héparanes sulfate neuronaux dans le développement d’une pathologie liée à Tau qui sera induite par injection intracérébrale de vésicules extracellulaires isolées d’échantillons post-mortem de cerveaux atteints de la maladie d’Alzheimer. Notre projet apportera une preuve de concept qui nous permettra de proposer des approches thérapeutiques innovantes ciblant de façon précoce la progression de la pathologie tau via l’étude des vésicules extracellulaires et des héparanes sulfates.

Bénéfices attendus

Nous attendons deux résultats majeurs de ce projet pour lequel nous avons déjà développé la plupart des réactifs et méthodes nécessaires. Dans un premier temps, nous caractériserons les mécanismes impliqués dans la propagation de cellule en cellule médiée par les vésicules extracellulaires (EV) des formes toxiques de Tau. Nous évaluerons l’association des EV contenant Tau avec les héparanes sulfates (HS) neuronaux afin d’identifier une nouvelle façon d'empêcher la propagation de Tau. Nous étudierons spécifiquement le rôle joué par HS3ST2, une enzyme neuronale principalement exprimée dans les régions cérébrales vulnérables au développement de la pathologie Tau. Deuxièmement, nos résultats constitueront une preuve de concept pour tester de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur l'arrêt ou le ralentissement de la transmission entre cellules des formes toxiques de Tau associées aux EV en ciblant les HS neuronaux ou HS3ST2. En particulier, l'utilisation de souris dans lesquelles le gène codant pour HS3ST2 a été supprimé constituera un guide expérimental quant à la stratégie à suivre pour des thérapies futures. En résumé, ce projet constitue une approche originale permettant de mieux comprendre des mécanismes encore mal caractérisés de propagation pathologique des formes toxiques de Tau dans la maladie d’Alzheimer pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblées. De plus, les résultats générés par ce projet seront étendus et applicables à d'autres pathologie liées aux protéines tau telles que la maladie de Pick, la paralysie supranucléaire progressive ou la dégénérescence cortico-basale.

Procédures

Les souris reçoivent une inoculation intracérébrale (durée de la stéréotaxie : 20 min). Tests comportementaux (3 sessions de 9 min chacune à 24h d’intervalle par animal) non invasifs permettant de déceler des altérations cognitives associées aux lésions Alzheimer. Euthanasie des souris et prélèvement du cerveaux pour analyses biochimiques et histologiques.

Impact sur les animaux

Douleur post-chirurgie. Réduction des capacités cognitives (légère et en général uniquement détectable dans des tâches comportementales très élaborées).

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin du projet pour étudier par des techniques histologiques et biochimiques les différentes lésions cérébrales typiques de la maladie d'Alzheimer induites par notre schéma expérimental. Ces analyses ne peuvent étudiées qu'en post-mortem après prélèvement du cerveau des animaux.

Remplacement

L'apparition des lésions de la maladie d'Alzheimer et leur diffusion dans le cerveau dépend de l'interaction entre les lésions, le système immunitaire et le cerveau de l'hôte. Il n'y a actuellement aucun modèle disponible pour effectuer une analyse complète de la dynamique d'apparition des lésions sans utiliser des animaux. Les tests in vitro ne permettent que d'étudier des aspects non-intégratifs des pathologies amyloïdes ou tau dans la maladie d’Alzheimer. La procédure fait intervenir toute la complexité des systèmes biologiques intégrés (apparition et diffusion des lésions de la maladie d'Alzheimer, interactions avec le système immunitaire) et ne peut pas être réalisé in vitro ou avec des modèles non-mammifères.

Réduction

Le critère principal sur lequel nous basons notre étude statistique est l'induction d'une pathologie tau qui est quantifiée par immunohistologie. Pour l'ensemble de notre étude nous allons étudier 64 animaux. Pour ce projet nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés au maximum en calculant le nombre nécessaire par groupe expérimental grâce à des études préliminaires. Les analyses vont être menées de façon progressive (lots de 8 animaux) et des calculs de puissance statistique basé sur des résultats intermédiaires permettra de réduire le nombre d'animaux si un effet fort est détecté ou d'annuler l'expérience si aucune lésion de la maladie d'Alzheimer n'est induite.

Raffinement

Pendant toute l'étude, les animaux sont hébergés dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h optimisés pour l’hébergement des souris. Eau et nourriture sont fournies ad libitum. L'environnement est enrichi par un système de nidification périssable renouvelé lors du change hebdomadaire. Les animaux seront hébergés par groupes. Les animaux seront examinés quotidiennement par les techniciens animaliers, sous la supervision d'un vétérinaire. Toute intervention chirurgicale sera effectuée sous anesthésie générale suivie d’un traitement au paracétamol (antalgique et antipyrétique) dans l’eau de boisson pendant 48h. Des points limites ont été définis afin de limiter la douleur éventuelle des animaux. Ces mesures garantissent que les conditions de douleur et de souffrance inutile des animaux sont contrôlées.

Choix des espèces

Les souris représentent le principal modèle animal pour l’étude de la maladie d’Alzheimer, que ce soit dans des animaux sauvages ou transgéniques. L'induction d’une pathologie Tau de type Alzheimer suite à l'inoculation d'extraits de cerveaux ou de vésicules extracellulaires Alzheimer a déjà été décrite chez des souris sauvages ce qui garantit le succès de notre approche expérimentale. La lignée murine mutée éteinte n’entraine pas le développement de caractères qui altèreraient gravement l’animal. Nous nous intéressons à des événements précoces de la maladie d’Alzheimer. Les souris seront donc inoculées à un stade jeune adulte (à l’âge de 3 mois), conformément aux données de la littérature. L'utilisation de souris plus jeunes ou plus âgées peut introduire des variables susceptibles d'affecter la robustesse de notre modèle.