Rongeurs
Influence de deux acides gras (oléate et palmitate) dans l’infection au Sars-Cov-2
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles reçoivent des injections intraveineuses d'acides gras, une injection ou une nébulisation de pseudoparticules virales, des mesures de fréquence respiratoire et cardiaque, puis un prélèvement sanguin terminal. Le porteur attend potentiellement une difficulté à respirer, voire la mort des souris, les pseudoparticules au contact des acides gras étant cytotoxiques in vitro. Il justifie le recours à l'animal par la "nécessité" de valider dans un "organisme entier et complexe" une hypothèse déjà obtenue en culture cellulaire.
Objectifs
Il est connu que pour entrer dans les cellules, le virus Sars-Cov-2 responsable de la pandémie de Covid-19 doit se fixer à un récepteur, le récepteur ACE2 (Angiotensin Converting Enzyme-2). Considérant les profils cliniques des patients atteints de covid sévères, nous avons voulu vérifier in vitro l’impact d’acides gras dans cette infection. Nous avons alors réalisé des études in vitro sur différentes lignées cellulaires et il s’avère que sur des lignées dépourvues du récepteur ACE2 et en présence d’acides gras, le virus était capable de tuer ces cellules. Notre hypothèse est donc qu’il existe un autre moyen au virus pour tuer les cellules. Nos études in vitro ont été réalisées avec du virus fonctionnel et avec des particules de virus inactivées appelées pseudoparticules. Nous souhaitons ici vérifier cette hypothèse en testant deux acides gras et deux voies d’administration des pseudoparticules chez des souris naturellement dépourvues du récepteur ACE2 humain, le Sars-Cov-2 ne se liant pas à l'ACE2 murin.
Bénéfices attendus
Dans cette étude, des souris dépourvues du récepteur ACE2 humain seront utilisées. Si des altérations au niveau des poumons sont observées en présence d’acides gras, cela révèlera la présence d’un second mécanisme d’entrée du virus dépendant de la présence d’acides gras mais indépendant du récepteur ACE2. Il y aura donc d’autres recherches à mener pour identifier cette seconde voie d’entrée, la bloquer et ainsi bloquer l’entrée du virus. Une fois que les deux mécanismes d’entrée du virus dans les cellules seront bloqués (via ACE2 et via le second mécanisme), le virus ne pourra plus se multiplier et provoquer de graves maladies telles qu’observées lors de la pandémie de Covid-19.
Procédures
Les souris seront soumises à 3 injections intraveineuses (3x2min) d’oléate ou de palmitate, 1 injection intrapéritonéale (1min) ou 1 nébulisation de pseudoparticules (30min). Elles seront soumises à une mesure de fréquence respiratoire (5min) et cardiaque (20min). Un prélèvement sanguin (1min) unique sera réalisé à la fin de la procédure juste avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
Les souris seront isolées 30min durant la nébulisation, 5min pendant la mesure de fréquence respiratoire et 20min pendant la mesure de fréquence cardiaque. D'après nos études in vitro, les pseudoparticules en contact de différents acides gras sont cytotoxiques, nous attendons potentiellement une difficulté à respirer, voire une mortalité des souris.
Devenir
A la fin de la procédure, toutes les souris seront mises à mort.
Remplacement
Notre hypothèse selon laquelle il existe un second mécanisme d’entrée du virus dans les cellules dépendant des acides gras a déjà été validée in vitro. Nous souhaitons maintenant la valider in vivo, dans un organisme entier et complexe. Des dosages et caractérisations seront effectuées sur les sérums et organes des souris afin d’identifier le rôle des acides gras dans le mécanisme d’entrée du virus dans les cellules.
Réduction
Le nombre de souris a été déterminé statistiquement pour être nécessaire et suffisant pour répondre à notre hypothèse. Des études statistiques seront également réalisées à postériori pour comparer les groupes 2 à 2.
Raffinement
Les gestes effectués sur les souris seront effectués par du personnel entrainé et tout sera mis en œuvre pour assurer le bien-être des animaux. Les souris seront par groupe de 4 ou 6 dans des cages adaptées et leur bien-être sera évalué tous les jours. La température et l'hygrométrie ambiantes seront également suivies quotidiennement et maintenues respectivement entre 20 et 24°C et entre 35 et 75%. Leur milieu sera enrichi avec un objet en plastique rouge transparent tout au long de l’étude et avec des bâtons de coton pour créer un nid. Les souris seront observées quotidiennement et cette surveillance sera accrue durant les 3 jours d’étude. En cas d’atteinte d’un point limite, la décision de mettre à mort la souris selon une méthode réglementaire, sera prise par le responsable du bien-être animal.
Choix des espèces
Nous envisageons d’effectuer la suite de ce projet sur des souris K18-hACE2 (modèle COVID) de fond génétique C57Bl6, c’est pourquoi cette étude sera effectuée sur cette souche de souris. Souris âgées de 6 mois. Les patients atteints de Covid sévère sont en majorité des personnes âgées, c'est pourquoi nous avons choisi de travailler avec des souris âgées.
Evaluation de l’efficacité d’une série de 4 composés d’intérêt thérapeutique chez un modèle souris d’inflammation colique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
82 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une colite leur est provoquée par du dextran sulfate de sodium dans l'eau de boisson, avec un gavage quotidien pendant seize jours et un hébergement individuel de vingt-trois jours. Le porteur reconnaît que l'isolement constitue une nuisance pour ces animaux sociables, mais le juge "incontournable" pour mesurer la prise alimentaire. Toutes les souris sont tuées pour prélever le côlon, afin de tester quatre composés contre les inflammations chroniques de l'intestin.
Objectifs
Le présent projet vise à tester l'efficacité d'une série de 4 composés d'intérêt thérapeutique en développement préclinique et visant à traiter les inflammations chroniques de l'intestin (maladie de Crohn ou colite ulcérative).
Bénéfices attendus
Si la présente étude permet de mettre en évidence une efficacité des composés en développement sur la colite, ces deniers seront employés ultérieurement dans le cadre d'études cliniques et pourraient, à terme, obtenir une autorisation de mise sur le marché.
Procédures
Les souris recevront une administration journalière par gavage pendant 16 jours (véhicule pendant 7 jours puis traitement pendant 9 jours). Hormis pour le groupe expérimental contrôle du modèle de colite, elles seront exposées à du Dextran sodium sulfate (DSS 3%) via leur eau de boisson. Les souris seront pesées deux fois par semaine avant traitement et quotidiennement pendant les 9 jours de traitement. Enfin, à l'issue de l'étude, les souris seront anesthésiées et mises à mort après anesthésie. Les souris seront hébergées individuellement pendant les 23 jours de l'étude.
Impact sur les animaux
Le modèle employé est un modèle de colite. Le taus de DSS employé ici (3%) est de nature à induire une colite modérée chez la souris. L'hébergement individuel peut induire une nuisance chez les souris qui sont des animaux sociables, mais il s'avère incontournable de par la nécessité de mesurer la prise alimentaire individuelle qui est un des paramètres principaux de l'étude. L'ensemble des traitements par voie orale et les pesées quotidienne à l'état vigile peuvent être source de stress ou de nuisances.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des analyses biochimiques et histologiques sur les colons qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur l’inflammation colique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de résultats préliminaires obtenus lors d’études antérieures menées par le client. Le nombre de 15 animaux par groupe a été défini comme le nombre minimum d’animaux à utiliser pour pouvoir mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Un total de 82 souris Balb/cJ sera utilisé, divisé en 5 groupes de 7 (groupe contrôle du modèle) ou 15 (autres groupes) animaux. Le groupe contrôle du modèle a été réduit à 7 animaux puisqu'il ne présente pas de colite, réduisant la variabilité des mesures réalisées.
Raffinement
Le modèle animal utilisé est un modèle d’inflammation colique induite par administration de DSS chez la souris qui est un modèle particulièrement bien caractérisé dans la littérature. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress induit aux animaux (périodes d’acclimatation et d’habituation des animaux aux procédures d’administration) et à établir des points limites appropriés. Les animaux seront hébergés individuellement (du fait des mesures de prise alimentaire et des récoltes de matière fécale imposées par le protocole) et une enrichissement de leur environnement sera mis en place sous forme de briquette de bois spéciales pour rongeurs et de dômes en cartons.
Choix des espèces
Le modèle animal utilisé est un modèle d’inflammation colique induite par administration de DSS chez la souris qui est très bien caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans le cadre d'études précliniques. Les animaux seront réceptionnés à 5 semaines d'âge et les traitement débuterons à 7 semaine d'âge. Chez la femelle, cela correspond à un stade de jeune adulte mimant la population cible majoritaire des inflammations chroniques de l'intestin chez l'humain.
Caractérisation comportementale et pharmacologique de trois modèles murins de stress chronique : évaluation de leur pertinence pour l’étude de la dépression
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles sont soumises à trois protocoles de stress chronique, dont un modèle de défaite sociale fondé sur des agressions physiques répétées, que le porteur décrit comme le plus sévère, induisant douleur physique et psychique et un état de stress durable. Les deux autres protocoles enchaînent des situations désagréables provoquant peu ou pas de douleur physique. Toutes les souris sont tuées pour prélever le cerveau, l'objectif déclaré étant de comparer ces modèles de dépression et, à terme, de réduire le nombre d'animaux utilisés au laboratoire.
Objectifs
Les troubles dépressifs sont la principale cause d’invalidité dans le monde. Cependant l’efficacité des antidépresseurs est insuffisante chez un grand nombre de patients, ce qui nécessite une meilleure caractérisation des mécanismes neurobiologiques de la maladie ainsi que l’investigation de thérapies alternatives. Il est donc essentiel de développer des modèles précliniques liés à l’exposition à des événements stressants (« stresseurs ») générant des phénotypes comportementaux récapitulant au mieux certains aspects de la pathologie humaine. Nous proposons de comparer trois protocoles de stress chez la souris : le stress de défaite sociale (SDS), le stress variable chronique (SCV), et le stress chronique imprédictible (SCI). Ces trois protocoles diffèrent par la nature, la durée et l’intensité des stresseurs appliqués. La littérature suggère qu’ils ont également des conséquences qui peuvent être différentes sur l’expression des comportements anxiodépressifs selon les individus et le sexe. L’objectif est donc de comparer ces modèles au niveau des comportements anxiodépressifs qu’ils provoquent à différents points dans le temps. Si ces modèles s’avèrent pertinents pour l’étude de la dépression, nous explorerons leur profil de réponse à un antidépresseur couramment utilisé. Ces recherches permettront d’instaurer une diversité de modèles d’étude sur la dépression dans notre laboratoire, et ont le potentiel de mener au développement de thérapies innovantes et différenciées selon le sexe et l’individu. Nous attendons que ces modèles génèrent des résultats différents : par exemple, il est attendu que le SDS ait un impact plus important sur les phénotypes liés à l’interaction sociale étant donné la nature du stresseur par rapport au CVS ou au SCI. Ces différences sont une richesse, le but étant de modéliser différents symptômes présents chez les patients humains en utilisant plusieurs modèles précliniques. Concrètement, le développement et la validation de ces modèles nous servira dans la plupart de nos études postérieures : par exemple, dans nos études sur la neurostimulation ultrasonore et magnétique, qui sont des traitement alternatifs potentiels aux antidépresseurs. Tester ces nouveaux traitements dans ces modèles de stress nous permettra d’une part d’évaluer l’efficacité de ces traitements par rapport aux antidépresseurs, d’autre part de tester ces traitements dans différents types de stress.
Bénéfices attendus
Ce projet pourra permettre une meilleure utilisation utilisation des modèles précliniques de maladies neuropsychiatriques murins grâce à une caractérisation plus détaillée de trois modèles de stress différents couramment utilisés. Il pourra également identifier de potentielles différences dans les effets du stress ou du traitement antidépresseur selon le protocole, le sexe et les individus. De manière importante, il réduira l’utilisation d’animaux sur le long terme dans notre laboratoire en établissant des protocoles de stress reproductibles et en éliminant des protocoles peu reproductibles. Ces modeles seront par ailleurs essentiels à une meilleure compréhension des substrats neurobiologiques sous-tendant les atteintes aux différentes dimensions comportementales observées dans les pathologies psychiatriques liées au stress. En effet ces études nécessitent la mise en place d’outils d’imagerie de précision (exemple : imagerie calcique), combinés à des approches mécanistiques (modification d’expression de gènes, optogénétique, électrophysiologie, etc), pour la plupart nécessitant des chirurgies stéréotaxiques, et pour lesquelles il est essentiel de disposer d’un modèle comportemental fiable et reproductible.
Procédures
Le modèle de SDS (stress de défaite sociale) est le plus sévère des trois modèles proposés. Celui-ci étant fondé sur des agressions physiques répétées, il induira de la douleur physique (de très courte durée, sauf en cas de blessure où elle sera prise en charge par les expérimentateurs) et psychique, ainsi qu’un état de stress aigu pendant la procédure qui deviendra durable après les répétitions (l’impact comportemental constaté dans la littérature est présent jusqu’à 3-4 semaines). Cela induit des comportements anxio-depressifs chez les souris exposées au modèle. Les deux autres modèles provoquent peu ou aucune de douleur physique et consistent en des enchaînements répétés de situations désagréables. L’objectif final de cette étude étant de comparer les modèles puis d’étudier les substrats neurobiologiques des changements comportementaux pertinents pour nos études ayant été validés par la littérature dans ces modèles, il est essentiel de les caractériser. Ces comportements anxio-dépressifs seront évalués par différents tests : l'apathie est mesurée par un test d'éclaboussement du pelage par une solution de sucrose sur 5 minutes, l'état du pelage évalue les mêmes symptômes (mesure hebdomadaire avec préhension des animaux), le test d'hyponéophagie évalue l'anxiété (privation de nourriture 12-24h puis mise en présence de nourriture pendant 5 minutes), l'open field, la boîte claire obscure et le labyrinthe en croix surélevé également (5 minutes dans l'arène), le test de préférence au sucrose évalue l'anhédonie (24h d'accès à une solution sucrée sur 5 jours), le test de nage forcée évalue les symptômes d'abandon (6 minutes). Les tests d'interaction sociales ont lieu sur des plages de 10 minutes qui peuvent être répétées sur 3 jours. De plus, si ces modèles de stress s'avèrent être pertinents, nous caractériserons également leur profil de réponse à un antidépresseur (fluoxétine dans l'eau de boisson 5 semaines) afin de pouvoir comparer avec les réponses aux traitements chez l'humain.
Impact sur les animaux
Le modèle de SDS est le plus sévère des trois modèles proposés. Celui-ci étant fondé sur des agressions physiques répétées, il induira de la douleur physique (de très courte durée, sauf en cas de blessure où elle sera prise en charge par les expérimentateurs) et psychique, ainsi qu’un état de stress aigu pendant la procédure qui deviendra durable après les répétitions (l’impact comportemental constaté dans la littérature est présent jusqu’à 3-4 semaines). Les deux autres modèles provoquent respectivement peu et aucune douleur physique. L’objectif final de cette étude étant de comparer les modèles puis d’étudier les substrats neurobiologiques des changements comportementaux induits par chaque modèle, et des comportements anxio-dépressifs pertinents pour nos études ayant été validés par la littérature dans ces modèles, il est essentiel de les caractériser. L'administration d'antidépresseurs chez les animaux modèles et contrôles se fera dans l'eau de boisson sur 5 semaines. Aucun effet indérisable de l'antidépresseur n'est attendu : en effet, il sera administré directement dans l'eau de boisson afin d'éviter le stress lié aux injections répétées, et sera utilisé à une dose standard qui ne provoquera pas de nuisances visibles chez l'animal. De fait, l'effet d'un tel traitement est souvent bénéfique : il a été observé dans de mutiples études chez la souris un rétablissement des comportements liés au stress (diminution voire disparition des comportements anxio-dépressifs obtenus suite aux modèles de stress) à la suite d'un traitement chronique.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issu des expériences afin de récupérer les cerveaux pour des études histologiques. Ces études histologiques permettront de décrire les effets de chaque protocole de stress au niveau cérébral afin de mieux comprendre les mécanismes en jeu.
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale nécessite également l’utilisation d’animaux.
Réduction
Les effectifs sont optimisés, les analyses comportementales nécessitent une taille d’effectifs suffisante compte tenu de la variabilité inter-individuelle. Les effectifs seront adaptés en fonction de la taille des effets et deux cohortes seront utilisées au lieu de trois dans la première partie si nous trouvons les conditions adéquates dès la première cohorte. Egalement, la seconde partie sera abandonnée si nous n’obtenons pas de résultats dans la première partie. La stratégie des trois cohortes suit une analyse statistique a priori utilisée de manière standard dans la communauté scientifique.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu. Les animaux sont hébergés une semaine avant l’initiation des expériences. Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. En cas de blessure, les animaux recevront un traitement analgésique . En cas d’hypothermie, chaque animal est placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie. Une surveillance accrue d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris montrant des signes de mal-être et intervenir si nécessaire . Les éxpérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. Des points limites gradés sont appliqués et la décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout d’une semaine.
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, l’implémentation d’un modèle de dépression et de neurostimulation, ainsi que la possibilité d’utiliser des technologies permettant l'étude détaillé du cerveau. Les animauxseront adultes au début de l’étude car il s’agit de comprendre ces phénomènes comportementaux associés à un cerveau adulte.
Optimisation d’un traitement de thérapie génique pour l’hypophosphatémie liée au chromosome X
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
366 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Reproduisant un rachitisme génétique lié au chromosome X, elles reçoivent une injection unique d'un virus-médicament, puis des prélèvements sanguins rétro-orbitaux répétés cinq à vingt fois sur trois à dix-huit mois, avec des mesures morphologiques et un test de la grille inversée. Le porteur indique n'attendre aucun effet secondaire du traitement, les nuisances se limitant au stress de contention et à la douleur des piqûres. Il affirme que les résultats sur cellules "ne reflètent pas toujours" ceux obtenus chez l'animal, ce qui justifie le recours à la souris.
Objectifs
Notre projet a pour but de développer une solution thérapeutique pour les patients atteints d’hypophosphatémie liée au chromosome X (XLH). L’XLH est la forme de rachitisme génétique la plus fréquente touchant 1 naissance sur 20 000 chaque année. Cette maladie métabolique rare se traduit principalement par des malformations squelettiques. Les patients sont de petite taille et souffrent de douleurs osseuses, dentaires, et musculaires. Leurs os sont plus fragiles et les fractures nombreuses. Deux traitements sont actuellement disponibles, mais ils présentent des limitations importantes : i) leur efficacité est transitoire et/ou partielle et nécessite une réadministration fréquente; ii) ils peuvent provoquer des effets néphrotoxiques sévères. C’est pourquoi nous développons une alternative par thérapie génique, qui a le potentiel de guérir les patients en une seule administration. Ce projet va nous permettre d’identifier chez le modèle murin de XLH, un traitement sûr et efficace.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mettre au point, chez un modèle murin, un traitement sûr et efficace pour la maladie XLH. Nos précédents travaux ont permis d’établir la preuve de faisabilité d’une approche par thérapie génique. Dans ce projet, qui durera 5ans, nous voulons améliorer le produit que nous avons conçu et réaliser l’ensemble des études nécessaires à son développement vers la clinique. Les résultats obtenus nous permettront alors d’envisager une solution thérapeutique pour patients XLH, efficace sur le long-terme, afin de stopper l’évolution de leur pathologie. Les bénéfices attendus concernent donc directement l’amélioration de l’état de santé des malades et de leur qualité de vie.
Procédures
Les animaux seront injectés une seule fois avec des virus médicaments dans la veine temporale ou les sinus rétro-orbitaux selon l’âge des souris. Ce geste dure moins de 30 secondes. Les animaux seront anesthésiés par voir gazeuse (isoflurane) puis prélevés en sang au niveau des sinus rétro-orbitaux. Ce geste dure moins de 30 secondes. OEil gauche et oeil droit seront alternés. Ce geste sera réalisé entre 5 et 20 fois, en 3 à 18 mois. Les mesures morphologiques (taille du corps, taille de la queue) seront réalisées juste après les prélèvements de sang afin d’éviter une autre anesthésie. Ce geste dure moins de 30 secondes. Ce geste sera réalisé entre 5 et 20 fois, en 3 à 18 mois. Le test de la grille inversée sera réalisé entre 5 et 20 fois, en 3 à 18 mois. Nous réalisons ce test couramment dans d’autres projets, et aucun traumatisme physique n’a été observé. Ce test dure 3 minutes et le nombre de chutes par minute est comptabilisé.
Impact sur les animaux
Traitement injecté : aucun effet secondaire n'est attendu suite à l'injection du traitement. Traitement des souris HypDuk : diminution des problèmes liés à la maladie (augmentation taille et poids des souris) Injection : Stress lié à la contention + douleur liée à la piqure d'aiguille. Prise de sang : Stress lié à la contention + douleur liée à la piqure. Mesures morphologique : Réalisé sur souris endormies lors du prélèvement de sang : pas de stress supplémentaire. Test musculaire : Stress lié à la manipulation. Euthanasie : Stress lié à la manipulation. Souris HypDuk : pas de douleur quotidienne lié à la maladie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Dans un premier temps, nous avons réalisé un premier tri de nos candidats sur des cellules en culture. Ces tests nous ont permis d'éliminer les candidats produisant une trop faible quantité de protéine. Néanmoins, par expérience, nous savons que les résultats obtenus sur cellules ne reflètent pas toujours les résultats obtenus chez l'animal et ne permettent pas d’identifier si l’approche permet de traiter les symptômes de la maladie. L’utilisation d’animaux est donc primordiale pour réaliser cette étude car (1) il est nécessaire de tester nos produits sur un corps entier pour observer les effets simultanés sur le foie, les reins et sur les os (2) il est nécessaire d’évaluer la croissance ainsi que la force musculaire des souris (3) il faut obtenir des fluides (sang, urine) pour mesurer les marqueurs de la maladie.
Réduction
Afin de d'utiliser le moins d'animaux possible, nous avons calculé le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir des résultats suffisamment fiable (6 souris par groupe soit 186 souris saines et 166 souris malades). Le nombre de souris déterminé ici est le nombre maximal de souris utilisé, si la deuxième procédure n'aboutit pas à des résultats concluant, nous ne passerons pas aux étapes suivantes ou seulement avec 1 candidat. De plus, nous allons prioriser l'utilisation d'animaux sains (186 souris) lors de la sélection de nos meilleurs candidats, cela permettra d'obtenir des animaux plus rapidement (il est plus facile d'accoupler des animaux sains que malades et le nombre de petits par portée est plus important) et permettra aussi de limiter la génération de souris malade.
Raffinement
Dès leur arrivée en zone d’expérimentation, les souris seront manipulées et contentionnées afin d’être familiarisées aux expérimentateurs et aux gestes expérimentaux. Cette habituation devrait réduire le stress et l’angoisse des animaux. Les souris utilisées lors de ce projet ne présentent pas de signes de douleurs évidents. Les virus utilisés sont non dangereux et les doses utilisées ne sont pas toxiques, de ce fait aucune toxicité n’est attendue. Prélèvements de sang: ils seront réalisés au niveau de la veine mandibulaire sur animal vigile. Une fois le prélèvement terminé, un éventuel saignement sera stoppé par l’application d’une compresse au niveau du point de prélèvement. L’animal sera remis dans sa cage. Si des signes de souffrance venaient à apparaitre, la souris sera pesée et surveillée de manière assidue. En absence d’amélioration sur une semaine, ou en cas de perte de poids supérieure à 20% du poids initial, la souris sera euthanasiée. Le nombre d'accouplement mit en place sera réduit au strict nécessaire afin de ne pas générer de souris inutilisées. Certaines souris générées ne seront pas utilisées (comme les femelles qui ne portent pas la maladie), elles seront rapidement euthanasiées afin de limiter le nombre de souris en élevage.
Choix des espèces
A notre connaissance, les seuls modèles animaux de la maladie XLH sont des modèles murins. Il y a 2 modèles : le modèle HypDuk-B6 et le modèle HypDuk-Balb. Ces deux modèles reproduisent les signes cliniques retrouvés chez les patients XLH. La population de patients que nous visons sera composée d’enfants, de jeunes adultes et des adultes, aussi, nous avons besoin de traiter des souris à des âges qui correspondent à ces étapes chez l’homme (souris de 0-2 jours, de 2 semaines, de 4 semaines et de 6 semaines) et d’évaluer si notre traitement pourra être efficace en : (1) en prévention de la pathologie : le traitement est-il efficace s'il est administré avant l'apparition de symptômes important (traitement des souris les deux premiers jours de vie (=nourrisson)) ? (2) le traitement est-il efficace s'il est administré à l'apparition des premiers signes de la maladie (traitement des souris à 2 ou 4 semaines (=enfant ou adolescent)) ? (3) le traitement est-il efficace s'il est administré une fois que la pathologie est bien établie et que les symptômes sont important (traitement des souris à 6 semaines (=adulte)) ?
Evaluation par bioluminescence de l’efficacité combinée de la radiothérapie et du temozolomide sur un modèle de glioblastome opéré (EU porteur ; EU 1/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
85 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une tumeur cérébrale leur est injectée, suivie pour la plupart d'une chirurgie d'ablation partielle et, pour certaines, de séances de radiothérapie, sous imagerie et anesthésies répétées. Le porteur indique que la tumeur provoque des effets délétères non réversibles et que toutes les souris atteignent des points limites entraînant leur mise à mort. L'objectif déclaré est de reproduire le glioblastome opéré pour étudier la combinaison de radiothérapie et de chimiothérapie après chirurgie.
Objectifs
Nos projets de recherche portent sur le développement et la validation de stratégies innovantes pour le traitement des glioblastomes, tumeurs cérébrales très agressives et de très mauvais pronostic. Dans ce contexte, nous cherchons à affiner nos modèles , tant in vitro qu'in vivo afin qu'ils deviennent plus pertinents et plus représentatifs de la réalité clinique de cette pathologie. Nos modèles jusqu'à présent étaient limités car l'intervention chirurgicale pratiquée en première intention chez les patients n'était pas appliquée dans nos expérimentations. Nous sommes parvenus à mettre au point le modèle de glioblastome opéré chez la souris immunodéprimée porteuse d'une tumeur intracérébrale. Nous souhaitons donc maintenant appliquer à nos animaux, le traitement classiquement délivré aux patients (appelé "protocole de Stupp") qui combine chirurgie + radiothérapie + chimiothérapie : l'objectif est de caractériser les effets des traitements et de mieux comprendre les mécanismes conduisant à la récidive tumorale.
Bénéfices attendus
L'utilisation d'un modèle de glioblastome opéré dans nos expérimentation permettra de replacer nos recherches dans un contexte thérapeutique plus représentatif de la pratique clinique. En particulier, cette étude devrait nous aider à comprendre les mécanismes induits par la radiothérapie et la chimiotherapie, lorsque celles-ci sont administrées juste après une chirurgie, et déterminer comment les cellules tumorales et les cellules du microenvironnement favorisent la rechute. Au final, ces données seront essentielles pour proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les phénomènes de récidives.
Procédures
Tous les animaux (85) recevront une injection de cellules tumorales dans le cerveau : l'injection est réalisée une fois au début de l'étude (durée 45min) et le suivi du développement de la tumeur intracérébrale se fait par imagerie de bioluminescence 2 à 3 fois par semaine (durée de chaque examen environ 15 min). Parmi les 85 animaux prévus, 72 animaux subiront une intervention chirurgicale permettant de retirer partiellement la tumeur qui s'est développée dans le cerveau : cette chirurgie d'exérèse est réalisée une fois au milieu de l'étude (durée 45min) et les animaux sont placés après l'opération en cage individuelle pendant 4 jous pour convalescence. Pour 54 animaux : traitement par radiothérapie (chaque irradiation dure environ 5 min ; 18 animaux recevront 1 irradiation ; 18 animaux recevront 2 irradiations espacées de 72h, 18 animaux recevront 5 irradiations à raison d'1/jour pendant 5 jours consécutifs)
Impact sur les animaux
La première nuisance attendue sur les animaux est liée à l’implantation même du glioblastome (apparition d’une tumeur cérébrale avec des effets délétères attendus non réversibles). Schéma de traitement par radiothérapie (itérations répétées) et imagerie par bioluminescence (2 ou 3 fois par semaine en phase péri-opératoire de l'exerèse) nécessitent un transport et une anesthésie répétés des animaux, qui se produiront de surcroit lors de la phase péri-opératoire. Une accoutumance liée à la répétition des anesthésies chimiques (kétamine) peut être observée, nécessitant une augmentation des volumes administrés : ce phénomène est maitrisé par le laboratoire et l'augmentation du volume injecté est de l'ordre d'une dizaine de µL entre le début et la fin des expérimentations. La bioluminescence et la radiothérapie sont des protocoles rapides et nécessitent une anesthésie de 15 minutes maximum. Une attention toute particulière sera portée aux animaux notamment en optimisant au maximum les conditions de raffinement. Chirurgie opératoire classée sévère mais utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux. Hébergement en cage individuelle après la chirurgie d'exérèse pouvant conduire à un stress des souris (limitation des interactions sociales directes) mais atténuation de cet effet indésirable en accolant les cages les unes aux autres qui sont de surcroit transparentes. Une attention toute particulière sera portée aux animaux notamment en optimisant au maximum les conditions de transport des animaux.
Devenir
Tous les animaux du projet développent une tumeur qui ne peut pas être contrôlée par les traitements appliqués : la tumeur finit par provoquer l'apparition de points limites qui expliquent la mise à mort à l'issue de chaque procédure (soit 85 souris au total)
Remplacement
Dans notre contexte, le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n'est clairement pas possible puisque nous tentons de modéliser chez l'animal l'impact de l'ablation chirurgicale des tumeurs dans le cas de tumeur cérébrale très agresssives et de très mauvais pronostic : la chirurgie ne peut pas être réalisée sur des modèles in vitro.
Réduction
Pour deux groupes d'études, nous avons réduit le nombre d'animaux car nous avons, lors une étude préliminaire, acquis des données qui pourront être compilées avec celles acquises dans ce nouveau projet. Afin de suivre la croissance tumorale, nous utiliserons une méthode d'imagerie permettant ainsi un suivi dans le temps de chaque animal. De plus, concernant les animaux qui recevront les différentes modalités de radiothérapie, les procédures se feront de façon séquentielle, palier par palier, de la procédure d'irradiation la moins contraignante à la procédure d'irradiation la plus contraignante pour les animaux. Seules les procédures bien tolérées seront conduites.
Raffinement
Un soin tout particulier sera apporté aux animaux notamment par un suivi post-opératoire rigoureux (désinfection de la plaie, analgésie, réhydratation par injection de glucose à 37°C...). Les souffrances de l'animal seront évaluées en appliquant une grille de score adaptée aboutissant à une prise de décision adéquate, en fonction de points limite et de crières d'arrêt préalablement définis et validés pour nos protocoles. Les conditions d'hébergement et d'enrichissement garantiront les conditions de bien-être animal. Le transport des animaux se fera de façon à éviter au maximum le stress des animaux.
Choix des espèces
Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles souris et rats. Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de son accessibiltié et de sa facilité de manipulation. Les souris immunodéprimées sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines. Nous privilégions des souris femelles, plus dociles et moins agressives, pour faciliter l'hébergement collectif. Des souris âgées de 6 semaines sont utilisées, à un stade où leur crâne a une conformation très bien définie qui permet l'injection de cellules tumorales sans danger et sans difficulté.
Rôle des nanoplastiques de polystyrène dans l’induction de l’épilepsie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes et leurs petits sont exposés à des nanoplastiques de polystyrène dans l'eau de boisson jusqu'à dix mois, puis les descendants reçoivent des électrodes implantées dans le cerveau et une injection d'un composé déclenchant des crises. Le porteur indique que les nanoplastiques provoquent une nuisance faible, mais que la chirurgie d'implantation et les crises peuvent être douloureuses ou stressantes. Toutes les souris sont tuées pour prélever le cerveau, l'objectif étant de tester si l'exposition aux nanoplastiques favorise l'épilepsie.
Objectifs
L'épilepsie est une maladie qui se traduit par une activité électrique anormale du cerveau. Elle touche surtout les enfants, les adolescents et les personnes âgées à des degrés divers. Les causes peuvent être génétiques, mais dans la plupart des cas, elles ne sont pas identifiées. Dans 60% des cas d'épilepsie, on suspecte des lésions du cerveau qui ne sont pas détectées par les méthodes de diagnostiques actuelles. Notre hypothèse est que les résidus de polluants environnementaux pourraient altérer le cerveau au moment de sa formation et induiraient de l'épilepsie qui apparaitrait plus tard dans la vie de l'individu. Notre objectif est de comprendre si une exposition aux nanoplastiques de polystyrène peut induire de l'épilepsie ou une sensibilité accrue à des stimulants pro-épileptiques chez les souris. Pour cela, nous allons faire des mesures de l'activité électrique cérébrale via des électroencéphalogrammes (EEG) et des observations du comportement dans ces 2 cas. Indépendamment de l'apparition de crises (ou pas), les enregistrements pourront mettre en évidence des modifications de l'activité cérébrale qui pourraient sous-tendre aux troubles du neurodéveloppement liés à l'exposition aux nanoplastiques, ainsi qu'une sensibilité accrue aux stimuli pro-épileptiques. Ceci sera évalué grâce à une injection d'un composé convulsivant, qui, à faibles doses, n'induit pas de réponse chez l'animal sain mais provoque une crise épileptique chez les animaux susceptibles, indicative d'une fragilité du réseau neuronal.
Bénéfices attendus
Le projet aura des bénéfices sur la santé humaine : (i) identification d'un lien entre l'exposition aux nanoplastiques et l'épilepsie; (ii) si les souris développent de l'épilepsie, cela permettrait d'expliquer, en partie, l'origine de certains cas d'épilepsie; (iii) au vu de la quantité de plastiques rejetés dans l'environnement, il a été évalué que les êtres humains ingèrent l'équivalent d'une carte bancaire par semaine (5 g par personne et par semaine). Nos recherches pourraient pousser les autorités à prendre des mesures plus drastiques pour limiter l'usage des plastiques dans les emballages alimentaires et protéger la santé des populations les plus fragiles étant donné que des études récentes ont montré que les nanoplastiques pénètrent dans le cerveau.
Procédures
Trois interventions : 1) Exposition aux nanoplastiques de polystyrène dans l'eau de boisson sur femelles gestantes et leurs petits jusqu'à 10 mois d'âge. Nombre femelles gestantes = 36 et progéniture = 156. 2) Implantation d'électrodes dans le cerveau des souris (progeniture) en vue d'enregistrements électro-encéphalogrammes (EEG). Durée de la chirurgie = 40 minutes maximum. 7-10 jours entre l'implantation et les enregistrements. Nombre d'animaux = 156. 3) Une seule injection de composé pro-épileptique lors de la deuxième session d'enregistrement EEG. Durée du geste: 30 s maximum. Nombre d'animaux = 156.
Impact sur les animaux
D'après nos résultats préliminaires, l'administration de nanoplastiques dans l'eau des biberons induit une nuisance faible, voire inexistante. L'éventuelle survenue de crises épilepsies peut être source de stress pour l'animal. Il est difficile de savoir si une douleur est associée aux crises motrices (secousses) mais chez l'humain il n'y a pas de douleur rapportée en cas de crise. Concernant l'implantation des connecteurs EEG, la chirurgie en soi pourrait induire une douleur, bien que tout soit mis en place pour minimiser ces effets. La chirurgie sera effectuée sous anesthésie générale après injection d'anesthésiants. Ces injections peuvent engendrer une légère douleur locale. Un spray anesthésiant est également appliqué dans les oreilles afin d'éviter une douleur locale au réveil. Concernant les suites post-opératoires, et d'après notre expérience, ce type de procédure n'engendre pas de signes de douleur, ni d'infection. L'enregistrement des EEG pourrait engendrer un léger stress dû au changement d'environnement.
Devenir
A l'issue de la procédure tous les animaux seront euthanasiés et leur cerveau prélevé pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet, il nous est impossible de remplacer l'animal vivant pour l'étude de l'épilepsie induite par l'exposition chronique aux nanoplastiques. En effet, les phénomènes physiopathologiques que nous souhaitons étudier sont très complexes et ne sont pas reproductibles à ce jour par des modèles in vitro, ni par modélisation. La souris demeure le meilleur choix, surtout en vue de l'existence de souris modèles d'épilepsie.
Réduction
Pour ce projet nous envisageons d'utiliser 210 souris sur la durée du projet. Le nombre d'animaux adéquat a été calculé grâce à un logiciel permettant d'avoir des analyses robustes. Nous avons également tenu compte de notre expertise de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en en gardant un nombre suffisant d'animaux pour ne pas compromettre la validité statistique des expériences qui seront menées. Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées.
Raffinement
Concernant le traitement par les polluants, les industriels ne sont pas tenus de faire des tests de toxicité pour les résidus de plastiques car à ces faibles doses, il n'est pas attendu de toxicité. Par ailleurs, des études préliminaires conduites au laboratoire n'ont pas montré de signes de souffrance chez les animaux exposés pendant 10 mois à ces concentrations de nanoplastiques. La chirurgie sera effectuée sous anesthésie générale, après injection d'anesthésiants. Un spray anesthésiant est également appliqué dans les oreilles afin d'éviter une douleur locale au réveil. Les animaux seront hébergés en groupe, sauf lors de l'implantation des dispositifs nécessaires pour enregistrer l'activité cérébrale, afin d'éviter le risque de blessure mutuelle (par ex. connecteurs arrachés). L'environnement sera enrichi (copeaux, morceaux de coton, papier, maisonette). Afin de diminuer le stress, les souris seront manipulées quotidiennement par les expérimentateurs avant chaque étape de la procédure expérimentale (chirurgie, enregistrement EEG). L'état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l'expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de bien-être, utilisée sur notre plateau d'expérimentation. Cela nous permettra d'intervenir immédiatement et de manière appropriée en fonction de la grille de score établie et si des signes de souffrance sont détectés (détresse, souffrance, prostration, perte de poids supérieure à 15%, poils ébouriffés) .
Choix des espèces
Dans les modèles d'expositions in utéro aux polluants environnementaux, la souris représente un modèle de choix, pour les raisons suivantes: - ce sont des mammifères donc le mode de transmission des polluants via le placenta et le lait est similaire à l'humain; - des études précédentes sur l'exposition aux plastiques ont permis de mettre en évidence que les nanoplastiques affectent le cerveau et le comportement des souris; - la reproduction et la gestation sont relativement rapides ce qui permet de générer les groupes nécessaires à l'étude assez rapidement; - le nombre de petits par portée est élevé, ce qui permet d'avoir une robustesse dans nos études comportementales, de prendre en compte le sexe dans les groupes et d'avoir des échantillons en nombre suffisant pour les analyses. Les mères (6-8 semaines) seront traitées avec les nanoplastiques de polystyrène à faibles doses avant l'accouplement pendant 1 mois, puis pendant l'accouplement et la gestation. Elles seront en permanence sous traitement à une concentration résiduelle, comme c'est le cas de la population humaine exposée chroniquement aux plastiques tout au long de leur vie. Les petits issus de ces portées seront également soumis aux nanoplastiques de polystyrène à faibles doses pendant le développement (stade foetal), pendant la lactation et jusqu'à la date d'euthanasie prévue des animaux.
Prévention du risque de cancer du côlon par réduction des nitrites ou utilisation d’antioxydants dans la charcuterie
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection d'azoxyméthane, un cancérogène, puis sont nourris de charcuteries testées et placés en cage à métabolisme pendant 48 heures. Le porteur indique que l'étude s'arrête au stade des lésions précancéreuses microscopiques et qu'aucune douleur n'est attendue. Tous les rats sont tués pour prélever le côlon et le sang, afin de comparer l'effet des nitrites et d'antioxydants sur le risque de cancer.
Objectifs
La consommation de charcuteries est associée à une augmentation du risque de cancer du côlon. Sur la base de données épidémiologiques (données issues de questionnaires de volontaires humains et de santé humaine), l’organisation mondiale de la santé (OMS) a classé la charcuterie comme cancérigène avéré pour l’Homme (Classe I). Ces données ont été consolidées par des études expérimentales à l’aide de modèles animaux (rats et souris). Les mécanismes mis en jeu impliquent la production de composés toxiques par la présence de lipide dans l’alimentation et de constituants de la charcuterie tel que le rouge de la viande (fer héminique) et les nitrites ajoutés. Des travaux précédents ont démontré que les antioxydants dans le régime ou ajoutés dans la charcuterie peuvent limiter l’effet néfaste des viandes dont les charcuteries. De plus, ces travaux ont permis d’observer un déséquilibre de la flore intestinale chez le rat comparable à celle observée pendant la cancérogenèse colique. Nous proposons de modifier la production des charcuteries pour limiter le risque de cancer du côlon associé à leur consommation. Nous évaluerons l’effet d’un régime riche en charcuteries et de régimes riches en charcuteries modifiées (réduction de concentration en sel nitrité ou ajout d’antioxydant) sur la formation des composés toxiques, l’inflammation, le microbiote intestinal et la promotion de la carcinogenèse colorectale au stade très précoce. Dans ce projet, nous proposons une procédure où 192 rats Fisher 344 mâles seront nourris avec un régime contenant de la charcuterie modèle type jambon cuit et type saucisson pendant 100 jours. Leur urine et leur fèces seront récupérés séparément et leur côlon post mortem sera prélevé à la fin de l’expérimentation. Ces échantillons permettront des mesures des produits d’oxydation des lipides, de l’inflammation, du microbiote, de marqueurs de la promotion de la cancérogenèse colique et des analyses pour la compréhension mécanistique au niveau du tissu colique.
Bénéfices attendus
Nous proposons d'évaluer des indicateurs de la cancérogenèse précoce tels que le microbiote, son déséquilibre, l'inflammation, la formation de composés toxiques et les lésions précancéreuses coliques (lésions à l'échelle cellulaire). Ce projet nous permettra de comparer différentes charcuteries selon qu’elles contiennent autant de nitrite ou moins que celles du marché ou encore selon qu’elles contiennent des antioxydants ou non.
Procédures
Une injection en intrapéritonéale durant 30 secondes / Tatouage d’identification durant 5 secondes / Passage en cage à métabolisme durant 48h précédé de 3h d'habituation / Aucun prélèvement invasif n'est prévu sur les animaux, seulement la récupération des urines et des fèces, sans contention de l'animal
Impact sur les animaux
Injection d'azoxyméthane en intrapéritonéale : douleur contrôlée / Tatouage : douleur contrôlée (un seul point de tatouage à une oreille) / Passage en cage à métabolisme durant 48h précédé de 3h d'habituation : stress contrôlé / les prélèvements de fèces et urines se font sans contention et l'étude est arrêtée au stade des lésions prénéoplasiques dites précancéreuses microscopiques qui ne concernent que quelques cryptes intestinales et ne provoquent pas de douleur : pas de douleur attendue / les charcuteries ont pour majorité été testées lors d'autres études sur ce modèle rat sans observation de modification sanitaire, les antioxydants ont été testés in-vitro et sélectionnés en fonction de leur non toxicité sur les cellules : pas d’effets indésirables attendus. Cependant les animaux sont continuellement surveillés à l'aide d'une fiche de suivi (sanitaire et comportement) construite spécifiquement pour le rat F344 mâle utilisé dans cette étude (sous couvert de la SBEA qui l'a validée).
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin que le côlon et le sang soient prélevés pour analyses.
Remplacement
Les antioxydants choisis pour ce projet sont testés au préalable pour qu’ils soient efficaces au niveau de leur capacité anti effet du nitrite, antioxydante et au niveau organoleptique (couleur et goût acceptable pour le consommateur). Cependant, aucune étude in vitro ne permet d'évaluer les répercussions de ces composés, sur la physiologie et le métabolisme d'un organisme entier. L'utilisation d'animaux permet de mesurer et/ou d’examiner des atteintes dans les voies intestinales et coliques (inflammation, atteinte tissulaire). Seule une approche in vivo permet de prendre en compte la complexité de l'épithélium colique sur la physiologie intestinale et leurs rôles dans l'inflammation et l'apparition de dommages à l'ADN dans l'épithélium ainsi que les modifications possibles du microbiote intestinal.
Réduction
Dans l'objectif de réduire au strict minimum l'utilisation d'animaux de laboratoire, leur nombre a été limité au maximum (n=12 animaux/lot). Lors d’expérimentations précédentes conduites sur ce même format et confirmé par un calcul de test de puissance statistique (paramètre suivi : nombre ACF (Aberrant Crypt Foci), un nombre de 12 rats par groupe a été déterminé pour mettre en évidence une modulation significative de la carcinogenèse.
Raffinement
Les animaux auront 5 jours d'acclimatation à leur arrivée de J-12 à J-7. La nourriture, expérimentale et l'eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière sera réalisé 1 fois par semaine au moins. Les animaux seront suivis et surveillés quotidiennement à l'aide d'une fiche de suivi sanitaire (spécifique à cet animal et à cette étude ; validée par la SBEA). Pour ne pas souffrir d'isolement, les rats seront maintenus à 2 par cage (cage conventionnelle). Elles contiendront un enrichissement. Les animaux seront hébergés dans des cages à métabolisme individuelle pendant 48h (J70) précédées de 3h d'habituation (recueil des fèces et urines séparées). Les animaux seront euthanasiés en fin d’étude par 2 (même cage conventionnelle) et dans une salle différente de la salle d’hébergement (stress contrôlé).
Choix des espèces
Depuis les années 80, l’étude de la relation entre l’alimentation et le cancer est basée sur les études épidémiologiques mais aussi sur des approches expérimentales in vivo qui reposent sur les modèles animaux. Le modèle le plus utilisé est le rat chimio-induit (par injection intrapéritonéale d’azoxyméthane) qui a l’avantage de présenter une évolution cellulaire vers le cancer colorectal du tissu colique comparable à la situation humaine. Le rat F344 chimio-induit est un bon modèle pour étudier la modulation des biomarqueurs urinaires, fécaux et coliques associés à l’effet promoteur de l’hème des charcuteries sur une durée de 100 jours. Les mâles adultes sont privilégiés pour analyser le développement des pathologies à l’âge adulte afin d’éviter les effets hormonaux liés aux cycles de la femelle (observés sur l’inflammation et carcinogenèse). L'ensemble des études précédentes ont été menées sur des rats adultes dont la fonction digestive est totalement fonctionnelle. Afin de rester en accord avec ces résultats précédents, il est important de rester au même stade de développement.
Traitement thérapeutique in utero de la souris Moblo, un modèle d’étude de la maladie de Menkes
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
132 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, pour tester un traitement in utero de la maladie de Menkès. Les femelles gestantes reçoivent des injections sous-cutanées cinq jours sur sept, et les souriceaux mâles malades subissent sept tests neurocomportementaux de J3 à J38. Le porteur décrit une mortalité importante des souriceaux non traités et un risque de mort par anévrisme aortique, précédé de perte de poids et d'apathie. Douze femelles sont tuées au vingtième jour de gestation et les mâles à J38, tandis que quarante femelles sont gardées vivantes pour de futurs accouplements.
Objectifs
La maladie de Menkes est une maladie genetique rare au niveau du chromosome X qui a pour conséquence un deficit en cuivre dans l’ensemble de l’organisme. C’est l’incapacite du cuivre a franchir les barrieres biologiques (placenta, intestin, cerveau) qui est responsable de la pathologie. Les traitements actuels sont inefficaces et le devenir des enfants malades reste extremement pauvre avec des troubles graves aboutissant a un deces dans les premieres annees de vie. Les nanoparticules ont la capacite de franchir differentes barrieres biologiques dont la barriere placentaire. Nous suivons une piste therapeutique chez la souris porteuse de cette mutation, par l’utilisation d’un transporteur synthetique du cuivre (TSC) qui permet d’acheminer le cuivre aux organes cibles tels que le cerveau ou le placenta. Nos travaux ont montre une tolerance des souriceaux à ce traitement. Nous avons determine une dose et un rythme d’administration optimaux de TSC, et demontre l’amelioration des signes cliniques chez les souriceaux males malades traites par TSC. Neanmoins, malgre un allongement tres net de l’esperance de vie et un comportement exploratoire plus alerte, nous n’avons pas corrige les troubles squelettiques dont les malformations apparaissent au stade embryonnaire, notre traitement actuel ne demarrant qu’au 5e jour post-natal. De plus, les souriceaux males non traites montrent une forte mortalite a la naissance avec des ratio sexe/genotype non respectes. Les atteintes liees au deficit en cuivre apparaissent des le stade embryonnaire. Notre projet vise a montrer qu’un traitement precoce des souris gestantes porteuses de la mutation va permettre une viabilité plus importante tout en corrigeant les troubles squelettiques des descendants malades. Le gène de la maladie du métabolisme du cuivre étant porté par le chromosome X, les mâles sont fortement touchés. L’étude sera donc menée sur des femelles dites hétérozygotes, i.e. porteuses d’une version mutée et d’une version non mutée du gène responsable de la maladie, et ne déclarant que peu ou pas de symptômes. Les souris mâles hémizygotes, i.e. porteuses d’un exemplaire unique du gène muté et donc souffrant de la maladie, et nées de ces femelles seront également utilisées pour réaliser les tests neurocomportementaux pour certains, tandis que les animaux surnuméraires seront traités tout au long de leur vie afin d’établir une courbe de survie pour ce modèle d’étude.
Bénéfices attendus
1) Une restauration des ratios sexe/génotype avec une diminution importante de la mortalité à la naissance 2) Une croissance squelettique normalisée pour les descendants mâles malades mais traités avec le médicament. 3) Une restauration des fonctions biologiques altérées. 4) Une restauration des fonctions cognitives principales. 5) Une amélioration de la survie.
Procédures
- Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 au cours de la gestation jusqu’au 20e jour de gestation pour les femelles porteuses de la maladie mais non atteintes - Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 au cours de la gestation jusqu’à la mise bas - Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 à partir de J5 et ce jusqu’à la fin du protocole à J38 pour les mâles descendants et porteurs de la maladie - Tests neurocomportementaux au nombre de 7 allant de J3 à J38 pour les souris mâles malades.
Impact sur les animaux
1) Une mortalite importante a la naissance des souriceaux issus de femelles porteuses de la maladie mais non atteintes, et non traitees pendant la gestation. 2) Mort des animaux non traites ou traites par histidine-cuivre liee au risque d’anevrisme aortique. Ce point est previsible dans la plupart des cas notamment avec une stagnation voire une perte de poids, ainsi qu’une apathie et une febrilite (troubles de la mobilite, difficultes d’alimentation). Les études précédemment réalisées ont montré que les souriceaux recevant le TSC avaient une espérance de vie considérablement augmentée, ce qui nous permet de dire que les animaux traités ne subiront pas d’anévrisme aortique grâce au traitement administré. 3) Modification du comportement maternel pendant la gestation et a la naissance (construction du nid, gestion de la portee...) grâce au traitement.
Devenir
Les femelles porteuses de la maladie (mais non atteintes) destinées à l’étude du passage placentaire (au nombre de 12) seront mises à mort au vingtième jour de la gestation, juste avant la mise bas. Les femelles porteuses de la maladie (mais non atteintes) (40) allant jusqu’à la mise bas seront gardées en vie pour de futurs accouplements. Les descendants mâles seront gardés en vie jusqu’à J38 pour ceux destinés aux tests neurocomportementaux (40) dans le but d’effectuer les analyses biochimiques et histologiques. La descendance mâle surnuméraire (40) destinée à l’étude de survie sera gardée vie jusqu’à J100 dans le but de valider les effets bénéfiques du traitement sur la survie. L’âge de survie des animaux mutants non traités ou traitées avec le placebo ou l’histidinate de cuivre (traitement actuel mais inefficace de la maladie de Menkes) est comprise entre 3 et 5 semaines. Au total 132 souris seront impliquées dans ce protocole expérimental.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative d’approche in vitro car le projet porte sur l’étude de l’allongement de la durée de vie, le ratio sexe/génotype dans les portées et l’amélioration de la mobilité et du comportement du souriceau porteur de la maladie de Menkès en fonction de la réponse au traitement.
Réduction
L'etude gestationnelle portera sur 52 femelles au total reparties en 4 groupes de 3 femelles pour la validation du traitement gestationnel. La cohorte de 12 femelles porteuses saines de la mutation, sera mise a mort au 20e jour de gestation dans le but de confirmer les effets positifs potentiels du traitement au cours de la gestation. Au vu des résultats encourageants que nous avons obtenus sur nos travaux portant sur le franchissement de la barrière sangcerveau, et partant du principe que les mécanismes biologiques régissant le transport du cuivre sont similaires au niveau du cerveau et du placenta nous pensons que le TSC franchira cette barrière placentaire. Si les résultats de dosage du cuivre confirment notre hypothèse de transport à travers le placenta, 4 autres groupes de 10 femelles porteuses saines de la mutation seront destinees a l'etude de l'impact du traitement gestationnel sur la descendance male. L’etude comportementale, quant a elle, portera sur 40 souris reparties en 4 groupes de 10 souris malades qui seront etudiés et mis a mort une fois les tests comportementaux termines, a l’age de 38 jours. La courbe de survie sera évaluée à partir d'animaux surnuméraires, selon la même distribution de 40 souris mâles supplémentaires et porteuses de la maladie. Au total 132 souris seront impliquées dans l'étude, un nombre d’animaux necessaire pour mener a bien ce protocole expérimental et obtenir une puissance statistique suffisante. De plus, l’hypothèse faite serait que grâce au traitement, les ratios sexe/génotypes devraient être restaurés et produire au moins 2 mâles mutants par portée. Un mâle sera dédié aux tests neurocomportementaux tandis que le deuxième permettra d’établir une courbe de survie nécessaire pour valider l’effet positif du traitement gestationnel.
Raffinement
Toutes les cages du protocole sont garnies d’éléments enrichissants (coton, buchettes, etc.). Ces éléments permettront notamment aux femelles gestantes de nidifier, ce qui va créer une atmosphère sécurisante pour l’ensemble des souris. Au cours des expérimentations, les souriceaux devant subir un traitement seront isolés de la mère le temps de l’expérimentation (injection et/ou tests neurocomportementaux), et la mère mise à distance, dans le but de réduire le stress maternel. A la fin de l’expérimentation, les petits seront remis rapidement dans la cage avec la mère et isolé au calme (pièce d’hébergement, sans mouvement brusque de la cage). S’agissant d’une maladie génétique, les troubles physiologiques sont présents tout au long de la vie de l’animal et il n’est pas prévu de pratiquer une analgésie qui pourrait d’une part générer un stress supplémentaire lors du traitement quotidien et d’autre part perturber fortement les tests neuro-comportementaux, rendant les résultats inexploitables. Une procedure d’estimation et suppression de la douleur est mise en place : differents elements visuels chez l’animal sont evalues afin d’etablir un score qui permet d’anticiper et d’eviter d’atteindre les points limites : isolement, yeux fermes, dos voute, poils herisses, immobilite, perte de poids, yeux et abdomen creux.
Choix des espèces
La souris ATP7Amoblo est le seul modèle de mutation spontanée permettant une étude de cette pathologie génétique. L'utilisation d'un modèle mammifère, et de souris en particuliers, permet d'étudier l'efficacité du médicament dans l'intégralité d'un organisme vivant proche de l'homme. Ce choix se justifie aussi par la possibilité de faire des liens avec d’autres modèles transgéniques murins utilisés pour l'étude d'autres maladies métaboliques. Nous focaliserons l’étude de la conception jusqu’au-delà du sevrage, à J38 pour les souriceaux destinés aux études neurocomportementales et J100 pour les souriceaux surnuméraires destinés à l’étude de la survie. Ceci nous permettra d’évaluer l’efficacité du traitement du développement embryonnaire et ce jusqu’à l’âge adulte. Les femelles porteuses saines de la mutation seront mises en accouplement à l'âge de 3 à 5 mois, et celles qui subissent le traitement pendant la gestation seront utilisées à nouveau pour maintenir la lignée.
Etudes et modulations pharmacologiques des mécanismes liant les troubles métaboliques au déclin cognitif sur un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
1 840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Soumises à un régime gras sur douze mois, elles subissent des prélèvements sanguins rétro-orbitaux tous les trois mois, un test de tolérance au glucose, une batterie de tests comportementaux non détaillés et, pour certaines, une injection stéréotaxique dans le cerveau. Le porteur indique que le régime peut être mal toléré et que la stéréotaxie ou l'IRM sous anesthésie peuvent provoquer détresses respiratoires et hypothermie. Toutes les souris sont tuées pour prélever le cerveau et réaliser des études histologiques.
Objectifs
Le déclin cognitif est un processus naturel survenant avec le vieillissement. Néanmoins il peut être accéléré et aggravé par la présence de troubles métaboliques, particulièrement lorsque ceux-ci sont présents à un âge moyen. Nous avons montré précédemment sur notre modèle à long terme (12 mois) l'apparition progressive de troubles métaboliques en réponse à un régime enrichi en gras (hypercholestérolémie, intolérance au glucose, hyperglycémie de stade prédiabétique, stéatose, augmentation de la graisse viscérale). Des altérations de la flexibilité de la mémoire, de la mémoire de reconnaissance visuelle ainsi que des altérations fonctionnelles des vaisseaux cérébraux de surface et intraparenchymateux ont été observées de manière concomittante et étroitement corrélées à l'augmentation de la graisse viscérale. Notre hypothèse est qu'une altération du couplage entre activité neuronale et réactivité vasculaire pourrait participer à la mise en place du déclin cognitif, vulnérabiliser le tissu cérébral et favoriser l'évolution vers la démence.
Bénéfices attendus
Ce projet a l'avantage de proposer un modèle murin totalement maitrisé au laboratoire mimant la mise en place progressive de troubles métaboliques. Ce profil pathologique est souvent retrouvé en clinique humaine et les médecins sont parfois indécis quant à la prise en charge de ces troubles, d'autant plus quand ceux-ci sont associées. Grâce à cette étude, nous pourrons mieux comprendre les mécanismes d’action et les conséquences observées, et envisager des projets de recherche translationnels avec la clinique.
Procédures
La mise en place des troubles métaboliques chez les souris sera évaluée par des dosages plasmatiques des marqueurs standard (cholestérol, triglycérides, glycémie, leptinémie et insulinémie). Des prélèvements sanguins seront effectués tous les 3 mois de 0 à 12 mois de régime au niveau du sinus rétro-orbital, après anesthésie des animaux pendant 10 minutes. En parallèle, un test de tolérance oral au glucose sera effectué sur une durée de 2 heures. Les souris seront mises à jeun 6h avant l'expérience. Tous les animaux sont évalués d'un point de vue comportemental par une batterie de tests aux différents temps d'intérêt. Avant la mise sous régime, certains animaux subiront une injection stéréotaxique d'AAV permettant de cibler les neurones glutamatergiques pour les mettre en évidence lors des expérimentations électrophysiologiques ultérieures (intervention de 30 minutes/souris). Enfin, à tous les temps d'intérêt, certains animaux subiront une anesthésie de 15 minutes pour la mesure du débit sanguin cérébral par laser Doppler en réponse à une stimulation des vibrisses et d'autres animaux subiront une anesthésie de 30 minutes pour la réalisation des séquences d'IRM.
Impact sur les animaux
La mise en place d'un régime HFD peut être mal tolérée par certains animaux et entrainer de l'inconfort. Les injections en stéréotaxie ou l'imagerie en IRM sous anesthésie peut provoquer des détresses respiratoires et une hypothermie chez certains animaux. Les évaluations comportementales n'induisent pas de perturbation en elles-mêmes. De potentiels effets indésirables peuvent apparaitre en fonction des traitements administrés. Ils seront analysés au cas par cas.
Devenir
A l'issue des différentes procédures tous les animaux seront mis à mort après les évaluations comportementales aux différents temps d'intérêt. Le cerveau sera ensuite prélevé dans le but de réaliser des études histologiques et immunohistochimiques.
Remplacement
L’expérimentation proposée vise à comprendre les mécanismes d'apparition du déclin cognitif induits par des désordres métaboliques dans un contexte sans facteurs confondants. Il s’agit de l’étude d’un modèle physiopathologique faisant appel à de nombreux types cellulaires et à de nombreux mécanismes donc la complexité et la cinétique ne peuvent être reproduites in vitro. Les évaluations cognitives ne peuvent se faire que sur l'animal.
Réduction
L’ensemble des procédures expérimentales nécessaires à l’accomplissement de ces études requiert un nombre total de 1840 animaux. Le nombre minimal nécessaire d'animaux a été défini pour assurer la validité scientifique et statistique des résultats (différences statistiquement observables entre les animaux traités et les animaux contrôles). Les études comportementales et la réponse aux traitements présentent une certaine hétérogénéité qui nécessite d'avoir un nombre d'animaux suffisant par lot ainsi que plusieurs lots pour valider les résultats. Les données et les analyses statistiques sont conformes aux recommandations sur la conception expérimentale et l'analyse en pharmacologie (Curtis et al, 2018). Ainsi, des études statistiques seront réalisées à l'aide de tests paramétriques ou non paramétriques selon la normalité de la distribution. Pour l'ensemble de ces analyses, les différences seront significatives lorsque p≤0,05.
Raffinement
Dans tous les cas, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et une vigilance particulière sera réalisée sur les points limites afin de respecter au mieux le bien-être animal. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique ou seront euthanasiés dans une salle dédiée. La structure BEA ou le vétérinaire référent seront sollicités pour avis si besoin. Les conditions d'hébergement sont optimisées avec un environnement contrôlé (température, pression, humidité de l'air) et de l'enrichissement dans les cages.
Choix des espèces
Le projet est basé sur l’évaluation de marqueurs métaboliques, biologiques et comportementaux et sur l’observation de l’impact d’un traitement pharmacologique ou nutraceutique. L’utilisation d’animaux est donc requise. Notre laboratoire travaille depuis de nombreuses années sur les rats et les souris et nous disposons d’outils fiables et de protocoles bien validés pour l’imagerie, les tests comportementaux, l'électrophysiologie, la réactivité vasculaire, l’histologie, les marquages et les dosages. Les souris C57Bl6/j mâles sont reconnues comme étant des animaux particulièrement sensibles à un régime enrichi en gras. Les souris seront soumises à un régime enrichi ou non à partir de l’âge de 8 semaines, âge le plus couramment utilisé dans la littérature pour induire des troubles métaboliques chez ces souris.
Extension d’indication thérapeutique préclinique
- Recherche appliquée
- Cancers
1 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Une tumeur cancéreuse leur est injectée sous la peau, suivie de quatre injections d'un vaccin combinant virus atténué, anticorps et fragment d'ADN sélectionné par intelligence artificielle. Le porteur indique que la tumeur peut s'ulcérer, provoquer douleur et détresse et se propager aux poumons, à l'abdomen, au cerveau et aux genoux. Les bénéfices annoncés pour de futurs essais cliniques sont présentés comme "essentiels", l'objectif immédiat restant de vérifier la réponse immunitaire induite par le vaccin.
Objectifs
Nous souhaitons vérifier la capacité du traitement que nous avons développé à produire des réponses immunitaires permettant de contrôler l'évolution du cancer. Ce traitement consiste en un virus atténué, un anticorps et un fragment d'ADN qui contient des informations sur des mutations génétiques retrouvées au sein de la tumeur que l'on veut traiter. Le choix de ces mutations est réalisé à l'aide d'outils reposant sur l'intelligence artificielle et ce projet nous permettra également de vérifier l'efficacité des mutations choisies par les algorithmes que nous utilisons.
Bénéfices attendus
Nous attendons des bénéfices à deux niveaux à la suite de l’exécution de ce projet : - La meilleure compréhension de la réponse immunitaire induite par notre vaccin contenant les molécules cibles, et l’analyse des réponses favorables au contrôle de la tumeur permettra potentiellement d’améliorer notre vaccin - Ces données sont essentielles pour les futurs essais cliniques chez l’humain et tester la sureté et l’efficacité de notre vaccin pour soigner des patients atteints de cancer
Procédures
Les souris seront injectées une fois sous la peau avec les cellules de cancer sous anesthésie générale. L’anesthésie dure environ 5 minutes et l’injection 30 secondes. Elles seront aussi injectées 4 fois sous la peau avec notre vaccin sans qu’une anesthésie ne soit nécessaire. Le geste dure environ 30 secondes.
Impact sur les animaux
La tumeur peut gêner au déplacement de l’animal. La tumeur peut ulcérer et causer douleurs et détresse à l’animal. Le cancer peut se propager à différents endroits de l’organisme. Ce point concerne surtout le modèle de cancer du sein qui peut se répandre aux poumons, dans l’abdomen, au cerveau et aux genoux. Cela peut alors perturber le comportement de l’animal, sa respiration ou ses déplacements
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de procéder au prélévement des organes où s'initie la réponse immunitaire et, le cas échéant, des tumeurs.
Remplacement
Nous voulons étudier les mécanismes mis en œuvre par notre système immunitaire d’une part et par la tumeur d’autre part, ainsi que l’interaction entre ces deux entités. Cette interaction nécessite l’intervention de nombreuses cellules différentes provenant d’organes différents. Cette complexité requiert pour l’heure des études chez l'animal pour évaluer et comprendre les phénomènes mis en jeu.
Réduction
Pour les études de survie chez les souris atteintes de cancer où nous réaliserons des comparaisons 2 à 2 avec un test statistique adéquat, le nombre de souris nécessaires par groupe est de 20 pour avoir 70% de chances de détecter l'effet recherché. Concernant les autres études, pour avoir 90% de chance de détecter l'effet de notre vaccin en utilisant un test statistique adéquat, nous avons besoin de 9 souris par groupe. Le dosage des composés de notre vaccin est basé sur l’art antérieur issu de la littérature et de nos données propres.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages disposant de matériel de nidification et de bâton à ronger. Le déplacement des animaux, notamment lors des changements de cages, seront réalisés à l’aide de tunnels transparents afin d’éviter au maximum une prise en main stressante pour l’animal. Des pellets de nourriture seront ajoutés au fond de la cage des souris présentant des tumeurs au moindre doute que celles-ci puissent gêner l’accès des souris à la mangeoire et donc leur prise de nourriture. L’observation des animaux sera effectuée tous les jours et un suivi attentif des animaux sera assuré trois fois par semaine, à partir de 7 jours après l’injection des cellules tumorales. Nous effectuerons tout d’abord une observation simple de l'animal, il sera alors jugé de la qualité de son toilettage, de sa posture, de son expression faciale et de sa démarche, à la recherche de signes de douleur potentiels. L’animal sera ensuite pesé en utilisant le tunnel transparent pour le transfert dans le bol de pesée. Cette pesée permettra de détecter toute difficulté à la prise alimentaire et/ou toxicité inattendue du traitement. A partir de 7 jours après l’injection des cellules cancéreuses, les souris pourront être palpées à la recherche de tumeur au site d’injection ou, à la recherche d’une dissémination du cancer. Des points limites ont été mis en place et ces examens réguliers nous permettrons, le cas échéant, de soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
La souris est un modèle de référence en immunologie ainsi qu’en immuo-oncologie et de nombreux outils permettant de caractériser les réponses immunitaires sont disponibles dans cette espèce. De plus, cette espèce dispose de nombreuses ressources en oncologie et notamment des modèles de cancer utilisés dans ce projet. Les souris seront de jeunes adultes (6-8 semaines) ce qui correspond à un stade où le système immunitaire est pleinement mature et fonctionnel. Les animaux ne sont pas choisis plus âgés pour limiter les effets de la dégénérescence immunitaire.
Nociception et douleur dans la maladie de parkinson (modèle 6OHDA dans le faisceau médian du télencéphale)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie de lésion cérébrale d'environ une heure trente reproduisant la maladie de Parkinson, puis sept tests comportementaux évaluant les seuils de douleur et les déficits moteurs. Le porteur indique que la douleur liée au modèle "ne peut être soulagée, car c'est l'objectif de l'étude", et attend perte de poids, déficits moteurs et douleurs post-chirurgicales. Il affirme que la caractérisation de la douleur dans Parkinson nécessite une observation comportementale "uniquement possible chez l'animal vivant et vigile".
Objectifs
La maladie de Parkinson est caractérisée par une perte progressive des neurones dopaminergiques localisés dans la substance noire compacte. Cette maladie est classiquement associée à des symptômes moteurs, cependant il est maintenant reconnu que de nombreux symptômes non moteurs, incluant la douleur, sont très communs. Les symptômes douloureux peuvent être observés chez environ 85 % des patients Parkinsoniens. Le seuil de douleur est également altéré chez les patients Parkinsoniens, présentant ou non des symptômes de douleur. Ces douleurs sont négativement associées avec la qualité de vie des patients, en ayant un impact plus fort que les symptômes moteurs. Ces symptômes de douleurs sont donc un souci majeur dans la prise en charge de la maladie. Les douleurs centrales dans la maladie de Parkinson suggèrent que les circuits cérébraux permettant de percevoir et traiter les informations douloureuses pourraient être dysfonctionnels. Cependant, bien que des traitements nociceptifs anormaux aient été reportés dans certaines structures cérébrales impliquées dans la douleur, il n’y a à ce jour aucune hypothèse pathophysiologique permettant de les expliquer. Notre objectif est d'étudier les mécanismes physiopathologiques corticaux et sous-corticaux à l'origine de la douleur liée à la maladie de Parkinson, en utilisant des approches lésionnelles et comportementales.
Bénéfices attendus
le but de se projet est de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques, potentiellement différentes chez le mâle et la femelle, pour traiter les douleurs associées à la maladie de Parkinson chez l'homme.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie lésionnelle d'une durée d'1h30 environ et 7 test comportementaux. Après un repos post chirurgical de 3 semaines les animaux subiront au maximum 1 test par jour et l'ensemble des tests sera reparti sur 3 semaines. Ces tests auront pour objectif d'évaluer les seuils de nociception ou bien les déficites moteurs. La durée des tests peut aller de 10 minute à 20 minutes.
Impact sur les animaux
La présence de douleur liée à la modélisation de la maladie de Parkinson ne peut être soulagée, car c'est l'objectif de l'étude. Les lésions dopaminergiques peuvent entrainer une perte de poids attendue et des déficits moteurs eux aussi attendue. Des douleurs post-chirurgicales au niveau du crâne sont également attendus aini que des douleurs inflammatoires.
Devenir
les animaux seront mis à mort pour prélèvement
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, la caractérisation de la douleur dans la maladie de parkinson nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Chaque groupe expérimental explorant les comportements douloureux et moteurs liés à la maladie de Parkinson sera constitué afin d’assurer d’un échantillonnage intra groupe suffisant et au moins deux séries d’expérience par test seront réalisées afin de s’assurer de la reproductibilité de nos résultats. Au regard de la littérature, de la variabilité phénotypique interindividuelle, le nombre d'animaux a été établi pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en animalerie dont la température, l’humidité et le cycle jour/nuit sont contrôlés. La nourriture et boisson sont disponibles ad libitum. Ils seront hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Nous travaillerons en cycle jour/nuit (lumière allumée de 8h à 20h). Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Lors des chirurgies des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont utilisées. Des points limites ont été etablis permettant de soustraire l'animal à la souffrance . Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point, une concertation avec la structure du bien etre animal pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques.
Choix des espèces
Le modèle lésionnelle de maladie de Parkinson utilisé dans cette étude a été caractérisé et validé pharmacologiquement chez la souris. De plus, pour de futures études, de nombreuses lignées de souris transgéniques existent et sont disponibles ce qui nous permettra de répondre de façon précise la question des mécanismes physiopathologiques impliqués dans cette comorbidité maladie de Parkinson/douleur. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés pour les tests comportementaux
Effets de trois molécules anti-épileptiques sur les crises audiogènes létales dans la lignée de souris LAGS+ employée comme modèle de SUDEP (mort subite dans l’épilepsie)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issues d'une lignée qui répond à 100 % par une crise convulsive, elles reçoivent une injection d'un médicament anti-épileptique puis une stimulation sonore pouvant déclencher une crise potentiellement mortelle. Le porteur indique que ce modèle sert à mesurer si trois molécules réduisent le risque de mort subite lié à l'épilepsie, et que les souris sont ensuite tuées car le médicament reçu interférerait avec toute autre étude. Le stress provoqué par la stimulation sonore est reconnu, que l'animal réponde ou non par une crise.
Objectifs
Le risque de mort subite chez les patients épileptiques (SUDEP pour SUdden Death in Epileptic Patients ou mort subite chez les patients épileptiques) est trois fois plus élevé que chez les personnes saines. Le meilleur modèle de SUDEP actuel chez la souris correspond à une crise épileptique induite par un stimulus sonore et possiblement suivi du décès. L'objectif du projet vise à évaluer si trois molécules connues pour leurs effets anti-épileptiques et couramment employées chez des patients présentant des épilepsies à fort risque de décès, ont aussi des effets bénéfiques pour directement réduire les risques de décès.
Bénéfices attendus
Une validation d'un bénéfice de ces molécules pour réduire la mortalité devrait permettre d'obtenir une extension de l'AMM (autorisation de mise sur le marché) de ces médicaments pour d'autres formes d'épilepsies à fort risque de décès.
Procédures
Une injection d'un médicament anti-épileptique pratiquées aux 240 souris du projet. Une stimulation auditive d'une durée maximale de 60 sec pratiquées aux 240 souris du projet.
Impact sur les animaux
Un stress induit par la stimulation sonore pour les animaux, qu'ils répondent à la stimulation sonore par une crise ou qu'ils ne répondent pas.
Devenir
Les animaux seront mise à mort puisqu'ils ne peuvent pas être réutilisés pour une autre étude, puisqu'ils ont reçu une injection d'un médicament pouvant interférer avec une quelconque étude.
Remplacement
Ce projet vise à évaluer la capacité de certaines médications avec AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) ou de certaines molécules innovantes en développement, à bloquer ou réduire les risques de décès lors d'une crise d'épilepsie humaine. Les procédures de validation d'une efficacité attendue sont légalement très contraintes et elles reposent sur la capacité objective à supprimer ou réduire le risque de décès mesurée sur un animal vivant modélisant une situation homologue chez l'Humain.
Réduction
Ce projet sera réalisé sur une lignée qui présente 100 % de souris répondeuses au test de la crise audiogène létale. Cette situation permet de minimiser le nombre (n=20) de sujets expérimentés par groupe. Il n’est pas envisageable de descendre en dessous de 20 sujets par groupe car les scores analysés statistiquement sont des moyennes et des pourcentages ; ce dernier représentant le facteur limitant. Enfin, un effet dose à 3 points (puisque 3 doses par AED) correspond au nombre minimal possible de doses, sachant que les laboratoires ont une bonne connaissance des doses à envisager pour évaluer un effet anti-épileptique mais pas pour évaluer un effet ant-létal.
Raffinement
Notre protocole suit des procédures standardisées soucieuses de minimiser le stress et toute souffrance des animaux avec une détermination précise des points limites. Sur le plan de l'élevage et du maintien des souris à l'animalerie, ceci se traduit par une visite quotidienne pour contrôler le bien-être des animaux, l’enrichissement des cages autant que faire se peut, le respect des normes liées aux surfaces/volumes des cages pour éviter la surpopulation ainsi que celles liées aux plages acceptables pour la température et l’hygrométrie. Sur le plan du test lui-même, ceci se traduit par une durée limitée de stimulation auditive (max 60 sec), une utilisation d'une arène circulaire pour éviter des cognements dans les angles. Il faut aussi mentionner que la convulsion en elle-même ne dure pas plus de 8 sec dans 99 % des cas.
Choix des espèces
Les travaux sur l'évitement des décès dans l'épilepsie ne peuvent pas, par essence, s'affranchir de l'expérimentation animale qui nécessitent d'expérimenter l'animal et d'observer possiblement son décès. L'AGS est un modèle de choix pour l'étude de la SUDEP car aucun facteur systémique (chimique ou électrique) n'est pas l'origine de la crise létale, pouvant être co-responsable du décès de l'animal. L'AGS n'est pas létale chez le rat, rendant impossible l'emploi de ce modèle. Enfin il n’est pas envisageable d’instrumenter (ECG, EEG, respiration) sur des animaux plus petits que l’espèce souris. Ces approches ne sont pas envisagées dans ce projet mais elles ne seront dans des projets ultérieurs visant à comprendre comment les AED pourraient réduire les décès dans les modèles expérimentaux. Les animaux seront testés à 30-40 jours d'âge, au moment où ils devraient être sevrés.