Rongeurs
Caractérisation métabolique de souris modèles d’une myopathie mitochondriale
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
581 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la majorité tuées à l'issue et 110 replacées comme reproductrices. Porteuses d'une mutation reproduisant une myopathie humaine, elles subissent des tests de glucose avec prélèvements par section de la queue, des épreuves de course et des mesures de force musculaire sous anesthésie, certaines recevant des injections six jours sur sept pendant plusieurs mois. Le porteur annonce un stress léger à modéré et utilise des animaux de réforme pour former les manipulateurs, les souris étant tuées pour prélever leurs muscles. Il teste un peptide qu'il juge prometteur après un essai sur levures, une piste d'essai clinique restant renvoyée au terme du projet.
Objectifs
Notre groupe étudie des souris modèles d’une myopathie congénitale de l’être humain. Nous avons mis en évidence que cette maladie s’accompagne d’une anomalie cellulaire qui amène à un défaut de production d’énergie par les muscles, ce qui explique leur capacité d’endurance réduite et les amène à consommer plus d’énergie pour assurer le fonctionnement de leurs muscles. Le gène muté dans cette affection participe à la synthèse de certains lipides et dans une étude précédente, nous avons pu montrer l’intérêt thérapeutique chez les souris mutante d’un peptide stabilisant un lipide dont le contenu est diminué dans les muscles atteints. Nous avons ainsi pu observer une amélioration des performances musculaires et de la respiration musculaire chez les souris traitées par ce peptide. Suite à ces résultats prometteurs, ce projet vise à consolider la caractérisation des effets thérapeutiques de ce peptide chez les souris mutantes et à poursuivre l’évaluation métabolique et musculaire de ces souris hors traitement. Nous évaluerons également l’impact de cette mutation sur les capacités de lactation des femelles en analysant la composition lipidique de leur lait et en suivant la croissance de leurs petits. Enfin, pour la bonne réalisation de ces expériences, nous souhaitons pouvoir former les utilisateurs aux gestes nécessaires grâce à des animaux de réforme.
Bénéfices attendus
Notre équipe a pour mission de caractériser des myopathies affectant l’être humain et de développer des thérapies susceptibles d’améliorer leur condition grâce à des modèles animaux. Une première étude nous a permis de démontrer un rôle prometteur d’un peptide sur le fonctionnement énergétique des muscles de souris modèles d’une myopathie congénitale rare chez l’être humain, à ce jour orpheline de tout traitement. Le projet que nous proposons vise à poursuivre la caractérisation de cet effet thérapeutique afin d’offrir à la communauté scientifique une description la plus précise possible de l’intérêt de cette molécule pour cette affection. Plus largement, ce projet améliorera notre connaissance de cette myopathie, sur le plan musculaire, métabolique et reproducteur. L’objectif est à terme de pouvoir fournir aux médecins en charge des patients atteints de cette myopathie des informations les plus précises possibles sur un modèle animal pertinent de cette maladie, concernant ses mécanismes, son évolution et ses conséquences. Enfin, l’objectif est de pouvoir leur proposer une piste pour un essai clinique à partir d’éléments fiables et précis sur la sécurité et l’efficacité d’une molécule, telle que potentiellement ce peptide.
Procédures
Selon les procédures, les animaux subiront l’une de ces séries d’interventions : 1. a. Test de tolérance au glucose ou de sensibilité à l’insuline : mise à jeun respectivement 12h ou 4h, 7 prélèvements de sang, de 20 secondes, sur 2h, après section d’1/2 mm de queue, 1 fois dans la vie. b. Epreuves de course comprenant habituation sur 4 jours, mesure de la vitesse maximale aérobie (VMA), endurance et mesure du taux de lactates dans le sang, 1 fois dans leur vie. L’habituation dure de 10 min à 15 min au fil des 4 jours ; la mesure de la VMA environ 30 min, l’endurance environ 1h30 et la mesure du taux de lactates dans le sang après une épreuve d’endurance à nouveau environ 1h30 maximum. Pour la mesure du taux de lactates dans le sang, les animaux subiront 2 prélèvements de sang de 30 s, l’un avant et l’autre après la course, après section d’1/2 mm de queue. c. Mesure de force musculaire par stimulation musculaire sous anesthésie générale avec analgésie forte : chaque intervention durera au maximum 1h, soit 2h30 de manipulation au total en comptant depuis la première injection d’analgésique et jusqu’au réveil complet. Réalisée au maximum 3 fois dans leur vie. Tous les tests fonctionnels (test de tolérance au glucose, de sensibilité à l’insuline, mesure de la vitesse maximale aérobie, endurance, mesure du taux de lactates dans le sang, mesure de la force musculaire) seront séparés a minima de 4 jours. 2. Mêmes interventions qu’en 1, avec en plus une injection sous-cutanée 6 jours sur 7 de l’âge de 4 semaines jusqu’à 4 mois. Chaque injection dure environ 30 s. 3. Trois injections sous-cutanées ou intrapéritonéales ou prélèvements d’une micro-goutte de sang, ou toute combinaison de 3 de ces gestes, séparés a minima de 24h (30 s pour chaque geste) ou une série d’épreuves de course (habituation, VMA, endurance, mesure de la lactatémie) ou 3 mesures de force musculaire, séparées a minima de 4 jours, tels que décrits en 1. 4. Mesure de la glycémie par un prélèvement de sang de 20 s après section d’1/2 mm de queue, 1 fois dans la vie.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront subir un stress léger lié à la contention, aux injections ou aux prélèvements, ou modéré lors des épreuves de course. Les femelles en lactation et leurs petits pourront subir un stress énergétique modéré. Les injections et prélèvements pourront causer une douleur légère et brève aux animaux.
Devenir
La majorité des animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires à de nombreuses analyses histologiques, biochimiques et moléculaires. Une partie des animaux sera replacée comme reproducteurs.
Remplacement
Nous étudions des souris mutantes qui constituent un modèle de myopathie humaine. Une molécule semblait prometteuse d’après son mécanisme d’action et nous l’avons donc testée chez des levures mutantes pour le gène équivalent à celui qui est muté chez les souris que nous étudions. Ces levures présentent en effet des défaut cellulaires et métaboliques très proches de ceux observés dans les cellules musculaires des souris mutantes. Dans ce contexte de remplacement, cette molécule a restauré la croissance des levures mutantes. Forts de cette preuve de concept, nous avons ensuite testé cette molécule chez les souris mutantes. A ce stade, nous avons besoin de nouvelles analyses sur ces souris mutantes pour poursuivre l’évaluation de cette molécule à potentiel thérapeutique sur la fonction musculaire et métabolique de ces souris. Nous avons également besoin d’utiliser des animaux pour évaluer les conséquences de la mutation de ce gène sur la fonction musculaire et la reproduction.
Réduction
Grâce aux connaissances accumulées ces dernières années sur ces souris mutantes et les tests réalisés, nous pourrons optimiser le nombre de lots et le nombre d’animaux par lot pour les réduire autant que possibe, tout en gardant des effectifs permettant d’atteindre une pertinence statistique. Nous utiliserons pour cela des analyses statistiques adaptées. Par ailleurs, nous utiliserons des animaux de réforme pour la formation aux gestes techniques et tests fonctionnels.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Le comportement des mâles est particulièrement surveillé et en cas de bagarre grave amenant à des plaies, le mâle agresseur est séparé de ses congénères et ses congénères sont pris en charge de manière adaptée (mise à mort compassionnelle si blessures trop graves, soins dans les autres cas). En dehors de ce cas, seuls les mâles reproducteurs seront maintenus isolés. Le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft ou du coton, un bâton de bois à ronger et une maison en carton. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Tous les gestes seront réalisés avec une attention très forte au respect physique et émotionnel des animaux. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice, au besoin pharmacologique, et en cas d'absence de bénéfice, nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.
Choix des espèces
Grâce à la génération de mutations d’intérêt par manipulation du génome, la souris est un mammifère particulièrement pertinent pour l’étude des affections humaines et notamment des myopathies congénitales, que ce soit pour l’étude des mécanismes en jeu ou la réalisation d’essais thérapeutiques. Elle présente par ailleurs des atouts zootechniques (temps de reproduction court, petite taille, effectifs importants) et techniques (familiarité et facilité de manipulation). Nous utiliserons de animaux à partir du sevrage, et jusqu’à un an maximum, ainsi que des jeunes, suivis de leur naissance jusqu’au sevrage (étude de la lactation). Pour la procédure de formation, nous utiliserons des animaux de réforme, âgés d’un mois à un an. Ces âges seront pertinents pour les études réalisées et minimiseront le risque d’effet dommageable de la mutation étudiée.
Développement chez la souris d’une nouvelle méthode contraceptive non hormonale
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Une souris qui présente démangeaisons, dermatite ou conjonctivite après l'ovule au lyral, un odorant que le porteur sait allergisant, est retirée de l'expérience et mise à mort. 640 souris Swiss CD1 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour tester une contraception non hormonale. Avant l'accouplement, l'expérimentateur introduit avec le pouce un ovule de la taille d'un grain de blé dans le vagin de la femelle, geste de deux minutes trente répétable jusqu'à trois fois, accompagné d'un massage destiné, selon le porteur, à "apporter du bien être à l'animal". La souche est retenue pour ses portées de plus de 10 souriceaux, et ces souriceaux sont immédiatement mis à mort. Les femelles retournent ensuite dans le pool pour d'autres accouplements, sans que le résumé dise ce qu'elles deviennent à la fin du projet.
Objectifs
La contraception bénéficie de nombreuses méthodes. La pilule à base d'hormones qui est l'une des méthodes les plus utilisées dans notre société souffre à tort ou à raison d'une suspicion quant aux effets négatifs que l'usage répété d'hormone pourrait engendrer. Les travaux de recherche sur les récepteurs olfactifs (OR) capables de reconnaître des molécules odorantes, ont montré qu'un certain nombre d'entre eux étaient présents à la surface des spermatozoïdes de plusieurs mammifères dont l'homme et la souris. Il a été montré qu’un odorant, le bourgeonal, modifiait in vitro le chimiotactisme des spermatozoïdes humains et que le lyral, un autre odorant, modifiait lui aussi in vitro le chimiotactisme des spermatozoïdes de souris. Suite à ces travaux, nous avons cherché à savoir si in vivo l'addition de lyral dans le vagin des souris modifierait leur chimiotactisme. Pour cela, nous avons émis l’hypothèse qu’une surcharge de lyral dans le vagin de souris serait de nature à perturber la reconnaissance d’un ligand naturel à découvrir et limiterait la fécondation de l'œuf. Dans une série d’expériences préliminaires nous avons de fait observé que l’introduction de lyral liquide dans le vagin de souris perturbait la procréation : Ainsi, la copulation de 31 couples de souris, n’a donné naissance qu’à 176 souriceaux (13 femelles n’ayant eu aucune progéniture) alors que tous les couples témoins (n=31) ont été productifs et amené à la naissance de 372 souriceaux (résultats non publiés). A partir de ces résultats, statistiquement significatif, nous avons émis l'hypothèse qu'une molécule odorante introduite dans le vagin par un ovule pourrait être la source du développement d'une nouvelle méthode contraceptive non hormonale. Le présent projet a pour but de tester cette possibilité, ainsi le mode de l'utilisation via un ovule.
Bénéfices attendus
Les conséquences et bénéfices attendus sont à deux niveaux le premier dans le cadre de la pratique médicale, le second sur le plan de la recherche fondamentale. 1) Si le lyral introduit dans le vagin à l’aide d’un ovule diminue nettement la procréation, comme observé précédemment chez les souris ayant reçu du lyral liquide il est prévu de faire des essais cliniques d'utilisation d'ovules chargés d'un odorant reconnu par les OR exprimés à la surface des spermatozoïdes humains, dans le but de développer une nouvelle méthode contraceptive sans hormone. 2) Sur le plan de la recherche fondamentale, une forte limitation de la taille des progénies confirmerait les résultats de nos expériences précédentes selon lesquels les OR exprimés à la surface des spermatozoïdes ont un rôle biologique dans la fécondation de l'oeuf, ce qui n’a jamais été démontré. Cela ouvrirait la voie à la recherche de ligand(s) particuliers impliqués dans le chimiotactisme naturel des spermatozoïdes et dans la reproduction. Cela conduirait aussi à la recherche des cellules émettrices de ce ligand et plus encore permettrait d’envisager de nouvelles explications et hypothèses de travail relatifs à la stérilité de certains couples.
Procédures
L'expérimentation se limite à l'introduction d'un ovule de la taille d'un petit grain de blé dans le vagin de souris avant leur mise en accouplement. L'introduction sera réalisée manuellement et délicatement la souris est maintenue, sans contrainte par la base de la queue afin de permettre à l'expérimentateur d'accéder à la région vulvaire. L'ovule est introduit délicatement avec le pouce. L'expérimentateur maintient une légère pression avec son pouce sur la région génitale afin d'éviter une sortie de l'ovule et exerce un massage doux de la zone pour faciliter l'introduction complète de l'ovule et apporter du bien être à l'animal pendant ce geste. Le temps d'introduction complète est d'environ 2m30s et l'animal ne montre aucun signe de douleur ou de stress (pas de morsure, de réaction de fuite...) Le geste sera répété à une semaine d'intervalle ou plus, en cas de non copulation. La même souris femelle pouvant être utilisée jusqu’à 3 fois, si nécessaire.
Impact sur les animaux
Les expériences préliminaires que nous avons faites et qui consistaient en l'introduction directe de lyral dans l'espace vaginal de souris n'ont pas mis en évidence d'effets indésirables à court ou moyen terme chez les souris. La même dose sera utilisée dans cette expérience. L’introduction de la molécule via un ovule sera également sans effet. Aussi toutes les souris recevant un ovule (placebo ou test) seront quotidiennement observées pour noter tout changement dans leur comportement ou l'apparition de quelques symptômes qu'ils soient. Etant donné le caractère allergisant du lyral, une attention particulière sera donnée à l’apparition de démangeaisons et de conjonctivites pendant 2 à 3 semaines après introduction des ovules. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne de leur comportement afin de détecter toute gêne éventuelle, ou phénomène de nature allergisant (dermatites, conjonctivites). Si de tels problèmes étaient observés, risquant d’entrainer une douleur chez l’animal, l’expérience sera stoppée et celui-ci sera euthanasié.
Devenir
Après chaque accouplement, les souris seront remises dans le pool et utilisées pour d'autres accouplements. Les souriceaux seront immédiatement mise à mort.
Remplacement
Il est impossible de remplacer ces expérimentations chez la souris, préliminaires à des essais cliniques chez l'homme, par des tests in vitro dans la mesure où la question posée est celle de savoir si un ovule libérant dans le vagin une molécule odorante se fixant à la surface des spermatozoïdes pourrait empêcher la procréation en perturbant leur chimiotactisme en direction de l'œuf. A l’évidence, des expériences reposant sur fécondation in vitro ne permettrait pas de tester cette hypothèse.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques pertinentes et scientifiquement irréprochables afin de valider les données obtenues.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une structure agréée qui tient compte de l'éthique animale. Les accouplements seront hébergés dans une armoire ventilée afin d'éviter les conséquences olfactives de l'utilisation de la molécule odorante sur les autres animaux présents dans la pièce d'hébergement. Le reste du temps l'hébergement se fera en groupes sociaux et les animaux bénéficieront d’un environnement calme et d'une alimentation abondante. Une surveillance journalière des animaux sera réalisée pour s'assurer que les conditions de bien-être sont respectées. Si des souris présentaient une réaction de nature allergisante, elles seraient immédiatement retirées de l'expérience. Par ailleurs, rappelons que les ovules sont de qualité pharmaceutique, fabriqués par une société pharmaceutique avec des produits autorisés par la pharmacopée et ainsi sans danger par elles-mêmes.
Choix des espèces
La souris est la seule espèce animale pour laquelle on a clairement identifié les récepteurs olfactifs exprimés à la surface des spermatozoïdes. Par ailleurs nous avons choisi la souris Swiss CD1 car elle est très prolifique. Les portées sont régulièrement supérieures à 10 souriceaux, ce qui facilite la recherche d'un effet négatif sur la procréation. Les souris mâles et femelles utilisées auront entre 8 à 48 semaines.
Implantation in vivo dans le système gastro-intestinal de polymères adhésifs biocompatibles à visée thérapeutique chez le rat.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
648 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit sous anesthésie une incision du caecum ou de l'estomac refermée par un polymère adhésif, pour valider des produits destinés à remplacer les sutures en chirurgie digestive. Le porteur annonce un risque d'infection bactérienne, des douleurs abdominales, une perte de poids et une léthargie après l'opération, les rats étant tués pour analyser la cicatrisation. Il présente ces travaux comme une étape de développement de ses propres polymères et affirme qu'il lui est "impossible" de les remplacer par des méthodes sans animaux.
Objectifs
Ce projet permettra de caractériser et de valider in vivo l'intérêt de nos polymères adhésifs biocompatibles pour la réparation tissulaire dans le cadre de chirurgies du système gastro-intestinal. L'objectif est d'évaluer les propriétés adhésives et mécaniques de nos polymères notamment leur conformité aux tissus après application locale au site de chirurgie. Les indications dans lesquelles nos polymères seront évalués sont les suivantes : (1) promotion d’étanchéité dans le cadre des anastomoses colorectales et (2) après gastrectomie. Cette évaluation sera réalisée sur du court à long terme, et permettra de sélectionner les candidats polymères les plus pertinents pour chacune des indications mentionnées ci-avant. Compte tenu de l'innovation de notre technologie, ces informations ne sont pas disponibles dans la littérature et sont essentielles au développement de nos produits.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider au niveau préclinique l’intérêt de nos polymères à (1) venir en support des méthodes de réparation déjà existantes afin de compléter leur action et d’éviter des effets secondaires tels que les fuites voire (2) remplacer les sutures couramment utilisées lors de ces chirurgies (et présentant des limitations) afin de réduire le traumatisme aux tissus et de faciliter la procédure chirurgicale. Ce projet fait partie de l’étape de recherche et validation de produits qui seront implantés dans le corps humain, qui permettra de réduire le risque pour le patient. Il nous est impossible de substituer ces travaux par d’autres méthodes n’utilisant pas d’animaux. Ce projet a donc pour but de mettre en évidence l’intérêt du développement de nos polymères adhésifs, dans un modèle rongeur adapté aux cas cliniques.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux procédures : 1) Après anesthésie et analgésie de l'animal, un défaut sera réalisé sur le caecum puis scellé avec une ou 2 sutures et l’application d’un polymère adhésif. La durée de la procédure sera d’environ 20 minutes par animal. 2) Après anesthésie et analgésie de l'animal, un défaut sera réalisé sur l’estomac puis scellé avec une ou 2 sutures et l’application d’un polymère adhésif. La durée de la procédure sera d’environ 20 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Les risques anesthésiques sont les suivants : hypothermie et assèchement de la cornée. Une infection bactérienne est un effet indésirable potentiel résultant de la section du caecum ou de l’estomac. Suite à la chirurgie, les rats pourront présenter des douleurs abdominales. Les animaux pourraient également manifester des signes de perte de poids, malaise et léthargie associés à la procédure chirurgicale.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire car des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem. L’absence de battements cardiaques et réflexes sera confirmée puis une dislocation cervicale sera réalisée selon les directives de la Structure chargée du Bien Etre des Animaux, le vétérinaire référent et l’inspecteur de la Direction Départementale de la Protection des Populations.
Remplacement
Les études ex vivo ne permettent pas de mimer les propriétés biologiques et mécaniques des organes entiers. Par conséquent, ce projet a pour but de valider l’efficacité de nos polymères à la prévention de fuite dans le cadre de chirurgies du système gastro-intestinal.
Réduction
Le nombre d’animaux (648) a été rationalisé au maximum en tenant compte des tests préalables réalisés sur les polymères candidats à l’implantation in vivo, afin de réduire le nombre de polymères à tester : 1) Propriétés physico chimiques 2) Etude des capacités de polymérisation 3) Caractérisation ex vivo des propriétés mécaniques et d’adhésion Aussi, le nombre d’animaux par groupe (6) a été défini en se basant sur les analyses statistiques qui seront effectuées.
Raffinement
Le nombre d’animaux par cage (2 animaux) respectera la législation sur la protection des animaux de laboratoire. Les rongeurs disposeront à volonté d’eau et d’aliments jusqu’à 2-3h avant la chirurgie puis post-chirurgie. Les animaux seront soumis à un jeun 2-3h avant la chirurgie (uniquement la nourriture, l’eau restant disponible à volonté) pour minimiser le contenu dans le caecum et l’estomac. Tous les animaux seront hébergés en portoirs ventilés et enrichis avec des maisons, des bâtons, du papier, des balles en bois ou des os en plastique. La totalité des gestes expérimentaux sera pratiqué par du personnel qualifié. Les animaux recevront un traitement antalgique avant toute procédure chirurgicale qui se fera sous anesthésie générale. A la suite de la procédure chirurgicale, un traitement antalgique systémique sera administré, ainsi qu’un traitement antibiotique pour prévenir des infections. Les animaux seront observés au minimum une fois par jour afin d’évaluer de potentiels signes de mal-être. Un vétérinaire est joignable tous les jours si besoin. En cas d’atteinte des points limites (variation relative du poids corporel supérieure ou égale à 20 pour cent par rapport au poids maximum mesuré, persistante sur 2-3 semaines ou dégradation de l’état général de l’animal), l’euthanasie de l’animal sera effectuée. La lignée de rats impliquée sera Wistar, et le nombre maximum d’animaux utilisé sera de 648.
Choix des espèces
L’utilisation d’un modèle mammifère est, selon nous, essentiel à cause des différences structurales existantes entre les organes des espèces mammifères et non-mammifères. La taille des rats permet d’utiliser de faibles quantités de polymères en comparaison des porcs ou des brebis. De plus, les rats sont des modèles animaux classiquement utilisés en expérimentation animale pour évaluer la réparation des défauts dans le système gastro-intestinal. Le modèle singe a été automatiquement exclu pour des raisons éthiques, les études présentées dans ce projet étant des études précoces du développement. Les animaux qui seront utilisés auront entre 6 et 12 semaines au début de l’étude. Ils seront donc adultes et arrivés à maturité sexuelle. Simultanément les animaux seront jeunes et donc auront une plus forte chance de ne pas développer des maladies liées au vieillissement. Les animaux seront bagués sur l’oreille dès leur arrivée dans l’animalerie.
Etude pharmacocinétique de composés administrés chez le rat, effets sur la qualité osseuse.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
1 500 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit un cathéter posé dans la veine jugulaire, des administrations orales jusqu'à deux fois par jour et des prélèvements sanguins et urinaires répétés, pour mesurer la toxicité osseuse de composés développés par les clients du laboratoire. Le porteur annonce une inflammation transitoire aux sites d'implantation et d'injection ainsi qu'un stress lié à l'isolement en cage métabolique jusqu'à 24 heures, les rats étant tués pour prélever leurs os. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit le remodelage osseux d'un organisme entier et juge l'usage d'animaux "indispensable".
Objectifs
L’objectif du présent projet est d’évaluer les atteintes osseuses potentielles qui pourraient survenir lors de traitements thérapeutiques. En effet, des études de pharmacovigilance ont montré que la fragilisation osseuse peut être induite par des médicaments, par carence ou pertes en calcium, phosphate et vitamine D, ou réduction de la minéralisation / densité minérale de l’os. La classe thérapeutique la plus fréquemment en cause est celle des corticoïdes mais d’autres médicaments sont aussi suspectés comme les antirétroviraux, des antiacides, des médicaments antiépileptiques, des antithrombotiques mais aussi des antidépresseurs, des neuroleptiques, et médicaments utilisés par exemple dans le traitement du cancer du sein. A noter aussi qu’un risque d’ostéoporose est évoqué pour les statines, et retrouvé significatif à forte dose. D’autre part, si le risque d’effets indésirables osseux est plus ou moins bien documenté les mécanismes mis en jeu ne sont pas encore connus avec précision. Il devient donc essentiel et indispensable dans le développement de nouveaux médicaments et tout particulièrement pour les classes thérapeutiques citées ci-dessus, de vérifier l’absence d’effets secondaires délétères pouvant intervenir sur l’os afin de ne pas dégrader la qualité de vie des patients. C’est donc, dans ce contexte que s’inscrit ce projet afin d’évaluer sur l’animal les effets secondaires potentiels de composés thérapeutiques actuellement en développement chez nos clients. Les études permettront de définir les types de lésions osseuses qui pourraient être observées, et d’améliorer les schémas thérapeutiques d’administration des composés évalués afin de réduire et/ou abolir les effets délétères, voire même de stopper le développement de certains composés.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - Court terme : chaque protocole inclus dans ce projet, permettra à son échelle d’informer sur la pharmacocinétique ainsi que sur la potentielle toxicité osseuse des composés étudiés. - Long terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications des conditions physiologiques osseuses chez les animaux après application du composé. De plus, ce projet doit permettre d’établir des plans de prévention, prophylaxie, et diagnostic robustes indispensables à la prise en charge et au suivi de maladies, chez l'homme et/ou les animaux.
Procédures
Un cathéter connecté à un dispositif facilitant les prélèvements récurrents de sang sera posé dans la veine jugulaire de l’animal (45 min environ par animal). Les administrations orales de composés seront réalisées sur animaux vigiles (moins de 5 minutes par administration). Les fréquences d’administration (au maximum 2 fois par jour) dépendent de la prophylaxie des composés testés. Les injections de composés seront réalisées sur animaux vigiles ou anesthésiés (moins de 5 minutes par injection). Les fréquences d’administration dépendent de la prophylaxie des composés testés. Les prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles via le dispositif de prélèvement (moins de 3 min par prélèvement). Si des prélèvements à l’aorte abdominale sont effectués, ils ne se feront qu’en point final sous anesthésie avant euthanasie de l’animal. Les urines pourront être prélevées en cours de protocole sur animaux vigiles, en pressant sur la vessie des animaux (moins de 5 minutes par prélèvement) ou en point final, sur animaux euthanasiés. Elles peuvent être également collectées suite au placement des animaux en cage métabolique pendant un maximum de 24h où l'urine libérée par l’animal pendant ce laps de temps sera collectée.
Impact sur les animaux
Une possible réaction inflammatoire pourra apparaître au cours du temps en cas de toxicité osseuse (due à l’administration du traitement thérapeutique). Pour prévenir ce cas de figure, les animaux sont suivis de près et des grilles d’évaluation clinique ainsi que les conduites à tenir en cas de l’observation de ces signes ont été prévus. Les nuisances attendues sur les animaux sont : - Inflammation transitoire au niveau du site d’implantation de cathéter - Inflammation transitoire au niveau du site d’injection du traitement - Stress dû à l’isolement des animaux en cage métabolique pour une durée maximale de 24h
Devenir
A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront humainement euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les pièces osseuses, seront prélevés. Les prélèvements sanguins et urinaires seront utilisés pour doser le composé et/ou évaluer la toxicité systémique par numération sanguine et/ou évaluer les modifications éventuellement de biomarqueurs du remodelage osseux et du métabolisme phosphocalcique. Les organes seront également utilisés pour doser les composés et / ou réaliser des analyses histopathologiques et d’imagerie.
Remplacement
De manière systématique, les composés que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des agents thérapeutiques testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, le tissu osseux est un tissu en perpétuel remodelage avec une activité de résorption et de formation osseuse. Cet équilibre repose sur des mécanismes de régulations systémiques et locaux grâce à une communication étroite entre les différentes cellules osseuses afin de maintenir l’homéostasie du tissu. Ce mécanisme complexe ne peut être mimé par un modèle simple de culture in vitro. Il n'existe donc pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer l’apparition de lésions osseuses. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité probable des réponses aux principes actifs et en accord avec l’article R.214-105 du Code rural et de la pêche maritime, 10 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance), sur nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif sera revu à la baisse dans le cas où le traitement évalué est connu, et après analyse des résultats d’études précliniques préliminaires d’efficacité, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre. Pour chacune des procédures, des tests statistiques seront réalisés.
Raffinement
Les animaux seront stabulés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors des prélèvements sanguins à la jugulaire et des traitements antalgiques dès l’apparition de premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux ou trois fois par semaine. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera euthanasié
Choix des espèces
Le rat a été choisi pour ce projet car cette espèce mammifère présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires notamment en termes de remodelage osseux, proches de celles observables chez l'homme. Le rat, étant fréquemment utilisé à des fins de recherche, l’étude des effets de composés chez cet animal de laboratoire, permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, la taille de cet animal permet d’obtenir un volume suffisant de liquides biologiques parfaitement analysables. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents composés seront utilisés.
Etude du comportement des lymphocytes T mémoires générés après infection virale, dans la peau et le poumon, chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le virus de la vaccine ou de la grippe par voie cutanée ou nasale sous anesthésie, puis reçoivent des injections et des prélèvements sanguins, pour étudier le rôle d'une protéine dans la mise en place des lymphocytes T mémoires de la peau et du poumon. Le porteur qualifie les atteintes de légères et affirme que ces infections ne génèrent pas de signes cliniques, les souris étant tuées pour prélever leurs organes. Il présente ce travail de recherche fondamentale comme visant à comprendre les mécanismes de défense, et juge l'étude in vivo "nécessaire" faute de pouvoir reproduire la réponse immunitaire in vitro.
Objectifs
Lors d’une infection virale, les lymphocytes T prolifèrent et acquièrent la capacité d' éliminer les cellules infectées. En parallèle, un petit nombre de lymphocytes T mémoires se développent, qui sont capables de réagir de manière plus rapide et plus efficace en cas de nouvelle rencontre avec le même virus. Il existe différentes sous-populations de lymphocytes T CD8 mémoires. L'une d'entres elles est capable de résider sur le long terme dans le tissu préalablement infecté. Il s'agit des Lymphocytes T mémoires résidents des tissus et ils représentent l'une des premières barrières de défense immune dans les tissus. Une protéine a été identifiée comme étant impliquée dans la mise en place de ces lymphocytes T résidents, dans la peau et le poumon, après infection virale. Ce projet vise à présent à étudier plus en détail le rôle de cette protéine, dans la mise en place d'un compartiment mémoire résident, dans la peau et le poumon. Pour cela, nous utiliserons des modèles murins d'infections virales (par le virus de la vaccine et le virus de la grippe), de la peau et du poumon.
Bénéfices attendus
Les lymphocytes T mémoires qui résident dans les tissus non lymphoïdes représentent la première ligne de défense contre des infections virales. Ce projet permettra de comprendre le rôle spécifique d'une protéine récemment identifiée, dans la mise en place de ce compartiment tissulaire et dans sa capacité à remplir ses fonctions de défense anti-virale.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Infection intranasale (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal concerné – durée 30 secondes par narine - Infection cutanée (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal concerné – durée 2 mn ; - Injection Intraveineuse (sous brève anesthésie gazeuse) – 1 fois par animal – durée de l'anesthésie: 30 secondes; Injection intrapéritonéale pour anesthésie profonde: 1 fois par animal – durée de l'anesthésie: 30 mn; Prélèvements sanguins (sous anesthésie gazeuse)- 1 fois par animal – durée 30 secondes;
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont : i) une légère douleur générée par les injections intra-péritonéales; ii) une légère douleur générée par les injections intra-veineuses et une légère irritation à l'oeil; iii) le stress généré par l’anesthésie et/ou la procédure d’inoculation du virus par voie intranasale ; iv) une légère abrasion de la peau suite à l'infection par voie cutanée; ; v) une légère douleur et le stress généré par les prélèvements de sang. Les infections virales par voie cutanée ou intranasale sont des procédures bien établies dans la communauté scientifique et dont les conséquences ne génèrent pas de signes cliniques sur les animaux.
Devenir
Des prélèvements d'organes seront réalisés sur les animaux mis à mort, afin d'effectuer des analyses cellulaires et morphologiques sur les lymphocytes T.
Remplacement
Les mécanismes de défense d'un organisme face à une infection virale sont basés sur la capacité des cellules immunes à circuler dans l'organisme : ainsi, une infection au niveau de la peau ou du poumon déclenche une cascade d'évènements qui conduit notamment au recrutement de lymphocytes T circulants, qui acquièrent la capacité de pénétrer dans le tissu infecté. Une fois le virus éliminé, une partie de ces lymphocytes persistent dans le tissus réparé. Ainsi, la réponse immunitaire est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale qui rend impossible son étude dans des tests in vitro. L’utilisation de modèles murins est donc nécessaire pour comprendre la complexité des mécanismes qui prennent place lors de la réponse immunitaires face à une infection
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris au maximum, nous utiliserons par exemple qu’un seul groupe control pour toutes nos approches expérimentales afin de réduire par 2 le nombre de ces animaux. Nous avons aussi calculé par des approches statistiques le nombre minimum d’animaux nécessaire pour pouvoir interpréter les variations expérimentales que nous attendons et nous assurer que nos travaux seront interprétables et ne devrons pas être répétés inutilement sur des animaux complémentaires.
Raffinement
Afin de réduire la souffrance, le stress et la douleur de l’animal, l'ensemble des gestes techniques seront réalisés sous anesthésie profonde ou gazeuse. Concernant les anesthésiers profondes, les animaux seront placés sur un tapis chauffant durant toute la durée de l'anesthésie, pour limiter les risques d'hypothermie, et du gel oculaire sera appliqué sur les yeux des souris, afin d'éviter la sécheresse oculaire. De plus, nous maintiendrons les animaux en groupes sociaux au sein de chaque cagée (en moyenne 5 animaux par cagée). Enfin, nous assurerons une surveillance adaptée à chacune des procédures ou étape au sein d'une procédure, et des points limites définis pour chaque procédure ont été établis afin d'anticiper toutes souffrances et tout mal être des animaux. de plus, les animaux sur lesquels nous identifierions des signes de douleur seront immédiatement mis à mort pour éviter toute souffrance inutile
Choix des espèces
Le modèle souris a été choisi car il permet de réaliser des expériences dans des animaux génétiquement modifiés et d'étudier les conséquences d'un gène invalidé ou muté, sur la génération et la maintenance d'un compartiment mémoire dans le tissu cutané. Ce type d'expériences est nécessaire pour comprendre la mise en place d'une compartiment résident des tissus, au cours des réponses immunes. De plus, des souris adultes (entre 6 et 12 semaines) seront utilisées: le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant au moment de l’infection et certains animaux seront gardés jusque 45 jours après infection.
Evaluation de l’effet therapeutique de la cytokine IL-34 dans plusieurs modèles murins de maladies de peau : le psoriasis, la dermatite allergique de contact et la dermatite atopique
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié reçoit un dispositif implanté dans l'abdomen par chirurgie, l'autre des injections locales, et toutes subissent l'application répétée de pommades irritantes provoquant psoriasis, eczéma ou dermatite, pour tester le potentiel thérapeutique de la cytokine IL-34. Le porteur décrit un épaississement de la peau accompagné de démangeaisons ou de douleur locale, et prévoit la mise à mort pour prélever peau et organes immunitaires. Il affirme que la structure et l'immunité de la peau rendent l'analyse in vivo "indispensable", les retombées pour des maladies humaines fréquentes restant annoncées à terme.
Objectifs
La cytokine IL-34, découverte en 2008, a été principalement décrite pour son implication dans la survie et la différenciation de certaines cellules immunitaires présentes dans le sang et les tissus. Plus récemment, il a également été montré qu’elle est impliquée dans la fonction de cellules régulatrices, aboutissant à une tolérance dans le contexte de la transplantation. Cette protéine a donc un grand potentiel thérapeutique dans la maitrise du rejet de greffe, mais également dans d’autres maladies autoimmunes ou inflammatoires. Celle-ci pourrait en effet offrir une alternative aux traitements donnés à ces patients pour limiter l'action du système immunitaire, dont les effets secondaires sont importants. En parallèle, il a été décrit que les cellules de Langerhans, cellules résidentes de la peau, sont dépendantes de la présence d’IL-34. Cela rend l’étude du rôle de l’IL-34 dans le compartiment cutané très intéressant, au niveau des cellules de Langerhans mais aussi d'autres cellules résidentes du derme. L’objectif principal est donc d’étudier le potentiel thérapeutique de l’IL-34 dans le traitement de pathologies inflammatoires de la peau comme le psoriasis ou l'eczéma par exemple.
Bénéfices attendus
Plusieurs bénéfices, à court et long terme sont attendus avec ce projet. Dans le cadre du projet, l’association des résultats obtenus in vitro et in vivo permettra l’amélioration des connaissances sur les mécanismes d’action de l’IL-34, et de l’impact sur les différentes cellules cibles présentes dans le derme et l’épiderme. Mais l’objectif est surtout la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques pour la molécule IL-34, ici dans des modèles de pathologies cutanées. Ces résultats permettront de proposer de nouvelles alternatives thérapeutiques pour ces pathologies très fréquentes chez l’homme. De manière plus générale, la cytokine IL-34 pourrait avoir un potentiel thérapeutique dans plusieurs maladies autoimmunes ou inflammatoires. Celle-ci pourrait en effet offrir une alternative aux traitements immunosuppresseurs dont les effets secondaires sont importants chez les patients, et dont l’efficacité peut être insuffisante.
Procédures
Deux voies d’administration de la molécule thérapeutique seront comparées. 50% des animaux seront traités à l’aide de dispositifs implantables permettant une diffusion continue de la molécule thérapeutique. Le traitement via l’utilisation de ces dispositifs implique une seule chirurgie (environ 30 min) pour leur implantation au niveau de la cavité abdominale. Toutes les précautions sont prises pour limiter le stress, l’inconfort et la douleur induite par la chirurgie, avec une procédure réalisée sous anesthésie gazeuse, une analgésie pré- et post-opératoire, une prévention de l’hypothermie avec placement des animaux sur tapis chauffants, ainsi que la prévention de l’hypotension avec l’injection d’une solution saline. Les animaux sont suivis de manière journalière dans les jours suivant la chirurgie. 50% des animaux recevront le traitement sous forme d’injections locales au niveau des zones lésées de la peau, l’objectif étant d’évaluer l’efficacité locale et de limiter les potentiels effets secondaires. Ces injections seront également réalisées sous anesthésie afin de limiter le stress et garantir la sécurité des animaux, ainsi que la qualité de l’injection thérapeutique. Dans les différents protocoles, l’induction des pathologies se font par application cutanée de pommades ayant un effet irritant localement. Le protocole de psoriasis a une durée de 5 jours avec une application locale journalière. Le protocole de dermatite allergique de contact a une durée de 10 jours avec un total de 2 applications locales. Le protocole d’eczéma a une durée de 20 jours, avec un total de 12 applications locales. Toutes ces applications se feront sous anesthésie générale de courte durée afin de limiter la contention et le stress des animaux.
Impact sur les animaux
Des effets indésirables modérés et de courte durée sont attendus dans les procédures décrites dans cette saisine. Ces effets sont décrits ci-dessous et seront tous pris en compte afin de limiter leur intensité et leur durée. En plus des soins pré- et post-opératoires ainsi que des traitements analgésiques prévus suite à la chirurgie, les animaux sont suivis de manière journalière dans les jours suivant la chirurgie, bien qu’aucune réduction de mobilité ou inconfort n’est attendue. La réalisation des injections au niveau de la peau ne doit pas être responsable de douleurs au niveau local, mais sera également réalisée sous anesthésie. Dans les différents modèles de pathologies cutanées décrits ici, l’induction des pathologies se font par application cutanée de pommades, ayant un effet irritant localement et spécifiques pour chaque modèle (psoriasis, dermatite allergique de contact, dermatite atopique/eczéma). Ces pommades sont appliquées de manière répétée sur une petite zone de la peau des animaux, soit au niveau d’une zone de l’abdomen, soit au niveau de l’oreille. Les effets attendus sont un épaississement de la peau de l’oreille, associé au non à des démangeaisons ou une douleur locale. Telles que décrits dans la littérature, les effets attendus sont légers avec peu d’impact sur le bien-être et le comportement des animaux traités. Une grille de suivi clinique et un suivi de poids seront réalisés afin de pouvoir repérer une éventuelle aggravation de l’état clinique des animaux.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Le but est d'obtenir le maximum d'informations sur les mécanismes d'actions et cellules cibles de la molécule thérapeutique, pour chaque animal traité, et en comparaison avec les animaux non traités. Un prélèvement de sang sera réalisé avant euthanasie afin d'analyser les cellules immunitaires et cytokines circulantes du sang. Des prélèvements d'organes seront réalisés en post-mortem afin d'analyser effets de la molécule thérapeutique sur les différents organes immunitaires (ganglions, rate) mais également au niveau de la peau traitée ou non traitée.
Remplacement
La majorité des résultats obtenus sont issus d'études sur la structure et la fonction de l’IL-34, réalisées in vitro sur cellules de souris et humaines, et ont permis de mettre en évidence les propriétés immunorégulatrices de l’IL-34. Malgré cela, ces résultats sont limités par l’absence de contexte physiologique et par la complexité du système immunitaire qui ne peut être mimé in vitro. L’utilisation de modèles pré-cliniques est donc nécessaire pour approfondir les mécanismes d’action et cibles thérapeutiques potentielles de l’IL-34, notamment dans les pathologies cutanées ayant une composante immunitaire. La peau possède une structure et une immunologie très spécifique, qui rend l’analyse in vivo indispensable.
Réduction
Un nombre total maximum de 440 animaux est prévu dans ce projet, dont la répartition est décrite ci-après. Le nombre d'animaux a été déterminé de façon à être interprétable statistiquement. Chaque protocole contient 4 groupes de 10 souris maximum, soit 40 souris par modèle. Quatre modèles seront développés, à savoir un modèle de psoriasis, un modèle de dermatite allergique de contact, avec deux agents différents, et un modèle d'eczéma (dermatite atopique). Pour chaque modèle, 2 voies d’administration seront comparées, une administration systémique par l’utilisation de dispositifs implantables permettant une diffusion continue, ou une administration via une injection locale au niveau de la zone lésée de la peau. De plus, l'efficacité du traitement en préventif et en curatif sera comparée. Pour chaque modèle, des expériences préliminaires seront d’abord effectuées sur un petit nombre d’animaux; si les effets observés ne sont pas suffisamment visibles in vivo lors de premiers tests (groupe de 3 à 4 souris par expérience), les expériences ne seront pas reproduites et la totalité des 10 souris ne sera donc pas utilisée. Dans le modèle de dermatite de contact par exemple, un seul agent sera testé en premier lieu, et si le modèle est satisfaisant, le deuxième agent ne sera pas testé. De la même manière, si une voie d’administration donne des résultats bien supérieurs à l’autre, une seule voie d’administration sera conservée afin de diminuer le nombre total d’animaux utilisés. Le traitement curatif (après apparition des premiers symptômes) ne sera testé qu'avec la voie d'administration choisie dans la première phase, et seulement si les résultats préliminaires sont encourageants en préventif.
Raffinement
Des mesures sont mises en place lors de la chirurgie d’implantation des dispositifs, avec une analgésie pré- et post-opératoire et une anesthésie générale. Les souris sont placées sur un tapis chauffant pendant la chirurgie jusqu’au réveil total. Elles recevront une injection de solution saline, un baume ophtalmique sera appliqué sur leurs yeux. Une analgésie locale sera également ajoutée au moment de la chirurgie. En post-opératoire, les animaux seront suivis quotidiennement pour vérifier l’absence de perte de poids et l’état général, avec suivi quotidien de la cicatrisation. Les injections locales cutanées ainsi que les prélèvements sanguins avant euthanasie seront également effectués sous anesthésie générale. Bien qu’une atteinte de l’état général ne soit pas attendue dans ces différents protocoles, un suivi journalier du poids et de l’apparition de signes cliniques (comportement/mouvement, aspect général, évaluation du poids) sera effectué. Un tableau de score a été mis en place, afin d’agir rapidement en cas de détérioration de l’état clinique, avec mise en place d’une analgésie si besoin, ou sortie du protocole avec euthanasie le cas échéant. Dans ce cas, les animaux concernés seront euthanasiés après anesthésie générale. Les animaux provenant d'élevages agréés sont acclimatés pendant au moins une semaine avant de débuter une procédure. Les souris sont hébergées dans des cages ouvertes par groupe de 5 animaux maximum, et ont des formes d’enrichissements à leur disposition (tube, block, frisottis) afin de réduire leur stress.
Choix des espèces
Les études fonctionnelles réalisées in vitro à partir de cellules humaines mettent en évidence les propriétés immunorégulatrices de l’IL-34 mais sont limitées par l’absence de contexte physiologique et de la complexité du système immunitaire qui ne peut-être mimé in vitro. L’utilisation de modèles pré-cliniques est donc nécessaire pour valider ces résultats, pour approfondir les connaissances sur les cellules cibles et mécanismes d’action, et pour obtenir des informations sur le potentiel thérapeutique de l’IL-34. De plus, le compartiment cutané possède une structure et une immunologie très spécifiques, qui rend l’analyse in vivo indispensable. Plusieurs modèles de souris sont utilisés pour différentes pathologies cutanées, et les mécanismes immunitaires sont bien mis en évidence dans la littérature, ce qui permet à ce projet de s’appuyer sur des publications déjà existantes représentant de manière fiable les pathologies humaines. Les fonctions de l’IL-34 de souris sont également bien décrites et sont représentatives des effets observés sur cellules humaines. La souris est donc l’espère la plus pertinente pour faire la preuve de concept sur le potentiel thérapeutique de l’IL-34 dans des pathologies cutanées. Pour ce projet, les animaux utilisés seront des souris jeunes adultes de 10 à 12 semaines, afin d’éviter la phase de croissance et d’avoir un poids stabilisé au démarrage de l’expérimentation, permettant un meilleur suivi clinique, mais aussi un poids suffisant pour limiter le risque de complications chirurgicales liées à l’implantation des dispositifs au niveau de la cavité abdominale.
Isolement d’hépatocytes primaires de rongeurs (rat et souris)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Rats : 400
600 rongeurs, 400 rats et 200 souris, vont être utilisés, anesthésiés puis tués avant tout réveil, dans des procédures classées sans réveil. Chaque animal est mis à jeun douze heures, anesthésié, ouvert au niveau de l'abdomen pour que son foie soit canulé et perfusé, puis tué par section des vaisseaux, afin de récupérer des cellules du foie pour des cultures. Le porteur avance que l'opération "s'apparente davantage à du prélèvement sur organe" hors du champ de la réglementation, l'anesthésie préalable justifiant malgré tout l'autorisation. Il affirme qu'"aucun autre modèle n'existe" et qu'il est "incontournable" d'isoler ces cellules à partir d'animaux.
Objectifs
Toutes les fonctions cellulaires reposent sur la disponibilité en énergie dont la principale forme cellulaire est l'ATP. Sa production par le métabolisme intermédiaire est ajustée au mieux pour satisfaire les besoins et ainsi assurer la fonction associée, contribuant au bon état cellulaire. Un dérèglement du métabolisme intermédiaire peut être à l'origine de ou contribuer à l'installation de situations pathologiques (tumorigénèse, insuffisance cardiaque...) ou à des difficultés d'adaptation (vieillissement, nutrition...). La cellule hépatique est un excellent modèle pour l'étude de ce métabolisme intermédiaire qui représente une cible pour corriger les conséquences liées à ses altérations. Son étude est possible in vitro (cellules hépatiques en culture ou perifusées) ou sur extraits cellulaires. La quantité de cellules nécessaires est importante et ne peut pas être obtenue par culture classique de lignées. De plus, les propriétés métaboliques de la plupart des lignées cellulaires d'hépatocytes peuvent présenter des écarts par rapport au métabolisme de l'hépatocyte natif. Il est donc incontournable de les isoler à partir d'animaux, en fonction des besoins expérimentaux, des conditions à tester ou des résultats obtenus. Cet isolement s'apparente davantage à du prélèvement sur organe, donc en dehors du champ d'application de la réglementation. Cependant, une étape nécessite l'anesthésie préalable et la perfusion du foie avant prélèvement, justifiant la présente demande d'autorisation.
Bénéfices attendus
Toutes les utilisations de ces hépatocytes primaires isolés visent à contribuer à une meilleure compréhension des relations entre métabolisme énergétique et état cellulaire, à tester des molécules d'intérêt sur le métabolisme intermédiaire, à disséquer le fonctionnement de la glycolyse et de la mitochondrie. Ces travaux s'inscrivent dans l'utilisation à terme de ces deux éléments comme cible thérapeutique pouvant avoir un intéret dans la lutte contre certains états pathologiques ou pour améliorer les capacités d'adaptation cellulaire.
Procédures
La veille de son utilisation, un animal sélectionné au hasard est isolé en cage ouverte et mis à jeun pour 12h (retrait de sa nourriture à 19h). Le lendemain matin, une anesthésie/analgésie chimique est appliquée (30s) avant pratique de la laparotomie et canulation du foie (2min). Le foie est ensuite perfusé pour digestion des tissus conjonctifs (10 min) puis prélevé. L'animal est mis à mort par section des veines et artères du tronc abdominal.
Impact sur les animaux
Isolement en cage ouverte et mise à jeun pendant 12h la veille (retrait de la nourriture à 19h) pour l'animal sélectionné au hasard.
Devenir
Le prélèvement du foie entier n'est pas compatible avec la survie de l'animal. Il est donc mis à mort sans réveil préalable.
Remplacement
L'hépatocyte constitue un très bon modèle d'étude du métabolisme intermédiaire (glycolyse et fonction mitochondriale). Un indicateur de son bon fonctionnement métabolique est sa production de glucose in vitro. Certains projets imposent une mise en culture de cellules primaires afin de les exposer à divers facteurs ou molécules d'intérêt avant de les étudier ensuite. La mise en culture d'hépatocytes primaires impose leur obtention sur animaux au préalable. Seuls les hépatocytes primaires produisent suffisament de glucose en culture et permettent ainsi d'évaluer l'effet pharmocologique du produit ou de la condition expérimentale à tester. En effet, les lignées cellulaires présentent en général un métabolisme altéré (niveau métabolique trop faible et/ou peu de mitochondries). Ainsi, lorsque l'étude porte sur la fonction mitochondriale, l'obtention d'une quantité suffisante de mitochondries par fractionnement cellulaire à partir d'hépatocytes primaires est la seule solution, après les avoir mis en culture pour quelques dizaines d'heures. Aucun autre modèle n'existe à ce jour.
Réduction
Le nombre d'animaux indiqué est un nombre maximal, basé sur un rythme d'isolements d'hépatocytes de 3 par semaine en moyenne par an, sur 40 semaines d'activité. Les préparations d'hépatocytes isolés se font à la demande. En considérant deux préparations à partir de rat et une préparation à partir de souris par semaine, le nombre maximal prévisionnel est de 400 rats et 200 souris pour 5 ans.
Raffinement
La procédure est réalisée par des personnes compétentes, ayant suivi ou sous la responsabilité de personne ayant suivi une formation à la chirurgie expérimentale sur rongeurs. Une analgésie/anesthésie chimique est appliquée à l'animal avant réalisation de la laparotomie et perfusion du foie. Nous utilisons une même préparation pour faire une condition contrôle systématique. Cette méthodologie nous permet de faire des tests statistiques appariés, renforçant la puissance des tests et la confiance dans les résultats obtenus. La procédure est réalisée par des personnes compétentes, ayant suivi ou sous la responsabilité de personne ayant suivi une formation à la chirurgie expérimentale sur rongeurs. Une analgésie/anesthésie chimique (kétamine/xylazine) est appliquée à l'animal avant réalisation de la laparotomie et perfusion du foie. Nous utilisons une même préparation pour faire une condition contrôle systématique. Cette méthodologie nous permet de faire des tests statistiques appariés, renforçant la puissance des tests et la confiance dans les résultats obtenus. Avant leur utilisation, les animaux sont stabulés en groupe. La procédure étant un prélèvement sur animal anesthésié puis mis à mort sans réveil, il n'est pas défini de points limites.
Choix des espèces
L'obtention d'hépatocytes primaires se fait par une méthode nécessitant la perfusion du foie pour digestion enzymatique qui ne peut pas se faire sur des espèces de mamifères trop petites. De plus, en fonction de la quantité d'hépatocytes nécessaire, nous utilisons soit le rat soit la souris. La procédure d'isolement mise au point par perfusion du foie avec une solution de collagénase est réalisable sur ces deux espèces. Les animaux doivent être au stade adulte jeune pour avoir un métabolisme hépatique mature mais pas encore impacté par un éventuel effet de l'âge. De plus, des animaux trop âgés risquent de présenter des débuts de stéatose ou d'infiltration lipidique, d'insulino-résistance, sources de pertubations métaboliques hépatiques, empêchant l'utilisation d'animaux de réforme.
Evaluation des caractères observables de nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
425 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 210 d'entre elles et modéré pour 215. Le porteur indique qu'elles ne subissent aucune intervention et sont seulement observées de la naissance à l'âge adulte, la souffrance venant du phénotype dommageable que certaines lignées génétiquement modifiées portent dès la naissance. Les 210 souris sans comportement anormal seront réutilisées dans d'autres projets, les autres seront tuées. Le porteur affirme que ces modèles sont "indispensables" et que la création de lignées est la "seule" voie pour étudier un "organisme entier".
Objectifs
Le phénotype est l'ensemble des caractères observables des souris. En modifiant génétiquement les souris nous cherchons à étudier une maladie ou un phénomène biologique important ou responsable d'une maladie. Mais cela peut provoquer d'autres dommages à l'animal, donc créer un phénotype dommageable que l'animal subira dès sa naissance, mimant ainsi la pathologie humaine. Le but de ce projet est de s'assurer qu'il n'y a pas phénotype dommageable, ou de l'évaluer s'il y en a un, afin de comprendre la maladie. L'objectif est de produire des nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées par croisement avec des lignées déjà existantes ou sur un fond génétique particulier pour répondre à de nouvelles questions scientifiques en lien avec les thématiques de recherche de l’Institut sur des maladies humaines.
Bénéfices attendus
Les projets développés dans l'Institut visent à la compréhension des mécanismes responsables de maladies humaines et au développement de traitement pour ces maladies humaines. Une étape indispensable est le développement de modèles de souris génétiquement modifiées pour reproduire la pathologie humaine et tester des approches thérapeuthiques. Le bénéfice de ce projet est donc de développer de tels modèles dans des conditions les plus adaptées au bien être animal.
Procédures
Les animaux ne seront soumis à aucune intervention dans le cadre de ce projet, ils seront simplement examinés et surveillés tout au long de leur développement, de la naissance à l'age adulte
Impact sur les animaux
Il n'y aura pas d'intervention sur les animaux, seulement une observation attentive des caractères visibles et du comportement. Les effets indésirables potentiels seraient liés au phénotype dommageable
Devenir
Les animaux ne présentant pas de comportement anormal pourront être réutilisés dans d'autres projets pour répondre aux questions scientifiques ayant conduit au développement de cette lignée.
Remplacement
Ce projet ayant pour but le développement de modèles souris mimant des pathologies humaines en particulier pour la mise au point de thérapies, il n'y a pas de remplacement possible par d'autres modèles.
Réduction
Le nombre d'animaux sera réduit au maximum en fonction des besoins. Les animaux ne présentant pas de phénotype associé à une douleur non controlée pourront être ré-utilisés dans d'autres projets afin de réduire le nombre d'animaux produits pour ces projets et répondre aux questions scientifiques ayant conduit au développement de cette lignée.
Raffinement
Les animaux présentant le génotype d’intérêt feront l’objet d’une surveillance particulière selon les recommandations de l'Union Européenne afin d’établir si ces créations de nouvelles lignées provoquent l’apparition d’un phénotype dommageable vis-à-vis du bien-être animal, et si c’est le cas, des points limites seront mis en oeuvre et éventuellement réadaptés en fonction du phénotype observé pour limiter toute souffrance chez les animaux. Les animaux sont hébergés en groupe dans un environnement enrichi. Ils sont observés quotidiennement et des points limites ont été définis afin de prendre en compte d’éventuels effets inattendus pour lesquels il sera décidé de mettre en place un traitement approprié ou une euthanasie.
Choix des espèces
Le but de ce projet est la création de modèles génétiquement modifiés pour reproduire les pathologies humaines. Le développement de souris génétiquement modifiées est l'approche la plus simple à mettre en oeuvre et la seule permettant d'étudier un organisme entier. Ces modèles vont permettre de répondre à de nouvelles questions scientifiques en lien avec les thématiques de recherche de l’Institut telles que la compréhension des mécanismes physiopathologiques et le développement d'approches thérapeuthiques pour lesquelles les modèles souris sont indispensables. Ces pathologies pouvant toucher l'homme à tous les stades du développement, tous les stades seront donc analysés dans les lignées créées.
Validation d’un test d’apprentissage spatial préservant le bien-être animal à destination de la souris
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis gardées vivantes et transférées vers un autre projet. Elles apprennent à trouver une issue sur un plateau éclairé, le labyrinthe de Barnes, sous l'effet de lumières et de ventilateurs dirigés vers elles pour les forcer à mémoriser le trajet, et une partie reçoit un traitement qui efface la mémoire. Le porteur présente ce test comme un remplacement moins stressant du labyrinthe aquatique de Morris et met en avant le "bien-être animal". Il décrit ces désagréments, lumière et courant d'air, comme volontairement créés pour contraindre l'apprentissage.
Objectifs
L’étude des maladies qui affectent le cerveau et en particulier celles qui réduisent la mémoire nécessite d’évaluer - chez les animaux - le souvenir des trajets que ceux-ci effectuent dans une piscine. Néanmoins, il a été montré que cette façon de procéder comporte quelques désavantages qui peuvent être réduits ou même supprimés si l’utilisation d’une piscine, et donc le placement de l’animal dans l’eau, peut être évité. La solution alternative a été trouvée par l’utilisation d’un grand plateau éclairé où le rongeur se déplace à la recherche d’une issue dont il devra apprendre l’emplacement. Nous souhaitons dans le futur utiliser cette nouvelle façon de faire chez la souris, mais auparavant nous devons valider cette procédure en nos locaux, ce qui représente le but de ce projet. Pour ce faire, nous allons devoir trouver les meilleures conditions pour que les souris se souviennent de leurs trajets et qui seront des conditions d’éclairage ou de ventilation plus ou moins fortes du plateau. Une fois que ces conditions auront été trouvées, il nous faudra ensuite montrer que des souris présentant une mémoire réduite pourront être distinguées - par cette procédure - des souris non malades. Comme il existe de multiples types de souris, nous prendrons des souris avec ou sans une bonne vision et de niveaux de témérité différents. Si la nouvelle procédure confirme bien que, et quelque soit le type de souris évaluées, les animaux sont capables de se souvenir de leurs trajets sur un vaste plateau éclairé, nous remplacerons alors la procédure de la piscine par celle du plateau.
Bénéfices attendus
Il a été montré que la procédure faisant appel à un plateau pour étudier les trajets des souris est beaucoup moins stressante pour les animaux que celle de la piscine, et donc fournit des résultats plus précis. Ainsi, si nous remplaçons la procédure de piscine par celle du plateau, cela représentera un grand bénéfice pour les animaux car cela leur évitera un stress important lorsque nous voudrons évaluer leur mémoire ; et le bénéfice sera également non négligeable pour nous, car les résultats seront plus précis et donc, en conséquence, cette alternative nous permettra d’avoir à utiliser moins d’animaux pour étudier les maladies qui affectent le cerveau.
Procédures
Lorsque nous voudrons montrer que la procédure du plateau est capable de distinguer des souris présentant une mémoire réduite par rapport à des souris non malades (seconde phase du projet), nous devrons injecter une fois par jour, sur un total de 3 jours consécutifs, un traitement qui efface les souvenirs chez les souris considérées comme malades. Les traitements seront réalisés par la personne de notre structure qui a été validée par notre vétérinaire pour les injections. La préhension de l'animal et l'injection prendront environ 10 secondes. En ce qui concerne la détermination des bonnes conditions nécessaires pour le test du plateau, les animaux subiront le même jour 3 fois la procédure sur une durée maximum établie à 180 secondes. Pour la seconde phase du projet, ce schéma sera conservé, et répliqué pendant 3 jours consécutifs.
Impact sur les animaux
Les souris sont des animaux qui n’aiment pas apprendre. Si elles doivent néanmoins apprendre un chemin dans un piscine, elles n’ont pas le choix mais cette façon de faire est stressante et mérite d’être remplacée. L’alternative à cette procédure de la piscine par l’utilisation d’un plateau est beaucoup moins stressante, mais peut n’aboutir à aucun résultat si les souris ne sont pas obligées d’apprendre. Pour faire face à ce problème, il peut être nécessaire d’utiliser des lumières ainsi que des ventilateurs dirigés vers le plateau. Ainsi ces légers désagréments que nous créons volontairement pour les souris seront susceptibles de les forcer à apprendre le chemin vers l’issue sombre et sans courants d’air qui constituera alors leur récompense au terme de ce test de mémoire de trajets.
Devenir
Les souris seront gardées en nos locaux avant leur sortie une fois affiliées à un autre projet.
Remplacement
A l’heure actuelle, il n’existe pas de technique in vitro ou in silico permettant d’évaluer les effets d’un traitement sur les fonctions cognitives supérieures telles que l’apprentissage ou la mémoire.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux repose sur une démarche d'essais successifs : pour la phase 1 du projet, les 24 souris de chaque souche étudiée seront réparties en 8 sous-groupes de 3 individus. Le trio d’animaux de chaque sous-groupe sera testé aux mêmes conditions expérimentales, conditions qui seront ensuite modulées en fonction des résultats obtenus pour l’évaluation du sous-groupe suivant. Cette démarche devrait aboutir in fine à la détermination des modalités optimales à mettre en œuvre pour aboutir à un apprentissage spatial, en utilisant un nombre le plus faible possible d’animaux. L’expérience acquise par le personnel opérant à la réalisation du test comportemental est suffisante pour interpréter les données issues d’un groupe de 3 individus uniquement. Si les conditions étaient trouvées adéquates avant que la totalité des 8 sous-groupes n’aient été testé, le restant des sous-groupes (animaux non testés) sera alors évalué selon les conditions optimales précédemment déterminées afin d’augmenter la puissance statistique des résultats obtenus via un accroissement des effectifs. Si malgré tout, aucun apprentissage n’était détecté à l’issue de cette première phase, les animaux seront alors gardés en hébergement pendant un mois durant, au terme duquel ils seront alors retestés pour une nouvelle phase de paramétrage. Cette période sera suffisante pour opérer chez les souris une perte de souvenir des 3 tests préalablement réalisés. Concernant les effectifs requis minimum (n=12/groupe) pour la phase 2 du projet ils ont été définis par un programme informatique spécifique.
Raffinement
Les cages seront munies d’éléments d’enrichissement (buchettes, tunnels en carton, sizzlenet), permettant d’offrir aux animaux la possibilité d’évoluer en espaces clos, type de milieu préférentiel chez des rongeurs. L’état des animaux sera évalué quotidiennement par observation de tout comportement pouvant suggérer la présence de mal être chez les animaux de cette étude. Par ailleurs, le succès de ce projet aura pour conséquence le remplacement - quand cela sera possible - en notre structure de la procédure lu labyrinthe aquatique de Morris par celle du plateau troué de Barnes lorsque l’apprentissage ou la mémoire de rétention devront être testés sur modèle souris, ce qui constituera un raffinement certain de nos pratiques d’études.
Choix des espèces
La validation de la procédure du plateau troué de Barnes sera effectuée chez la souris car ce modèle animal est celui qui est majoritairement utilisé par les utilisateurs de notre structure de recherche. Les animaux seront âgés de 6 semaines à la réception (jeunes adultes)
Etude du rôle de la mobilité et de la nano-organisation des récepteurs AMPA dans la physiologie synaptique et les fonction cérébrales
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'injection d'un virus dans le cerveau, la pose d'une fenêtre crânienne et un contrôle de leur consommation d'eau et de nourriture, pour étudier la mobilité de récepteurs synaptiques et son rôle dans la mémoire. Le porteur annonce comme bénéfice une meilleure compréhension du fonctionnement des synapses, sans application médicale précise. Il affirme que la souris est "l'espèce de choix" et qu'une approche in vivo est "nécessaire" pour observer le cerveau en fonctionnement.
Objectifs
Le but de ce projet est d’étudier le rôle de la mobilité et de la nano-organisation des récepteurs à glutamate hétérotétramère formé de quatre sous-unités dans la physiologie des synapses, les fonction cérébrales et le comportement. Dans ce but nous utiliserons des outils moléculaires et génétiques qui permettent d'induire l'immobilisation de récepteurs à glutamate contenant les sous-unités A2 ou A1 . Précédemment, nous avons démontré que la diffusion de surface de ces recepteurs est impliquée dans la régulation de la potentialisation synaptique à long terme et de la mémoire dépendante de l'hippocampe. Nous voulons étudier ce phénomène plus précisément et premièrement, examiner l'implication de la diffusion latérale des AMPAR dans différentes formes de plasticité synaptique comprenant non seulement la plasticité synaptique à long terme mais aussi la plasticité synaptique à court terme, dans différentes régions du cerveau. Deuxièmement, nous voulons également identifier d’autres acteurs moléculaires, répertoriés comme protéines auxiliaires de ces récepteurs, impliqués dans la régulation de leurs mobilités et pouvant modifier la plasticité synaptique. Troisièmement, nous voulons étudier les processus physiologiques qui agissent sur la mobilité de ces derniers pour réguler la plasticité synaptique. Enfin, nous voulons rechercher des paradigmes comportementaux qui sont régulés par la mobilité des recpetuerus à glutamate in vivo.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons découvrir le rôle et la régulation de la mobilité de surface des AMPAR dans la plasticité synaptique et la fonction cérébrale, ce qui contribuera à une meilleure compréhension de la manière dont la transmission synaptique est régulée dans le cerveau. Grâce à l'approche expérimentale conçue, nous voulons découvrir comment les effets de la mobilité de la surface des AMPAR sur la plasticité synaptique sont régulés dans le tissu cérébral intact et in vivo. De manière générale, cela nous permettra de mieux comprendre la fonction des synapses dans le cerveau.
Procédures
Procédure chirurgicale pour injection de virus : entre 10 et 20 min - procédure chirurgicale avec implantation fenêtre crânienne : entre 1 et 2H- régime avec contrôle de la consommation hydrique et alimentaire.
Impact sur les animaux
Les procédures postopératoires et l'analgésie se feront sans douleur. Le stress sera limité avec une habituation progressive à l'expérimentateur. Toutes les procédures ont été régulièrement utilisées en laboratoire. Les expérimentateurs auront une solide expérience dans l'exécution des procédures. Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte.
Devenir
Tous les animaux seront mises à mort à l'issue de chaque procédure
Remplacement
La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. Le concept de l’importance de la mobilité des récepteurs dans les phénomènes de plasticité synaptique a été identifié par notre équipe avec des approches in vitro de culture de neurones de souris de type sauvage comme de neurones de nos lignées transgéniques. Pour vérifier ce concept dans des approches plus intégrées, il est nécessaire d’utiliser des approches in vivo avec des animaux de façon à observer le cerveau en fonctionnement.
Réduction
La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique.
Raffinement
A chaque étape du projet, le bienêtre de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventiles, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptes aux procédures de chirurgie. L’expérimenter a une forte expérience pour toutes les procédures proposes. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du systéme nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les injections de virus seront effectuées sur des animaux âgés de P0 semaines à 3 mois. Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.
Validation d’un protocole de thérapie génique et essai pré-clinique dans un modèle murin pour une neuropathie fatale chez l’Homme (EU 2/3)
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
314 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un vecteur viral sous anesthésie, cinq prélèvements de sang et cinq séries de tests comportementaux sur douze mois, pour évaluer une thérapie génique contre une maladie neuromusculaire mortelle chez l'humain. Ce dossier constitue le deuxième volet d'une série de trois autorisations pour le même programme. Le porteur mentionne des tests moteurs et sensoriels sans les nommer et juge la souris "essentielle" pour prouver l'efficacité de l'approche.
Objectifs
Ce projet concerne le développement d’une thérapie génique pouvant constituer un traitement curatif pour une maladie neuromusculaire fatale chez l’Homme et pour laquelle, il n’existe aujourd’hui aucun traitement curatif. Cette maladie est provoquée par des mutations d’un gène, et cela entraine des troubles moteurs et sensoriels chez les patients dès l’enfance. La thérapie génique consiste donc à compenser le gène défectueux en important une copie du gène fonctionnelle dans l’organisme grâce à un vecteur viral. Précédemment, nous avons développé un modèle animal (souris) qui reproduit pour la première fois les troubles moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients. Nous avons élaboré une méthodologie avec ce modèle pour développer notre thérapie. Notre premier objectif est d’optimiser les conditions de notre protocole (choix du meilleur promoteur, doses à utiliser) en analysant les effets sur le comportement et l’organisme de nos souris (prélèvements sanguins, analyses moléculaires). Ensuite, notre deuxième objectif est d’évaluer les bénéfices de ce protocole thérapie génique grâce à un essai pré-clinique dans notre modèle sur une durée de 12 mois. Nous évaluerons ces bénéfices en évaluant le comportement et l’effet sur l’organisme de ces souris.
Bénéfices attendus
La validation de notre protocole et l’évaluation des bénéfices de notre thérapie génique chez la souris constituerait un premier pas vers une thérapie adaptable à l’Homme dans le cadre d’une maladie génétique. De plus, lors des analyses sanguines, nous aimerions pouvoir mettre en évidences des marqueurs sanguins de cette maladie. Ces marqueurs pourraient être utilisés également dans le cadre du diagnostic d’autres maladies neurodégénératives.
Procédures
Les souris recevront le vecteur viral (durée : 5mn) sous anesthésie générale. Les souris auront 5 prélèvements sanguins (durée : 5mn). Les souris réaliseront 5 fois la série de tests comportementaux (5 tests comportementaux, durée : entre 30s et 15mn) entre 1 mois et 12 mois. Ces tests permettront d’évaluer les capacités motrices et sensorielles des animaux permettant de rendre compte de l’efficacité de l’approche thérapeutique.
Impact sur les animaux
L’administration du vecteur viral, les prises de sang pourront induire un stress faible chez les animaux. Les tests comportementaux pourront induire un stress variable chez les animaux allant de faible à modérer. Aucun autre effet indésirable n’est attendu à l’issu de ces éléments.
Devenir
Ce projet compte 2 procédures. La première permettra de valider le protocole de thérapie génique sur les souris par des analyses comportementales et tissulaires, nécessitant leur mise à mort afin d’étudier le phénotype tissulaire (prélèvement d’organes post-mortem pour analyses). La deuxième permettra d’évaluer les bénéfices de la thérapie au niveau comportemental et tissulaire nécessitant la mise à mort des souris (prélèvement d’organes post-mortem pour analyses.
Remplacement
Le projet a pour but de valider un premier essai pré-clinique de thérapie génique pour une maladie neuromusculaire fatale et incurable chez l’Homme. Les modèles in vitro (cellules immortelles et neurones en culture) ont permis de mettre en évidence des effets au niveau moléculaire/cellulaire de cette approche. Elle nécessite à présenter être validée dans un organisme modèle de mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de prouver l’efficacité de notre approche dans une étude pré-clinique chez la souris.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire au maximum le nombre d’animaux par condition expérimentale tout en conservant un nombre suffisant de souris par lot pour pouvoir analyses nos résultats de façon statistique et ne pas avoir besoin de reconduire ce type de projet.
Raffinement
Le phénotype de notre modèle murin ne diffère pas du modèle sauvage durant le temps de l’expérimentation (12 mois maximum) permettant un hébergement en cage collective pour respecter leurs besoins sociaux. L’administration du vecteur viral est réalisée sous anesthésie générale avec un réveil post-anesthésie dans une cage chauffée, du gel ophtalmique est appliqué post-injection et mise en place d’une analgésie si besoin. Les prises de sang sont effectuées sous anesthésie générale avec réveil post-anesthésie dans une cage chauffée et mise en place d’une analgésie si besoin. L’organisation des tests comportementaux seront précédés d’une phase d’entrainement et une période de récupération d’au moins une demi-journée voir 2 jours entiers est prévue afin de limiter au maximum le stress des animaux. Chaque animal sera surveillé de façon individuelle et de façon quotidienne. A chaque étape du projet, des points limites ont été établis pour soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
Avec 98% d’identité protéique avec l’Homme, la souris constitue un modèle idéal pour reproduire les pathologies humaines afin de les étudier dans un contexte physiologique mais également de pouvoir tester et valider des approches thérapeutiques. L’étude réalisée sur notre modèle a montré qu’il reproduit pour la première fois les symptômes moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients, justifiant son utilisation valider notre approche de thérapie génique. Notre projet utilisera le stade juvénile (1 mois) et le stade adulte (2 à 12 mois). Notre modèle murin présente des défauts moteurs et sensoriels à partir de 3 mois ; il est donc nécessaire de débuter la stratégie à un stade précoce. La validation du protocole et l’évaluation des bénéfices au niveau comportemental et histologique doivent être évaluées au stade adulte pour évaluer les effets de la thérapie à moyen- et long-terme.
Contribution des canaux astrocytaires dans l’allodynie mécanique chez le rat: sensibilité cutanée et effets d’un triptan et d’un antagoniste CGRP
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection dans la moelle épinière sous anesthésie et développe une hypersensibilité douloureuse de la face, l'allodynie, avant d'être anesthésié en profondeur et tué pour prélever ses tissus nerveux, dans une étude sur la migraine. Le porteur teste un triptan et un antagoniste du CGRP et prévoit la mise à mort des animaux perdant plus de 15 % de leur poids. Il juge le développement de nouvelles molécules "indispensable" et affirme qu'"aucune méthode alternative" ne peut remplacer ce protocole.
Objectifs
La migraine est une pathologie qui a un fort impact sur la santé publique (12-15% de la population touchée). Les traitements proposés ont une efficacité limitée, surtout au stade chronique de la maladie. Le développement et l'évaluation des effets antalgiques de nouvelles molécules est indispensable pour l’amélioration des thérapeutiques. Une des signatures comportementales de la migraine est l’hypersensibilité à la douleur mécanique cutanée appelée allodynie qui représente en plus de la douleur spontanée un symptôme très handicapant pour les malades.
Bénéfices attendus
A moyen terme, ce projet a pour but de mettre en évidence l'implication des astrocytes dans la chronicisation de la migraine et l'installation de l'allodynie mécanique. Si nous arrivons à identifier de nouveaux acteurs ainsi que leurs rôles, cela nous permettra de mieux comprendre ces pathologies. A plus long terme, ces études peuvent aider à développer de nouveaux traitements pour soulager les patients.
Procédures
Chaque animal aura une une injection intramédullaire (sous anesthésie gazeuse, 1fois 20 min), une injection intra péritonéale (vigile 1 fois 30s) et une perfusion (sous ananesthésie profonde 1fois 30min). Elles seront réalisées par du personnel formé et compétent, sous la responsabilité des membres de la Structure du Bien Etre Animal.
Impact sur les animaux
Les résultats obtenus des travaux du laboratoire ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux mise à part le développement d'une allodynie faciale. La douleur occasionnée à l’animal est estimée comme étant « modérée » et les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer ses gestes habituels.
Devenir
A la fin des procédures d'études comportementales, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort: pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une analyse immunohistochimique.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après l'injection virale et pour tester les différents traitements curatifs.
Réduction
Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc il est préférable de prévoir 10 animauxmaximal par groupe: habituation, injections virale et systémique,comportement, stimulation et perfusion. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 6 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. D’abord, un test de significativité sera réalisé afin de déterminer si les données suivent une distribution normale, puis un test d’égalité des variances avant de confronter les valeurs avec un test paramétrique. Dans le cas où le test de normalité soit significatif ou les variances ne puissent pas être considérées égales, nous allons donc utiliser des tests non paramétriques.
Raffinement
Préalablement à toutes études comportementales, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. L’anesthésie adéquate des animaux est confirmée par l’absence de réflexe de retrait de la patte en réponse à un pincement de la patte postérieure. De plus, lors d’injection intra médullaire, le suivi post-opératoire, avec un examen minutieux de la zone d’injection, est poursuivi dans les jours suivants. L'état général de l'animal est surveillé tous les jours avec contrôle du poids. Si un amaigrissement de plus de 15% du poids total, mesuré au début de l’expérimentation, est constaté ou s’il apparaît un comportement défini dans la liste de points limites, alors les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
La souche de rat Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Nous utiliserons des animaux entre 3 à 8 semaines, pour comparer avec les données du laboratoire.