Rongeurs
Rôle de la voie métabolique de la tyrosine dans la progression métastique de l’adénocarcinome canalaire pancréatique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue et toutes classées en souffrance sévère, dans des procédures impliquant une greffe de cellules cancéreuses dans la rate ou le foie sous anesthésie. Le porteur indique que ces souris sont identifiées dès l'âge de sept jours par coupure des phalanges, et que la chirurgie entraîne un stress et d'éventuelles douleurs, sutures comprises. La greffe vise à générer des métastases hépatiques pour tester un régime alimentaire et un médicament, la nitisinone, bloquant la dégradation de la tyrosine. Il affirme que le recours aux animaux est "absolument indispensable", les souris étant euthanasiées par dislocation cervicale pour autopsie.
Objectifs
Ce projet innovant a pour objectif de déterminer les changements métaboliques associés aux caractéristiques agressives et métastatiques du cancer pancréatique (ADKP). Pour répondre à cet objectif, nous avons défini et comparé le profil métabolique des métastases hépatiques (MH) associées à la tumeur pancréatique à celui de la tumeur pancréatique elle-même. Nous avons révélé que l’utilisation de l’acide aminé tyrosine est activée dans les MH par rapport à l’ADKP. Cette différence laisse envisager que l’utilisation de la tyrosine soutiendrait la survie des cellules cancéreuses au sein du tissu hépatique, lors du processus métastatique. A présent, nous souhaitons étudier le rôle de la tyrosine dans la progression métastatique de l’ADKP. Nous avons aussi démontré que les hépatocytes produisent des taux élevés de tyrosine. Cette donnée renforce l’hypothèse selon laquelle les cellules cancéreuses métastatiques s’adaptent au foie en sollicitant de manière importante l’utilisation de la tyrosine au sein du tissu hépatique pour en dériver différents composés qui lui seraient utiles. Le rôle de la tyrosine est jusqu’à présent très peu étudié dans les processus métastatiques mais représente un intérêt thérapeutique certain en laissant entrevoir son rôle dans la généralisation du cancer. Ce projet a pour but d’apporter à terme de nouvelles approches thérapeutiques aux patients à un stade avancé et métastatique de la maladie alors exclus du seul protocole curatif disponible en clinique : la chirurgie. C’est dans cette démarche préclinique que souhaitons valider notre hypothèse par l’utilisation de différents modèles de souris.
Bénéfices attendus
Ce projet par ces approches in vivo, nous permettra de valider le rôle de la voie de dégradation de la tyrosine dans le développement des métastases hépatiques associées à l’ADKP. L’inhibiteur pharmacologique de la dégradation de la tyrosine, la nitisinone, etant utilisé en clinique avec autorisation de mise sur le marché (AMM), nous souhaitons valider son utilisation dans le cadre du traitement du phénotype invasif du cancer du pancréas pour proposer un repositionnement de la nitisinone pour le développement d'une approche thérapeutique chez les patients atteints d'un cancer pancréatique métastatique. L'utilisation d'un régime pauvre en tyrosine sera une double validation de l'interêt clinique du ciblage du métabolisme de la tyrosine dans le cadre du cancer du pancréas métastatique. Ainsi, ce projet apportera à terme de nouvelles approches thérapeutiques aux patients à un stade avancé et métastatique de la maladie alors exclus du seul protocole curatif disponible en clinique : l’exérèse chirurgicale. C’est dans cette démarche préclinique que nous souhaitons valider notre hypothèse par l’utilisation de différents modèles de souris.
Procédures
Les souris sont soumises à une procédure chirurgicale de greffes de cellule stumorales dans la rate ou le foie, 1 procédure chirurgicale par souris sera effctuée. Cette procédure chirurgicale sera de 20 min maximum entre le temps d'endormissement et de réveil de l'animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances subies par les animaux sont dues tout d’abord à leur identification, à l'âge de 7 jours, par coupures des phalanges. Certaines nuisances sont aussi dues à l’acte chirurgicale qui entraîne inévitablement un stress et éventuellement des douleurs chez la souris, même si tout est mis en oeuvre au moment de la chirurgie pour les réduire. Ces nuisances sont dues i/à l’anesthésie avant l’acte chirurgical, ii/à l’injection avec des cellules tumorales au niveau de la rate et du foie pour générer des métastases hépatiques, iii/ aux sutures qui peuvent aussi entraîner une gêne, démangeaisons qui poussent l’animal à se gratter et à former des plaies au site de fermeture de la cicatrice (cette gêne disparait généralement en quelques jours). Ces douleurs post-opératoires sont minorées par une antalgie. Les nuisances liées au développement de métastases hépatiques sont : douleur, perte de poids, mobilité réduite, apparences et/ou comportements anormaux, qui indiquent une progression métastatique avancée. Notre expertise nous permet de détecter quotidiennement tout signe de douleur, d’angoisse et de souffrance de l’animal. A ce-jour, aucun marqueur de dépistage précoce de la progression métastatique de la maladie ne peut être utilisé pour ce modèle et notre infrastructure n’est pas encore pourvue d’un échographe qui permettrait de diagnostiquer les métastases et de suivre leur évolution.
Devenir
Afin d'évaluer la prise métastatique au sein du foie et de la rate en fonction des traitements administrés aux animaux, ceux ci seront euthanasiés par dislocation cervicale et autopsiés.
Remplacement
Le recours à des animaux est absolument indispensable pour mener à bien ce projet qui vise à inhiber les échanges métaboliques au sein du foie, entre les cellules cancéreuses et les hépatocytes à proximité de la métastase, en utilisant un régime alimentaire spécifique, et à observer la progression/régression des métastases hépatiques. Ce projet fait suite à plusieurs validations in vitro et ex vivo (sur cultures primaires en 2 dimensions, en organoïdes) de la pertinence de cette inhibition du dialogue métabolique entre hépatocytes et cellules métastatiques pour limiter l’expansion métastatique. Ainsi, il est à présent nécessaire de démontrer au sein d’un hôte vigile, porteur de métastases et avec des fonctions hépatiques conservées, qu’un régime alimentaire dédié permettrait de réduire la progression métastatique et d’envisager une telle approche, par régimes alimentaires spéciaux, chez des patients atteints d’un cancer pancréatique métastatique, évitant/limitant ainsi une approche thérapeutique lourde. L’utilisation d’alternatives expérimentales ne faisant pas appel à l’utilisation d’animaux sera envisagée chaque fois que c’est possible (ex : caractérisation moléculaire des hépatocytes et des cellules métastatiques après inhibition des échanges métaboliques entre les 2 types cellulaires).
Réduction
Le nombre d’animaux/groupe expérimental et par procédure expérimentale nécessaire à l’obtention d’une significativité statistique a été défini à partir du site biostatgv en déterminant : - le test statistique à utiliser : T-test ou ANOVA et test post-hoc (Tukey) en fonction du nombre de groupes expérimentaux à comparer (deux ou plus de deux, respectivement). - l’effet biologique traduisant la progression tumorale et la prise métastatique et la dispersion escomptés, cette estimation a été faite d’après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par le laboratoire - la puissance du test à 0.8 - le risque de 1ère espèce à 0.05. Ainsi, le nombre d’animaux/groupe expérimental, tel que défini au-dessus, est de : - 8 pour le groupe 1 (régime contrôle), 2 (régime nitisinone) et 3 (régime tyr-/Phe 0,25%)) des procédures 1 (greffes intraspléniques) et 2 (greffes intrahépatiques).
Raffinement
Une personne compétente (formations en expérimentation animale + chirurgie) réalisera l’implantation des cellules tumorales par chirurgie dans la rate et le foie en traitant les animaux opérés avec une injection d’antalgique (buprénorphine) en pré- et post-opératoire. Une observation quotidienne des animaux (poids, douleur/souffrance) sera faite et permettra de déceler des apparences/comportements anormaux, des signes physiologiques altérés : ces observations seront mesurées/quantifiées pour leur intensité/importance sur une échelle de 0 à 3, qui constituera un score que nous reporterons dans une grille (voir grille de score jointe). Les scores obtenus chez l’animal éveillé, après anesthésie ou au cours du développement métastatique nous conduiront à arrêter l’expérience si le score 3 a été atteint au moins une fois pour l’un des symptômes mentionnés dans cette grille. Un enrichissement matériel (twists, cocon ou nid) de l’environnement des animaux est mis en place dans toutes les cages afin qu’ils expriment un répertoire diversifié de comportements normaux.
Choix des espèces
Nous nous servirons de souris syngéniques ne développant ni tumeur primaire ni métastases de manière spontanée. Ce modèle nous permettra d’injecter en intra-splénique ou en intra-hépatique des cellules cancéreuses métastatiques syngéniques préalablement isolées du modèle murin de carcinogenèse pancréatique d’origine. Cette compatibilité immunologique entre les cellules greffées et l’hôte murin nous permettra de réaliser cette expérience dans un modèle murin immunocompétent nous évitant ainsi d’exclure la composante immunitaire requise au processus métastatique. Pour les protocoles 1 et 2, nous utiliserons des souris syngéniques de sexes indifférents, âgées d'environ 6 semaines : à cet âge les animaux sont sevrés, correspondent au stade de développement jeune adulte auquel les études de l’impact du métabolisme sur la progression métastatique ne sont pas impactées par une prise de poids ou tout autre facteur lié au vieillissement de l’animal.
Etude des potentiels effets indésirables d’une vésiculothérapie CD146 dans l’athérosclérose
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une injection intraveineuse de vésicules puis un prélèvement de sang, avant d'être euthanasiées pour récolter la moelle osseuse des os des pattes, l'objectif étant de repérer les effets indésirables d'une thérapie contre l'athérosclérose. Le porteur indique que l'injection rétro-orbitaire et la biopsie de la queue peuvent causer un stress ou une douleur légère. Il affirme qu'aucune alternative in vitro ne permet d'évaluer les effets hors-cibles d'une telle thérapie.
Objectifs
Ce projet permettra d'étudier les effets indésirables de la vésiculothérapie par CD146 qui consiste à délivrer des petites vésicules exposant la protéine CD146. En effet, un protocole précédemment accepté a testé le bénéfice de cette thérapie dans l'athérosclérose qui est la maladie correspondant aux dépôts de LDL cholestérol dans les parois des artères pouvant conduire à des AVC ou des infarctus du myocarde. Nos études en cours montrent que l'administration de vésicules CD146 par voie intraveineuse diminuent significativement l'athérosclérose. Mais les vésicules extracellulaires étant été également décrites comme pouvant être pro-coagulantes ou pro-inflammatoires, selon le contexte clinique, il est essentiel de vérifier que la vésiculothérapie proposée n'entraîne pas de phénomènes de coagulation ou d'inflammation qui pourraient être délétères dans l'athérosclérose.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet permettra de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique dans la lutte contre l'athérosclérose.
Procédures
1/ Injection dans la veine de vésicules extracellulaires après anesthésie gazeuse (5 secondes) 2/Temps de saignement : Prélèvement de quelques gouttes de sang à la queue après anesthésie gazeuse (15 minutes maximum) 3/Extraction des cellules de la moelle osseuse sur animal euthanasié. Au total, 2 interventions sur animal anethésié (1 et 2) et 1 sur animal enthanasié (3).
Impact sur les animaux
L'animal subit une injection rétro-orbitaire, une anesthésie ainsi qu'une biopsie de la queue. Cela pourra entrainer par exemple : un stress physique léger, un stress thermique ou une douleur légère chez l'animal.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure, en effet il est necessaire d'avoir un animal euthanasié pour récolter la moelle osseuse des tibias et des péronés.
Remplacement
Il n'existe à l'heure actuelle aucune autre alternative à l'utilisation d'un modèle murin pour tester le bénéfice global d'une thérapie dans l'athérosclérose, l'évaluation des effets indésirables hors-cibles ne pouvant pas se faire in vitro.
Réduction
Les souris seront observées avant d’initier le protocole. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, deux protocoles différents seront testés sur le même animal sans que cela ne perturbe les données scientifiques. Ainsi, les souris qui seront soumises à un test de saignement pour évaluer l'effet de la thérapie sur l'hémostase, seront ré-utilisées pour leur extraction de moelle osseuse afin d'isoler et de mettre en cuture les macrophages in vitro.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages contenant de l'enrichissement. Aussi, si les animaux présentant des symptômes type infection, ils seront écartés des protocoles, anesthésiés puis euthanasiés. Nous serons attentif à toute souffrance animal lors de l'élevage. En effet, si l'animal présente des difficultés à respirer (visualisées par une augmentation des rythmes cardiaque et respiratoire répercutée au niveau des flancs de l’animal), si l’animal est prostré ou en retrait l’analgésie peut être envisagée par administration de carprofène par voie sous-cutanée à 5 mg/kg, 1 injection par jour tant que les signes de douleur persistent.
Choix des espèces
La meilleure façon d'appréhender les effets indésirables et 'hors cibles' d'une nouvelle stratégie thérapeutique est de l'étudier dans un modèle animal. Les animaux seront utilisés au stade adulte, seul le modèle murin adulte développe des plaques d'athérosclérose semblables à celle de l'homme.
Détermination du potentiel santé de compléments alimentaires enrichis en polyphénols dans le cadre de la Dégénérescence Maculaire Liée à l’Age (DMLA)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
1 864 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un œil reçoit des impacts laser sous anesthésie, provoquant une cécité partielle, puis des injections intraoculaires d'anti-VEGF et de molécules inflammatoires, tandis qu'un complément enrichi en polyphénols leur est administré par gavage pendant quarante-deux jours. Le porteur affirme n'impacter qu'un seul œil pour éviter la cécité totale et juge les supplémentations sans effet indésirable d'après des tests antérieurs. Il indique que ces compléments, déjà testés sur cellules rétiniennes, doivent être évalués sur l'ensemble de la rétine, les organes étant prélevés après la mise à mort.
Objectifs
La Dégénérescence Maculaire Liées à l’Age (DMLA) est la première cause de la perte partielle de la vision centrale chez les plus de 50 ans dans les pays industrialisés. La DMLA ne rend pas complétement aveugle mais reste très invalidante. Elle se traduit par une dégradation d’une partie de la rétine responsable de la vision haute définition et en couleur. La forme la plus sévère est la forme humide caractérisée par une formation excessive de vaisseaux sanguins. La phase précoce de la DMLA est caractérisée par un contexte de stress oxydant qui participe à la mise en place d’un stress inflammatoire favorisant la création de nouveau vaisseaux (néoangiogenèse). Ces néovaisseaux sont désorganisés et de mauvaises qualités, ce qui entraîne d’éventuelles hémorragies rétiniennes. Ils sont à l’origine d’une accumulation de liquide au niveau de l’épithélium rétinien entrainant une désorganisation des photorécepteurs et un décollement de la rétine, ce qui provoque une perte partielle de la vision centrale. Le traitement principal consiste en des injections dans l’œil d’anticorps permettant de contrecarrer l’action d’une molécule appelée VEGF qui favorise la néoangiogenèse. S’il permet de retarder l’évolution de la maladie, ce traitement n’est aucunement curatif et certains patients acquièrent une résistance aux anti-VEGF entrainant une perte de leur efficacité. Il est nécessaire de développer de nouvelles approches thérapeutiques permettant de prévenir la survenue de résistance et/ou d’améliorer les thérapies actuelles. La prise de compléments alimentaires riches en anti-oxydants tels que les oméga-3 ou encore les polyphénols est recommandée aux patients souffrant de DMLA de manière à diminuer son développement. Les polyphénols possèdent aussi des propriétés anti-angiogéniques démontrées dans le cadre de cancers. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’identifier si différentes supplémentations en polyphénols et/ou oméga-3 pourraient prévenir ou retarder la progression de la DMLA, dans un contexte pro-inflammatoire induit (Lipopolysaccharide) ou non. Pour cela, le modèle murin de néovascularisation choroïdienne, induit par impact laser dirigé contre la rétine et classiquement décrit dans la littérature pour mimer le phénotype de la DMLA, sera utilisé pour identifier de possibles nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’identifier les compositions de supplémentations polyphénoliques les plus prometteuses dans la lutte contre la DMLA et de déterminer la fréquence de supplémentations ainsi que les doses nécessaires afin d’obtenir un effet bénéfique lors de leur utilisation seules ou en combinaison avec les traitements actuels anti-VEGF. Si les supplémentations s’avèrent accroitre l’efficacité du traitement anti-VEGF dans le temps, ce projet pourrait faire émerger de nouveaux schémas thérapeutiques incluant des traitements nutritionnels en combinaison avec des injections d’anti-VEGF et notamment suggérer qu’avec certaines supplémentations un espacement entre ces injections est possible, tout en préservant l’efficacité du traitement. Ce serait d’autant plus précieux puisque ces injections d’anti-VEGF sont coûteuses et que leur trop grande fréquence est une contrainte majeure dans le parcours de soin des patients et augmente le risque de phénomènes de résistance. Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent l’efficacité de ces supplémentations. Les différents prélèvements d’organes ou de sang vont permettre de savoir si les différents agents, extraits et formulations sont capables de franchir la barrière hémato-encéphalique, s’accumuler dans la rétine (en globalité ou seulement certains de leur composants ou métabolites) et s’ils ont un effet protecteur global. De plus, des analyses protéiques et transcriptomiques de ces échantillons permettront d’analyser les mécanismes moléculaires responsables des effets bénéfiques des différentes supplémentations, effets anti-inflammatoires y compris.
Procédures
Tous les animaux seront soumis qu’à 3 types d’interventions. Afin de mimer la maladie, les animaux seront soumis à une séance d’impact laser touchant qu’un seul œil et durant laquelle les animaux seront anesthésiés. L’anesthésie sera réalisée par injection intrapéritonéale de kétamine, injection qui durera environ 5 secondes. Les souris resteront anesthésiées pendant 30 minutes, période au cours de laquelle elles recevront des impacts laser durant 30 secondes. Elles seront soumises, toujours sous anesthésie, à des injections intraoculaires d’anti VEGF (soit une injection à J31 soit 2 injections à J31 et J42) et de molécules conduisant à l’inflammation (une injection à J31) ou de solvant contrôle, et ce uniquement dans l’œil ayant reçu les impacts laser. Chaque injection durera 5 secondes. Enfin, il leur sera administré quotidiennement par gavage ou par alimentation des supplémentations ou des solvants contrôles pendant 42 jours. Seule cette dernière procédure sera réalisée sur animal vigile et durera 10 secondes lors des gavages et jusqu’à 30 minutes lors de l’administration à l’aide d’une croquette appétente. L’implantation de mini-pompes osmotiques sera réalisée par un personnel qualifié, avec du matériel chirurgical stérile, et se fera selon une procédure de chirurgie au niveau abdominal de 336 souris préalablement anesthésiées. La durée de la chirurgie est estimée à 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales ont été définies de manière à minimiser les dommages, souffrances, douleurs et angoisse. Supplémentation : l’innocuité des différentes supplémentations ont déjà été testées sur des modèles murins, elles n’induisaient pas d’effet indésirable. Impacts Laser : Les impacts lasers induisent une cécité partielle (atteinte de la vision centrale). Le fait de n’impacter qu’un seul des 2 yeux permet d’éviter la cécité totale. Cette pratique clinique est couramment utilisée chez l’Homme souffrant de pathologies rétiniennes et ne nécessite ni anesthésie générale ni prise d’antalgique. Cependant, tout animal sur lequel nous aurons induit une NVC à un œil et qui présenterait une anomalie sévère sur l’œil controlatéral (cataracte, kératite sévère) sera systématiquement mis à mort. Nous impacterons un seul œil ceci en pleine conformités avec les règles d’utilisation des animaux pour la recherche en ophtalmologie (directives de l’ARVO), qui interdisent l’intervention sur les 2 yeux d’un même animal. Implantation de mini-pompes osmotiques au niveau abdominal et traitement LPS : Des effets secondaires pourront être observés tels que des signes de fatigue, des diarrhées et une perte de poids. L’état générale des animaux sera évalué de manière journalière. De plus, tout animal présentant des signes de souffrance extrême tels qu’une perte de poids de plus de 20 % en 72 h sera mis à mort. Traitement intravitréen d’anti-VEGF et de LPS : Les effets secondaire associés aux injections intravitréennes d’anti-VEGF pourront être observés tels que l’apparition d’une cataracte ou kératite sévère. Tout animal sur lequel un œil présenterait une anomalie sévère (cataracte, kératite sévère) sera systématiquement mis à mort.
Devenir
Afin de prélever différents organes pour réaliser nos différentes analyses, tous les animaux serons mis à mort à l’issue de chaque expérience.
Remplacement
Les différentes supplémentations utilisées dans cette étude ont déjà fait l’objet d’études in vitro ayant démontrées leurs bénéfices sur une lignée cellulaire rétinienne humaine. Cependant, ces études ne montrent des résultats que sur des cellules séparées de leur environnement d’origine au sein de la rétine. Le modèle animal nous permet d’étudier l’impact de nos supplémentations sur l’ensemble de la rétine. Le modèle animal nous permettra d’étudier l’impact de nos supplémentations sur l’ensemble de la rétine. De plus, un de nos objectifs est de détecter et mesurer les taux de métabolites, ce qui est possible uniquement sur modèle animal car il est nécessaire d’avoir l’effet de premier passage hépatique. Les études sur lignées cellulaires ou encore sur des organoïdes de rétines ne nous permettraient pas d’étudier ce mécanisme. Des études précliniques avec des animaux sont incontournables pour la finalité de ce projet puisqu’il est nécessaire de considérer l’aspect pharmacocinétique et pharmacodynamique des molécules de nos différentes supplémentations incluant le processus de transformation de ces molécules par l’organisme (pouvant conduire à une augmentation de leur efficacité ou bien une perte de leur efficacité). Notre projet vise également à étudier l’impact de nos supplémentations sur l’inflammation aussi bien au niveau de la rétine qu’au niveau systémique. Si les études sur des macrophages primaires humains isolés nous permettent d’apprécier la capacité des supplémentations à diminuer l’inflammation produite par ce type cellulaire, elles ne nous permettent pas pour autant d’étudier l’inflammation au niveau systémique d’où la nécessité d’utiliser un modèle animal.
Réduction
L’induction par impact laser du modèle de murin de DMLA utilisée dans ce projet ainsi que les méthodes de suivi de l’angiogenèse associées sont parfaitement maitrisées au sein de notre équipe, évitant ainsi de réaliser des étapes de mises au point supplémentaires et, par conséquent, l’utilisation d’un trop grand nombre d’animaux. Dans le cadre de manipulations in vivo antérieures à ce projet, la majorité des supplémentations décrites dans ce nouveau projet ont déjà fait preuve d’une certaine efficacité dans un contexte de DMLA quand elles sont utilisées seules. Comme précédemment mentionné, cela permet d’avoir déjà des schémas de traitement (doses, fréquence) fiables et ainsi d’éviter la réalisation de mises au point supplémentaires et de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour ce projet. La maladie sera mimée sur un seul œil (droit) ce qui permettra d’utiliser le second d’œil (gauche) comme contrôle (sans NVC, sans traitement avec LPS et anti-VEGF) et ainsi de réduire le nombre d’individus utilisés. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminer de façon à avoir le minium d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statiquement analysables.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe (entre 3 et 10 animaux par cage) pour favoriser les contacts sociaux, avec un enrichissement du milieu approprié et nécessaire à leur bien-être, à savoir par cage : des objets et des jouets leur permettant de se cacher, de maintenir une activité et de développer leur répertoire comportemental. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Si les points limites que nous avons établis sont atteints, les souris seront mises à mort selon la méthode choisie. Après chaque procédure nécessitant une anesthésie (séance d’impact laser, injection intravitréenne, incision abdominale), nous instillerons une goutte de gel de méthylcellulose (Methocel® 2%) sur chaque œil afin d’éviter tout dessèchement de l’œil pouvant favoriser l’apparition d’une inflammation de la cornée non souhaitée. Les animaux seront ensuite replacés par groupe dans une cage de réveil sous conditions optimales de température et d’hygrométrie (respectivement 23°C et 55%). L’état des animaux sera évalué chaque 15 minutes jusqu’à leur réveil, puis toutes les 12 heures pendant les 36 heures suivantes.
Choix des espèces
La littérature justifie pleinement l’utilisation de la NVC induite par laser chez la souris pour mimer et étudier la DMLA in vivo et identifier à la fois les facteurs promouvant la maladie et l’impact bénéfique possible de traitements utilisés seuls ou en combinaison. Bien que d’autres modèles mimant la DMLA chez l’animal existe, le modèle de NVC est recommandé pour faire de la recherche à haut débit d’un grand nombre de molécules ou de formulations complexes pouvant aboutir à une utilisation chez l’Homme. Il est important de conserver ce modèle d’étude de la DMLA car il a déjà été démontré un potentiel santé du Resvega® et du Nutrof® à partir de ce même modèle. Ce nouveau projet nous permettra d’accroitre nos connaissances sur les différentes supplémentations en combinaison avec les anti-VEGF afin d’optimiser les traitements actuels utilisé chez l’Homme. Pour ce projet, nous utiliserons des souris de 8 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal et d’un poids minimum de 20 g. Nous pouvons considérer qu’à ce stade les souris ont acquis une maturité physiologique, ainsi qu’une maturité de l’acuité visuelle.
Analyse d’images multimodales précliniques (SPECT et IRM) pour la détection de la dysfonction coronaire microvasculaire (2/2)
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
20 rats vont être utilisés, tués sans réveil à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ces rats obèses subissent des imageries IRM sous anesthésie répétées entre 17 et 32 semaines, puis une imagerie nucléaire avec pose d'un cathéter et injection d'un agent de contraste, pour caler l'analyse d'images d'une dysfonction des petits vaisseaux du cœur. Le porteur affirme que les effets indésirables sont "très faibles" et que les animaux sont tués sans réveil après la dernière acquisition. Il conclut que le remplacement de l'expérimentation animale par un modèle alternatif "n'apparaît pas envisageable".
Objectifs
Les maladies qui affectent les gros vaisseaux sanguins et le cœur, aussi appelles maladies cardiovasculaires, représentent la première cause mondiale de mortalité. Les problèmes liés aux petits vaisseaux qui alimentent le cœur est de plus en plus reconnue comme un responsable majeur de la mortalité cardiovasculaire indépendamment de la présence ou de l'absence de maladie des gros vaisseaux. Bien que la dysfonction des petits vaisseaux qui alimentent le cœur soit dorénavant considérée comme un marqueur clinique dont l'évaluation fournirait des informations primordiales pour évaluer le risque des patients avec ou sans maladie des gros vaisseaux, il n’existe pas à l’heure actuelle de technique non invasive et largement disponible pour l’évaluation ces petits vaisseaux. Les images produites par les techniques d'imagerie nucléaire sont très importantes pour diagnostiquer et prédire les maladies qui affectent les vaisseaux sanguins qui alimentent le cœur, même chez les patients qui ont peu de symptômes. L’objectif du projet est de réaliser le suivi longitudinal de l’évolution des petits vaisseaux qui alimentent le cœur chez le rongeur par imagerie nucléaire ainsi que par IRM, avec un double objectif. Il s’agit tout d’abord de développer des outils d’intelligence artificielle permettant d’améliorer la détection précoce d’anomalies des petits vaisseaux sur les images nucléaires à l’aide de l’IRM. L’objectif à terme est d’améliorer l’évaluation clinique de la des problèmes liés aux petits vaisseaux qui alimentent le cœur en imagerie nucléaire. Deuxièmement, nous souhaitons améliorer l’analyse du signal IRM pour la mesure de ces petits vaisseaux. Nous limitons le projet, qui se déroule en collaboration entre deux établissements utilisateurs, aux seules expériences considérées comme absolument indispensables chez l’animal. Le nombre d’animaux par cage (avec enrichissement du milieu de vie) sera adapté en fonction de leur poids. Les animaux seront suivis quotidiennement afin de contrôler leur bien-être. La mise en place de points limites adaptés permettra de limiter la souffrance de ces animaux. Les injections seront réalisées selon les bonnes pratiques vétérinaires.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d’améliorer l’évaluation de la DCM en imagerie nucléaire grâce à la comparaison des données avec les valeurs de référence procurées par l’IRM. Il devrait permettre à terme d’améliorer l’évaluation clinique de la DCM en SPECT.
Procédures
A l’âge de 17 semaines les animaux seront placés sous anesthésie générale. Une injection dans l’abdomen sera réalisée pour mimer un effort avant l’acquisition IRM. La durée de l’acquisition sera de 60 min environ. A l’issue de l’anesthésie, les animaux seront replacés dans leurs cages. L’acquisition IRM sera répétée selon les mêmes modalités à 25 semaines et 32 semaines d’âge. A l’issue de l’acquisition à 32 semaines, une acquisition d’image nucléaire sera réalisée après anesthésie générale et pose d’un cathéter intraveineux pour l’injection de l’agent de contraste. La durée d’acquisition des images sera de 25 min.
Impact sur les animaux
L’acquisition des images IRM est réalisée sans agent de contraste et ne nécessite qu’une anesthésie gazeuse dont les nuisances ou effets indésirables attendus sont très faibles. L’acquisition d’images nucléaire nécessite une injection intraveineuse caudale et une injection dans l’abdomen, aux effets indésirables également très limités, d’autant plus que les animaux seront mis à mort sans réveil à l’issue de l’acquisition.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l’issue de l’unique procédure expérimentale pour analyses post mortem.
Remplacement
Remplacement : Cette étude vise à caractériser les conditions d’analyse des images précliniques SPECT de la perfusion myocardique pour permettre l’évaluation de la DCM sur les images cliniques. Le remplacement de l’expérimentation animale par un modèle alternatif n’apparaît pas envisageable.
Réduction
Réduction : Au total 20 rats seront utilisés ici. Il y aura 10 animaux par groupe. Il s’agit du strict minimum d’animaux nécessaires afin de pouvoir obtenir des résultats exploitables en termes de classification des images SPECT comme correspondant à des animaux présentant ou non une DCM par machine learning ou deep learning en fonction des valeurs de référence procurées par les images IRM (vérité-terrain).
Raffinement
Raffinement : Les animaux seront suivis quotidiennement afin de contrôler leur bien-être. Le poids des animaux ainsi que la prise de nourriture seront surveillés une fois par semaine. Le nombre d’animaux par cage sera adapté en fonction de leur poids. Ils disposeront d’enrichissement de leur milieu de vie (bâton en bois, tunnels, etc…). Une surveillance particulière de la consommation d’eau de boisson sera effectuée considérant le statut pré-diabétque des animaux. Les expérimentations prévues lors de cette étude sont des procédures non invasives (IRM et SPECT). Lors de ces procédures, les animaux sont sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane. Une surveillance quotidienne des animaux reste cependant nécessaire et des points limites sont proposés. L’effet de l’agent pharmacologique permettant de mimer la situation d’effort pour l’acquisition des images SPECT est transitoire, mais une grille de surveillance sera toutefois ajoutée pour la surveillance respiratoire des rats.
Choix des espèces
Ce modèle de rat obèse est très largement utilisés pour l’étude de pathologies métaboliques. Une étude préliminaire a permis de démontrer par imagerie échographique une atteinte microvasculaire (diminution de la réserve coronaire) chez les animaux obèses aux stades où nous prévoyons d’utiliser les animaux dans le présent projet. De plus, nous disposons de données préliminaires qui pourront être comparées à celles obtenues dans le cadre du présent projet. Enfin, le rat est particulièrement adapté au matériel d’acquisition (gamma-caméras) en termes de sensibilité et de résolution, par comparaison avec la souris. Les animaux seront accueillis à un âge compris entre 13 et 16 semaines. Ils seront hébergés dans des conditions standards pendant 1 semaine minimum avant inclusion dans le protocole. Cet âge correspond, d’après la littérature, au stade des signes cliniques (obésité, insulinorésistance, hyperlipidémie) développé par ces animaux. Ils seront suivis jusqu’à 32 semaines, âge auquel nous avons précédemment observé une DCM par imagerie échocardiographique.
Explorer les axes intestin / système nerveux autonome et central / cœur pour ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
475 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une arthrite rhumatoïde leur est induite par injection de collagène ou d'auto-anticorps, avec implantation chirurgicale d'un capteur cardiaque, échocardiographie et gavages destinés à modifier leur microbiote intestinal. Le porteur indique que les animaux implantés doivent être isolés en cage individuelle et que les injections visent à établir un "tableau clinique de polyarthrite rhumatoïde". Il affirme que l'étude des interactions entre microbiote, système nerveux et cœur ne peut se mener directement chez les patients ni sur cellules, les tissus étant prélevés après la mise à mort.
Objectifs
L'objectif de notre projet global est de comprendre les interactions entre le microbiote intestinal et le reste de l’organisme et en particulier le système nerveux autonome , le système cardiovasculaire, et l'intestin et comment elles peuvent être modulées par l’alimentation ou les probiotiques dans la polyarthrite rhumatoïde.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet seront une meilleur compréhension du rôle de microbiote intestinal dans la physiopathologie de la polyarthritre rhumatoïde et comment une modification de ce microbiote influe sur l'activité du sytème nerveux autonome et finallement sur la fonction cardiovasculaire. Cette meilleur compréhension devrait permettre d'identifier de nouveaux marqueurs de la polyarthrite rhumatöide, et d'identifier les voies impliquées dans ce processus pathologique. Ces voies indiqueront de possible cibles thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à - l'induction de l'arthrite rhumatöide par injection de collagène (injection J0, J21 et suivi sur 56 jours) en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse ou à -l'induction de l'arthrite rhumatöide par injection d'auto-anticorps anti collagène/LPS (injection J0, J3 et suivi sur 10 jours) en sous-cutranée sous anesthésie gazeuse. Les animaux seront soumis ensuite à - la mesure de l'electrocardiogramme par télémétrie (implantations du capteurs de télémétrie sous anesthésie gazeuse) et à la mesure échocardiographique non invasive (sedation gazeuse). Les animaux seront soumis à une humanisation du microbiote intestinal par gavage. Certains animaux auront une modulation du microbiote intestinale par option thérapeutique (modulateur du métabolisme par l'alimentation ou probiotiques, médicaments ciblant les voies identifiées dans le projet).
Impact sur les animaux
Le projet nécessite l'enregistrement de l'électrocardiogramme par système holter implanté. Pour ne pas gêner les mouvements de l’animal, le capteur est implanté sous la peau au niveau du dos. Pour éviter les blessures post-opératoires entre les animaux au niveau de la suture, les animaux implantés devront être isolés en cage unique. Cet isolement et la chirurgie seront pris en compte par un suivi journalier de l'animal. Les modifications du microbiote par gavage auront un effet minime sur le bien-être animal et sont censés seulement moduler l'activité du système nerveux (rythme cardiaque). Les interventions du projet (injection de collagène ou auto-anticorps anticollagène) visent à établir un tableau clinique de polyarthrite rhumatoïde très modéré.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèver différents tissus qui seront analysés.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de développer de nouvelles approches thérapeutiques dans la polyarthrite rhumatoïde basées sur la modulation du microbiote par l’alimentation et les probiotiques et d’en évaluer les conséquences à l’échelle de l’organisme. Les approches directement chez les patients permettront de voir les effets cliniques et immunologiques mais ne permettront pas de décortiquer les effets liés au microbiote ni d’appréhender l’influence du système nerveux et des autres organes dans les effets observés. Actuellement, seul le recours aux expériences de transfert de microbiote chez l’animal in vitro permettent d’évaluer les fonctions d’un microbiote. Tous ces éléments ne peuvent absolument pas être appréhendés en dehors de modèles in vivo.
Réduction
Pour réduire la variabilité interindividuelle et donc le nombre de souris nécessaires pour démontrer un effet, nous utiliserons des lots d’animaux du même âge et du même genre au moment de l’initiation du protocole. Nous avons fait le choix de méthodes (télémétrie, échocardiographie), compatible entre elles et permettant le suivi des animaux dans le temps pour réduire le nombre de groupes utilisés et obtenir le maximum d'information sur chaque animal.
Raffinement
L'ensemble de la procédure d'implantation du capteur de télémétrie sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse. L'animal est monitoré jusqu’à son réveil complet puis placé dans une couveuse à 30°C / 3 heures en cage unique. Le jour de la procédure, des visites régulièresl sont effectuées. Des soins per- et postopératoires appropriés seront réalisés depuis l'avant réveil puis dans les 2 jours suivant l’implantation. Une grille d'évaluation clinique de l'animal permettra son suivi et le respects des points limites. A l'exception des animaux en télémétrie, les animaux seront hébergés en cage par 5 pour respecter leur caractère grégaire, avec présence d'outil de raffinement (nid en cellulose et carré de cellulose).
Choix des espèces
Le projet utilise la souris car c’est le modèle mammifère de référence pour les expériences de transfert de microbiote chez l’animal in vivo, permettent d’évaluer les conséquences fonctionnelles intégrées d’un microbiote précis. La régulation autonomique (afférences/éfférences) est similaire entra l'Homme et la souris. L'expérience du laboratoire dans le transfert de microbiote chez la souris, dans les investigations cardiaques et autonomique (HRV) permet d'éviter une mise au point/validation du protocole et la consommation d'animaux d'autres espèces pour cela. Par ailleurs, un projet connexe sur le modèle murin est déjà en cours sur cette thématique au laboratoire. Notre structure et son matériel est de plus adaptée à la souris.
Identification des mécanismes responsables du biais de sexe dans les infections parasitaires
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
441 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie des mâles subit une ablation des testicules sous anesthésie, toutes sont infectées par un ver intestinal avec prélèvements sanguins répétés, puis euthanasiées quatorze jours après l'infection pour analyser la charge parasitaire et la réponse immunitaire. Le porteur indique que la chirurgie peut induire de faibles douleurs abdominales et affirme que le parasite, éliminé naturellement par les animaux, ne s'accompagne pas de douleur. Il conclut que la coordination des cellules immunitaires dans plusieurs organes ne peut être reproduite in vitro.
Objectifs
Comme c'est le cas pour la plupart des infections microbiennes, les individus mâles éliminent plus difficilement les parasites que les femelles. Les objectifs de notre projet seront d'identifier les mécanismes biologiques à l'origine de la plus grande susceptibilité des mâles à des infections par des parasites intestinaux. Nous évaluerons si la réponse immunitaire anti-parasitaire est différente entre les souris mâles et les femelles lorsqu'ils sont infectés avec le ver intestinal Strongyloïdes Ratti. Nous étudierons si les hormones sexuelles mâles, les androgènes, influencent la réponse immunitaire anti-parasitaire en particulier en régulant une population immune clé dans l'élimination des parasites, les cellules lymphoïdes innées de type 2.
Bénéfices attendus
La prise en compte des différences liées les sexes dans la santé et la maladie a toujours été négligée, voire intentionnellement mise de côté. Cependant, à l'ère du développement d'approches thérapeutiques personnalisées, il est essentiel de considérer le sexe comme une variable critique pour les maladies infectieuses. Connaître les mécanismes à l'origine des biais de sexe dans l'immunité permettra non seulement une meilleure connaissance physiopathologique des maladies chez les hommes et les femmes mais aussi le développement de nouvelles pistes thérapeutiques. Ce projet permettra de contribuer à identifier les mécanismes à l'origine de la plus grande susceptibilité des individus mâles aux maladies parasitaires.
Procédures
Une partie des animaux sera orchidectomisée (ablation des testicules) afin d'éliminer la source principale de production des androgènes (durée de l'opération = 5 min/souris). L'opération aura lieu sous anesthésie générale (l'animal est anesthésié pendant 60 min environ par une injection qui dure moins de 10 secondes). Toutes les souris seront infectées avec le parasite S. ratti (durée de l'infection = 1 min). Leur sang sera aussi prélevé à jour 0, 6 et 12 post-infection (durée de la prise de sang = moins d'1 min). L'infection et le prélèvement de sang auront lieu sous anesthésie gazeuse (durée de l'anesthésie = 2 min). Nombre total d'interventions chez les animaux non castrés = 4. Nombre total d'interventions chez les animaux castrés = 6
Impact sur les animaux
Les animaux récupèrent parfaitement d'une orchidectomie. Cependant, la chirurgie peut induire de faibles douleurs abdominales post-opératoires. Le parasite qui sera administré est naturellement éliminé par les animaux immuno-compétents qui seront utilisés dans ce projet. Son administration ne s'accompagne pas de douleurs chez les animaux.
Devenir
A l'issue de l'orchidectomie, les souris mâles castrés ainsi que d'autres lots d'animaux seront infectés par le parasite s.ratti. 14 jours après l'infection, toutes les souris seront euthanasiées. Les souris seront euthanasiées afin que nous prélevions et analysions dans les tissus (intestin, poumons) la charge parasitaire ainsi que le niveau d'inflammation et la réponse immunitaire induite par le parasite.
Remplacement
Les mécanismes de défense mis en place pour éliminer les parasites sont complexes. Ils nécessitent l'implication de plusieurs types de cellules immunitaires qui agissent de manière coordonnée et séquentielle avec des cinétiques précises dans différents organes (Intestins, poumons). Ces différentes étapes ne peuvent donc pas être reproduites in vitro.
Réduction
Les calculs de puissance statistique pour obtenir des résultats interprétables et reproductibles ont mis en évidence qu'un nombre de 7 animaux par groupe est requis. Nous répéterons les expériences 3 fois. Nous essayons d'effectuer le maximum d'analyse sur le même animal : analyse des tissus inflammés par histologie, analyse en cytométrie en flux pour analyser la nature, le phenotype et la fonctionnalité des cellules immunitaires infiltrant les tissus post-mortem et prélevements sanguins et de fèces au cours du temps pour évaluer l'inflammation et la charge parasitaire sur animal vivant.
Raffinement
Ce modèle n'induit généralement pas de dommages chez la souris qui, lorqu'elle est immuno-compétente comme c'est le cas avec les animaux ici utilisés, est capable d'éliminer complètement le ver. Les souris infectées ne perdent généralement pas de poids et n'ont pas de signes de douleurs apparentes. Cependant, les animaux seront attentivement observés après l'infection. Le poids des animaux sera mesuré et si les souris devaient perdre 20% de leur poids initial ou si nous observons des signes de douleurs apparentes (isolement, baisse importante de l'activité, posture voûtée ou prostrée, pilo-érection, absence de toilettage), l'animal sera mis à mort. Le même soin sera apporté aux animaux ayant subi une orchidectomie qui est cependant une procédure dont les animaux se remettent parfaitement mais qui recevront en complément un bolus d'antalgique en post-opératoire. Les animaux seront placés dans des cages avec enrichissement : igloo/maison, papier kraft pour nidification.
Choix des espèces
Tout comme chez l'Homme, il existe des biais de sexe dans les infections parasitaires chez la souris, les souris mâles étant plus sensibles aux infections. Du point de vue immunitaire, les souris présentent des caractéristiques proches de l'espèce humaine. Nous disposons aussi de modèles murins génétiquement modifiés qui nous permettront d'évaluer de manière directe si la plus grande susceptibilité des mâles à être infectés par un parasite est en partie expliquer par l'inhibition de la réponse immunitaire par les androgènes. Une partie des animaux mâles sera orchidectomisée autour de 4-5 semaines de vie, avant maturité sexuelle. Tous les animaux seront ensuite infectés à l'âge adulte avec les parasites (9-15 semaines).
Détection du glucose issu de la néoglucogenèse intestinale et ses effets sur le métabolisme
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. La plupart subissent la pose chirurgicale d'un cathéter dans la veine porte, puis des perfusions de solution sucrée ou physiologique, d'autres recevant un gavage de glucose, pour comprendre comment le sucre produit par l'intestin agit sur le métabolisme. Le porteur indique que la chirurgie peut détériorer le vaisseau ou provoquer une hémorragie, et que le gavage peut irriter l'œsophage. Il affirme que la fonction étudiée, impliquant des échanges entre organes, ne peut être reproduite sur cellules, les animaux étant tués pour analyser la veine porte et le cerveau.
Objectifs
L’obésité et le diabète de type 2 connaissent une croissance alarmante. La dérégulation de l’homéostasie du glucose, notamment chez des personnes diabétiques ou obèses, est un problème majeur de santé publique nécessitant une recherche constante quant aux thérapies proposées. Les études précédentes ont mis en évidence que la production de glucose (sucre) par l’intestin exerce des effets bénéfiques sur l’équilibre glucidique et énergétique. En effet, le glucose sécrété dans la veine porte (localisée à la sortie de l’intestin) induit un signal nerveux - appelé signal « glucose-portal » - qui cible les régions du cerveau du contrôle de la prise alimentaire et de la dépense énergétique. Les effets bénéfiques des protéines et des fibres alimentaires, réputées « coupe-faim », sont dépendants de l’induction du signal « glucose-portal ». Ce signal est activé par une production de glucose par l’intestin, qui se déclenche après la prise d’un repas riche en protéines et/ou en fibres, protégeant ainsi du développement de l’obésité et du diabète. Ce projet vise à caractériser les mécanismes nerveux par lesquels la production intestinale de glucose exerce ses effets bénéfiques et, à plus long terme, de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques dans le cadre de l’obésité et du diabète. Parmi les différents transporteurs ou récepteurs de glucose, des résultats précédents montrent que la détection en veine porte du glucose produit par l’intestin pourrait impliquer le récepteur de glucose nommé SGLT3. La détection par SGLT3 induirait un signal nerveux jusqu’au cerveau. L’objectif du projet est de caractériser le rôle de ce récepteur SGLT3 dans la détection du glucose issu de la production intestinale de glucose. Pour cela, nous étudierons l’impact d’une augmentation de glucose dans la veine porte chez des souris transgéniques invalidées pour ce récepteur en analysant les zones du cerveau connues pour réguler la prise alimentaire ou l’homéostasie glucidique.
Bénéfices attendus
Les mécanismes moléculaires par lesquels la production intestinale de glucose exerce ses effets bénéfiques sur l’obésité, le contrôle glycémique et l’accumulation de graisses dans le foie ne sont pas connus. Les résultats issus de ce projet nous permettrons d’identifier comment le glucose est détecté dans la veine porte et comment le cerveau reçoit et intègre informations nutritionnelles envoyées par l’intestin. Ce projet nous permettra d’identifier comment la production intestinale de glucose active le cerveau. Trouver des agents agissant sur ces mécanismes pourrait représenter une cible thérapeutique intéressante pour lutter contre l’obésité et ses complications.
Procédures
- A l’âge de 12 semaines, 64 souris recevront une solution de glucose dilué dans du sérum physiologique par voie orale (administrée par gavage en moins de 10 secondes). Afin d’induire un renforcement positif, la sonde de gavage sera préalablement trempée dans une solution d’eau sucrée pour favoriser la déglutition de l’animal. Pour limiter l’irritation, le gavage sera réalisé avec une sonde de gavage souple, de plus, cette intervention ne sera réalisée qu’une seule fois par animal. Puis les souris seront mises à mort après analgésie et anesthésie profonde. - A l’âge de 12 semaines, 192 souris subiront une chirurgie de 20 minutes permettant la pose d’un cathéter dans la veine porte sous anesthésie et analgésie. Après une semaine de soins post-opératoires, la moitié des souris recevra une perfusion de solution sucrée et l'autre une perfusion de solution physiologique à l'état vigile. Un groupe de 64 souris sera perfusé pendant 15 minutes ; un groupe de 64 souris sera perfusé pendant 6 heures ; enfin, un groupe de 64 souris sera perfusé pendant 24 heures. Puis les souris seront mises à mort après analgésie et anesthésie profonde.
Impact sur les animaux
- Il est possible de rencontrer des difficultés lors de la pose des cathéters en veine porte. Les souris subissant cette chirurgie pourront présenter une détérioration du vaisseau ou l’apparition d’une hémorragie. - Les souris recevant un gavage de glucose oral pourront présenter une légère irritation de l’œsophage.
Devenir
A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à morts dans le but de mesurer l’expression des transporteurs de glucose dans la veine porte en utilisant plusieurs techniques d’imagerie et de quantification. De plus, le but de ces procédures est de déterminer comment les informations nutritionnelles issues de la veine porte activent le cerveau. Dans cette optique, l’activation du cerveau sera mesurée par des marquages spécifiques sur des coupes histologiques de cerveaux fixés, obtenus après mis à mort d’animaux profondément anesthésiés.
Remplacement
Cette étude ne peut pas être réalisée sur cellules car la fonction étudiée, la détection du glucose dans la veine porte, a des impacts sur l’ensemble du métabolisme et implique des dialogues entre organes. En effet, le glucose produit par l’intestin est détecté au niveau des senseurs de glucose dans les vaisseaux qui vont transmettre un signal nerveux au niveau du cerveau. En réponse, le cerveau va émettre des signaux nerveux en périphérie, régulant l’équilibre énergétique. Conserver la physiologie de l'organisme est nécessaire pour comprendre les mécanismes régulant la production intestinale de glucose et ses impacts sur la physiologie. Les études de ce projet seront donc réalisées in vivo dans des modèles de souris transgéniques ciblant un détecteur de glucose.
Réduction
Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances des modèles animaux et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept, soit au maximum 16 souris par groupe. Ce nombre a été établi sur différents paramètres prenant en compte les seuils de détection des techniques utilisées, l’analyse statistique et la variabilité entre individus De plus, de nombreux autres tissus (foie, cœur, reins, rate, poumons, …) seront prélevés afin de constituer une banque de tissus commune au laboratoire, qui permettra à l’avenir de limiter le nombre d’animaux nécessaires. Au total, ce projet nécessitera au maximum 320 souris transgéniques et contrôles (dont 288 mâles et 32 femelles).
Raffinement
Les souris contrôles, exprimant le récepteur SGLT3, seront commandées à l’âge de 5 semaines et auront ainsi une longue période d’acclimatation avant le début des procédures à l’âge de 12 semaines. Pendant cette phase d’acclimatation, des pesées hebdomadaires seront réalisés et les animaux seront observés et manipulés quotidiennement. Les souris seront élevées et hébergées par groupes, en milieu enrichi pour favoriser la nidation (maison en carton, coton de nidation). L’implantation du cathéter dans la veine porte pour la perfusion de glucose sera réalisée sous anesthésie gazeuse avec un traitement analgésique et antalgique adapté pendant plusieurs jours afin de limiter la souffrance, la douleur et le stress de l’animal pendant et après cette chirurgie. Les cathéters utilisés sont en matériaux biocompatibles (silicone) et de diamètre adapté. Les animaux seront observés et pesés régulièrement. Des signes de maladie, de perte de poids, de souffrance, de lésions ou de détérioration de l’état de santé général constituent des points limites au-delà desquels, si aucun moyen de prévention/correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort. Une étude pilote sera réalisé avec 5 souris ré-utilisées de protocoles antérieurs pour raffiner la méthode de fixation des cerveaux.
Choix des espèces
Le rôle du foie et de l’intestin, deux organes capables de produire du sucre entre deux repas ou lors de jeûne, sur le métabolisme glucidique et énergétique a été étudié chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs, tels que le poisson, montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Ces études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine et la souris est un modèle dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Le modèle de souris est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyse disponibles (anticorps, kits biochimiques…). Les animaux seront tous utilisés à l’âge adulte, chez des souris âgées de 12 à 15 semaines. A cet âge, les individus présentent un meilleur rétablissement post-chirurgical.
Evaluation du potentiel protecteur d’un anticorps antiplaquettaire dans le cas de lésions de reperfusions à la suite d’un accident vasculaire cérébral.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue et toutes classées en souffrance sévère, dans des procédures impliquant la pose chirurgicale d'une fenêtre crânienne. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par obstruction transitoire de l'artère cérébrale moyenne, suivi d'une injection d'anticorps et d'une imagerie du cerveau de deux heures sous anesthésie, avant une mise à mort par dislocation cervicale. Le porteur justifie l'impossibilité de garder les animaux en vie par la nature même de l'expérience, un thrombus occlusif étant provoqué. Il affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas la complexité de la désagrégation plaquettaire et que les plaquettes, cellules anucléées, ne peuvent être cultivées.
Objectifs
Lors d'un saignement les plaquettes s'accumulent au niveau de la lésion formant un clou hémostatique qui stoppe l’hémorragie. Un processus similaire peut survenir dans un vaisseau malade et mener à la formation d'un thrombus entrainant l’occlusion du vaisseau, responsable de maladies graves comme l’accident vasculaire cérébral (AVC) ou l’infarctus du myocarde, qui représentent la première cause de mortalité dans le monde. Une étude clinique très récente indique qu'un nouveau candidat médicament divise la mortalité par 3 de patients qui présentent un AVC ischémique aigu. Le mécanisme d’action de cet agent reste obscur étant donné que l’effet protecteur n’est pas lié à une meilleure recanalisation mais un risque hémorragique diminué, suggérant un impact lors de la reperfusion de la zone du cerveau ayant subit une privation d'oxygène. Ce projet vise à déterminer le mécanisme d’action de cet agent lors d’AVC ischémique chez la souris justifiant ainsi l’utilisation de cet agent pour un futur essai clinique chez l’homme.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet portent sur la possible utilisation d'un nouveau candidat médicament pour de nouvelles indications et d’essais cliniques
Procédures
Tous les animaux subiront : •Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale permettant la pose d’une fenêtre cranienne afin de pouvoir imager le cortex cérébral. 1 fois 45 minutes •Une induction d’un AVC par obstruction transitoire de l’artère cérébrale moyenne du cerveau sous anesthésie générale ainsi qu’une injection par voie veineuse d’un anticorps 4 semaines après la pose de la fenêtre. 1 fois 15 minutes •Imagerie du cerveau par microscopie multiphotonique sous anesthésie générale 1 fois 2h •Mise à mort pas dislocation cervicale
Impact sur les animaux
Lors de l’expérimentation nous pouvons nous attendre à une baisse de la fréquence cardiaque, respiratoire ainsi qu’une baisse de température dû à l’anesthésie de l’animal. Ces paramètres seront surveillés, la concentration d’anesthésique sera ajustée si nécessaire et l’animal sera réchauffé tout au long des procédures. La procédure expérimentale comprenant une chirurgie au niveau du crâne ainsi que du cou de la souris sera réalisée par un personnel expérimenté disposant de la formation requise pour réaliser ce type d’expérimentation limitant ainsi au strict minimum les effets indésirables. De plus les souris seront anesthésiées tout au long des procédures expérimentales et et leur état de santé sera étroitement surveillé. Après la pose de la fenêtre cranienne, nous pouvons nous attendre à une légère perte de poids des animaux qui ne devrait pas excéder 3 jours. Nous nous attendons pas a des effets indésirables après l’induction de l’AVC de plus les animaux seront conservés seulement 24h et seront encore sous traitement analgésique.
Devenir
Le projet porte sur l’étude de l'effet d'un anti-thrombotique dans le cas d'un thrombus occlusif au niveau de l'artère carotide, en conséquence les animaux ne peuvent pas être garder en vie à l'issu de l'expérimentation.
Remplacement
Le but de ce projet est d’évaluer l’effet d’inhibiteurs dans un processus complexe et intégré qu’est la désagrégation plaquettaire. Les modèles in vitro n’étant pas assez sophistiqués pour reproduire toute la complexité de ce processus, un modèle in vivo sera utilisé. De plus, les plaquettes sont des cellules anucléées qui ne peuvent être cultivées, empêchant tout modèle reposant sur la culture cellulaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude sera réduit au minimum. Pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs les effectifs de chaque groupe ont été calculés suivant les tests statistiques en respectant la distribution selon une loi normale. Nous utiliserons des statistiques pour la comparaison de 2 groupes.
Raffinement
Les conditions d’hébergement des animaux sont optimisées par l’enrichissement des cages. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. Les conditions de travail pour l’utilisation de modèles animaux ont été raffinées afin de limiter leur angoisse, stress et douleur lors des manipulations. Lors des procédures, les animaux sont anesthésiés, maintenus à une température de 38°C par l’utilisation d’une plaque chauffante (tout au long de la procédure) et un antalgique sera administré au niveau de la zone de chirurgie. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel qualifié.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont largement répendus et maitrisés. Les techniques de mutagenèse ont permis de générer des souris sur un même fond génétique : •Exprimant la Glicoprotéine VI humaine permettant de tester des anticorps humains chez la souris. •N’exprimant pas la protéine Glicoprotéine VI permettant d’évaluer l’importance de la glicoprotéine dans la formation de thrombus occlusif. Ces lignées sont parfaitement adaptées à cette étude et constituent des outils originaux et uniques. L’expression de la Gliprotéine VI humaine n’induit pas d’effet indésirable notable chez les souris. Ces souris seront utilisées en comparaison de souris contrôles sauvages. Les animaux seront utilisés au stade adulte entre 8 et 24 semaines. Cet âge correspond à la période permettant l’utilisation de souris pubères et ne présentant pas encore syndrome de vieillissement. Nous réaliserons des groupes homogènes en âge.
Etude de l’efficacité d’une immunothérapie selective et prolongée sur un modèle murin de mélanome
- Recherche fondamentale
- Oncologie
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome en sous-cutané, puis des séances répétées d'imagerie sous anesthésie et, pour dix d'entre elles, une injection d'immunothérapie, afin de comparer une administration intra-tumorale couplée à un hydrogel à une administration systémique. Le porteur reconnaît un développement tumoral rapide, atteignant des "masses importantes" occasionnant une gêne pour l'animal. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne permet d'étudier l'effet d'une thérapie sur le développement de tumeurs, les masses étant prélevées après la mise à mort.
Objectifs
L’avènement de l’immunothérapie dans la prise en charge thérapeutique des cancers a permis, en monothérapie ou de manière combinée, l’amélioration de la survie des patients notamment ceux atteints de mélanome. Cependant, cette thérapie lorsqu’administrée en intra veineux est responsable d’effets secondaires systémiques d’ordre immunologique. Pour pallier ces effets secondaires fréquents et parfois sévères, des équipes ont étudié l’injection de l’immunothérapie intra tumorale direct, déjà utilisée dans des études cliniques avec des résultats prometteurs permettant de réduire le nombre d’injection ainsi que les doses utilisées. D’autre part, les propriétés intéressantes des hydrogels thermosensibles telles que la gélification entre 36 et 38°C ainsi que leur dégradation progressive en font un support de choix pour la délivrance ciblée et progressive de drogues intra tumorales permettant de réduire l’élimination sanguine dans ces tumeurs très vascularisées. L’objectif de notre étude est donc de prouver le bénéfice d’une administration intra tumorale de l’hydrogel chargé de l’immunothérapie dans la survie et la réponse tumorale.
Bénéfices attendus
Démontrer l’efficacité d’une administration ciblée et prolongée d’une immunothérapie par couplage avec un hydrogel. Comparer l’efficacité d’une administration intra-tumorale versus systémique. En effet, une thérapie administrée en intra-tumoral permettrait de s’affranchir des effets secondaires consécutifs à une administration systémique.
Procédures
Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie gazeuses (Isoflurane ou sévoflurane). Les 60 animaux de l'étude auront une implantation sous cutanée de suspension cellulaire tumorale. Les 10 animaux du groupe traité par immunothérapie en IP auront une injection IP de 30µL avec une aiguille de 26G. Les 60 animaux seront imagés (TEP, échographie, scanner) tous les 5 jours post-implantation tumorale ou tous les 3 jours post-traitement. L'échographie nécessite 10 minutes d'acquisition, le scanner 5 min et l'imagerie TEP 30min.
Impact sur les animaux
Développement tumoral rapide, atteignant des masses importantes occasionnant une gêne pour l'animal.
Devenir
L'intégralité des animaux utilisés dans ce projet sera mise à mort. Le prélèvement post-mortem des masses tumorales étant nécessaires pour les analyses immunohistochimiques.
Remplacement
Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro ou in silico pour étudier l’impact d’un nouveau médicament / thérapie sur le développement de tumeurs. La souris est un modèle de choix puisqu’elle permet le développement et le suivi de lignées tumorales. L'induction de modèle de mélanome murin chez la souris est une techniques simple et documentée.
Réduction
Sur l’ensemble de ce projet, nous utiliserons au maximum 60 souris âgées d’au moins 7 semaines (jeune adulte). L’imagerie TEP et l’échographie sont des imageries non invasives qui permettent de suivre un même animal de manière longitudinale et contribuant ainsi à hautement réduire le nombre d’animaux. Le choix du nombre d'animaux par groupe tient compte de la possibilité que la croissance tumorale ne soit pas homogène entre les individuts. Le nombre d'animaux par groupe pourra être réévalué à la baisse suite à l'étude préliminaire sur 10 souris. Le nombre de souris nécessaires par groupe a été défini selon notre expérience et non selon une approche statistique. En effet, l'analyse statistique des résultats par comparaison des groupes se fera par tests (ANOVA 2-way, Wilcoxon ou Mann-Whitney) qui nécessitent un minimum de 6 animaux par groupe.
Raffinement
Au cours de l’étude, les souris seront hébergées entre 2 à 5 individus par cages enrichies de dômes, tunnels ou batonnets de bois et copeaux, sur portoir ventilé, dans une pièce avec des cycles de lumière-obscurité de 12h, dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées en permanence et avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel qualifié ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe de souffrance pour la prendre en charge. Pour limiter au maximum la souffrance et le stress des animaux, l’induction des modèles tumoraux se fera sous anesthésie générale selon des protocoles internes validés et une surveillance accrue des animaux se fera jusqu’à leur réveil. La surveillance de l'aspect et de la taille de la tumeur sera réalisée tous les 2 jours afin de vérifier que les points limites spécifiques du projet ne sont pas atteints. Des antalgiques seront administrés en cas de signes de douleurs. Toutes les imageries se feront également sous anesthésie ; nous privilégierons dans ce cas une anesthésie gazeuse qui permet un endormissement et un réveil rapide. Afin d’éviter la souffrance, tout signe et comportement anormal : difficultés à respirer, souris prostrée ou en retrait, ou une perte de poids supérieure à 20% du poids initial des animaux ; entraineront la fin de l’expérimentation, et leur mise à mort sans délai.
Choix des espèces
Le modèle tumorale de mélanome est validé dans la litterature sur cette espèce Les animaux seront utilisés au stade adulte, à 7 semaines, conformément au modèle décrit dans la littérature. Après réception, les animaux seront hébergéspendant 7 jours avant le début du protocole.
Impact de l’inhibition pharmacologique de CD98hc sur la croissance tumorale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 046 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 736 d'entre elles étant classées en souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de tumeur pulmonaire de patient, puis des injections répétées de molécules testées, avec prélèvements de sang et d'urine, pour voir si ces molécules améliorent la réponse aux immunothérapies. Le porteur indique que la croissance tumorale peut provoquer nécrose, inflammation et troubles de la locomotion, et n'exclut pas une dissémination entraînant difficultés respiratoires, convulsions, ataxie ou décubitus. Il affirme recourir aux cultures en co-culture "aussi souvent que possible" mais les juge trop expérimentales, d'où la validation in vivo.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de déterminer si l’utilisation de nouvelles molécules améliore la réponse des cancers pulmonaires aux immunothérapies. Ce projet va s’articuler de la façon suivante : 1) Tester la pharmacocinétique de ces molécules. 2) Tester la spécificité de ces molécules. 3) Analyser si ces molécules permettent une réduction de la croissance tumorale . 4)Tester si ces molécules améliorent la réponse des tumeurs aux immunothérapies.
Bénéfices attendus
L’adénocarcinome pulmonaire est un cancer très agressif dont l’espérance de vie à 5 ans est d’environ 5%. Ainsi, trouver un traitement est primordial pour soigner ces cancers. La découverte de nouvelles molécules pourraient améliorer la réponse des tumeurs aux immunothérapies. Cette étude in vivo va permettre de valider le potentiel thérapeutique de ces molécules.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions : - 5 prélèvements sanguin (durée de l'intervention: 10 min) - 5 prélèvements urinaire par contention (durée de l'intervention: 0 min) - injection sous-cutanée (1 fois au début de l'expérience- durée de l'intervention: 10 min). Pour chaque intervention les animaux seront anesthésiés afin de diminuer le stress.- Greffe de tumeur de patient (1x au début de l'expérience- durée de l'intervention: 15 min). Les animaux seront anesthésiés afin de diminuer le stress. le rasage (2min) sera realisé lorsque l'animal sera anesthésié. - injection en intrapéritonéal des molécules testées, durée de l'intervention: 2 min- 3x par semaine pendant 4 semaines sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
L'implantation de tumeurs au niveau du flanc de l'animal peut induire : - des problèmes liés à la croissance de la tumeur (nécrose, inflammation de la tumeur), des problèmes de locomotion. - des inflammations aux sites d'injections des molécules testées. De plus, nous ne pouvons exclure qu'une modulation de la densité de la matrice extracellulaire peut induire une dissémination tumorale pouvant entrainer des difficultés respiratoires, des convulsions, une ataxie ou un décubitus. C'est pourquoi nous allons analyser les différents organes en coupes histologiques. Les animaux seront suivis régulièrement à l'aide d'une fiche de score.
Devenir
A la fin de l'étude, nous devons collecter et analyser les tumeurs. Les animaux seront tous euthanasiés en fonction de chaque procédure.
Remplacement
Les cultures organotypiques en co-culture avec les cellules immunitaires seront envisagées aussi souvent que possible. Cependant, ces cultures sont encore très expérimentales et ne récapitulent pas l’hétérogénéité cellulaire des tumeurs, c’est pourquoi nous avons besoin maintenant de valider nos résultats in vivo en ayant recours à des animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été choisi afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs avec le nombre de souris minimum.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe et en milieu enrichi. Ils seront surveillés quotidiennement (comportement, apparence, signes cliniques) par le personnel animalier d'une part, et par les personnes en charge de l'expérimentation d'autre part. Si nécessaire, les animaux seront isolés (un par cage) en cas d’agressivité. Les animaux seront également suivis périodiquement à l’aide d’une fiche d’observation. En cas de signe de souffrance, du paracétamol (Acétaminophène 1,5mg/ml dans l’eau de boisson) sera administré (score compris entre 6 et 8) pendant 48h. Si les symptômes persistent l'animal sera euthanasié. Pour l'administration du paracétamol, les souris seront isolées afin de monitorer la prise effective du paracétamol.
Choix des espèces
Nous souhaitons étudier l'efficacité de nos nouvelles thérapies dans la progression des cancers pulmonaires. Dans cette optique, nous avons choisi d'utiliser comme modèle la souris car il existe un modèle de souris immunodéprimée. En effet, nous avons besoin d'un modèle dont le système immunitaire est déffaillant afin d'éviter le rejet de la transplantation de la tumeur humaine. De plus grâce à l'utilisation de ce modèle très bien decrit dans la litterature, nous pouvons reconstituer le système immunitaire humain afin d'être au plus proche de l'environement tumoral du patient. Enfin, de nombreuses études utilisant des tumeurs dérivées de patients utilisent ce modèle, nous permettant ainsi de comparer nos résultats avec ceux de la littérature. Dans cette étude, nous utiliserons des souris âgées d’au moins 8 semaines (âge adulte). En effet, nous avons besoin d'un système hôte mature pour la greffe (pour éviter toute stimulation qui pourrait être liée au stade de développement de la souris) et jeune afin de supporter la durée de croissance tumorale et de traitement.
Caractérisation d’un modèle murin reproduisant une myopathie liée à une déficience en cavéoline 3 et évaluation de potentielles thérapies.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une myopathie liée à un déficit en cavéoline 3, elles subissent des tests de force hebdomadaires, des courses forcées jusqu'à épuisement contraintes par de petits chocs électriques, un isolement de douze heures, des prélèvements sanguins par la queue et des examens cardiaques sous anesthésie. Le porteur reconnaît que les nuisances comprennent la contention, la chute dans la litière et l'extension de l'animal par tirement de la queue, tout en indiquant que les souris ne présentent pas de symptômes cliniques sévères. Il affirme qu'évaluer la force musculaire in vivo est "indispensable" pour tester deux thérapies, les souris étant tuées pour prélever leurs muscles.
Objectifs
Les cavéolinopathies sont des maladies rares du muscle associées à de la faiblesse, des crampes et des douleurs musculaires chez les patients. Actuellement, aucun traitement n’existe. Le but de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique de deux thérapies, capables d’améliorer les fonctions motrices de souris atteintes d’autres maladies du muscle et présentant des symptômes similaires.
Bénéfices attendus
Ce projet pourra fournir les premières preuves de concept pour soigner des patients atteints d'une maladie rare du muscle. Elle permettra, en outre, de mieux comprendre cette maladie et les acteurs impliqués.
Procédures
Des tests de force non invasifs et durant 1 minute au maximum seront réalisés une fois par semaine entre 7 et 12 semaines. Chacun de ces tests sera réalisé 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 mins. Un autre test de fonction motrice consistant à faire courir la souris jusqu'à épuisement sera réalisés entre 1 et 3 fois durant la période de test des animaux et durera au maximum 1h40. L'animal sera également laissé libre dans une cage pendant 12h afin d'étudier ses mouvement spontanés. Des prélèvements de sang seront effectués toutes les deux semaines au maximum et ne dépasseront pas 10% du volume total de l'animal. Durant ces prélèvements, les souris seront maintenues dans un tube pendant moins de 5 mins afin d'avoir accès à leur queue pour la prise de sang. Des tests cardiaques seront réalisés sur des souris anesthésiées au cours de la même expérience, afin de limiter le nombre d'anesthésies. Ces tests dureront au maximum 30 mins. Un test final sera effectué sur souris anesthésiées précédant l’euthanasie des animaux pour mesurer la force musculaire des souris. Ce test dure au maximum une heure. Une biopsie auriculaire durant moins de 2 mins sera effectuée à 3 semaines afin d'identifier les animaux ainsi que leur mutation grâce à l'ADN qui sera extrait de cette biopsie.
Impact sur les animaux
Il est attendu que les animaux n’aient pas de symptômes cliniques sévères. Les nuisances causées par les différents tests sont la contention temporaire de l’animal, la chute de l’animal dans une cage remplie de litière, l’extension de l’animal par tirement progressif de la queue par l’expérimentateur, l’isolement de l’animal dans un cage spéciale pendant 12 h, la contrainte à la course par délivrance de petits chocs électriques et l’anesthésie générale de l’animal.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issu des tests afin de récolter les muscles nécessaires aux analyses moléculaires et d'évaluer à une échelle plus petite les effets potentiellement bénéfiques des thérapies.
Remplacement
Le projet consiste à évaluer l'effet bénéfique de deux thérapies sur le muscle et la fonction cardiaque. Malheureusement, l’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni sur l’ensemble de l’organisme. Evaluer les fonctions motrices et la force musculaire in vivo est indispensable pour déterminer l'efficacité d'un traitement contre des myopathies. Le modèle murin est suffisament proche physiologiquement et structurellement pour étudier la physiopathologie ainsi qu'une potentielle amélioration des symptômes dans le cadre d'une thérapie.
Réduction
La grande majorité des tests étant non invasif, il est possible de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. Les tests histologiques et moléculaires seront effectués sur les mêmes animaux après euthanasie. Ces deux points nous permettent de réduire drastiquement le nombre d'animaux. Le nombre d'animaux a été choisi à partir des données présentes dans la littérature, ainsi que de façon à pouvoir détecter une différence statistiquement significative entre les animaux malades, sains et traités.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage avant d'être hébergés en groupe. Chaque cage sera enrichie avec des nids de chanvre ainsi que du carton, pour permettre aux souris de ronger. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 1 à 2 fois par semaine. Dès lors qu’une perte de poids sera notée, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. L’animal sera sorti de la cage à l’aide d’un tube ou les mains du manipulateur disposées en coupe pour réduire leur stress. Lors de l'évaluation des fonctions cardiaques sous anesthésie, une crème ophtalmique sera appliquée pour éviter l’assèchement des cornées et la phase de réveil s’effectuera sous une lampe chauffante dans une cage où l’animal sera seul, puis l’animal sera replacé dans sa cage avec ses congénères. Durant les mesures de force, l'animal sera anesthésié et analgésié afin d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. Pour chaque anesthésie, la température corporelle de l'animal sera maintenue au moyen d'une plaque et d'une lampe chauffante. Pour chaque expérience de phénotypage, l'animal sera tout d'abord familiarisé avec le matériel pour minimiser autant que possible son stress.
Choix des espèces
Le modèle murin utilisé reproduit les problèmes de dégénérescence de fibres musculaires retrouvés chez les patients. Les souris malades ne présentent cependant pas de symptômes cliniques importants et peuvent vivre aussi longtemps que des souris saines sans être handicapées au quotidien. Dès 8 semaines, on retrouve des défauts de fibres musculaires, et à 12 semaines une forte régénération des fibres. Les tests seront donc réalisés entre 7 et 12 semaines, sur souris adultes.
Evaluation de la tolérance de deux dispositifs (un disque de titane et un implant en silicone) après implantation sous-cutanée chez la souris
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
12 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit sous anesthésie un implant en silicone au graphène ou un disque de titane en sous-cutané, neuf d'entre elles subissant un prélèvement intracardiaque avant la mise à mort destinée à récupérer l'implant et les tissus. Le porteur affirme que ces matériaux, déjà utilisés en clinique, sont "parfaitement tolérés" et que les animaux ne montrent aucun signe de souffrance après réveil. Il indique que les tests in vitro, jugés "indispensables", ont été réalisés, l'étape sur animaux répondant à une demande réglementaire et au choix de l'industriel commanditaire.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer la tolérance d’un implant en silicone traité avec des nanoparticules de graphène pouvant induire un changement de forme (comparé à un implant en silicone non traité) ou d’un disque de titane nano-texturé après une implantation sous-cutanée chez la souris.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont de pouvoir développer des matériaux innovants permettant d’améliorer des dispositifs médicaux (comme des prothèses, des cathéters…). Les disques de titane ont été modifiés pour posséder une nano-texture augmentant leur énergie de surface afin de modifier l’adsorption de protéines. Ce dispositif aura pour but de fournir en toute sécurité des cellules régénératrices et/ ou des produits biothérapeutiques dont les cibles pourraient être les cellules bêta productrices d’insuline. L’implant en silicone coaté avec des nanoparticules de graphène pouvant changer de forme dans le corps sous l’influence d’un stimulus externe permettra une avancée révolutionnaire dans différents domaines d’application tels que la cicatrisation des plaies à la demande, la fermeture de sphincter, la cicatrisation des tissus mous, le réglage de dispositifs médicaux implantés etc…) tout en s’affranchissant d’une ré-ouverture chirurgicale.
Procédures
La mise en place de l’implant chez la souris sera réalisée sous anesthésie fixe 30 min après une administration d’analgésique. La procédure chirurgicale sera réalisée stérilement et le disque (titane ou silicone) sera inséré. La plaie sera ensuite refermée. La durée de la chirurgie pour chaque animal est évaluée à 10 minutes environ. Le changement de forme induite par le dispositif se fera sous anesthésie fixe et ne durera quelques secondes. 9 souris seront soumises à un prélèvement intracardiaque sous anesthésie fixe avant la mise à mort. Les autres souris (3) seront mises à mort par sans prélèvement intracardiaque.
Impact sur les animaux
S’agissant de matériels étrangers implantés en sous-cutané (sans infection bactérienne), les effets indésirables attendus pourraient principalement être de nature tissulaires (nécrose au site d’implantation, œdème, hématome, altération de la morphologie tissulaire). Les implants en titane et en silicone sont déjà largement utilisés en pratique clinique et sont parfaitement tolérés. L’atteinte tissulaire à type de collection purulente (en cas de contamination bactérienne), d’œdème au niveau du site d’implantation peut être attendue mais les expériences menées par le passé par l’équipe montrent que celles-ci sont extrêmement rares voire inexistantes. Les animaux retrouvent une mobilité immédiatement après leur réveil et ne montrent aucun signe de souffrance. De plus les essais in vitro ne montrent pas de toxicité particulière de ces différents supports. Le changement de forme induite par le dispositif Si traité se fera sous anesthésie fixe et ne dura quelques secondes. Si toutefois, l’animal présente un score clinique entre 5 et 7 une injection de buprénorphine pourra être envisagée pour soulager l’animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude afin de récupérer l’implant et le tissu environnant pour une étude histologique et bactérienne
Remplacement
Lors du développement de nouvelles stratégies anti-infectieuses, ou encore dans le domaine de la médecine régénérative, les molécules ou matériaux sont tout d’abord testées selon des méthodes traditionnelles in vitro (mesure de l’activité bactéricide selon différentes normes, de l’inflammation, de changement chimique ou encore de structure). Ces études in vitro sont indispensables à l’avancée des travaux de recherche et développement et ont en effet été réalisés par le commanditaire de l’étude. Les instances règlementaires demandent à ce stade d’évaluer ces nouveaux dispositifs en conditions réelles, c’est-à-dire dans des modèles vivo, afin d’approcher au mieux les conditions de cicatrisation tissulaire.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude a été réduit au maximum : 4 souris par groupe pour évaluer la phase de tolérance des différents dispositifs. - Implant Ti - Implant en Si traité Implant en Si non traité
Raffinement
D’une façon générale pour l’ensemble de l’étude, la prise d’anti-inflammatoires est contre indiquée du fait de l’interaction reconnue avec les modulateurs de l’inflammation. De plus, les marqueurs à analyser lors de cette étude sont essentiellement inflammatoires. L’utilisation d’un antalgique, 30 min avant l’anesthésie permettra de diminuer la douleur et une récupération plus rapide de la mobilité des souris. Lors de la mise en place de l’implant, les souris seront anesthésiées. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant du début de la chirurgie jusqu’à leurs réveils. La plaie sera observée quotidiennement et désinfectée sur les 3j suivant la chirurgie. Les souris reprennent une activité normale dès leur réveil et ne présentent pas de signes de souffrance particuliers, selon l’expérience de l’équipe. Par ailleurs, il s’agit d’une implantation sans infection donc en aucun cas une infection locale ou systémique ne sont anticipées. Si toutefois, l’animal présente un score clinique entre 5 et 7 une injection de buprénorphine pourra être envisagée pour soulager l’animal. Enfin, un enrichissement du milieu (jouets en plastique, igloos en carton) sera utilisé et une surveillance quotidienne sera réalisée tout au long de l’étude.
Choix des espèces
Les modèles d’implant utilisent le plus souvent le cochon d’Inde ou la souris. Dans notre cas, la demande de l’industriel a porté sur l’utilisation de la souris. Des souris C57Bl6 de 7 semaines de façon à avoir un poids corporel de 23-25g