Rongeurs
Mesure de la clairance rénale chez un rat sain
- Enseignement supérieur
210 rats vont être utilisés, anesthésiés puis tués avant tout réveil, dans des procédures classées sans réveil. Chaque animal reçoit trois cathéters au cours d'une intervention de trois heures, pour initier des étudiants de licence à la mesure de la fonction rénale, avant d'être tué pour prélever huit millilitres de sang. Le porteur indique avoir déjà remplacé des travaux pratiques sur le cœur par une simulation sur ordinateur, tout en maintenant celui-ci sur des animaux vivants. Il juge cette initiation "nécessaire" à l'orientation future des étudiants.
Objectifs
Les procédures décrites dans ce projet ont pour objectifs d'initier les étudiants au fonctionnement intégré de l'organisme d'un mammifère, de leurs donner les règles de Bonnes Pratiques de Laboratoire (dans le respect de la règlementation), de leurs apprendre à exécuter un protocole expérimental in vivo et les initier à l'analyse critique de données expérimentales. Ces objectifs seront réalisés au travers la mesure de la clairance rénale chez des animaux sains. Le but de ce projet est réaliser des mesures, des prélèvements sanguins et urinaires seront effectués après administration d'une solution contenant du NaCl (excipient), de l'héparine (anticoagulant), de l'inuline (librement filtré par les reins), du mannitol (qui accélère la diurèse) et du glucose en intraveineuse. Ces prélèvements sont effectués sur une dizaine de minutes après vérification de la présence d'inuline dans les urines (20 minutes environ après le début de l'injection de la solution) .
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans leur formation initiale, et vient illustrer de façon expérimentale la pédagogie développée lors des cours magistraux. Ce projet est nécessaire lors de la formation des étudiants afin qu'ils puissent 1) avoir une première expérience en expérimentation animale in vivo, 2) règlementaire afin que les étudiants valident leur licence en Sciences de la Vie, option Physiologie animale.
Procédures
Tous les animaux subiront la procédure de préparation à l'étude de la clairance rénale. Ils seront tous anesthésié, puis auront les 3 cathéters de posés. Cette procédure sans réveil durera en moyenne 3 heures par animal. Il y a 3 animaux par groupe de TP (en moyenne 14 groupes par an, sur 5 années, donc total de 210 animaux maximum pour ce projet d'enseignement).
Impact sur les animaux
Les animaux sont hébergés dans des conditions standard, avec accès à la nourriture ad libitum. Les seules nuisances possibles sont: le stress lié à la pesée de l'animal, la contention avant anesthésie, ainsi qu'une douleur lors de l'insertion de l'aiguille d'anesthésie dans le péritoine. Toutes les procédures seront effectuées sur des animaux anesthésiés, avec antalgiques (dolorex) et sans réveil afin de limiter au maximum tout stress et douleur.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés afin de récolter leur sang (8 ml nécessaire par animal pour effectuer les dosages pour le bon déroulement du TP).
Remplacement
Afin de respecter le principe énoncé par Russell et Burch en 1959 des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) il a été décidé de limiter l'utilisation des animaux dans la formation de nos étudiants. Nous avons, pour cela, opter pour des recherches sur simulateurs ou in vitro lorsque ceux-ci sont disponibles. Pour information, dans l'UE fonctionnement harmonieux du coeur et du rein, nous avons déjà substitué le fonctionnement du coeur par un TP in silico sur ordinateur afin de limiter l'utilisation d'animaux. Toutefois, la phase d’analyse sur l’animal est le seul moyen d'observer concrètement le fonctionnement intégré de l'organisme d'un mammifère, comme le fonctionnement de la fonction rénale chez l'animal. Amenés à embrasser des carrières d'ingénieurs ou chercheurs dans le domaine de la physiologie, nous pensons qu'une initiation précoce, mais limitée, est nécessaire dans l'orientation future de nos étudiants.
Réduction
Ces travaux pratiques s'appuyent sur des données publiées dans des revues scientifiques à comité de lecture, le but de ce projet n'est pas tant le résultat que la façon de l'obtenir. Au vu de l'expérience des enseignants, du nombre d'enseignants participants et du libre choix de la participation active des étudiants, il a été décidé de limiter au maximum le nombre d'animaux employés par groupe de TP. Cependant, les dosages nécessitent un volume de sang et d'urine conséquents (10 mL environ). 3 animaux par groupe de TP (pour 16 étudiants, avec au maximum 14 groupes annuels) est le nombre minimum nécessaire afin de réaliser, dans de bonnes conditions ces travaux pratiques.
Raffinement
Il est à noter que les prélèvements de sang et d'urine non utilisés lors de ce TP sont conservés 2 mois (-23°C) pour une possible utilisation ultérieure en cas de nécessité. Les animaux sont anesthésiés pendant toute la procédure, et une analgésie est administré.
Choix des espèces
Ce modèle animal a fait l'objet de recherches exhaustives, de sorte que tous les aspects du cycle de vie de l'animal et leurs incidences potentielles sur l'expérimentation sont relativement bien connus. Un large éventail de techniques sont adaptées aux rats pour étudier différents paramètres et mécanismes, dont ceux décrits dans cette saisine. La taille et le poids de l'animal sont compatibles avec une manipulation aisée pour les étudiants. L'obtention d'un volume suffisant de sang et d'urine est possible avec cet animal et ce afin de réaliser les dosages nécessaires à l'étude de la clairance rénale. Les rats mâles "Wistar" auront un âge compris entre 40 et 90 jours, soit l’âge de la maturité sexuelle. Cet âge permet de s’affranchir des problèmes à la fois prépubères et de vieillissement et donc évite d’inclure des paramètres supplémentaires dans la compréhension des mécanismes mis en jeu.
Bases neurales du déclenchement de l’action motrice par les neurones arkypallidaux du globus pallidus en situation physiologique et physiopathologique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 709 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 645 d'entre elles et sévère pour 2 064. Elles subissent une chirurgie d'injection d'un virus dans le cerveau, une chirurgie d'implantation puis une imagerie tête immobilisée, après une déplétion en dopamine reproduisant la maladie de Parkinson et un traitement à la L-DOPA. Le porteur décrit peu les procédures elles-mêmes et n'en précise pas la durée pour chaque animal. Il affirme qu'"aucun modèle in vitro ne peut reproduire" la connectivité cérébrale étudiée, ce qui justifie selon lui le recours à la souris.
Objectifs
Nos actions quotidiennes nécessitent la sélection de comportements moteurs adaptés tout en supprimant les comportements indésirables. Cette fonction, que l'on appelle la régulation des actions motrices, est essentielle à l'interaction et à la survie dans un environnement en constante évolution, comme l'illustrent peut-être le mieux les conditions neurologiques dans lesquelles cette capacité est perturbée. Par exemple, dans la maladie de Parkinson (MP), la perte de la dopamine, un neurotransmetteur, est associée à des déficiences motrices dévastatrices qui commencent d'abord par une bradykinésie/hypokinésie (c'est-à-dire le ralentissement/l'incapacité d'initier une action volontaire), mais qui peuvent rapidement passer à un comportement extrême et opposé sous traitement à la lévodopa, comme les mouvements involontaires amormaux (MIAs), également connus sous le nom de dyskinésie induites par la lévodopa (DIL). Notre projet vise à mettre en lumière les bases neuronales qui sous-tendent le déclenchement normal de l'action motrice et la façon dont ces mécanismes sont perturbés dans des conditions pathologiques qui entraînent soit une incapacité à exécuter un plan moteur désiré (comme dans l'état akinétique de la maladie de Parkinson : MP), soit, au contraire, l'incapacité à s'abstenir de mouvements indésirables (comme dans les DIL). Nous avons montré récemment que le globus pallidus (GPe) est composé de deux populations neuronales, nommées neurones prototypiques (PROTO) ou arkypallidaux (ARKY) qui ont des fonctions distinctes dans le contrôle du mouvement. L'hypothèse principale de notre projet est que les neurones ARKY représentent un substrat cellulaire clé dans le réseau des ganglions de la base pour contrôler l’exécution du mouvement volontaire. En outre, nous proposons également que la dérégulation de la fonction des neurones ARKY pourrait contribuer aux déficits moteurs présents dans l'état akinétique (MP) ou dyskinétique (DIL) de la maladie de Parkinson. Toutes les expériences seront réalisées sur des souris contrôles (Sham), des souris déplétées en dopamine (MP) et des souris déplétées en dopamine avec un traitement à la L-DOPA (DIL).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour l'amélioration des traitements, ou le développement de nouveaux traitements pour réduire les symptômes moteurs des patients atteints de la maladie de Parkinson et des effets secondaires "dyskinésies" qui surviennent suite à la prise de traitements dopaminergiques.
Procédures
Procédure chirurgicale pour injection de virus : entre 20 et 40 min, - procédure chirurgicale avec implantation : entre 1 et 2H, imagerie avec tête restreinte
Impact sur les animaux
L'effet indésirable attendu sur les animaux est inhérent à l'induction de la maladie de Parkinson qui induit un déficit moteur (réduction d'activité locomotrice et comportement rotatoire). Les procédures postopératoires et l'analgésie se feront sans douleur. Le stress sera limité avec une habituation progressive à l'expérimentateur. Toutes les procédures ont été régulièrement utilisées en laboratoire. Les expérimentateurs auront une solide expérience dans l'exécution des procédures. Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post- chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure
Remplacement
Le but du projet est connaitre la fonction d’une sous-population neuronale du globus pallidus externe (GPe) et le reste du réseau des ganglions de la base dans le contrôle de la motricité volontaire. La méthode la plus appropriée pour atteindre cet objectif consiste à combiner des approches d'injections stéréotaxiques, afin de rapporter des protéines capables d'être activer ou d’inhiber l’activité neuronale avec des d'enregistrements électrophysiologiques ou optique ex vivo sur tranches de cerveau, ou in vivo chez l’animal se comportant et nécessite donc le recours à l’animal. Aucun modèle "in vitro" ne peut reproduire la connectivité complexe entre le GPe et le reste du réseau des ganglions de la base.
Réduction
L'utilisation des mâles et des femelles nous permettra de porter une attention particulière au R de réduire dans la règle des 3R. En effet, tous les animaux transgéniques produits seront utilisés et ainsi moins d'animaux seront sacrifiés inutilement. La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés (t-test apparié pour des données paramétriques ou le test de Wilcoxon pour des données non parametrique).
Raffinement
Nous utilisons plusieurs procédures de raffinement, à savoir: 1/ choisir le modèle rongeur de maladie de Parkinson et de dyskinésies le mieux adapté pour reproduire les symptômes moteurs observés chez les patients Parkinsonsiens 2/ l'utilisation d'animaux hébergés dans la même strucutre ce qui ne nécessite aucun transport et donc limite le stress des animaux 3/ une manipulation des animaux par l'expérimentateur afin là aussi de limiter le stress 4/ l'établissement de points limites 5/ La mise en place de soins adéquats si nécessaire pendant et après l’opération et l'utilisation de l’anesthésie/analgésie leur de chaque protocole invasifs. A chaque étape du projet, le bien-être de nos animaux sera au coeur de nos préoccupations. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventiles, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures chirurgicale. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptes aux procédures de chirurgie. L’expérimenter a une forte expérience pour toutes les procédures proposes. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du systéme nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les procédures expérimentales seront réalisées sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.
Etude du rôle des productions hépatiques et intestinales de glucose sur le diabète induit par des polluants environnementaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 120 d'entre elles et sévère pour 24. Elles reçoivent des régimes contenant un cocktail de polluants dans l'eau de boisson pendant cent vingt jours, des injections, des tests de glycémie et des jeûnes qui exposent certaines lignées à des hypoglycémies, pour étudier un diabète lié aux contaminants de l'environnement. Le porteur affirme que la maladie "influence l'ensemble du métabolisme" et que le recours à des animaux est "nécessaire". Sa rubrique de réduction annonce 114 souris là où les nombres déclarés en atteignent 144.
Objectifs
Le diabète, qui est une maladie caractérisée par des taux de sucre trop élevés dans le sang (hyperglycémie), est un enjeu majeur de santé publique. Le diabète présente des formes et origines diverses, qui restent encore mal connues. En dehors des formes classiques induites par l’obésité, il en existe des formes où les patients ne sont ni en surpoids, ni obèses. Parmi les facteurs de risque, l’exposition à des polluants de l’environnement joue un rôle important. En effet, ces produits chimiques toxiques présents dans notre alimentation, les emballages, et dans les produits d’entretien ou cosmétiques favorise l’apparition de maladies, dont le diabète. Même s’il existe une réglementation et que des seuils d’exposition maximum à ces toxiques ont été mis en place à l’échelle mondiale, ils ont des répercussions sur notre santé. En effet, il a été récemment rapporté qu’à des doses, même très faibles, ces polluants peuvent provoquer le diabète lorsqu’ils sont consommés de façon chronique. Néanmoins les mécanismes impliqués sont encore mal compris. Après ingestion via les aliments, ces molécules chimiques auraient un impact sur le métabolisme en augmentant la production de glucose(sucre) par l’intestin et le foie, ce qui conduirait à l’apparition du diabète au cours d’une exposition chronique à ces polluants. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes impliqués dans l’apparition du diabète suite à une exposition chronique à un cocktail de polluants administré à faibles dose à des souris.
Bénéfices attendus
Des études menées dans différents pays, dont la France et l’Inde, ont exploré l'association entre les polluants environnementaux et la prévalence du diabète. En effet, l’exposition à des doses élevées de polluants est connue dans la littérature pour induire le diabète et de nombreuses autres complications. Néanmoins, bien que la dangerosité de ces composés soit généralement étudiée à court terme et à très forte dose chez l’animal, peu de travaux s’intéressent aux effets délétères d’une exposition à long terme à un mélange de faibles doses de toxiques, ce qui est pourtant la situation la plus fréquente. Ce projet devrait permettre de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement du diabète associé à une exposition chronique à un cocktail de contaminants chimiques de l’environnement, et de potentiellement les différencier de ceux associés à l’obésité. En effet, les résultats préliminaires indiquent que ce cocktail de contaminants induirait un diabète sans association avec l’obésité. Ces diabètes sont toujours difficiles à traiter et résistants aux traitements. Ce projet pourrait donc d’abord contribuer à une meilleure connaissance des diabètes sans obésité, mais aussi des diabètes induits par les polluants en général. L’objectif à terme est de proposer une meilleure prise en charge des patients diabétiques obèses et non obèses.
Procédures
Une biopsie de tissu (geste réalisé en quelques secondes) sera réalisée pour vérifier la modification génétique. L’invalidation de la production de sucre par le foie ou par l’intestin sera réalisée dans des modèles de souris transgéniques qui nécessitent un traitement injecté (5jours de suite). Les souris sans modification génique recevront le même traitement pour s’affranchir de ses effets possibles. Ce geste est réalisé en quelques secondes. L’activation de la production de sucre par l’intestin ne nécessite aucune intervention supplémentaire. Les souris recevront pendant 120jour, soit une alimentation standard, une alimentation riche en graisses et en sucres ou une alimentation standard et un mélange de produits chimiques dans l’eau de boisson. Le taux de sucre dans le sang (glycémie) sera mesuré tous les mois à partir d’une goutte de sang grâce à l’utilisation d’un glucomètre(réalisé en quelques secondes). Des tests permettant de caractériser le diabète seront réalisés soit à l’état nourri, ou à jeun. Ces tests consistent à administrer du sucre, de l’insuline ou du pyruvate aux souris et de suivre l’évolution de la glycémie (mesure avec un glucomètre à partir d’une goutte de sang). Une semaine entre chaque test permettra d’éviter le stress des animaux. Une prise de sang nécessitant une contention de 1-2minutes sera réalisée. Au total: - Les souris incapables de produire du glucose par le foie seront soumises à 10interventions dont 1biopsie, 1série d’injections, 3tests avec injections et prises de glycémie, 1mise à jeun de 6h, 1 mesure de glycémie, et 1prélèvement de sang terminal. - Les souris chez lesquelles la production de glucose par l’intestin est activée ou inactivée seront soumises à 9interventions dont 1biopsie, 3tests avec injections et prises de glycémie avec 3mises à jeun, 1mesure de glycémie, 1mise à jeun de 6h et 1prélèvement de sang terminal. Enfin, les animaux seront mis à mort par une méthode respectant l’éthique animale, afin de prélever leurs organes (dont le foie et l’intestin pour analyser la production de glucose).
Impact sur les animaux
Les souris qui ne sont pas capable de produire de sucre par le foie, peuvent réguler leur glycémie grâce à une production de sucre par les reins et l’intestin, ce qui permet de limiter les hypoglycémies(baisse du taux de sucre dans le sang) au cours d’un jeûne. Les souris seront soumises à un jeûne de 6h, ce qui représente une période entre deux repas. Dès 2h après l’arrêt de la prise de nourriture ces souris peuvent développer des hypoglycémies pendant cette période. La connaissance du modèle animal a permis de définir des points limites, en contrôlant les risques d’hypoglycémie. Ainsi, des croquettes sont accessibles aux souris directement dans la cage pour leur éviter la perte d’énergie nécessaire pour atteindre les mangeoires. Avant la mise à jeun, une partie de leur cage est placée sur une plaque chauffante pour éviter les hypothermies (baisse de la température corporelle). Un suivi très régulier de ces animaux est réalisé par le technicien en charge du protocole expérimental. En effet, le suivi des premiers signes d’hypoglycémie qui se caractérisent par une diminution de la mobilité, prostration, et/ou refroidissement de l’animal est réalisé très régulièrement afin de pouvoir mesurer la glycémie et injecter une solution de glucose en cas de mal-être ou de valeurs de glycémie trop basse(mesure avec un glucomètre sur une goutte prélevée au niveau de la queue). Chez les souris saines, la glycémie est normalement régulée lors d’une période de jeûne grâce à une production de glucose assurée par le foie(majoritaire), les reins et l’intestin. Les souris sans production de sucre par l’intestin présentent un phénotype anxieux léger. Néanmoins, les conditions d’hébergement en milieu enrichi(nid, maison pour se cacher) sont suffisantes pour atténuer leur anxiété. Après 16 semaines de régime riche en graisses et en sucres, les souris sans modification génétique deviennent obèses et diabétiques. Dans cette étude, elles seront étudiées à un stade précoce du développement de l’obésité et du diabète afin de limiter les complications liées à ces maladies. Des travaux précédents avec le cocktail de polluants dans l’eau n’ont révélé aucune modification de la prise de boisson, ni aucun effet secondaire indésirable, aucune anxiété, ni aucun changement de comportement chez les souris. Les souris soumis à l’exposition chronique de ce mélange de polluant pendant n’ont pas développé d’obésité mais présentent comme attendue une hyperglycémie, signe de diabète.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort par une méthode éthiquement autorisée pour prélèvement du sang et de différents tissus. Des études moléculaires, histologiques et biochimiques seront réalisées afin d’évaluer l’impact du mélange de contaminants chimiques sur le développement du diabète et la production de glucose par les différents organes producteurs de glucose (foie, reins et intestin). Des tissus non nécessaires à ce projet seront également prélevés afin de constituer une banque de tissus qui permettra à l’avenir de réduire le recours à des animaux supplémentaires.
Remplacement
Cette étude nécessite l’utilisation de modèles animaux puisque la pathologie étudiée, le diabète, influence l’ensemble du métabolisme de l’organisme et implique des dialogues entre organes. De plus, les contaminants chimiques testés sont capables de moduler la production de sucre par le foie et l’intestin. Ainsi, puisqu’elle implique de nombreux organes (et une communication entre eux), notre étude nécessite l’utilisation d’animaux.
Réduction
Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances des pathologies étudiées, des modèles animaux, du métabolisme glucidique, et d’outils statistiques. Afin de pouvoir faire une analyse statistique adaptée, des groupes de 8 souris seront analysés. Au total, ce projet nécessitera 114 souris mâles transgéniques et non transgéniques (témoins). En fin de procédures, les animaux seront mis à mort afin de prélever différents tissus à analyser, mais également de nombreux autres tissus pour constituer une banque de tissus utilisable à l’avenir pour certaines analyses moléculaires sans animaux supplémentaires.
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupe, dans un milieu enrichi pour favoriser la nidation et limiter le stress. L’invalidation de la production de sucre uniquement dans le foie évite les hypoglycémies sévères au cours d’un jeûne long grâce à l’induction de la production de sucre par les reins et l’intestin. La connaissance du modèle a permis de définir des points limites, en contrôlant les risques d’hypoglycémie et en limitant les efforts pour accéder à la nourriture et à l’eau de boisson. Pour limiter les hypoglycémies, le suivi des premiers signes d’hypoglycémie est réalisé très régulièrement. Si nécessaire, un suivi de glycémie sera réalisé et une injection d’une solution de glucose ou une mise à mort de l’animal sera réalisée si l’hypoglycémie intervient en fin de procédure (prélèvement des tissus dans ce cas). Enfin, une partie de la cage est placée systématiquement sur une plaque chauffante afin de maintenir la température corporelle de la souris. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés chaque semaine pour suivre leur prise de poids. Le recours à des grilles de score ou à l’échelle de grimace de souris permettra une évaluation précoce du bien-être. Lors de l’atteinte d’un point limite défini dans le projet, les souris pourront être mises à mort selon les méthodes autorisées par la législation. Enfin, la dose de contaminants utilisée dans ce projet n’entraine aucune altération physique. En effet, la dose utilisée dans les expériences sur les animaux est très faible (sous les seuils de tolérance admis chez l’Homme).
Choix des espèces
Souris (Mus musculus) En ce qui concerne la fonction étudiée, c’est-à-dire la production de sucre par l’organisme, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs, tels que le poisson, montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Nous souhaitons donc réaliser ces expériences avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’homme. De plus, le phénotype des modèles murins utilisés dans ce projet est bien caractérisé ce qui permet d’utiliser les modèles adaptés, dans des conditions limitant l’apparition de phénotype dommageable et dans le respect du bien-être animal. A l’âge de 6-8 semaines, les souris recevront des injections pour induire la modification génétique et leurs témoins (sauf pour le modèle d’activation de la production de sucre par l’intestin). Ainsi, après réalisation de la modification génétique à l’âge adulte, les animaux seront étudiés à l’âge de 11-13 semaines (soit 5 semaines après les injections, temps nécessaire à la disparition des effets potentiels de la molécule sur le métabolisme). Ensuite, les souris recevront un traitement (voir composition des groupes) pendant 120 jours. Enfin, les souris seront mises à mort pour prélever des tissus à analyser à l’âge de 28-30 semaines
Validation d’un protocole de thérapie génique et essai pré-clinique dans un modèle murin pour une neuropathie fatale chez l’Homme (EU 3/3)
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
314 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un vecteur viral sous anesthésie, cinq prélèvements de sang et cinq séries de tests comportementaux entre un et douze mois, pour évaluer une thérapie génique contre une maladie neuromusculaire mortelle chez l'humain. Le porteur mentionne des tests moteurs et sensoriels sans en préciser la nature. Il affirme qu'il est "essentiel" de prouver l'efficacité de l'approche chez la souris, présentée comme ayant "98 % d'identité protéique" avec l'humain.
Objectifs
Ce projet concerne le développement d’une thérapie génique pouvant constituer un traitement curatif pour une maladie neuromusculaire fatale chez l’Homme et pour laquelle, il n’existe aujourd’hui aucun traitement curatif. Cette maladie est provoquée par des mutations d’un gène, et cela entraine des troubles moteurs et sensoriels chez les patients dès l’enfance. La thérapie génique consiste donc à compenser le gène défectueux en important une copie du gène fonctionnelle dans l’organisme grâce à un vecteur viral. Précédemment, nous avons développé un modèle animal (souris) qui reproduit pour la première fois les troubles moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients. Nous avons élaboré une méthodologie avec ce modèle pour développer notre thérapie. Notre premier objectif est d’optimiser les conditions de notre protocole (choix du meilleur promoteur, doses à utiliser) en analysant les effets sur le comportement et l’organisme de nos souris (prélèvements sanguins, analyses moléculaires). Ensuite, notre deuxième objectif est d’évaluer les bénéfices de ce protocole thérapie génique grâce à un essai pré-clinique dans notre modèle sur une durée de 12 mois. Nous évaluerons ces bénéfices en évaluant le comportement et l’effet sur l’organisme de ces souris.
Bénéfices attendus
La validation de notre protocole et l’évaluation des bénéfices de notre thérapie génique chez la souris constituerait un premier pas vers une thérapie adaptable à l’Homme dans le cadre d’une maladie génétique. De plus, lors des analyses sanguines, nous aimerions pouvoir mettre en évidences des marqueurs sanguins de cette maladie. Ces marqueurs pourraient être utilisés également dans le cadre du diagnostic d’autres maladies neurodégénératives.
Procédures
Les souris recevront le vecteur viral (durée : 5mn) sous anesthésie générale. Les souris auront 5 prélèvements sanguins (durée : 5mn). Les souris réaliseront 5 fois la série de tests comportementaux (5 tests comportementaux, durée : entre 30s et 15mn) entre 1 mois et 12 mois. Ces tests permettront d’évaluer les capacités motrices et sensorielles des animaux permettant de rendre compte de l’efficacité de l’approche thérapeutique.
Impact sur les animaux
L’administration du vecteur viral, les prises de sang pourront induire un stress faible chez les animaux. Les tests comportementaux pourront induire un stress variable chez les animaux allant de faible à modérer. Aucun autre effet indésirable n’est attendu à l’issu de ces éléments.
Devenir
Ce projet compte 2 procédures. La première permettra de valider le protocole de thérapie génique sur les souris par des analyses comportementales et tissulaires, nécessitant leur mise à mort afin d’étudier le phénotype tissulaire (prélèvement d’organes post-mortem pour analyses). La deuxième permettra d’évaluer les bénéfices de la thérapie au niveau comportemental et tissulaire nécessitant la mise à mort des souris (prélèvement d’organes post-mortem pour analyses.
Remplacement
Le projet a pour but de valider un premier essai pré-clinique de thérapie génique pour une maladie neuromusculaire fatale et incurable chez l’Homme. Les modèles in vitro (cellules immortelles et neurones en culture) ont permis de mettre en évidence des effets au niveau moléculaire/cellulaire de cette approche. Elle nécessite à présenter être validée dans un organisme modèle de mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de prouver l’efficacité de notre approche dans une étude pré-clinique chez la souris.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire au maximum le nombre d’animaux par condition expérimentale tout en conservant un nombre suffisant de souris par lot pour pouvoir analyses nos résultats de façon statistique et ne pas avoir besoin de reconduire ce type de projet.
Raffinement
Le phénotype de notre modèle murin ne diffère pas du modèle sauvage durant le temps de l’expérimentation (12 mois maximum) permettant un hébergement en cage collective pour respecter leurs besoins sociaux. L’administration du vecteur viral est réalisée sous anesthésie générale avec un réveil post-anesthésie dans une cage chauffée, du gel ophtalmique est appliqué post-injection et mise en place d’une analgésie si besoin. Les prises de sang sont effectuées sous anesthésie générale avec réveil post-anesthésie dans une cage chauffée et mise en place d’une analgésie si besoin. L’organisation des tests comportementaux seront précédés d’une phase d’entrainement et une période de récupération d’au moins une demi-journée voir 2 jours entiers est prévue afin de limiter au maximum le stress des animaux. Chaque animal sera surveillé de façon individuelle et de façon quotidienne. A chaque étape du projet, des points limites ont été établis pour soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
Avec 98% d’identité protéique avec l’Homme, la souris constitue un modèle idéal pour reproduire les pathologies humaines afin de les étudier dans un contexte physiologique mais également de pouvoir tester et valider des approches thérapeutiques. L’étude réalisée sur notre modèle a montré qu’il reproduit pour la première fois les symptômes moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients, justifiant son utilisation valider notre approche de thérapie génique. Notre projet utilisera le stade juvénile (1 mois) et le stade adulte (2 à 12 mois). Notre modèle murin présente des défauts moteurs et sensoriels à partir de 3 mois ; il est donc nécessaire de débuter la stratégie à un stade précoce. La validation du protocole et l’évaluation des bénéfices au niveau comportemental et histologique doivent être évaluées au stade adulte pour évaluer les effets de la thérapie à moyen- et long-terme.
tPA et inflammation : comprendre la contribution de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) dans les processus inflammatoires et dans l’infiltration des neutrophiles lors de la phase aiguë d’un accident vasculaire cérébral ischémique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie du crâne avec pose d'un cathéter et ouverture de la boîte crânienne sous anesthésie pendant soixante-dix minutes, puis une IRM sous anesthésie, pour provoquer un accident vasculaire cérébral et étudier l'effet d'un thrombolytique sur l'inflammation. Le porteur n'annonce que de simples "pistes" thérapeutiques comme retombée. Sa rubrique de réduction avance deux nombres différents, 120 souris puis 60, sans lever la contradiction.
Objectifs
Cette étude vise à comprendre l'implication de l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) dans les processus inflammatoires qui surviennent lors d'un accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique, et notamment sur l'infiltration des neutrophiles du compartiment vasculaire vers le tissu cérébral. Des études précédentes montrent que l'utilisation de rtPA (Actilyse) pour induire une reperfusion du tissu cérébral peut moduler en parralèle l'infiltration des neutrophiles dans le tissu cérébrale. La contribution du rtPA dans ces mécanismes inflammatoires reste à déterminer. L'objectif de notre projet est de comprendre les effets du rtPA sur l'inflammation cérébrale à la suite d'un AVC ischémique. Afin de représenter les différentes situations qui se produisent en clinique, nous étudierons les effets de la thrombolyse par rtPA sur deux modèles murins d'AVC ischémique : un modèle thromembolique où l'injection i.v. de rtPA permet la reperfusion du tissu cérébrale et un modèle thrombotique où l'injection de rtPA est inefficace sur la reperfusion. De plus nous allons étudier l'impact de la thrombolyse par le rtPA sur la réponse inflammatoire dans le contexte d'une thrombolyse précose et tardive afin de mimer les differents contextes possibles en clinique.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d'apporter de nouvelles connaissances l'impact du rtPA sur l'inflammation cérébrale et ainsi nous permettra de proposer de nouvelles pistes pour de potentielles stratégies thérapeutiques en combinaison de la thrombolyse par rtPA.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie permettant une pose de cathéter caudal et l'accès à l'artère cérébrale moyenne par craniotomie sous anesthésie générale et couverture analgésique d'une durée de 70 minutes par animal. Les animaux seront également soumis à des acquisitions par imagerie par résonnance magnétique (IRM) à 24h après l’induction de l’AVC, sous anesthésie générale pour une durée totale de 34 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Afin de limiter toutes douleur occasionnée par la chirurgie, nous utiliserons un analgesique lors du protocol chirurgical. Lors de projets précédents utilisant des procédures identiques ou similaires, nous n’avons pas observés de signe de douleur ni souffrance des animaux à la suite de la chirurgie. Les mesures pour réduire au maximum toute forme d’inconfort et de souffrance sont le suivi strict et rapproché des animaux, l’hébergement en petits groupes sociaux stables (n = 5) avec un enrichissement minimum (un rouleau cartonné + une feuille de papier essuie-tout), et la manipulation uniquement par des personnels expérimentés. Les animaux seront maintenus dans des conditions optimales d’hébergement, dans un environnement stabilisé en température (21°), hygrométrie (55%), luminosité (100 lux), et durée du cycle de lumière (12h/12h).
Devenir
Tous les animaux utilisés au cours de ce projet (120 animaux) seront mis à mort. Les tissus récupérés seront necessaires pour les futures analyses immunohistochimiques et en biologie moléculaire.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’inflammation et l’ischémie cérébrale. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 120 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude, et l’utilisation d’outils d’imagerie non invasive permettant de mesurer les lésions cérébrale et l’inflammation cérébrale permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux total : 60) a été évalué via un test d’analyse de puissance (α=0.05 ; β=0.8).
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce de référence comme d’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la thrombolyse, la neuroprotection et la réponse inflammatoire suite à un AVC ischémique. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour notre étude.
Modulation de la flore intestinale (microbiote) pour améliorer les réponses anti-cancéreuses de l’hôte
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 480 d'entre elles et modéré pour 1 440. Elles reçoivent des prébiotiques ou des probiotiques par gavage, une greffe de tumeur sous la peau ou une injection de cellules cancéreuses dans le sang, puis une immunothérapie et des prélèvements sanguins, pour tester si la modification du microbiote intestinal renforce les réponses anti-tumorales. Le porteur annonce des essais chez l'humain et des recommandations nutritionnelles dans un second temps. Il affirme que le rôle du microbiote "ne peut être étudié qu'in vivo" et qu'il n'existe "pas d'alternative à ce jour".
Objectifs
Le microbiote intestinal (flore intestinale) comprend l'ensemble des bactéries, champignons et virus contenus dans notre intestin. Il est montré que ces bactéries communiquent avec notre immunité. Les espèces bactériennes qui composent notre microbiote détermine la qualité de notre immunité, donc de nos défenses contre les infections, ou même les cancers. Ainsi certaines bactéries ont été identifiées comme bénéfiques pour la santé, et notamment pour notre immunité. On peut augmenter la présence de ces bactéries dans l'intestin pour améliorer notre immunité notamment via l'alimentation, en consommant des fibres alimentaires qui les nourrissent, c'est ce que l'on appel des prébiotiques. On peut aussi consommer des probiotiques, c'est à dire directement ces bonnes bactéries. Le but de ce projet est d'améliorer la composition du microbiote intestinal de souris soit par prébiotiques, soit par probiotiques dans le but d'augmenter les réponses anti-tumorales et ainsi prévenir l'apparition de cancers ou le développement de métastases ou enfin, d'améliorer la réponse à l'immunothérapie. Nous avons pour objectif de tester 10 prébiotiques et 10 probiotiques différents dans les 5 ans à venir.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mettre en évidence des propriétés immunostimulantes de composés alimentaires (fibres) et/ou de compléments alimentaires (probiotiques) qui pourraient être utiles dans un contexte de cancer. Les découvertes quien découlerons, permettrons d'évaluer dans un second temps ces composés chez l'Homme, à travers des essais cliniques. In fine, ce travail permettra de rationaliser des interventions nutritionnelles qui favoriserons la prévention des cancers dans la population générale, et permettront de favoriser la réponse aux immunothérapies et/ou prévenir le phénomène de métastases chez les patients atteints de cancer.
Procédures
Une partie des animaux sera nourrie avec un régime prébiotique administré dans l'eau de boisson ou de probiotiques administrés par gavage oral 5 fois par semaine durant 1 mois (1 minute / gavage). Une partie des animaux recevra une implantation tumorale par injection sous-cutanée (1 minute / souris sur souris vigile), ou une injection de cellules cancéreuses par voie intra-veineuse (5 minutes / souris sur souris vigile). Les prélèvements sanguins (2 minutes / souris) seront réalisés principalement en fin d'expérience (ou lors d'atteinte de point limite), sous anesthésie volatile, et sans réveil. Sinon, un prélèvement après 15 jours de régime enrichi pourra être effectué sous anesthésie volatile avec suivi de réveil. Ainsi les animaux auront au maximum 2 prélèvements sanguins, dont un sans réveil. Le trateiement par immunothérapie consistera à 6 injections maximum en intra péritonéale ou intraveineuse, sur souris vigiles.
Impact sur les animaux
Les animaux, hébergés en groupe sociaux dans un environnement enrichi adapté, seront abreuvés et nourris sans restriction. Le régime alimentaire n'induit aucune nuisance et représente un enrichissement en termes de bien-être nutritionnel. L’administration par gavage oral nécessite une habituation de l’animal soumis à un léger stress. Les animaux recevront jusqu'à 6 injections sans anesthésie induisant une contrainte de niveau léger. Les prélèvements sanguins seront tous réalisés sous anesthésie générale induisant une contrainte de niveau léger ou sans réveil. Enfin, la tumeur implantée pourra évoluer en taille (maladie au stade léger), et dans de rare cas nécroser (lésion de niveau modéré) représentant un point limite pour l’arrêt de la procédure expérimentale.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés, à la fin des expériences ou dès atteinte des points limites. Des prélèvements seront effectués pour des analyses immunologiques complémentaires.
Remplacement
Le rôle du microbiote (flore) intestinal ne peut être étudié qu'in vivo. En effet, les interactions hôte/microbes et notamment système immunitaire de l'hôte/microbes et les réponses anti-tumorales induites nécessitent une étude dans un organisme vivant. Il n'existe donc pas d'alternative à ce jour.
Réduction
Afin de tenir compte de la variabilité inter individuelle dans la réponse aux différents traitements, des groupes de 12 animaux seront constitués. Ainsi, malgré la variabilité, ce nombre d'animaux par groupe apportera une fiabilité au niveau statistique. Pour renforcer nos observations, et réduire au maximum le nombre d'animaux, nous prévoyons de réaliser une première expérience avec 6 animaux par groupe et de confirmer tout effet anti-tumoral observé (ou tendance encourageante) en dupliquant l'expérience afin d'obtenir au final 12 animaux par groupes en 2 expériences indépendantes, plutôt qu'en une seule avec des groupes de 12 animaux d'emblée. De plus, dans les procédure 2 et 3, nous testerons 2 conditions expérimentales en parallèle, lorsque nous disposerons de 2 composés en simultané, afin de mutualiser les groupes contrôles, et donc de réduire le nombre d'animaux contrôles utilisés.
Raffinement
Afin d'assurer le bien-être des animaux, les souris seront hébergées par cage de 6, avec environnement enrichi. Le régime alimentaire (fibres) sera administré dans l'eau de boisson ou par gavage, et les probiotiques (bactéries) seront administrées par gavage. L'injection sous-cutanée des cellules tumorales ou l'injection IP des immunothérapies n'induisent qu'une brève légère souffrance des animaux. . Toutefois, les animaux seront quotidiennement surveillés à la suite des implantations tumorales. Les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale à la fin de l'expérience ou dès lors qu'un point limite est atteint. L'euthanasie par dislocation cervicale se fera sous anesthésie à l'isoflurane (3 %) quand il y aura prélèvement sanguin terminal.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus pertinent pour mener ce genre d'étude. La manipulation de leur flore est acquise. De plus, les modèles tumoraux ainsi que les outils pour étudier les réponses immunes induites sont parfaitement développées pour ce modèle animal. Tous nos résultats précédents obtenus dans le cadre de cette thématique l'ont été avec ce même modèle murin. Les souris seront utilisées à partir de 6 semaines d'âge (livrées à 5 semaines + 1 semaine d'acclimatation). A ce stade, les souris sont sevrées et le système immunitaire est pleinement mature et permet donc son étude.
Étude des troubles du contrôle de l’impulsivité dans un paradigme d’aversion sexuelle conditionnée dans un modèle évolutif précoce de la maladie de parkinson chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
128 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mâles subissent une neurochirurgie qui installe un modèle de la maladie de Parkinson, des injections quotidiennes pendant quarante-six jours et huit injections d'un composé provoquant "malaise gastrique et dégoût" pour conditionner une aversion sexuelle, avant d'être tués pour analyse du cerveau. Les femelles subissent l'ablation des ovaires et la pose d'un implant hormonal, puis seront réutilisées dans des formations à l'expérimentation animale. Le porteur décrit des tests d'activité motrice et sexuelle et affirme qu'"il n'existe pas de méthodes alternatives" pour évaluer un comportement impulsif.
Objectifs
Les traitements symptomatiques de la maladie de Parkinson sont associés à plusieurs complications motrices et non motrices. Les troubles du contrôle des impulsions sont les effets secondaires neuropsychiatriques les plus courants, affectant plus de 20 % des patients, principalement sous traitement médicamenteux. Les troubles du contrôle des impulsions sont des addictions comportementales telles que l'hypersexualité, l'alimentation compulsive, les achats compulsifs ou le jeu pathologique qui entraînent de graves conséquences familiales, des coûts sociaux, économiques et juridiques qui affectent un grand nombre de patients dans le monde entier. L'hypersexualité est l'un des troubles du contrôle des impulsions les plus fréquents développés par les patients. Ce projet est basé sur l’hypothèse selon laquelle les troubles du contrôle des impulsions sont associés à des signatures moléculaires spécifiques qui peuvent être récupérées sous la forme de biomarqueurs dans le sang. Nous supposons en particulier que des profils spécifiques de certains marqueurs cellulaires permettront de distinguer des animaux parkinsoniens atteints de troubles de l'hypersexualité, troubles que l'on peut reproduire facilement expérimentalement chez le rat mâle.
Bénéfices attendus
Le projet vise à fournir une compréhension de la physiopathologie des troubles du comportement impulsif par le développement d’un modèle préclinique innovant, permettant l'identification des mécanismes moléculaires et des biomarqueurs grâce à des méthodes de dépistage spécifiques. Ce projet conduira à une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à la réponse pharmacologique et aux effets secondaires de la maladie de Parkinson et permettra l'identification de biomarqueurs spécifiques aux troubles du comportement impulsif qui devraient aider, à plus long terme, à identifier des sous-groupes critiques de patients.
Procédures
Les animaux mâles subissent une neurochirurgie, pour induire le modèle animal de la maladie de Parkinson, d'une durée de 45 minutes, anesthésie incluse. Ils subissent 3 prélèvement sanguins n’excédant pas 1 mL, chacune espacés de plus de 6 semaines, n’excédant pas plus de 10 minutes, anesthésie incluse. Ils subissent des injections quotidiennes (pendant 46 jours) dans la cavité abdominale d’un antiparkinsonien sur animal vigile, chacune n’excédant pas 10 secondes. Enfin, ils subissent 8 injections (chacune n’excédant pas 10 secondes sur animal vigile) dans l'abdomen (une tous les deux jours) d’un composé qui provoque malaise gastrique et dégoût pendant environ une heures. Les rats males seront soumis à 3 reprises à un test d’activité motrice s’établissant sur 4 sessions (2 par jour sur 2 jours consécutifs) d’évaluation de leurs capacités à avancer leurs pattes antérieures. Chaque session dure moins de 5 minutes. Les animaux femelles subissent une chirurgie abdominale et une chirurgie sous cutanée, les deux étant consécutives et l’ensemble n’excédant pas 40 minutes, anesthésie incluse. Elles subissent par la suite 12 injections sous-cutanées d’un composé qui favorisent les processus de la grossesse, espacées chacune d’au moins 48h. Mâles et femelles, seront soumis à 12 sessions comportementales permettant d’évaluer l’activité sexuelle des mâles et n’excédant pas une heure chacune.
Impact sur les animaux
Une souffrance légère liée à la répétition des injections est à envisager ainsi que les risques de formation d’un hématome, que ce soit chez les femelles comme chez les mâles. De plus les injections qui provoque chez lesmâles malaise gastrique et dégoût sont également susceptibles d’induire un état d’angoisse modérée de par l’induction de la situation conflictuelle dans lequel elles placent l’animal. Lors de la neurochirurgie (rats mâles) et de la chirurgie abdominale (rats femelles) et d’implantation des implants d’estradiol (rats femelles), les nuisances ou effets indésirables modérés pourront concerner la douleur associée aux points d’incision et aux points de contention au niveau des oreilles, et des douleurs post-opératoires. En post-chirurgical, il n’est pas à craindre de souffrance plus que modérée au cours du processus neurodégénératif progressif induit par un virus codant pour une toxine avant 9 semaines d’incubation, les animaux restant tout à fait capable de s’hydrater et de se nourrir. La littérature rapporte des déficits moteurs pouvant s’aggraver au-delà de 9 semaines, date à laquelle seront initiées les injections quotidiennes d'une substance qui bloquent l’apparition de ces déficits. Pour les animaux traités avec le diluant des points limites seront définis pour que les déficits moteurs n’induisent pas de souffrance. Enfin, une souffrance légère pourra être liée aux échantillonnages sanguins réalisés par ponction de la veine de la queue à 3 reprises, pouvant induire chez l’animal stress et hémorragie.
Devenir
Les animaux mâles seront mis à mort pour effectuer des analyses des tissus cérébraux. Les femelles seront réutilisées dans le cadre de formations à l’expérimentation animale ou autre formation d’enseignement, en concertation avec le vétérinaire référent.
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, qui permettront l’évaluation d’un comportement impulsif. De plus, notre approche méthodologique nous permet d’avoir accès à l’activité de différentes structures dans un réseau complexe au sein du cerveau. Les activités transcriptionnelles (activités concernant le passage de l'information contenue dans les cellules sous forme d'ADN en ARN) des neurones au sein des différentes structures cérébrales étudiées sont influencées aussi bien par les structures auxquelles ils appartiennent que par les interactions entre ces différentes structures et ne peuvent être modélisées ni par des approche ex-vivo, ni des approches mathématiques.
Réduction
Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe afin de ne pas compromettre la validité́ des expériences. Ce nombre a été estimé à l'aide d'une d'approche statistique. Pour une question d’organisation et de gestion des expérimentations, l’ensemble des animaux sera traité au cours de deux sessions distinctes pour n’avoir à suivre simultanément qu'un nombre restreint de mâles et de femelles. Ainsi, à l’issue de la première session, si les résultats sont suffisants pour mettre en évidence des différences significative des différents paramètres étudiés, il ne sera pas nécessaire de faire appel à une seconde session.
Raffinement
Les animaux sont hébergés pendant une semaine à leur arrivée pendant laquelle ils sont manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations, afin d’atténuer le stress pouvant être lié aux manipulations et aux contentions. Les prélèvements sanguins sont réalisés sur les rats mâles endormis puis maintenus sous anesthésie gazeuse permettant un recueil de sang par une des veines latérales de la queue avec des aiguille- fines. Chaque recueil se fait en un point différent du précédent pour limiter les risques lésionnels. Les neurochirurgies chez les rats mâles sont réalisées sous anesthésie générale, les yeux sont protégés de la dessication et les points de contentions et d’incisions sont préalablement analgésiés. La température est maintenue constante. En post-opératoire les animaux sont placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Les douleurs post-opératoires sont prévenues par injection d’un antalgique. A leur réveil, les animaux sont retournés dans leur cage avec leurs congénères. Le retrait des ovaires chez les femelles se fait sous anesthésie générale et sous analgésie (température maintenue constante et yeux également protégés de la dessication). Puis, après fermeture des incisions chirurgicales, afin de ne pas avoir à réendormir les animaux, ceux-ci reçoivent un implant hormonal sous-cutané placé au niveau du cou par une incision restreinte de 1 cm de long. Après fermeture des incisions chirurgicales, en post-opératoire, les animaux sont placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil puis remis avec leurs congénères et reçoivent 24h après une nouvelle injection d’antalgique. Les injections répétées - chez les mâles comme chez les femelles - sont réalisées avec des seringues microfines avec changement de seringue entre animaux et changement des points d’entrée des aiguilles pour atténuer les risques de douleur et de formation d’hématomes. Le projet implique la mise en place d’un état pathologique chez le rongeur avec de la chirurgie de classe modérée n’affectant que très progressivement l’autonomie des rats à s’hydrater et se nourrir et donc une faible perte de poids. L’avantage de ce modèle par injection virale est que ces déficits moteurs bilatéraux restent modérés tout au long du protocole. Le suivi quotidien et les pesées bihebdomadaires des animaux permettent de veiller à ce que les animaux ne souffrent pas et de mettre en place des stratégies de soin et des points limites adaptés.
Choix des espèces
Le rat est une espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau dee certaines structures cérébrales sur lesquelles portent cette étude, tant du point de vue anatomique que physiologique. Les registres comportementaux explorés (motricité, sexualité) sont facilement appréhendables dans cette espèce. De plus le type de construction virale utilisé dans ce projet permettant d'induire progressivement des stades précoces de la maladie de Parkinson chez le rat est également bien caractérisé dans cette espèce et les troubles du contrôle de l’impulsivité semblent s’y exprimer de façon plus prépondérante que dans d’autres types de modèles lésionnels. Les animaux utilisés sont des animaux adultes de 8 semaines. Ce stade de développement est justifié, s’agissant d’étude portant sur le comportement sexuel des animaux, par la nécessité d’avoir des animaux présentant un développement des phases précoces de la maladie de Parkinson et ayant atteint leur pleine maturité sexuelle.
Evaluation d’une solution destinée à la conservation du greffon cardiaque avec un modèle de cœur isolé perfusé de rat.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Anesthésie générale, chirurgie de cinq minutes, injection d'un anticoagulant dans une veine, puis mise à mort dans les cinq minutes : 260 rats Wistar vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Dans la seconde partie du projet, ils reçoivent aussi un anesthésique et un curare par voie veineuse, puis sont tués dans la demi-heure. Sur leur cœur prélevé, l'équipe teste une solution de conservation des greffons cardiaques qu'elle a inventée et brevetée, et le premier objectif listé inclut l'apprentissage, avec la "validation des techniques de prélèvement-conservation-réanimation des cœurs". Tous sont mis à mort pour ce prélèvement, et les dates des séances sont communiquées aux autres porteurs de projets du site qui voudraient prélever d'autres tissus sur les corps.
Objectifs
L’objectif du projet est l’évaluation d’une nouvelle solution de préservation destinée au greffon cardiaque ainsi que la détermination des conditions optimales de survie du greffon cardiaque. CONTEXTE La transplantation d’organes, en particulier cardiaque, est face à une crise récurrente : la pénurie de greffons. Le manque crucial d'organes est en effet responsable de la première cause de mortalité en transplantation cardiaque. Afin d'optimiser le nombre de prélèvements et d'assurer une protection optimale des greffons cardiaques, notre équipe a inventé et breveté une nouvelle solution de conservation, permettant d’améliorer la préservation du cœur. OBJECTIF Notre objectif général est d'optimiser la survie du greffon cardiaque grâce à cette nouvelle solution. Les études expérimentales proposées seront menées chez le rat. Nos objectifs opérationnels sont les suivants : 1- Apprentissage et validation des techniques de prélèvement-conservation-réanimation des cœurs. 2- Comparaison de la nouvelle solution de conservation versus les autres solutions utilisées en clinique. 3- Détermination de la température optimale de conservation des greffons cardiaques. 4- Optimisation de la composition de la solution retenue en perfusion, en particulier par l’ajout d’un nouveau transporteur d'oxygène. 5- Élaboration du cycle optimal de perfusion. 6- Évaluation de l’efficacité des paramètres retenus, dans le cas des greffons prélevés à cœur arrêté.
Bénéfices attendus
Partout dans le monde, la transplantation d’organes fait face à une pénurie de greffons qui croît constamment. Pour optimiser la protection de ces greffons, disposer d’une solution de préservation adaptée et protectrice est essentiel car à l’heure actuelle, différentes solutions (expérimentales et cliniques) ont été identifiées pour la conservation des greffons mais aucune ne fait le consensus. En utilisant une méthodologie inédite notre équipe a conçu une nouvelle solution de conservation. L’objectif général du projet est donc d’évaluer et d’optimiser l’utilisation de cette solution en vue d’une future utilisation clinique. Nous utiliserons le rat comme modèle animal pour réaliser les études précliniques.
Procédures
Première partie du projet : Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d’une durée de 5 minutes, sous anesthésie générale et couverture analgésique adéquates, suivi d’une injection intraveineuse d’une molécule anticoagulante (moins d’1 minute). L’animal est mis à mort dans les 5 minutes suivant l’injection, sous anesthésie (durée totale de l’anesthésie : 30 minutes maximum). Deuxième partie du projet : Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d’une durée de 5 minutes, sous anesthésie générale et couverture analgésique adéquates, suivie d’une injection intraveineuse de molécules anticoagulante, anesthésiante et curarisante (moins de 3 minutes). L’animal est mis à mort dans les 30 minutes suivant la dernière injection, sous anesthésie (durée totale de l’anesthésie : 45 minutes maximum).
Impact sur les animaux
Le protocole expérimental consiste à placer l’animal sous anesthésie générale, complétée par des antalgiques puis réaliser une chirurgie thoracique permettant le prélèvement du cœur. Il s’agit donc de procédures sans réveil.
Devenir
Ce projet consiste à étudier les paramètres de conservation de greffons cardiaques. L’ensemble des animaux sont donc mis à mort pour permettre le prélèvement du cœur (greffon cardiaque).
Remplacement
La nouvelle solution de conservation a déjà été testé sur modèles cellulaires et a donné de bons résultats. Toutefois, les protocoles de conservation sur cellules restent très insuffisants pour représenter la complexité des phénomènes physiopathologiques survenant au niveau de l’organisme entier et du greffon cardiaque. L’évaluation des effets protecteurs de la nouvelle solution nécessite ainsi une expérimentation impliquant l’animal. L’utilisation du modèle animal adéquat, permet de mimer les situations cliniques (conservation du greffon suivie de transplantation), et conditionne la validité de l’évaluation de la nouvelle solution.
Réduction
Sur la base de notre expérience passée, nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux utilisés par groupe. Par ailleurs, les animaux de la première étape du projet seront intégrés aux groupes contrôles du projet. Le projet est organisé par étapes de validation successives et seuls les paramètres optimaux sont appliqués d’une étape à l’autre. Les dates et nature des expérimentations sont communiquées aux autres porteurs de projets locaux (par le biais de la cellule bien-être animale), potentiellement intéressés pour prélever post-mortem d’autres tissus sur l’animal.
Raffinement
Les animaux seront habitués à la manipulation afin de diminuer le stress le jour de l’expérimentation.
Choix des espèces
Le rat (souche « Wistar ») est utilisé en première intention car c’est sur cette espèce qu’ont été décrits les résultats historiques de fonction de cœur isolés perfusés. De plus, nos méthodes d’évaluation fonctionnelles sont bien validées entre nos mains chez le rat et pour cette souche en particulier. Nous utiliserons de jeunes adultes, âgés de quelques mois (poids compris entre 250-350g). Cela correspond, en clinique humaine, aux patients jeunes et jeunes adultes éligibles qui sont prélevés lors des prélèvements d’organes chez l’homme.
Etude pharmacocinétique en modéle murin de 10 anticorps monoclonaux
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection dans le sinus veineux situé derrière l'œil sous anesthésie, puis subit jusqu'à neuf prélèvements de sang par la joue sur deux à trois semaines, pour comparer des anticorps produits à partir de microalgues à des anticorps classiques. Le porteur présente l'enjeu comme économique, réduire le coût de production des anticorps, et annonce le bénéfice pour les patients à terme. Il affirme qu'après vérification in vitro il était "nécessaire" d'étudier ces anticorps dans un organisme au système immunitaire mature.
Objectifs
L’industrie pharmaceutique mise de plus en plus sur les anticorps thérapeutiques pour satisfaire les besoins de santé, encore nombreux. Cependant, l’industrie française a pris du retard dans ce domaine. Malgré une consommation importante de médicaments par la population française, seuls trois anticorps thérapeutiques sont produits en France (omalizumab, canakinumab, sécukinumab). Avec la prévalence croissante des maladies chroniques comme les cancers, les maladies autoimmunes et infectieuses telles que la COVID-19, le besoin en médicaments de type anticorps s’accroit considérablement. Ces médicaments sont actuellement produits en utilisant des cellules de mammifères comme usines cellulaires. Le coût de production de ces anticorps est très élevé. En conséquence, il devient indispensable de développer des systèmes alternatifs de production d’anticorps qui permettent de décroître leurs coûts de production et ainsi de les rendre plus accessibles. Récemment, les microalgues ont été utilisées avec succès pour produire des anticorps fonctionnels dirigés contre des virus comme le virus de l’Hépatite B ou le virus de Marburg. Nous produisons actuellement des bio-similaires d’anticorps anti-cancéreux. L'objectif du projet est donc de comparer la pharmacocinétique de ces anticorps produits à partir de microalgues par rapport aux anticorps génériques.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude, si ils valident le système alternatif de production d'Ac à partir de microalgues va permettre de diminuer considérablement leur coût de production et ainsi les rendre plus accessibles.
Procédures
Chaque souris recevra à J0 une injection intraveineuse unique via le sinus rétro-orbitale de 5 mg/kg d’anticorps dans un volume total de 200µl de PBS. Cette injection sera pratiquée sous anesthésie générale. Chaque souris aura des prélèvements sanguins, un total de 9 sur 2 à 3 semaines. Prélèvements de sang via les veines submandibulaires. L’ensemble des prélèvements sera effectué sous anesthésie générale à l’isoflurane 2.5% après une induction à l’isoflurane 5% dans l’air. Le volume de chaque prélèvement sera de 50µl récupéré dans des capillaires calibrés. Après chaque ponction une pommade antiseptique cicatrisante sera appliquée (Biseptine Cica gel).
Impact sur les animaux
Les gestes expérimentaux sur les animaux se limitent à une injection intraveineuse et des prélèvements sanguins qui ne devraient pas induire de nuisances ou effets indésirables particuliers compte tenu des mesures préventives prises et des précautions apportées à leur mise en oeuvre.
Devenir
Tous les animaux de l'étude seront mis à mort.
Remplacement
Les anticorps sont actuellement produits en utilisant des cellules de mammifères comme usines cellulaires. Récemment, les microalgues ont été utilisées avec succès pour produire des anticorps fonctionnels, malgré une structure protéique identique certaines modifications post-traductionnelles peuvent intervenir et par conséquent modifier l'affinité des parties constantes pour les différents récepteurs aux FcGamma ou son immunogénicité. Après vérification in-vitro de ces différentes interactions anticorps récepteurs il était nécessaire d’étudier leur comportement dans un organisme vivant avec un système immunitaire mature et fonctionnel.
Réduction
Au-delà de l’utilisation du nombre minimum d’animaux pour obtenir une modélisation correcte de la pharmacocinétique de chaque anticorps, cette étude à terme permettra de remplacer les milieux de culture riches en sérum de veaux foetal par de l’eau de mer pour la production de ces anticorps. Le problème éthique majeur du sérum de veau foetal vient du fait qu’il provient du sang de foetus de vache, prélevé au moment de l'abattage de vaches gestantes. Le foetus est retiré du ventre de sa mère, et la totalité de son sang est prélevé par ponction cardiaque, le plus souvent sans anesthésie afin de garantir la qualité de l’échantillon. Ce nouveau mode de production permettra donc à court et à long terme moins d’utilisation de sérum de veaux foetal et donc d’animaux donneurs.
Raffinement
L’injection intraveineuse ainsi que les différents prélèvements seront pratiqués sous anesthésie générale à l’isoflurane. Afin de limiter le nombre de prélèvement sur chaque souris tout en garantissant un suivi sérologique optimal pour l’étude pharmacocinétique, les 16 souris seront divisées en 4 groupe de 4. De cette façon le nombre de prélèvements par individu sera divisé par 4, de plus les prélèvements seront alternés coté droit et gauche de la mandibule. L’innocuité de ces anticorps devant être totale, des points limites extrêmement précoces basés sur le mouse grimace scale et le poids seront appliqués :
Choix des espèces
La souris est un très bon modèle qui permet d'évaluer après modélisation le profil pharmacocinétique d'un anticorps monoclonal. La demi vie d'un anticorps et sa bio distribution au sein des différents tissus d'un organisme vivant sont dûs à un récepteur aux Fc des immunoglobulines G, le FcRn. Chez la souris il est totalement fonctionnel pour les IgG humaines ce qui permet d'évaluer la demi vie et la courbe de distribution par dosage cinétique des concentrations résiduelles dans le sang (volume périphérique) d'un anticorps choisi. Ces anticorps sont actuellement produits en utilisant des cellules de mammifères comme usines cellulaires. Récemment, les microalgues ont été utilisées avec succès pour produire des anticorps fonctionnels, malgré une structure protéique identique certaines modifications post-traductionnelles peuvent intervenir et par conséquent modifier l'affinité des parties constantes pour les différents récepteurs aux FcGamma. Cette étude chez la souris permettra donc d'évaluer ces modifications potentielles. Les souris seront utilisées à l’âge de 7 semaines pour que leur système immunitaire soit mature. Elles arriveront dans notre animalerie à l’âge de 6 semaines et seront acclimatées pendant 7 jours période nécessaire au développement d'un microbiote dépendant de notre animalerie.
Etude des effets de l’absence de PiT2 dans les tissus adipeux chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le protocole prévoit l'ablation d'une phalange sur les pattes arrière des souriceaux pour les identifier, geste que le porteur qualifie lui-même d'acte douloureux, puis des pesées hebdomadaires jusqu'à seize semaines avant la mise à mort pour prélever les tissus adipeux. Le projet croise deux lignées génétiquement modifiées pour supprimer une protéine, PiT2, dans le gras, afin d'en comprendre le rôle dans l'obésité. Le porteur affirme que les cultures cellulaires ne reproduisent jamais les anomalies observées chez l'animal vivant et conclut que l'étude chez la souris est "nécessaire".
Objectifs
la protéine Slc20a2/PiT2 est un transporteur de phosphate présent à la surface de la plupart des cellules de mammifères. Nos travaux montrent qu’elle joue un rôle important pour la qualité et la solidité osseuse sans pour autant agir directement sur les cellules responsables de la minéralisation du squelette. Nos résultats suggèrent que des défauts de communication entre le squelette et d'autres organes, comme les tissus adipeux, pourraient avoir un impact sur l’intégrité du tissu squelettique. Nous savons déjà que l'absence de la protéine SLC20A2/PiT2 dans tout l'organisme aboutit à une diminution de la masse des tissus adipeux chez la souris. Cette diminution est associée à une augmentation de la dépense énergétique. Nous savons également que ces souris mutantes résistent à la prise de poids et à l'accumulation de gras dans le foie lorsqu'elles sont soumises à un régime riche en gras. Ces résultats, non publiés, laissent penser que PiT2 puisse jouer un rôle dans la régulation des tissus adipeux. L'objectif de ce projet est de générer une nouvelle souris mutante chez laquelle le gène Slc20a2 sera invalidé seulement dans les tissus adipeux. Grâce à ce modèle, nous pourrons comparer les effets de l'absence de SLC20A2/PiT2 dans les tissus adipeux à ceux observés chez les souris invalidées pour Slc20a2 dans tous les tissus de l'organisme.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires de PiT2 dans la régulation des tissus adipeux, et permettra de proposer cette protéine comme cible potentielle pour de nouvelles stratégies thérapeutiques de maladies métaboliques, comme l'obésité.
Procédures
L'identification par ablation de phalanges des souriceaux 10 jours postpartum est un acte douloureux. Nous limiterons l'ablation à la phalange la plus distale du doigt (pouce non concerné, limité à une seule phalange par patte) et seulement sur les pattes postérieures pour ne pas compromettre la préhension fine par les pattes antérieures (pour manger, se toiletter, grimper). La cicatrisation de la phalange est très rapide chez le souriceau (maximum 24h). Les souris seront pesées toutes les semaines jusqu'à 16 semaines.
Impact sur les animaux
Les souris chez lesquelle le gène Slc20a2 est invalidé dans tous les tissus de l'organisme (Slc20a2-/-) n'ont pas de phénotype dommageable. Elles présentent une diminution du volume des tissus adipeux sans aller jusqu'à la lipodystrophie et sans anomalie de tolérance au glucose et à l'insuline, et une diminution de la masse osseuse sans observation de fractures ou d'anomalies de la locomotion. Les souris mutantes AdipoQ-Cre/+;Slc20a2lox/lox de cette procédure ne seront pas différentes des souris contrôles ou présenteront le même phénotype adipeux que les souris Slc20a2-/- décrites ci-dessus. Il n'y aura donc pas de phénotype dommageable lié à la perte de Slc20a2 dans les tissus adipeux.
Devenir
La mise à mort des animaux est nécessaire pour analyser les conséquences de l'absence de PiT2 sur les tissus adipeux.
Remplacement
Ce projet concerne l'analyse du phénotype des tissus adipeux dans un organisme dépourvu de la protéine Slc20a2/PiT2 spécifiquement dans les tissus adipeux. Pour cela, nous croisons deux lignées de souris génétiquement modifiées : les souris Slc20a2lox et les souris AdipoQ-Cre/+ qui expriment une protéine permettant l'invalidation de Slc20a2 spécifiquement dans les tissus adipeux. Nos travaux antérieurs montrent que l'invalidation de Slc20a2 sur des cellules en culture ne reproduise jamais les anomalies que nous observons chez l'animal entier. Il est très probable que les effets de l'absence de PiT2 dans l'organisme entier résultent d'anomalies de communication entre les organes. Les études chez l'animal sont donc nécessaires pour identifier le rôles de la protéines PiT2 dans les tissus d'intérêt.
Réduction
Nous savons déjà que l'absence de PiT2 dans tout l'organisme aboutit à une réduction de la masse des tissus adipeux chez les mâles et les femelles. Cette étude sera donc réalisée chez les animaux mutants des deux sexes, ce qui permet de générer un nombre minimum de portées. Grâce à nos travaux antérieurs, nous savons que 24 animaux par groupe (12 mâles et 12 femelles) sont suffisants pour mettre en évidence une diminution de la masse des tissus adipeux par rapport aux souris contrôles. Si aucune tendance n'est observée entre les souris mutantes et les souris contrôles avec n=12 animaux par groupe, nous ne poursuivrons pas les expérimentations.
Raffinement
La gestion du bien-être animal sera assurée par un habitat optimisé, en groupes de 3 à 5 individus, avec des objets de stimulation dans la cage et par une surveillance hebdomadaire
Choix des espèces
Les animaux géniteurs seront utilisés au moment de leur fertilité (8 semaines). Les deux lots expérimentaux seront utilisés à partir de 10 jours (identification et génotypage) jusqu'au moment des prélèvements terminaux (16 semaines). Nous savons que les souris totalement invalidées pour Slc20a2 sont plus petites et plus légères dès la naissance. Nous savons que la masse des tissus adipeux est inférieure à celle des souris contrôles dès le plus jeune âge. Le phénotype est parfaitement installé chez la souris adulte à 16 semaines. Pour comparer le phénotype de nos souris mutantes AdipoQ-Cre/+;Slc20a2lox/lox avec celui des souris totalement invalidées pour Slc20a2, nous mesurerons le poids des souris à partir de 15 jours après la naissance jusqu'à l'âge adulte (16 semaines).
Evaluation d’inhibiteurs de eIF4A en combinaison avec des thérapies ciblées anti-cancéreuses
- Recherche appliquée
- Cancers
6 098 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses sous la peau, des injections dans le ventre, des médicaments par gavage et des prélèvements de sang, pour tester huit inhibiteurs de la protéine eIF4A censés lever la résistance des mélanomes et cancers du poumon aux thérapies ciblées. Le porteur situe l'essai clinique et le bénéfice pour les patients dans un temps ultérieur, l'objectif immédiat restant de mesurer l'effet des composés sur la tumeur. Il affirme qu'aucun modèle in vitro n'est assez robuste et que le recours à un modèle animal "comparable au corps humain" est "indispensable".
Objectifs
Le mélanome est la première cause de décès par cancer des jeunes adultes. Les thérapies ciblées actuelles augmentent la durée de vie des patients porteurs d’une mutation sur le gène BRAF mais n’empêchent pas l’apparition d’un phénomène de résistance au traitement dans la grande majorité des cas. Nos récentes études ont montré que l’inhibition de la protéine eIF4A impliquée dans la traduction de l’ARN en protéine entraine une levée de cette résistance in-vitro. Ces découvertes encourageantes ont initié l’étude de l’utilisation d’inhibiteurs de la protéine eIF4A en combinaison avec les thérapies ciblées usuelles. Actuellement plusieurs dizaines de candidats sont en cours de caractérisation in-vitro afin de sélectionner les 8 inhibiteurs les plus prometteurs qu’il est indispensable de tester in vivo. L’objectif de ce projet est de démontrer l'efficacité in vivo de 8 inhibiteurs eIF4A, dans différents modèles de mélanome et de cancer du poumon qui est également très répandu. Ces modèles ont été choisis parce qu’ils modélisent plusieurs types de thérapies ciblées usuellement utilisées en cancérologie et qu’ils présentent différents degrés de sensibilité à celles-ci nous permettant ainsi de mimer différentes situations cliniques. Les souris recevront une greffe sous-cutanée de cellules cancéreuses, permettant d’obtenir un modèle rapide et reproductible, avec une mesure de la croissance tumorale directe et des métastases rares.
Bénéfices attendus
A l’heure actuelle aucun inhibiteur eIF4A n’a reçu d’Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) pour le traitement des mélanomes et du cancer du poumon. Cela serait une avancée considérable dans la prise en charge des patients avec le recul du risque de rechute qui est malheureusement prévisible dans la plus grande majorité des cas. Les expériences in-vitro réalisées sur ces inhibiteurs présentent des conclusions très prometteuses lors de la combinaison avec une thérapie ciblée sur le phénomène de résistance. L’objectif par la suite sera de mettre en place un essai clinique dès qu’un inhibiteur eIF4A aura fait ses preuves dans le modèle animal afin de permettre aux patients d’en bénéficier dès que possible.
Procédures
Greffes de tumeurs en sous-cutanée sous anesthésie générale (durée 15 minutes). Injections en intrapéritonéale (durée 10 minutes). Administration de médicaments par gavage (durée 1 minute). Prélèvements de sang sous anesthésie générale, durée 2 minutes.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à la présence de tumeurs unique sur le flanc en sous-cutanée.
Devenir
Mise à mort pour prélèvements post-mortems d'organes et de tissus aux fins d'analyses.
Remplacement
Il n'existe, à ce jour, pas de modèle in vitro modélisant suffisamment robuste pour tester ces synergies ni les interactions entre tumeur et système immunitaire. La variété et la complexité des cancers, ainsi que leur incidence élevée, rendent l’utilisation de modèles animaux cruciale pour comprendre comment le cancer se développe et pour améliorer les stratégies préventives, de diagnostiques et thérapeutiques. L'utilisation de modèles animaux comparables par de nombreux aspects au corps humain est donc indispensable pour l'évaluation des nouvelles approches thérapeutiques.
Réduction
Des études préliminaires sur cultures cellulaires ont permis d’affiner les tests d’optimisation et de cibler les analyses à effectuer et ainsi réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de résultats statistiques significatifs. Ainsi, le nombre d’animaux a été défini pour utiliser l’effectif minimal d’animaux possible. Des études antérieures conduites dans les mêmes modèles d'étude et avec des cibles thérapeutiques différentes ont montré que 10 animaux par groupe sont nécessaires et suffisants pour obtenir des effets significatifs sur la croissance tumorale par rapport à des souris contrôle non traitées (procédures 3 et 4). De plus, les résultats de la procédure 3 nous permettront de réduire le nombre d'inhibiteurs à tester aux 5 les plus efficaces dans les modèles immunodéficients. La procédure 1 étant une étape préliminaire pour vérifier l’absence de toxicité in vivo, 3 animaux par groupe seront suffisants. La procédure 2 étant une étape d’optimisation, elle nécessitera également un nombre réduit de souris à savoir 3 animaux par groupe pour déterminer la dose et l’intervalle optimaux. Le nombre d'animaux indiqué est un nombre maximal qui pourra être réduit si le nombre de composés à tester diminue pour des raisons de toxicité ou autre raison.
Raffinement
Les animaux seront surveillés tous les jours lors des procédures qui sont raffinées par l’établissement de points limites précoces, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. De plus, des médications appropriées (anesthésiques et analgésiques) seront utilisées lors des greffes pour réduire la douleur et le stress de l’animal. La présence de souffrance sera recherchée en utilisant les critères habituels (état général, sous-alimentation, état du pelage, prostration). Les souris seront également surveillées quotidiennement afin de déceler le plus rapidement possible l’apparition de points limites précoces. Trois fois par semaine, les animaux seront pesés et les tumeurs mesurées.
Choix des espèces
Le génome de la souris a été séquencé et de nombreux outils ont été développés pour étudier ce modèle. De plus, on observe une croissance tumorale rapide chez ce modèle et son poids permet d’utiliser des doses de produits moins importantes. La souris est donc le modèle de choix pour l'étude des cancers. Le projet nécessite des souris adultes (5-8 semaines) sans plus de contraintes sur l’âge. Ceci se justifie par l’âge de la population humaine touchée par le mélanome et le cancer du poumon et ciblée par les éventuels traitements.
Etude du rôle du récepteur aux endocannabinoïdes mitochondrial (mtCB1) dans la balance énergétique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un régime gras et sucré, une chirurgie du cerveau sous anesthésie, des injections sous-cutanées, dans le ventre et directement dans le cerveau, des prélèvements sanguins sur animal éveillé et des jeûnes de 6 à 16 heures, pour étudier le rôle d'un récepteur dans la régulation du poids. Le porteur renvoie au long terme les retombées annoncées, de nouveaux traitements contre l'obésité et le diabète. Il affirme qu'il est "nécessaire" d'étudier un "organisme vivant intègre" que ni les cultures cellulaires ni aucun modèle informatique ne pourraient remplacer.
Objectifs
Le système endocannabinoïde représente une cible thérapeutique potentielle pour combattre l’obésité et le diabète de par sa capacité à réguler la balance énergétique et le métabolisme glucidique. Le récepteur aux cannabinoïdes CB1, qui fait partie de ce système, est présent dans plusieurs organes impliqués dans le métabolisme énergétique et glucidique. Il est notamment présent dans certains neurones du cerveau et dans certaines cellules pancréatiques. Ce récepteur a différentes localisations subcellulaires (à la surface ou à l'intérieur de la cellule). Ces cellules sont aussi très sensibles aux changements d’alimentation et participent activement à la régulation du métabolisme pour maintenir à terme un poids et une glycémie stable. Une étude récente suggère un rôle d'un sous-type de récepteur CB1 dans la modulation de la fonction des neurones et des cellules pancréatiques. Notre objectif général est de comprendre le rôle de ce récepteur CB1 dans la balance énergétique et le métabolisme glucidique. Nous combinerons des approches pharmacologiques, comportementales, métaboliques, moléculaires et neuro-anatomiques.
Bénéfices attendus
Nous espérons obtenir des informations sur comment l'organisme répond à la surcharge calorique, ainsi que de trouver de potentielles cibles thérapeutiques. Les bénéfices attendus à long-terme sont de permettre l'élaboration de nouveaux traitements pour l’obésité et le diabète.
Procédures
- Changement de régime alimentaire : le nouveau régime est plus gras et plus sucré. Il est palatable pour les animaux mais induit une obésité à long-terme. La consommation de ce régime durera entre une et 12 semaines. - Tests métaboliques avec prélèvements sanguins sur animaux vigiles : le suivi de la glycémie implique que les animaux soient non anesthésiés. - Chirurgie stéréotaxique (= cérébrale) et vasculaire, sous anesthésie générale, avec protocole d'analgésie post-chirurgicale. - Injections sous-cutanées, intra-péritonéales et intra-cérébro-ventriculaires : cela nécessite de prendre les animaux en contention pendant quelques secondes. - Jeune de 6h ou 16h
Impact sur les animaux
1. Stress induit par l’isolement en cage individuelle : ceci ne sera réalisé uniquement lorsque la prise alimentaire individuelle est nécessaire. 2. Stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle. Ce test nécessite de placer l’animal dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. 3. Prise de poids consécutive au régime gras HFD. La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser 200% du poids initial. 4. Perte de poids consécutive au jeun (6h ou 16h). La perte de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser -10 à 15% du poids mesuré le jour précédent. 5. Perte de poids/appétit post-opératoire. La peau du scalp et le périoste devant être incisés, une douleur post-opératoire est attendue. La perte de poids ne devrait pas durer plus de 3 jours (basée sur nos études antérieures).
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour faire des analyses moléculaires.
Remplacement
Le but de notre activité de recherche est de comprendre les bases biologiques de la régulation de la balance énergétique et les mécanismes physiopathologiques menant à l’obésité. Lors d’un déséquilibre énergétique, plusieurs structures cérébrales entrent en jeu et communiquent, non seulement entre elles, mais aussi avec les organes périphériques. Il est donc nécessaire d’étudier un organisme vivant intègre, qui ne peut être remplacé par des techniques in vitro. Toutefois, nous réaliserons des tests pharmacologiques in vitro sur îlots pancréatiques en culture, ce qui limitera le nombre d’animaux. Cependant, le niveau de complexité dans une telle étude est si important qu’aucun modèle informatique n’existe à l’heure actuelle pour remplacer l’animal, d’autant que de nombreux mécanismes biologiques contrôlant la balance énergétique restent inconnus. Enfin, les modèles génétiques dont nous avons besoin pour tester notre hypothèse sont largement développés chez la souris.
Réduction
Nous avons utilisé un test de puissance pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement (le calcul est détaillé en 3.4.10). Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests métaboliques sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil à résonnance magnétique nucléaire, qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents. Pour l’analyse des résultats, nous comparerons les différents groupes expérimentaux avec l’aide d’un test t de Student (2 groupes) ou par analyse de variance (ANOVA) à 2 facteurs, suivie si nécessaire d’un test post-hoc de Tukey (plus de 2 groupes). Dans le cas des mesures répétées (évaluation de la prise alimentaire, du poids corporel dans le temps), des ANOVAs à mesures répétées suivies des tests post-hoc adéquats seront utilisés
Raffinement
Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 3 ou 7 semaines et seront habitués pendant 1 semaine. Cette période d’habituation permettra de diminuer le stress des animaux en réponse à l’expérimentateur. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite parfois la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. 3) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier, un tunnel en carton pour se cacher et de bâtonnets en bois pour ronger. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Notre étude nécessite une chirurgie stéréotaxique, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole associant morphinique, anesthésique local et traitement anti-inflammatoire. Durant la chirurgie, dès l’induction, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Enfin, le traitement anti-inflammatoire se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis : ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échant). Des mesures conservatoires sont prévues pour chaque critère, afin de prendre en charge promptement toute modification de l’état de l’animal. Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.
Choix des espèces
Le comportement alimentaire, la balance énergétique et les métabolismes glucidique et lipidique sont depuis longtemps évalués chez la souris, qui représente donc une espèce adéquate pour ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités sont développés chez la souris. De nombreux modèles génétiquement modifiés existent et permettent l’étude de mécanismes moléculaires précis. De plus, la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement. Enfin, la forte proximité du génome murin et humain fait de la souris un bon modèle prédictif lors d’études d’inactivation de gènes. Toutes les souris arriveront dans notre animalerie expérimentale à l’âge de 3 semaines. Les procédures expérimentales débuteront après au minimum 1 semaine d’habituation. Etant donné l’impact significatif de l’âge sur le métabolisme énergétique et glucidique, ces expériences seront réalisées sur des souris jeunes (4 semaines) ou plus âgées (24 semaines).