Rongeurs
Etude du rôle des macrophages thymiques dans la mise en place de la myasthénie autoimmune dans le modèle murin
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
270 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées pendant une à six semaines, subissent des tests moteurs répétés et un électromyogramme sous anesthésie, pour tester l'hypothèse d'un lien entre déficit en macrophages thymiques et myasthénie. Le porteur indique que les molécules injectées peuvent provoquer une fébrilité transitoire. Il justifie le recours à l'animal par un "besoin" de valider chez la souris des observations faites chez des patients et in vitro.
Objectifs
La myasthénie grave est une maladie auto-immune rare. Elle est liée à la production d’auto-anticorps dirigés contre le récepteur à l’acétylcholine (RACh), situé à la jonction entre le nerf et le muscle. Ces auto-anticorps altèrent la transmission du message nerveux entre le nerf et le muscle conduisant à des faiblesses musculaires plus ou moins invalidantes. Il n’existe actuellement aucun traitement pour guérir de la myasthénie. Les traitements actuels proposés aux patients sont essentiellement pour limiter les symptômes ou non-spécifiques, et doivent être pris à vie. Dans la myasthénie, si le muscle est l’organe cible, l’organe effecteur est le thymus. Une diminution du nombre des macrophages dans le thymus des patients myasthéniques a été récemment mise en évidence. Notre hypothèse est que ce défaut en macrophages de l’inflammation du thymus à l’origine de la myasthénie. Ce projet de recherche a pour but de démontrer chez la souris qu’une diminution du nombre de macrophages thymiques induit des changements thymiques comme ceux observés chez les patients, et à long terme une myasthénie.
Bénéfices attendus
La myasthénie autoimmune est une maladie chronique invalidante. On ne sait pas exactement encore pourquoi des personnes développent cette maladie. La compréhension des mécanismes étiologiques est donc très importante pour proposer de nouveaux traitements plus adaptés aux patients. En effet, à l’heure actuelle, les traitements proposés sont souvent des immunosuppresseurs à vie et/ou une ablation radicale du thymus. Dans ce projet, nous souhaitons démontrer qu’un défaut en macrophages thymiques serait à l’origine de l’inflammation thymique conduisant à la myasthénie. Il n’y a pas de modèle spontané connu de cette pathologie chez la souris. Nous souhaitons utiliser une combinaison de molécules pour : 1) Démontrer que l’injection intrapéritonéale de ces molécules peut induire au bout d’une semaine, une inflammation dans le thymus. 2) Démontrer que les effets ces molécules sont exacerbés chez des souris transgénique qui ont moins de macrophages. 3) Sur des manipes plus longues (6 semaines), rechercher chez des souris ayant moins de macrophages thymiques, l’apparition de symptômes myasthéniques. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre comment la myasthénie se met en place afin de proposer ensuite de nouvelles approches thérapeutiques aux patients.
Procédures
1) L’injection intra péritonéale consiste à injecter un produit directement dans le péritoine, en bas de l’abdomen, afin d’induire une réponse systémique rapide. Cette manipulation se fait sur souris vigiles et dure quelques secondes. Geste réalisé sur chaque souris et selon les procédures: - 3/sem pendant 1 semaine pour 90 souris – 3/sem pendant 4 semaines pour 36 souris – tous les jours pendant 1 semaine 36 souris – 2/sem pendant 6 semaines pour 108 souris. 2) Les tests cliniques visent à étudier l’activité motrice des différents animaux afin d'évaluer l'apparition de la pathologie et les effets du traitement. L’évaluation comportementale de l’activité motrice des souris est pratiquée à l’aide de tests usuels, basés sur le comportement spontané des rongeurs (Grip test après une course sur tapis de 5 minutes et grille retournée) et la mesure du poids. 5 mesures sont faites par souris pour le grip test et un test de la grille retournée; chaque test durant 1 minute maximum. Ces tests concernent 108 souris et sont menés tout au long du protocole expérimental : une séance d’habituation (pour minimiser le stress associé aux manipulations répétées) est effectuée quelques jours avant la première injection et ensuite des séances régulières sont espacées de 8 à 12 jours. 3) L’electromyogramme permet de suivre le statut myasthénique suite à une stimulation du muscle squelettique. Pour ce protocole les souris sont anesthésiées. Après l’examen, les souris sont ensuite replacées dans leur cage initiale. L’examen, qui dure en totalité de 10 à 15 minutes par animal, sera pratiqué quelques heures avant l’euthanasie de la souris à la fin du protocole expérimentale et ne sera donc réalisé qu’une seule fois par animal. Cette procédure concerne 108 souris dans ce projet.
Impact sur les animaux
Les molécules injectées peuvent entrainer une fébrilité transitoire due à l’activation du système immunitaire. Les injections intrapéritonéales ne sont pas invasives pour les souris, le geste étant rapide et n’entrainant pas de blessure chez l’animal ou de gêne pour le déplacement. Les tests cliniques n’entrainent pas de stress particulier chez la souris. L’électromyogramme sera effectué sur les souris anesthésiées et elles ne ressentiront pas la douleur dût au test. Dès la fin de la manipulation, l’animal est euthanasié et n’est donc pas impacté pour la suite par cette procédure.
Devenir
Tous les animaux à la fin de ce projet sont euthanasiés. Effectivement à la fin de chaque protocole, il est nécessaire de prélever différents organes et tissus pour pouvoir étudier l’impact physiologique et moléculaire des différents traitements utilisés. Ceci a pour but d’optimiser l’utilisation des souris de ce projet.
Remplacement
A ce jour notre projet découle d’observations faites chez des patients myasthéniques et d’expériences in vitro. Maintenant, nous avons besoin de valider nos observations avec des modèles animaux, afin de démontrer que la myasthénie pourrait être due à une diminution des macrophages thymiques
Réduction
Le nombre de souris par condition expérimentale est déterminé pour permettre une bonne analyse statistique des données et par un test de puissance, pour obtenir des résultats fiables à la suite de nos expériences, tout en utilisant le minimum d'animaux. En tout 270 souris sont nécessaires à la réalisation de ce projet expérimentale
Raffinement
Lors de leur arrivée dans l’animalerie, les souris sont acclimatées pendant au moins 1 semaine. Les souris sont stabulées sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (les lumières s'allument automatiquement à 6h du matin et s’éteignent le soir à 18h). L'utilisation de "Sizzlenests" (bandes de papier Kraft autoclavées) permet aux rongeurs de faire rapidement des nids. Le nid leur permet d’être moins dérangés par le bruit, la lumière, le mouvement et les changements de température. Il donne un sentiment de sécurité, ce qui réduit le stress des animaux et donc leur agressivité. Lorsqu'il y a apparition de signe clinique de la maladie, de la nourriture humidifiée est mise dans la cage pour éviter aux souris, si elles sont faibles d'aller chercher la nourriture en hauteur. Afin de limiter au maximum la douleur et le stress chez les animaux lors des injections intrapéritonéales, elles seront effectuées alternativement à gauche et à droite dans la partie basse de l’abdomen. Une séance d’habituation aux tests cliniques est effectuée quelques jours avant la première injection pour minimiser le stress associé aux manipulations. Le score clinique complet est évalué tous les 8-12 jours. Lors de l’électromyographie, la souris est anesthésié afin qu’elle ne ressente pas la douleur. La souris est ensuite euthanasiée juste après les mesures et ne ressent pas les conséquences de ce protocole. Les souris sont surveillées quotidiennement par les animaliers pour repérer d’éventuels signes de mal-être, de blessures ou si elles atteignent des points limites. Dans ces cas la souris est euthanasiée.
Choix des espèces
Les souris sont couramment utilisées pour la mise en place de modèles pour des maladies autoimmunes, dont la myasthénie. L’avantage de la souris est que le système immunitaire est bien mieux connu et que des souris transgéniques, déficientes pour des gènes précis, peuvent être utilisées. Des souris femelles seront utilisées car la myasthénie est une maladie qui touche majoritairement les femmes. Les expériences seront effectuées sur des souris de 6 semaines au début de l’expérience ce qui correspond à l’adolescence, période d’apparition de la maladie chez l’humain.
Identification des précurseurs de macrophages
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent jusqu'à trois injections et un prélèvement de sang, certaines servant de donneuses de cellules de moelle osseuse transférées à des receveuses, pour identifier les précurseurs des macrophages. Le porteur indique que les gestes provoquent surtout un stress de contention de courte durée. Il affirme que ces mécanismes ne peuvent pas être reproduits de façon fiable en culture cellulaire et que les retombées contre les maladies inflammatoires relèvent du long terme.
Objectifs
Les macrophages, cellules du système immunitaire, se différencient à partir de cellules précurseurs hématopoïétiques de la moelle osseuse et migrent dans les tissus où ils protègent contre des maladies infectieuses. L’objectif du projet est de mieux comprendre processus qui gouverne leur différentiation et notamment de mieux identifier les cellules précurseurs de la moelle osseuse. Pour ce faire, nous recueillerons les différents précurseurs hématopoïétiques de la moelle osseuse de souris et les injecterons dans une souris receveuse afin de suivre leur différenciation en macrophages tissulaires dans des conditions inflammatoires et non-inflammatoires.
Bénéfices attendus
Ces résultats apporteront à court terme des données importantes sur l’origine des macrophages et les conditions requises chez l’adulte pour le recrutement des cellules précurseurs dans les tissues et leur différenciation en macrophages. Sur le long terme, ces découvertes permettront de mieux comprendre les maladies inflammatoires comme l’arthrite rhumatoïde et de trouver des nouveaux moyens de traitement. Les macrophages jouant un rôle clé dans la réponse contre des maladies infectieuses, ces expériences peuvent également apporter des moyens innovants de lutter contre des maladies virales ou bactériennes.
Procédures
Au maximum, 3 injections sont réalisées sur animal vigile, une injection sur animal anesthésié et un prélèvement sanguin pendant une période de 6 jours. L’intervalle entre chaque geste est minimum 24 heures. Chaque injection dure 1 à 2 minute, le prélèvement sanguin 3 minutes.
Impact sur les animaux
Les injections et le prélèvement sanguin sous anesthésie nécessitent une contention de courte durée qui peut stresser l'animal. L’injection dans la cavité abdominale sur animal vigile nécessite également une contention source d’inconfort pour l’animal pendant quelques secondes. Aucun geste n’est répétitif. Les produits administrés n’ont pas un effet de nuisance.
Devenir
Mise à mort de toutes les animaux à fin du projet pour analyse moléculaire et cellulaire.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant la formation des précurseurs des cellules du système immunitaire et leur différentiation en macrophages ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduites de manière fiable par des expériences en culture cellulaire.
Réduction
Nos protocoles expérimentaux sont basés sur les paramètres décrits dans la littérature (ex : quantité des produits à administrer), permettant ainsi de réduire le nombre de variables testées, et donc le nombre de souris utilisées. Les sites d’injections ont été choisis de manière à obtenir un drainage quasi exclusif vers des ganglions lymphatiques précisément identifiés, afin de diminuer la variabilité inter-expérimentale. Les données obtenues pour les différents groupes sont comparées par le test statistique adapatés pour permettre de répondre aux objectifs. En prenant en compte la marge d’erreur et l’indicateur de dispersion des valeurs, l'analyse de 10 à 20 souris est suffisante pour tirer des conclusions statistiquement fiables.
Raffinement
Les animaux adultes sont habitués à la contention ce qui contribue à réduire le stress lié à l’injection sur animal vigile. Les injections et le prélèvement sanguin sont réalisés sur animal anesthésié .Quand cela est nécessaire une anesthésie locale est ajoutée à l'anesthésie générale pour renforcer la couverture analgésique. Un temps de récupération minimal de 24 h entre les gestes réalisés sur l’animal est accordé. Le bien-être de l’animal est évaluée par un personnel expérimenté, prenant en compte une surveillance des lieux de d’injection, le poids, l’apparence, le comportement, hydratation, respiration et l’aspect des fèces. Les critères sont notés. Lorsque qu’une anomalie est observée l’animal bénéficie d’une prise en charge adaptée aux problèmes observés. Des points limites spécifiques ont été établis permettant de soustraire l’animal à la souffrance. Les souris seront hébergées par fratrie au sevrage tout en respectant le nombre de souris admis. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. L’hébergement bénéficie d’un enrichissement des cages : tunnel et abris, matériel de nidification et buches à ranger.
Choix des espèces
Les macrophages tissulaires, par exemple ceux des ganglions lymphatiques, et les processus controllant leur formation se ressemblent entre l’homme et la souris. La souris CD45.1 sera utilisée pour les transferts des cellules précurseurs afin de suivre leur différenciation en macrophages. Les souris donneuses seront utilisées à l’âge adulte (8-12 semaines) afin de garantir une hématopoïèse mature. Des nouveaux nées informeront sur la différentiation des macrophages dans un animal en croissance. Des receveuses adultes apporteront des connaissances sur le taux de remplacement des macrophages dans des conditions d’hémostasie, d’inflammation légère. Ces études enrichiront nos connaissances sur l’identité des précurseurs de ces macrophages et les conditions permettant leur remplacement.
Caractérisation in vivo des effets aigus et à long-terme des stimulations magnétiques dans un modèle rongeur d’épilepsie-absence
- Recherche appliquée
- Maladies animales
160 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 85 d'entre eux étant maintenus sous anesthésie jusqu'à leur mise à mort sans réveil. Une partie subit une trépanation et l'implantation d'un dispositif d'enregistrement cérébral, avec les risques de douleur et d'infection que le porteur mentionne, pour tester une stimulation magnétique sur un modèle d'épilepsie-absence de l'enfant. Le porteur décrit la stimulation elle-même comme indolore et renvoie l'usage en clinique au long terme. Il affirme que ces enregistrements in vivo sont "indispensables" et ne peuvent pas être remplacés.
Objectifs
Ce projet a pour but d’évaluer les effets thérapeutiques de la stimulation magnétique transcrânienne sur l’épilepsie dans un modèle rongeur d’épilepsie-absence de l’enfant, le rat GAERS (‘Genetic Absence Epilepsy Rat from Strasbourg’). Par le passé, les neurones à l’origine des crises chez le GAERS ont été identifiés, i.e. une sous-population de neurones présentant une hyperactivité et une hyperexcitabilité. Il a par ailleurs été mis en évidence chez des rats témoins que la stimulation magnétique avait pour effet de diminuer l’activité et l’excitabilité des neurones de la même région corticale que les neurones initiateurs des crises. En admettant qu’elle ait les mêmes effets inhibiteurs sur les neurones corticaux des rats épileptiques, elle pourrait bloquer la genèse des crises et ainsi constituer un nouvel outil thérapeutique prometteur pour le traitement de cette pathologie.
Bénéfices attendus
L’épilepsie-absence est une épilepsie généralisée non-convulsive affectant principalement les enfants et les adolescents. Cette épilepsie se traduit lors des crises par une perte soudaine de conscience associée à un arrêt comportemental. Les crises d’absence sont de courte durée mais surviennent très fréquemment ce qui handicape lourdement les jeunes patients qui souffrent de déficits de perception et de mémorisation. Nous espérons pouvoir corriger l’hyperexcitabilité des neurones corticaux à l’origine du déclenchement des crises d’épilepsie-absence à l’aide de la stimulation magnétique transcrânienne. Notre projet consistera à mettre en évidence les effets de cette stimulation sur les crises chez l’animal vigile et d’en identifier les mécanismes cellulaires chez des animaux anesthésiés à l’aide d’enregistrements électrophysiologiques multi-échelle non réalisables sur les animaux vigiles. A long-terme, on peut envisager que ces stimulations soient utilisées en clinique pour diminuer la fréquence de récurrence des crises chez les jeunes patients.
Procédures
Pour l’étude des effets aigus de la stimulation magnétique cérébrale sur les crises d’épilepsie dans un modèle rongeur de la maladie, des enregistrements de l’activité cérébrale à différentes échelles (au sein d’une région cérébrale et au niveau des neurones individuels) seront réalisés chez des animaux sous anesthésie générale complémentée par une injection d’analgésiques avant et pendant la chirurgie. Au cours des actes chirurgicaux, les animaux seront anesthésiés. Une fois la chirurgie terminée (environ 2h), l’activité cérébrale sera enregistrée de façon à calculer le nombre, la durée et la fréquence des crises d’épilepsie et de recueillir l’activité des neurones (environ 8h). Une session unique de stimulation magnétique transcrânienne indolore sera alors appliquée et les effets de cette stimulation sur les crises d’épilepsie sera étudiée. Un total de 85 animaux sera utilisé recevant une stimulation réelle (n = 50) ou fictive contrôle (n = 35). Cette étude nous permettra d’étudier les effets potentiellement thérapeutiques de ce type de stimulation sur les neurones à l’origine des crises d’épilepsie. Pour l’étude des effets d’un traitement chronique de la stimulation magnétique sur les crises d’épilepsie dans un modèle rongeur de la maladie, les animaux épileptiques et témoins seront stimulés 10 minutes par jour pendant 10 jours. Cette procédure comprend 75 animaux au total (45 rats épileptiques et 30 rats témoins). Pour étudier les effets de ce traitement, durant les 10 jours de stimulation, seront réalisés des enregistrements (1 heure/jour) de l’activité cérébrale en temps réel sur les animaux éveillés. Pour ce faire, des électrodes d’enregistrement seront placées sur la surface du cortex sous anesthésie générale complémentée par une injection d’analgésiques avant, pendant et après la chirurgie. A l’issue de ces 10 jours de traitement par stimulation transcrânienne indolore, seront réalisés des enregistrements comme décrits précédemment. Cette partie de l’étude nous permettra de comparer les effets sur les crises d’un traitement aigu ou chronique.
Impact sur les animaux
Il n’existe pas de nuisances ou d’effets indésirables liés à la stimulation magnétique puisqu’elle est sans bruit, sans vibration et sans douleur hormis un éventuel stress lié à la manipulation des rats lors des séances de stimulation. Les nuisances ou effets indésirables liés aux chirurgies d’implantation pour les enregistrements chez les animaux éveillés sont la trépanation ainsi que les éventuels risques liés à ces chirurgies (douleur, infection, fatigue). Sont à prévoir également les contraintes liées au système d’implantation et à l’hébergement individuel une fois l’implantation réalisée. Enfin, les enregistrements quotidiens nécessiteront un changement d’environnement (aller-retour quotidien entre la cage d’hébergement et la cage d’enregistrement). Les nuisances ou effets indésirables au cours des enregistrements chez les animaux anesthésiés sont liés aux procédures chirurgicales (trachéotomie, trépanation, points d’incision et de contention), à l’anesthésie prolongée lors des enregistrements (manque ou excès d’anesthésiques) et à la mise sous ventilation artificielle après curarisation (blocage de la canule par des sécrétions, volume d’air inspiré insuffisant).
Devenir
A l’issue de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés en raison d’analyses post mortem supplémentaires afin de déterminer les caractéristiques morphologiques des neurones enregistrés et leur localisation au sein du cortex cérébral.
Remplacement
Nos expériences d’enregistrement de l’activité cérébrale in vivo sont indispensables à la réalisation de ce projet et ne peuvent pas être remplacées puisque c’est la seule préparation permettant de caractériser de façon précise les changements d’activité et d’excitabilité induits par la stimulation magnétique transcrânienne. Cependant, les expériences que nous avons précédemment réalisées chez des rats témoins nous ont permis de déterminer la fréquence de stimulation optimale pour diminuer l’excitabilité des neurones ciblés. Nous nous servons donc de cette base d’études pour restreindre le nombre de fréquence de stimulation à tester et ainsi n’effectuer que les expériences nécessaires pour répondre aux objectifs du projet.
Réduction
Une stratégie expérimentale méthodique a été mise en place pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Ainsi, nous nous baserons sur nos études précédentes qui nous permis de déterminer la fréquence optimale de stimulation à appliquer pour réduire l’excitabilité corticale. Nous combinerons également différents protocoles (différents tests sur l’activité et les propriétés des neurones à l’échelle unitaire, enregistrements de longue durée et si possible de plusieurs neurones/animal) au sein d’une même expérience, ce qui nous permettra de n’utiliser que les animaux nécessaires à l’obtention de résultats fiables et reproductibles. Enfin, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance (160 animaux au total) et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Après la chirurgie, l’animal sera isolé dans une cage enrichie afin d'éviter toutes morsures du connecteur par un congénère. Pour faciliter l’hydratation, de l’hydrogel et des croquettes seront placés dans la cage. Une surveillance sera effectuée durant 72h par un personnel compétent afin de s'assurer de l'absence de points limites. Nous réaliserons une pesée quotidienne des animaux pendant ces 72 h, puis de façon hebdomadaire afin d’éviter une perte de poids supérieure à 10%/24h comparé au poids précédent la chirurgie. Un antalgique sera administré après la procédure. Cependant, si des points limites étaient observés, nous mettrons en place un traitement analgésique supplémentaire. Enfin, en cas d'observation de léthargie, d’inconscience, d’immobilité ou de perte excessive (> 10 %) ou prolongée (> 3 jours consécutifs) de poids, l’animal sera euthanasié. Des enregistrements électroencéphalographiques d’une heure/jour seront effectués dans des cages d’enregistrements adaptées permettant un accès libre à l’eau et à la nourriture. Ces enregistrements seront précédés d’une période d’acclimatation de 30 minutes, afin de réduire le stress. La température de la pièce et le comportement de l'animal seront monitorés par un système d’enregistrement vidéo et pourront être visionnés à distance. En amont de la période d’enregistrement et de la chirurgie, les animaux seront habitués à la cage d’enregistrement à raison d’une heure par jour durant 5 jours. Les stimulations (indolores et sans bruit) seront appliquées 10 minutes chaque jour durant 10 jours. L’animal sera donc maintenu par l’expérimentateur. Afin d’habituer les animaux à la manipulation humaine, une semaine avant la chirurgie d’implantation, les rats seront quotidiennement manipulés à raison de 15 minutes par jour. Un soin tout particulier sera apporté à la réduction de l'inconfort, de la douleur ou du stress des animaux grâce à une surveillance constante des paramètres physiologiques (activité cérébrale, fréquence cardiaque, température, oxygénation du sang) et la mise en place de protocoles d'interventions spécifiques (utilisation appropriée d'anesthésiques généraux ou locaux et myorelaxants, analgésie) pour chaque indicateur de souffrance (sensibilité au pincement de la patte, réflexes musculaires, variation de température ou de la fréquence cardiaque, modification de l’activité cérébrale). Avant l’enregistrement, 30 à 40 minutes d’acclimatation sera observée.
Choix des espèces
Les expériences seront réalisées sur des rats épileptiques ainsi que sur des rats témoins « normaux », âgés de deux à six mois, pesant de 250 à 450 g. La souche de rat épileptique utilisée ici est reconnue comme étant un excellent modèle d’épilepsie-absence parce qu’elle présente une très forte homologie (propriétés des crises) avec la pathologie humaine. Les rats témoins constitueront les rats « contrôles » non-épileptiques. Nous utiliserons des rats GAERS adultes, stade auquel ils présentent des crises matures typiques et des rats Wistar du même âge comme contrôles pour que l’âge ne puisse pas biaiser nos résultats.
Implication fonctionnelle de diverses structures cérébrales dans les troubles anxio-dépressifs liés à une douleur chronique par constriction du nerf sciatique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent une constriction du nerf sciatique et des chirurgies cérébrales avec implantation d'une fibre optique, puis des tests de douleur et des tests anxio-dépressifs, pour étudier les structures cérébrales liées à la douleur chronique. Le porteur indique que cette douleur ne peut pas être soulagée "car c'est l'objet de l'étude" et que les animaux vont développer des troubles anxio-dépressifs. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut remplacer l'observation comportementale sur l'animal vigile.
Objectifs
La douleur neuropathique est consécutive à une lésion ou une pathologie du système nerveux responsable des sensations somatiques. Généralement chronique, avec une prévalence de 5 à 7% dans la population, elle s’accompagne d’un fort risque de développement de troubles de l’humeur (anxiété, dépression). En effet, environ 50% des patients présentent ces deux symptômes associés : douleur chronique et troubles de l’humeur. Ceci constitue un enjeu important de santé publique. Malgré les données cliniques, les mécanismes sous-jacents de ce lien entre ces 2 pathologies (douleur et troubles de l’humeur) restent encore inconnus et nécessitent des études précliniques. Chez la souris mâle des données de la littérature suggèrent que plusieurs structures cérébrales clés seraient impliquées dans les conséquences affectives à long terme d’une douleur neuropathique. Les données clinique chez l’homme mais également préclinique chez l’animal montrent que non seulement la dépression majeure mais aussi les situations douloureuses s’accompagnent de changements dans des structures cérébrales bien précises. Mais de nombreuses données de la littérature montrent également d’importantes différences dans la sensibilité à la douleur entre les hommes et les femmes ; données également observées chez les rongeurs. De plus, la prévalence des troubles anxieux et dépressifs, dans la population ainsi que chez les patients douloureux chronique, présente également des différences intersexuelles. De telles différences suggèrent très probablement des mécanismes spécifiques à chaque sexe. Ainsi, bien que les régions cérébrales impliquées dans les troubles de l’humeur provoqués par la douleur chronique soient sans doute les mêmes, les altérations des réseaux que ces structures forment sont sans doute différentes chez des individus mâles et femelles. Le but de ce projet est donc de comparer les changements anatomo-physiologiques éventuels entre mâles et femelles dans un modèle spécifique de douleur neuropathique.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est d'étudier les modifications d’activité et d’interaction dans trois régions cérébrales pouvant être à l’origine du lien entre la douleur chronique et les troubles de l’humeur. A l’issue de ce projet, nous serons en mesure de détailler pour la première fois les adaptations d’activité cérébrale liées au développement des comportements de type anxieux et dépressif chez les deux sexes. Cette avancée pourrait permettre de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques (structures cérébrales d'intérêts) spécifiques au sexe et donc potentiellement différentes chez le mâle et la femelle.
Procédures
Les animaux seront soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. Ils subiront une chirurgie au niveau de la patte droite de l'animal d’une durée de 10 min environ et pour certains à 2 chirurgies stéréotaxiques avec injection de virus puis implantation de fibre optique d’une durée de 45 min environ. Ces 3 chirurgies se dérouleront sous anesthésie, soit 3 anesthésies générales. Les animaux subiront 3x le test de douleur d'une durée de 20 minutes environ avec 10 min d'habituation) avant la chirurgie neuropathique puis deux fois par semaine (délai d’1 semaine minimum après les chirurgies avant la reprise des tests) jusqu’à la fin du protocole expérimental soit un total de 15 tests maximum. Ils subiront également 1 semaine après la 2ème chirurgie stéréotaxique, 5 tests anxio-dépressifs d'une durée de 5 à 10 min selon le test (avec 24h minimum entre chaque test).
Impact sur les animaux
Il y a présence de douleur qui ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude. Suite à la chirurgie neuropathique (présente dans toutes les procédures de ce projet), une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 48-72h après la chirurgie. Les chirurgies neuropathique et d’injection cérébrales peuvent induire une inflammation et/ou infection et/ou une perte de poids de l’animal qui seront suivi et pris en charge. Les animaux vont développer des troubles anxio-dépressifs, objectifs de l'étude.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort pour prélèvements et analyses anatomiques des structures cérébrales impliquées.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l'analyse fonctionnelle du développement des troubles anxio-dépressifs dans un modèle de douleur neuropathique nécessite une observation comportementale réalisée sur l’animal vigile.
Réduction
Afin d’obtenir des résultats fiables et robustes à l’issue de l’étude tout en tenant compte des variabilités entre individus, le nombre d’animaux utilisé a été déterminé statistiquement. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure. Pour cette raison une même cohorte d’animaux sera étudiée et caractérisée au niveau comportemental et émotionnel, puis fera l’objet d’investigations anatomiques.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des enrichissements sont placés dans la cage pour favoriser le bien-être animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Des points limites ont été établis pour l’ensemble des procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le modèle de douleur neuropathique utilisé dans cette étude a été caractérisé et validé pharmacologiquement chez la souris et non dans une autre espèce comme le rat par exemple. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g).
Etude des conséquences des troubles métaboliques dans le contexte de l’accident vasculaire cérébral dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
1 188 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Après trois mois de régime enrichi en graisses, elles subissent une chirurgie provoquant un accident vasculaire cérébral, puis des tests de comportement et de l'imagerie, pour étudier la réparation cérébrale liée à l'âge et aux troubles métaboliques. Le porteur indique que le modèle induit une douleur peropératoire, une perte sensorimotrice, une prise de poids importante et une possible déshydratation. Les bénéfices pour l'être humain restent au conditionnel, tandis que le porteur affirme que l'étude ne s'envisage que dans un "organisme entier" et juge le passage à l'animal "indispensable".
Objectifs
Cette étude a pour objectif de caractériser le rôle de l’âge et des perturbations métaboliques qui font partie des facteurs de risque bien identifiés dans les pathologies cardiovasculaires, première cause de mortalité dans le monde dont l’accident vasculaire cérébral (AVC) fait partie. L’étude s’intéressera particulièrement à comprendre les mécanismes impliqués dans la réponse et la réparation cérébrale et vasculaire suite à un AVC, en prenant en compte ces facteurs de risques. A terme, l’objectif est d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour offrir des possibilités adaptées d’améliorer les résultats cliniques suite à un AVC.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent la progression des connaissances scientifiques, connaissances qui pourront être appliquées à l'Homme et ce grâce à la prise en compte de la réalité de la clinique (âge et comorbidités). Il pourra en découler l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Après 3 mois d'alimentation enrichie en protéines et en lipides et pauvre en glucides, les souris suivent un test d’intolérance au glucose (1 injection de glucose et prélèvement de 5 gouttes de sang pour mesure de la glycémie toutes les 30 min pendant 2h). Puis, nous mimerons l’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique en utilisant un modèle in vivo d'ischémie cérébrale (chirurgie sous analgésie et anesthésie gazeuse d'une durée de 15+5 min, suivie de 2 injections d'analgésiques 2 fois par jour pendant 3 jours). Les effets du régime sur la réponse à l’ischémie seront analysés 48h, 7 et 21 jours après la mise en place du modèle d’AVC à l’aide de tests de comportement (3 tests d'une durée de moins d'1 min par test) et de l’imagerie (méthode non invasive).
Impact sur les animaux
L’âge et le changement de l’alimentation induit une prise de poids qui est conséquente (animaux de 35 – 60g). La douleur induite par l’injection dans l'abdomen de glucose peut également être une nuisance pour l’animal. Le modèle d’AVC induit une douleur peropératoire et perte sensorimotrice. Une perte de poids et déshydratation peuvent également être attendues.
Devenir
La mise à mort est nécessaire pour récupérer les tissus et faire une étude protéique, moléculaire et de tri cellulaire.
Remplacement
Le projet a pour but d’étudier l’ischémie cérébrale, qui met jeu en des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants puisque l'étude des conséquences métaboliques du vieillissement et son retentissement sur le vaisseau et sa fonctionnalité, avec ou sans traitement, ne peut s'envisager que dans un organisme entier.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques dons le calcul de puissance est effectué en utilisant le logiciel in vivoStat. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu de vieillissement vasculaire et un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’AVC. De plus, le plus grand nombre de tissus et organes d’un animal mis à mort sera systématiquement prélevé et stocké pour l’utilisation de projets futurs sur les rôles de ces perturbations métaboliques.
Raffinement
Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement antalgique (buprénorphine) en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 72h. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse par isoflurane). En post-chirurgie une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et/ou mis à mort selon le score.
Choix des espèces
Des études précédentes ont montré la pertinence du modèle murin pour étudier les maladies cardiovasculaires liées à l’âge et ses comorbidités. Après une étude in vitro rapportant les effets d’un modèle de stress métabolique sur les fonctions angiogéniques et sécrétoires des cellules endothéliales, le projet a pour but maintenant d’étudier l’ischémie cérébrale, représentant un enjeu majeur de santé publique, qui met en jeu des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il est donc indispensable de passer à des études chez l’animal. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’AVC et du vieillissement vasculaire. L’ischémie cérébrale étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte avec des facteurs métaboliques aggravant comme le diabète, les animaux seront utilisés au stade adulte après un régime conduisant à des perturbations métaboliques systémiques en accord avec les recommandations données par le groupe de réflexion sur les modèles précliniques d’AVC. Les souris utilisées pour cette étude seront âgées de 24 semaines (6 mois) avant les 3 mois de régime (âge nécessaire pour avoir un vaisseau mature et qui peut subir un vieillissement vasculaire semblable au vieillissement vasculaire humain).
Mécanismes de l’atteinte des vaisseaux sanguins dans le diabète chez la souris, multisites 1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues diabétiques et hypertendues, elles reçoivent des injections intrapéritonéales quotidiennes, subissent une chirurgie, des séjours en cage métabolique et une échographie sous anesthésie, avant un prélèvement sanguin terminal, pour étudier l'atteinte des vaisseaux dans le diabète. Le porteur indique que ces modèles peuvent provoquer une atteinte du coeur, des reins et des rétines. Le seul bénéfice avancé est une meilleure compréhension de la maladie, et le porteur affirme que les cultures cellulaires ne reproduisent pas la complexité des mécanismes en jeu.
Objectifs
Le diabète est une maladie vasculaire très répandue affectant plus de 500 millions de personnes en 2021. Les cellules endothéliales, tapissant la face interne des vaisseaux, sont les premières affectées par les modifications métaboliques générées par le diabète. Il est connu que l'excès de sucre dans le sang et une dérégulation de la composition du gras participe à l'atteinte des vaisseaux que l'on retrouve chez les patients diabétiques. Nos données ont permis d'identifier un potentiel système dérégulé dans le diabète et participant au maintien du fonctionnement normal des vaisseaux sanguins. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle de la protéine identifiée sur les vaisseaux chez des souris diabétiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension de l'atteinte des vaisseaux sanguins dans le diabète.
Procédures
Une injection intrapéritonéale quotidienne pendant 5 jours (20 sec/ jour) puis pendant 2 jours (20 sec/ jour). Une procédure chirurgicale (10 min). Prélèvements urinaires en cage métabolique sur animal vigile (6 heures d'isolement par semaine). Mesure non invasive de la pression artérielle (15min par semaine) et échographie sous anesthésie (20min). Un prélèvement sanguin terminal sur animal anesthésié (1 minute).
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l'expérimentation: inconfort lié à la préhension des animaux, douleur au point d'injection, inconfort lié aux cages métaboliques. Effets de la chirurgie: douleurs post-opératoire soulagée par des analgésiques. Effets des modèles pathologique de diabète et d'hypertension artérielle: potentiellement atteinte des organes cibles (coeur, reins et rétines).
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes
Remplacement
Nous utilisons différentes approches pour analyser les mécanismes de l'atteinte microvasculaire liés au diabète incluant les cultures cellulaires. En général, les expériences de remplacement ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours du diabète comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire ou les interactions entre organes. C'est pourquoi nous aurons aussi recours au modèle animal, en choisissant la souris comme modèle classique de mammifère, et comme modèle expérimental établi, avec de nombreux outils génétiques disponibles, un temps de génération court et des portées de grande taille.
Réduction
Réduction : le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait sur le logiciel en ligne https://sealedenvelope.com/power/continuous-superiority/ ce qui donnait 25 animaux par groupe requis. 5 animaux de plus sont prévus par groupe pour pallier aux risques du modèle expérimental. Nous optimisons l'utilisation des organes pour les différentes analyses afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Raffinement : les animaux seront élevés en cages enrichies avec eau et nourriture ad libitum et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Une grille de score de souffrance et des points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. Les souris diabétiques et hypertendues urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux par cage est limité à 3 et les cages sont changées plus fréquemment et dès que nécessaire. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie péri-opératoire.
Choix des espèces
La souris est un modèle permettant de réaliser des expériences de physiopathologie de mammifère. De plus, les modèles de diabète et d'hypertension artérielle utilisés au cours de ce projet sont établis et validés par la communauté scientifique. Souris adultes agées de 8-12 semaines car il faut de jeunes adultes. En effet, l'age est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop agées induirait une plus grande variabilité de nos résultats expérimentaux.
Etudier le rôle de Clec1a dans un modèle murin de dommage tissulaire suite à une intoxication par l’acétaminophène.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Après un jeûne, elles reçoivent une injection intrapéritonéale de paracétamol à dose sous-létale, puis subissent des prélèvements de sang et le prélèvement du foie, de la rate et des ganglions, pour étudier le rôle du récepteur CLEC-1 dans les dommages du foie. Le porteur indique qu'à cette dose les souris ne perdent pas de poids et ne meurent pas, et qu'un mauvais état général conduirait à leur mise à mort. Les retombées pour l'être humain, un blocage de CLEC-1, sont renvoyées au long terme, tandis que le porteur affirme que ce dommage ne peut pas être reproduit in vitro et présente la preuve de concept chez l'animal vivant comme "essentielle".
Objectifs
La compréhension de la réponse immunitaire qui est impliquée dans de nombreuses pathologies telles que les maladies inflammatoires et auto-immunes est nécessaire afin de développer des approches thérapeutiques innovantes en cliniques. Aussi, il est important de déterminer finement les mécanismes liés à la réponse immunitaire dans des modèles in vivo chez la souris par le système d'ablation génétique d'un gène d'intérêt pour établir la preuve de concept de leur potentiel thérapeutique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices à court terme seraient d'établir in vivo la preuve de concept que l'absence du récepteur CLEC-1 (C-type Lectin-1) permet de moduler la réponse immune suite à un dommage tissulaire et permet de rétablir l'homéostasie tissulaire qui est perdue dans de nombreuses pathologies suite à des inflammations ou des infections. Ceci ne peut pas être fait in vitro et cette validation est nécessaire in vivo pour observer l'homéostasie tissulaire. A long terme, le blocage de CLEC-1 par des voies thérapeutiques chez l'Homme pourra ainsi être envisagé.
Procédures
Nous injecterons par voir intrapéritonéale de l'acétaminophène aussi appelé paracétamol à des doses sous léthales à des souris contrôles sauvages (WT) et déficientes (KO) pour Clec1a sevrées de toute alimentation solide dans les 12h précédentes afin de reposer leur système hépatique. A cette dose sous léthale, les souris ne meurent pas et ne perdent pas de poids. Les souris seront étudiées ensuite à 24, 48, 72 ou 96h après l'intoxication sous anesthésie par inhalation d'isoflurane. Du sang sera prélevé au niveau de la veine faciale maxillaire des souris. Ceci permettra d’en isoler le sérum pour étudier le niveau des enzymes transaminases du foie ASAT et ALAT qui reflèteront le dommage tissulaire. Le foie ainsi que la rate et les ganglions seront prélevés pour analyser la réponse immunitaire par cytométrie de flux. Puis, ces animaux qui seront sous perte de conscience par l'isoflurane, seront mis à mort par inhalation de CO2.
Impact sur les animaux
Les animaux à cette dose sous léthale ne perdent pas de poids et ne meurent pas. Aucune altération de l'état général n'est habituellement observée par l’intoxication. Cependant, ce modèle d’intoxication à l’acétaminophène nécessite un sevrage préalable. Afin d’éviter les conséquences physiologiques néfastes pour les souris de baisse de température du au temps de jeûne nocturne, nous limiterons le jeûne nocturne à 12h avant l’injection à l’acétaminophène.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, plus aucune autre utilisation n'est possible car les animaux ont subi un dommage du foie donc les animaux même s'ils n'ont pas atteints le point limite, seront tous mis à mort au maximum 2 semaines après l'injection de l'acétaminophène.
Remplacement
Le meilleur moyen pour étudier le rôle d'une molécule sur une réponse immune qui est complexe et qui fait intervenir de nombreux acteurs cellulaires est in vivo et ce en utilisant des animaux génétiquement modifiés ; en effet, notre molécule CLEC-1 étant exprimée par de nombreux types cellulaires et ayant un rôle sur de nombreux acteurs de l'immunité, il n'est pas possible de reconstituer un modèle de dommage tissulaire et d'étudier l'homéostasie d'un tissu dans des modèles in vitro.
Réduction
Nous limiterons le nombre de souris et utiliserons le minimum de souris estimé pour obtenir des différences significatives et reproductibles sur l'étude de la réponse immunitaire en prenant en compte l'hétérogénéité de ce modèle. Nous avons estimé le nombre minimum de souris à utiliser pour obtenir des différences significatives grâce au logiciel du « Experimental Design Assistant ». Nous envisageons donc d’utiliser 10 souris par groupes. Donc, nous planifions d'utiliser des groupes de 40 animaux WT et 40 animaux KO pour ce modèle d'intoxication à l'acétaminophène.
Raffinement
Les animaux à cette dose sous léthale d'acétaminophène ne perdent pas de poids et ne meurent pas. Aucune altération de l'état général n'est habituellement observée par l’intoxication. Cependant, ce modèle d’intoxication à l’acétaminophène nécessite un sevrage préalable. Afin d’éviter les conséquences physiologiques néfastes pour les souris de baisse de température du au temps de jeûne nocturne, nous limiterons le jeûne nocturne à 12h avant l’injection à l’acétaminophène. Par ailleurs, nous ajouterons des nids de coton dans les cages pour que les souris puissent se réchauffer. Un suivi quotidien du poids des animaux et de leur état général (attitude prostrée, poils hérissés, etc..) sera effectué. L’observation d’une perte de poids et/ou d’une attitude indiquant un état non naturel (attitude prostrée, poils hérissés, etc..) conduira à l’euthanasie de l’animal.
Choix des espèces
Pour étudier le rôle de la léctine de type -C 1 (CLEC-1), nous devons utiliser des souris déficients dans le gène Clec1a (Knock Out KO) pour tester son rôle in vivo dans des modèles expérimentaux de dommage tissulaire induit par intoxication à l'acetaminophène. Ces souris ont été génétiquement modifiées pour déléter le gène clec1a. Ces souris sont donc spécifiquement confinées dans des cages bien répertoriées lors de l'élevage et du transport et ne sont pas mélangés à d'autres types de souris. La preuve de concept in vivo est essentielle et ces souris qui ont cette ablation génétique permettent de réaliser ce type d'expérience in vivo pour mimer ce qui se passe dans des pathologies en clinique.
Identification du rôle d’une hormone dans le psoriasis chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rasées puis enduites d'une crème à l'imiquimod provoquant des lésions cutanées, elles reçoivent des injections sous-cutanées et un prélèvement de sang par voie rétro-orbitale, avant la mise à mort pour prélever la peau et divers organes. Le porteur indique une perte de poids d'environ 10 %, une peau rouge, squameuse et lésée après 48 heures, et un stress lié à la contention quotidienne. Il vise à comprendre le rôle d'une hormone du fer dans le psoriasis et à tester des pistes thérapeutiques.
Objectifs
Le psoriasis est une maladie inflammatoire chronique qui affecte principalement la peau et est associée à des comorbidités importantes. C'est une maladie courante qui touche 2 à 3 % de la population mondiale, sans distinction d'âge, de sexe ou d'ethnie. Les différents types comprennent notamment le psoriasis en plaques (ou psoriasis vulgaire), le plus répandu et le psoriasis pustuleux (PP), considéré comme plus résistant. Le PP, caractérisé par des pustules riches en cellules immunitaires, ne représente qu'une petite fraction des cas, mais peut mettre la vie des patients en danger lorsqu'il est étendu. Malgré des avancées majeures dans la compréhension de sa pathogenèse et dans son traitement, le psoriasis reste une maladie chronique courante dont les causes ne sont pas encore totalement élucidées. Le PP est particulièrement difficile à traiter. Des études ont montré une augmentation des niveaux de fer dans la peau de patients atteints de psoriasis. Le fer est indispensable au niveau cellulaire mais peut être toxique lorsqu’il est en excès. Il existe une hormone, principalement produite par le foie, qui régule les niveaux de fer dans l’organisme. Ce petit peptide est, de manière inattendue, exprimé dans la peau de patients atteints de psoriasis. Des données montrent que l'accumulation du fer et de "l'hormone du fer" dans la peau de patients souffrant de psoriasis est néfaste. Le projet visera à comprendre les mécanismes par lesquels cette hormone induit des effets délétères chez ces patients, mais également visera à tester différents agents thérapeutiques (médicaments ciblant le fer ou l'hormone) dans un modèle murin de psoriasis.
Bénéfices attendus
Dans la peau, l’hormone de régulation du fer pourrait avoir un rôle pro-inflammatoire en induisant d’une part la rétention de fer dans les cellules de ce tissu et d’autre part en activant les cellules immunitaires. Ce projet pourrait avoir des retombées en recherche fondamentale (meilleure connaissance des processus physiopathologiques du psoriasis) mais également en recherche appliquée en porposant de cibler l’hepcidine ou le fer comme alternative thérapeutique au traitement du psoriasis.
Procédures
Les souris seront rasées au dos avec une tondeuse sous anesthésie (1 minute par souris). Une crème est appliquée (temps d’application : 30 secondes) sur des animaux vigiles suite à une prise en contention 1 fois/jour pendant 1 à 5 jours. Le poids des animaux est pris chaque jour après l’application de la crème. Une injection en sous-cutané (temps de la réalisation impliquant la contention: 20 secondes) est réalisée 2 fois (Jour 0 et jour 3 suivant l’application de la crème).30 minutes avant le prélèvement de sang, les souris seront injectées avec un analgésique (temps de réalisation impliquant la contention : 30 secondes); 500µl de sang seront prélevé par voie rétro-orbitale. (1 minute par souris).
Impact sur les animaux
Les animaux perdent du poids jusqu’au 3ème jour (environ 10% de leur poids) puis commencent à récupérer à nouveau. La peau traitée par l’imiquimod devient rouge après 48h avec des lésions et des écailles. Un stress est généré par la contention quotidienne et les injections.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort pour prélever la peau et d'autres organes à des fins d'analyse immunohistochimique, d'expression génique, d'expression protéique et de cytométrie en flux.
Remplacement
Des tests in vitro sur des cellules de la peau ont été effectués en amont pour déterminer le rôle de l’hormone du fer dans l’inflammation. Nous avons en parallèle accés à des biopsies de patients atteints de psoriasis.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. L'étude statistique permet de calculer au plus juste le nombre d'animaux à utiliser.
Raffinement
Pour respecter le principe des 3R, la durée et la dose de traitements utilisée seront réalisées selon les protocoles préétablis. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance quotidienne et des soins adaptés. Le raffinement comprend l'utilisation d'anesthésie (pour rasage et avant exsanguination) et d'analgésie (avant exsanguination) et la surveillance quotidienne des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les études de processus inflammatoires et pour évaluer l’infiltrat immunitaire. Seule cette espèce possède des modèles murins génétiquement modifiés permettant l’étude de ce gène au cours de ces pathologies. De plus, la peau murine est similaire à la peau humaine (consituée de 3 parties : épiderme, derme, hypoderme). Des souris adultes de 8 à 12 semaines seront utilisées, car à cet âge la repousse du poil est la plus lente, donc adéquate pour le rasage du dos des souris. De plus, à cet âge, le système immunitaire est mature ce qui est indispensable à l’étude du psoriasis.
Rôle de la réponse inflammatoire microgliale postprandiale dans le contrôle de la prise alimentaire, étude nutritionnelle.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
258 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale unique d'un agent modifiant les lipides sanguins puis d'un anesthésique, avant la mise à mort pour prélever le cerveau et analyser une réaction inflammatoire survenant après un repas gras. Le porteur limite les nuisances à la contention et à cette injection unique. Le bénéfice annoncé, mieux comprendre l'appétit et des troubles comme la boulimie ou l'anorexie, reste éloigné de ce protocole mécanistique.
Objectifs
L’existence de la réaction inflammatoire postprandiale (PIR) systémique est maintenant bien documentée. En revanche, ses effets sur l’organisme et les mécanismes biologiques sous-jacents induisant la PIR sont encore mal connus. La PIR apparaît chez l’individu sain dans un contexte de physiologie normale. Elle se caractérise par l’augmentation transitoire de facteurs inflammatoires circulants après un repas, qui est exacerbée lors d’une consommation d’un repas gras. Récemment, l’équipe a montré que la PIR se développait aussi dans le cerveau, elle se caractérise par une activation des cellules spécifiques chez l’individu sain en réponse à un repas gras. Cette réponse est visible 3 heures après le début du repas, et elle se produit dans une structure impliquée dans la régulation de la prise alimentaire. Les médiateurs biologiques qui déclenchent la PIR cérébrale ne sont pas identifiés. Une hypothèse serait que les lipides nutritionnels qui se retrouvent dans la circulation générale après digestion et absorption soient capables de stimuler la réponse des cellules du cerveau. La stratégie consistera à manipuler l’hypertriglycéridémie postprandiale et à mesurer la réponse cellulaire cérébrale. L’hypertriglycéridémie sera suivie par analyse biochimique sanguine, et la réponse cellulaire cérébrale sera mesurée par microscopie sur coupes de cerveau. Nous utiliserons : 1) une solution de nutrition parentérale à base d’huile de soja, qui permettra d’élever artificiellement les triglycérides plasmatiques en l’absence de prise de repas, 2) un agent pharmacologique qui permettra d’élever les lipides sanguins en l’absence de prise de repas, et 3) un agent pharmacologique qui limitera l’hypertriglycéridémie postprandiale. Ces agents pharmacologiques seront administrés par voie intrapéritonéale, qui constitue une voie d’administration adaptée pour ces études mécanistiques. Une étude dose-réponse au cours du temps sera réalisée aux temps : T0, T1h, T2h, et T3h. Les cerveaux de ces animaux seront étudiés après mise à mort afin d’analyser la réponse cellulaire cérébrale dans différentes conditions. 258 souris C57Bl6J seront utilisées dans ce projet.
Bénéfices attendus
Les résultats permettront de mieux comprendre les caractéristiques de la PIR cérébrale et donnera des informations nouvelles sur l’intégration cérébrale de l’état métabolique chez l’individu obèse. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur le contrôle de l’appétit, et pourrait permettre de mieux comprendre les troubles du comportement alimentaire tels que la boulimie, l’hyperphagie, ou l’anorexie.
Procédures
Les animaux seront soumis à des contentions et des injections intrapéritonéales d’agent pharmacologique et d’anesthésique avant la mise à mort. Ces injections seront réalisées une seule fois par animal. Les effets des traitements seront mesurés trois heures après injection.
Impact sur les animaux
Les expériences pharmacologiques durent 3 heures au maximum et ne génèrent pas de souffrance chronique. La contention des animaux et les injections intrapéritonéales d’agent pharmacologique et d’anesthésique avant la mise à mort représentent les seules nuisances sur les animaux dans ce projet. Ces injections seront réalisées une seule fois par animal.
Devenir
Les 258 souris seront toutes mises à mort afin de prélever le cerveau en vue d’analyses histologiques.
Remplacement
Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes et les sensations de faim et de satiété que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ainsi ce projet sera réalisé chez la souris, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire.
Réduction
La procédure décrite (mise en place de conditions prandiales définies) a été optimisée, standardisée et validées précédemment, ce qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, d’éviter des études pilotes supplémentaires, et donc de réduire les effectifs nécessaires au projet. Le fait de travailler avec des animaux standardisés (sexe, âge, et fond génétique maitrisés) dans des conditions d’élevage standardisées (environnement, nutrition, intervention humaine) est un élément qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires dans l’étude. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier de manière optimale les différences significatives entre les groupes expérimentaux, ce qui permet de mener des études conformes sur des effectifs réduits. Dans ce projet nous avons réduit à 1 au lieu de 2, les lots expérimentaux contrôles en condition préprandiale, sans exposition ultérieure à la nourriture. En effet ce groupe peut être mis en commun pour les expériences 2 et 3 (détaillées dans les procédures 2 et 3). Bien que les procédures 2 et 3 soient similaires d’un point de vue technique, elles sont dissociées pour des raisons pratiques (gestion et traçabilité des individus plus facile dans le projet global).
Raffinement
Depuis l’arrivée des animaux au laboratoire, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux (manipulation par les animaliers, calme dans les pièces). Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidation qui permettent l’expression de comportements innés et favorisent la protection des animaux. Après réception des animaux, une semaine d’acclimatation sans intervention d’expérimentateurs sera respectée pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et au personnel. Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes mâles, âgées de 8 semaines. Cet âge correspond à un cerveau mature stabilisé
Etude du rôle des Neutrophil Extracellular Traps (NETs) dans la progression tumorale du carcinome squameux épithélial oral.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
6 192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un cancer de la cavité buccale leur est induit par un agent chimique, le 4NQO, puis elles reçoivent des injections quotidiennes de traitements, des pesées et des inspections sous isoflurane, avant une mise à mort par dislocation cervicale pour prélever la langue. Le porteur reconnaît des douleurs, une perte de poids et des difficultés à s'alimenter liées aux tumeurs buccales. Il présente des co-cultures cellulaires comme insuffisantes pour reproduire la complexité de l'organe, pour une recherche dont les retombées pour les patients restent hypothétiques.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'étudier le rôle des cellules immunitaires appelées neutrophiles dans la progression tumorale du carcinome épithélial oral. Plus précisemment nous souhaitons étudier une des fonctions des neutrophiles : la formation de « Neutrophil Extracellular Traps » (NETs) dans le developpement cancéreux. Les NETs sont des filaments d’ADN recouverts de protéines qui sont libérés par les neutrophiles, afin de piéger et tuer les micro-organismes pathogènes lors d'une infection. Cependant des études ont montré que ces NETs ont également des propriétés pro-tumorales. Notre hypothèse est que les neutrophiles qui forment des NETs entrainent la progression du cancer via i) l’activation des fibroblastes (des cellules saines de soutien des tissus) et ainsi la mise en place d’un environnement riche en matrice extracellulaire qui est nécéssaire à la croissance des tumeurs ; ii) l’inhibition des lymphocytes T CD8 cytotoxiques (des cellules immunitaires normalement capables de tuer les cellules cancéreuses). En effet, cet environnement est indispensable au développement tumoral et à l’invasion du cancer. Plus spécifiquement, nos expériences de culture cellulaire montrent que les NETs activent les fibroblastes capables de remodeler la matrice extracellulaire, ce qui augmente les capacités tumorales et invasives des cellules cancéreuses. De plus, nous avons identifié i) la protéine PD-L1 présente sur les NETs qui inhibent les capacités cytotoxiques des lymphocytes T CD8 ; ii) que les NETs activent la molécule du TGFβ également connu pour inhiber les capacités cytotoxiques des lymphocytes T CD8. Il en découle un environnement propice au développement des cellules tumorales. Nous souhaitons confirmer nos résultats chez la souris en utilisant le modèle 4NQO de carcinome épithélial oral. Nous nous attendons à une diminution de la progression tumorale après avoir supprimé des neutrophiles et la formation des NETs. Le but est d'utiliser ce modèle pour confirmer le rôle des voies de signalisation impliquées dans le recrutement des neutrophiles, la formation de NETs, l’activation des fibroblastes et l’inhibition des lymphocytes T CD8 sur le développement tumoral des carcinomes épithéliaux.
Bénéfices attendus
Notre étude nécessite l’utilisation d’animaux mais pourrait déboucher sur la mise au point de nouveaux médicaments permettant d’améliorer les traitements pour les patients atteints de carcinome épithélial.
Procédures
Les animaux seront manipulés par contention classique quotidiennement pour inspecter leur état général et leur administrer par injection intrapéritonéales les différents traitements (piqures en bas de l'abdomen, quotidiennement pour les inhibiteurs et 3 fois par semaine pour les anticorps). La contention de chaque animal durera en moyenne 20 – 25 secondes et sera réduit autant que possible dès que les conditions le permettront afin de réduire au maximum le stress de l’animal. Par ailleurs, chaque animal sera pesé 3 fois par semaine, ce qui nécessitera une manipulation de l’animal courte (environ 5 secondes) pour le déposer sur la balance et le remettre dans sa cage. Enfin, 1 fois par mois, les animaux seront sédatés avec de l'isoflurane pour les endormir, puis maintien au masque d'isoflurane (2-3 minutes maximum par souris) le temps d’inspecter l’aspect de la cavité buccale, et pouvoir suivre l’évolution du développement cancéreux. Les animaux se réveilleront dans leur cage posée sur un tapis chauffant et sous une lampe chauffante. Nous nous assurerons de leur réveil complet et normal à chaque fois.
Impact sur les animaux
Les signes cliniques attendus des animaux développant des tumeurs sont des signes de douleurs, une perte de poids (entre 5% et 10% du poids initial) dû à des difficultés à s’alimenter pour les animaux qui développent des tumeurs dans la bouche, et des signes de stress induit par l'injection répétée en intra-péritonéale des traitements.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience car nous aurons besoin de prélèver ensuite la langue des animaux pour analyser les lésions qui se seront développées en réponse au traitement cancérigène 4NQO.
Remplacement
Nos recherches ont décrit les cultures organotypiques comme une méthode de remplacement pour l’étude du développement métastatique. Nous avons déjà développé des modèles in vitro permettant de vérifier le rôle des NETs sur les capacités tumorales des CS (lignée de CS isolés à partir de souris DMBA/TPA). L’utilisation de co-cultures de cellules tumorales/neutrophiles/fibroblastes/lymphocytes in vitro, utilisées en routine au laboratoire, est envisagée aussi souvent que possible pour remplacer l’expérimentation animale, ce qui permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés. Cependant ces cultures ne récapitulent pas la complexité de l’organe, nous avons donc recours aux animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé pour pouvoir détecter toute différence significative entre les groupes expérimentaux, avec un nombre de souris minimal. En effet, pour l’étude des lésions cancéreuses très avancée, il nous faudra suffisamment d’animaux par groupes ayant développé spontanément ces lésions avancées pour avoir des analyses statistiques fiables. Nos résultats générés in vitro et in vivo sous une précédante DAP nous ont permis de générer une analyse statistique prévisionnelle permettant de réduire le nombre d’animaux dans toutes les procédures proposées. D'autre part, le fait que ce modèle soit largement utilisé et décrit par la communauté scientifique nous permettent de connaitre la cinétique de développement de la maladie. Ainsi nous avons générer une analyse statistique prévisionnelle permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Dans le respect de la réglementation européenne, les animaux seront manipulés dans le calme, 4 souris par cages, avec un rythme jour/nuit de 12h, ainsi que de l'eau et de la nourriture à volonté. Chaque cage est enrichie (maison pour souris, carrés de coton, bâtons à ronger). Les cages sont séparées des élevages pour un suivi adapté. La période d'acclimatation à l'animalerie sera de 5 jours. De plus le bien-être animal sera évalué 3 fois par emaine de manière objective grâce à une fiche de score regroupant de nombreux critères permettant d’évaluer l’état de chaque animal sur toute la durée des expériences. Un score trop elevé, calculé selon les différents critères de cette fiche de score entrainera soit la mise en place de mesures antalgiques visant à réduire la souffrance animale, soit la mise à mort immédiate de l’animal (car atteinte d'un point limite du bien être animal). Cette fiche nous permettra de décider au cas par cas de la poursuite ou de l’arrêt de la procédure. De plus, le modèle 4NQO est largement utilisé par la communauté scientifique, ce qui nous permet de connaitre la cinétique de développement de la maladie et justifie les procédures proposées. Les souris seront mises à mort à 28 semaines après l’initiation du cancer par le 4NQO ou lorsqu’un point limite sera atteint, comme décrit précédement.
Choix des espèces
Nous souhaitons étudier le rôle des NETs dans le développement des CS. Le modèle murin est un excellent modèle pour élucider ces mécanismes car il présente de grandes similitudes génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. De plus, le modèle 4NQO a été bien caractérisé et est largement utilisé pour sa reproductibilité dans la communauté scientifique pour ce type d’étude. L’administration d’agents chimiques induisant la carcinogénèse sera réalisée sur des souris âgées de 8 à 10 semaines. Les prélèvements des tumeurs sur les souris se feront à 28 semaines après initiation au 4NQO, ce qui correspond à la formation de carcinomes squameux. Les souris seront euthanasiées par dislocation cervicale avant prélèvement de la langue pour des analyses histologiques et biochimiques.
Étude de l’efficacité de vecteurs viraux (AAV) sur un modèle d’épilepsie du lobe temporal (ELT) chez la souris SWISS
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 776 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une épilepsie chronique leur est provoquée par des injections répétées, suivies d'une évaluation comportementale non précisée, d'une chirurgie d'injection intracérébrale, de l'implantation d'électrodes puis d'une perfusion terminale pour prélever l'encéphale, afin de tester une thérapie génique par vecteurs viraux. Le porteur décrit les crises comme "dommageables au bien-être animal" et prévoit une mise à mort dès l'atteinte d'un point limite. Les bénéfices annoncés pour les patients pharmacorésistants restent au stade de la preuve de concept préclinique.
Objectifs
L’épilepsie chronique représente une des causes majeures de troubles neurologiques dans le monde, dont le type le plus répandu est l’épilepsie du lobe temporal (ELT). Elle se caractérise par des crises récurrentes et spontanées provoquées par une hypersynchronie excessive et incontrôlée de l’activité neuronale. Les molécules pharmacologiques antiépileptiques actuellement utilisées visent essentiellement à soulager les symptômes associés à l'épilepsie chronique en réajustant l'équilibre entre excitation et inhibition de l'activité neuronale. Cependant, ces traitements n'agissent pas directement sur les processus sous-jacents responsables de la progression de la pathologie, dont l'origine provient souvent de gènes défaillants. Le projet a pour objectif de tester l'effet de nouveaux traitement basé sur la thérapie génique dans un modèle in vivo de souris reproduisant fidèlement les manifestations histologiques et comportementales d'ELT observés chez les patients. Le projet est focalisé sur l'une des structures du lobe temporal, l'hippocampe et/ou le cortex, qui jouent un rôle central dans la génération des crises d'épilepsie et les troubles du comportement associés. Ainsi, l'analyse des effets bénéfiques de la thérapie génique sur les souris épileptiques seront réalisés à partir d’analyse comportementales, électroencéphalographiques et histologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter une preuve de concept de l’efficacité de nouveaux traitements basés sur la thérapie génique sur les troubles électroencéphalographiques, les troubles comportementaux associés et les altérations histologiques dans un modèle rongeur d'épilepsie du lobe temporal. Une fois la preuve de concept validée à partir de ces études pré-cliniques, ces nouvelles stratégies thérapeutiques pourront être proposées pour des essais cliniques chez des patients pharmacorésistants souffrant d'épilepsie chronique.
Procédures
Au cours de ce projet, les animaux subissent 4 types d’intervention. Durant la 1ère intervention du protocole, les souris subissent une série d'injections (4-6) par voie intrapéritonéale de plusieurs molécules afin d'induire un état d'épilepsie chronique (durée de l'intervention: 2h30-3h30 environ). Les animaux sont ensuite immédiatement hébergés dans les cages enrichies de manière individuelle pour toute la durée du protocole expérimental (i.e. 4 mois). Après une période de 2 mois, la seconde intervention consiste à effectuer l'évaluation comportementale des souris par des tests simples, spontanés, non-invasifs et non associés à une privation d'eau ou de nourriture (durée d’intervention : 20 min environ). Une semaine après, durant la 3ème intervention, ces mêmes souris subissent une chirurgie dans le but de réaliser des injections intracérébrales du composé thérapeutique à tester. Deux à trois semaines plus tard, les souris sont implantées avec une électrode afin de réaliser des enregistrements électroencéphalographiques. A la dernière étape du protocole expérimental, l'animal est euthanasié par une anesthésie profonde terminale (par perfusion transcardiaque : durée de 30 à 60 min) afin de prélever l'encéphale.
Impact sur les animaux
L’ensemble des nuisances ou effets indésirables attendus peuvent être résumés selon les points suivants: - Le maintien des souris de manière individuelle pour observation durant de 2h30 à 3h30 pouvant générer de l'inconfort et du stress – Des injections répétées en intrapéritonéal pouvant induire du stress et de la douleur ; afin de réduire la souffrance, la zone injectée est préalablement traitée en topique avec une crème anesthésiante de type emla® - L'expression de crises d'épilepsie, condition dommageable au bien-être animal - Des anesthésies et interventions chirurgicales (craniotomie) afin de réaliser des injections intracérébrales et d'insérer les électrodes d'enregistrement de l'activité cérébrale, avec le cas échant l'inconfort associé au réveil post-chirurgical et un risque infectieux – Les sutures de la peau du crâne pouvant provoquer des démangeaisons lors de la cicatrisation.
Devenir
Les animaux doivent être maintenus en vie jusqu'à la dernière procédure (terminale), de façon à ce que les données scientifiques soient recueillies, y compris les données histologiques post-mortem.
Remplacement
L'objectif du projet étant de tester l'efficacité du candidat médicament sur une échelle multidimensionnelle et notamment sur les mécanismes pathologiques handicapants (crises, altérations du comportement) de l'épilepsie du lobe temporal afin d'améliorer la qualité de vie des patients ainsi que sur les caractéristiques histologiques, il n'est donc pas possible de substituer les souris par des modèles alternatifs (e.g. modèles in vitro). De plus, les rongeurs sont un excellent outil pour l'analyse comportementale (mesures des performances cognitives, de l'humeur et sensorimotrices), et sont un très bon modèle animal pour analyser les mécanismes physiopathologiques à la base de maladies neurologiques humaines, en l'occurrence l'épilepsie du lobe temporal. En ce qui concerne cette dernière pathologie, les rongeurs reproduisent fidèlement les caractéristiques cardinales de ce type d'épilepsie chez l'homme.
Réduction
Le protocole choisi pour induire une épilepsie chronique est basé sur une méthodologie récemment raffinée et publiée ayant permis une forte diminution du taux de mortalité lors de l’induction de la pathologie. Cela permet donc d'augmenter très significativement le taux de réussite et de limiter de façon importante le nombre d'animaux utilisé. Par ailleurs, chaque lot de souris utilisé pour ce projet subit toutes les étapes expérimentales à savoir l'induction de l'épilepsie chronique, l'évaluation comportementale, les injections intracérébrales, les enregistrements électroencéphalographiques, ainsi que les prélèvements de l'encéphale. Cela permet de réduire le nombre d'animaux nécessaire et d'optimiser l'utilisation de chaque souris. Par ailleurs, le calcul du nombre de sujets nécessaires (calcul de N) est basé sur les données antérieures obtenues en prenant en compte les moyennes et déviations standards mesurées pour chaque paramètre. Ainsi, l'utilisation d'un design expérimental optimisé incluant des analyses statistiques appropriées permette de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
La planification séquentielle du travail avec réévaluation constante de la stratégie en fonction des résultats. L’utilisation d’un nombre minimal d’animaux par groupe en s’appuyant sur des données statistiques. L’analgésie locale et anesthésie générale au moment des chirurgies et mesures particulières pour en minimiser l’impact (administration d’anti-douleurs, réveil sous source de chaleur, réhydratation, gel hyper-nourrissant mélangé avec des croquettes accessibles à hauteur de souris, pesée, enrichissement de l’environnement…). Après l’induction de la crise, l'état de récupération dans les jours qui suivent est étroitement surveillé (récupération sous source de chaleur, réhydratation, gel hyper-nourrissant mélangé avec des croquettes accessibles à hauteur de souris, pesée et récupération comportementale, enrichissement de l’environnement…). Les animaux ayant subi une chirurgie et/ou présentant une épilepsie chronique sont maintenus dans des cages individuelles enrichies afin de diminuer le risque de blessures inter individus et les souffrances associées. La formation continue du personnel scientifique et de soin permet de repérer immédiatement les premiers signes cliniques d’inconfort chez les animaux. La mise en place d’une grille de suivi, ainsi que la prévision d’actions spécifiques dès les premiers signes d’inconfort ou de douleur (voire l’euthanasie, selon leur gravité) complètent le dispositif. Les animaux sont conservés le minimum de temps nécessaire au projet et des points limites spécifiques à chaque procédure sont appliqués tout au long du projet.
Choix des espèces
Les souris modèles d'épilepsie manifestent des symptômes comparables à ceux des patients souffrant d'épilepsie du lobe temporal (génération de crises, troubles cognitifs et de l'humeur) mais reproduisent également des manifestations histologiques d'épilepsie du lobe temporal (mort neuronale, remodelage anormal du réseau, etc.). Ils sont donc un excellent modèle pour cette pathologie humaine. En outre, l'utilisation spécifique de souris permet de tirer avantage de nombreuses lignées transgéniques ouvrant de nombreuses possibilités pour la poursuite du projet.
Isolement d’Ilots pancréatiques de rat
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
100 rats vont être utilisés, anesthésiés puis tués sans réveil. Chaque animal reçoit une injection anesthésiante, puis une chirurgie prélève le pancréas avant la mise à mort, pour isoler des îlots pancréatiques destinés à des études in vitro sur le diabète de type 1. Le porteur indique que l'isolement des îlots impose la destruction du pancréas, incompatible avec la survie. Il écarte les lignées cellulaires jugées trop résistantes et la faible disponibilité d'îlots humains, présentant le rat comme le modèle "le plus ressemblant" pour une future transplantation humaine.
Objectifs
L'étude d'approches thérapeutiques innovantes du diabète de type 1 avec pour objectif notamment d'améliorer la résistance et la survie des ilots de Langerhans vis-à-vis des stress inhérents au protocole de greffe. Les procédés de conversion et d'utilisation de l'énergie au niveau cellulaire et leur régulation sont à la base du bon fonctionnement des cellules et tissus. Ce métabolisme énergétique est perturbé dans de nombreuses situations physiologiques ou physiopathologiques, soit comme témoin des altérations, soit comme facteur à l'origine de ces états. Restaurer le métabolisme énergétique peut constituer une stratégie thérapeutique. Afin de pouvoir l'explorer, il est nécessaire d'avoir un bon modèle d'étude du métabolisme intermédiaire. A ce titre, les îlots pancréatiques isolés constituent un très bon modèle avec un indicateur de bon fonctionnement simple à vérifier : sa capacité à sécréter de l'insuline in vitro. Bien que certaines lignées cellulaires (INS-1 d'origine rat et Min-6 d'origine souris) sécrètent de l'insuline in vitro, leur métabolisme est altéré et les rendent peu pertinentes dans ce type d'étude. Il est donc nécessaire de recourir à l'utilisation de rats comme sources d'îlots pancréatiques pouvant ensuite être mis en culture pendant plusieurs jours en présence de facteurs expérimentaux d'intérêt avant d'être ensuite étudiés in vitro.
Bénéfices attendus
Une meilleure connaissance de l'état métabolique des ilots en réponse à différents agents est nécessaire avant de passer à l'étape pré-clinique de greffe d'ilots encapsulés et de suivre leur devenir in vivo. Cette étape in vitro permet également de limiter le nombre d'animaux à utiliser et à traiter lors de l'étape in vivo.
Procédures
1 injection pour anesthésier et analgésier les animaux, suivie d’une chirurgie pour prélever le pancréas avant mise à mort l’animal sans réveil
Impact sur les animaux
Aucun
Devenir
L'isolement d'ilots pancréatiques impose la destruction du pancréas, incompatible avec la survie des animaux
Remplacement
Les lignées Min6 ou INS1 sont des cellules bien plus résistantes que les cellules pancréatiques humaines et de ce fait inadaptées à ce projet. De plus, la disponibilité en îlots humains, dépendante du don d’organe à usage scientifique, est extrêmement limitée. Dans la problématique de nos travaux qui vise à la transplantation humaine d’îlots pancréatiques, nous avons recherché un modèle le plus ressemblant. Les îlots de rats représentent une alternative à l’utilisation des îlots humains pour la validation in vitro du projet et justifie l’utilisation des animaux dans le projet.
Réduction
La présente demande porte sur un effectif prévisionnel de 100 rats sur 2 ans (valeur maximale) mais seuls les animaux absolument nécessaires seront utilisés, en fonction des besoins expérimentaux.
Raffinement
Les animaux utilisés sont hébergés dans des conditions qui remplissent toutes les exigences réglementaires (enrichissement du milieu, plusieurs animaux par cage, cage ouvertes permettant de sentir des congénères à proximité, contrôle des variables environnementales). Une fois l'animal sélectionné, il est anesthésié à l'aide d'une mélange Xylazine/Kétamine et n'est pas réveillé. La procédure d'injection de l'anesthésique suit les recommandations de dose établies et validées lors de la visite d'agrément et par notre SBEA et pour lesquelles nous avons suffisamment de recul car aucun signe de réveil n'a jamais été observé. L'administration est réalisée par des personnes formées et compétentes pour effectuer ce geste. Le maintien de l'anesthésie est vérifié constamment par l'expérimentateur qui contrôle l'absence de signe de réveil ou de mouvement lors de l'étape de perfusion après laparotomie.
Choix des espèces
Les îlots de rat sécrètent de l'insuline dans un contexte similaire aux îlots humains, ce qui correspond au mieux au but de nos projets qui visent une transplantation humaine. Les animaux utilisés sont des jeunes adultes, entre 150g et 300g de façon à avoir une taille d'organe suffisante pour en extraire un nombre suffisant d'ilots.