Rongeurs

110 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ou deux chirurgies cérébrales d'environ une heure, puis des tâches comportementales de locomotion fine. Le porteur utilise une lignée porteuse d'une mutation humaine reproduisant la sclérose latérale amyotrophique, qui développe une paralysie progressive du train arrière, et vise à enregistrer l'activité de certains neurones avant l'apparition des symptômes. Il indique que ces neurones, parmi les plus longs de l'organisme, sont impossibles à reconstituer en culture ou à modéliser, d'où le recours à l'animal.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie affectant le système moteur, qui se caractérise par la dégénérescence de plusieurs populations de neurones : ceux contrôlant l’activité des muscles (les motoneurones, situés dans la moelle épinière), ainsi que ceux transmettant l’information provenant du cerveau vers la moelle épinière (les neurones corticospinaux). Notre projet a pour but d’étudier l’activité fonctionnelle des neurones corticospinaux afin de mieux comprendre leur rôle dans l’évolution de la pathologie, dans un modèle murin de sclérose latérale amyotrophique. Plus précisément, nous avons pour objectif de : 1) identifier les neurones corticospinaux sur les enregistrements électrophysiologiques 2) comparer l’activité de ces neurones chez l’animal sain vs. dans un modèle de sclérose latérale amyotrophique, et 3) évaluer le rôle de cette voie dans divers comportements locomoteurs, à un stade peu avancé de la pathologie.

Bénéfices attendus

Chez certains patients SLA, une activité électrique anormale a été détectée dans le cortex moteur. Celle-ci est susceptible de nuire à la communication neuronale vers la moelle épinière, et d’endommager par conséquent les neurones qui, en bout de circuit, contrôlent l’activité des muscles. Grâce à l’analyse de l’activité électrique de neurones dans le cortex moteur d’animaux éveillés libres de leurs mouvements, notre projet va nous informer, avec un degré de détail jamais encore égalé, sur les propriétés électriques de ces neurones et leurs éventuels changements anormaux dus à la sclérose latérale amyotrophique. Notre objectif est de quantifier ces changements internes avant l’apparition des symptômes moteurs. Il est attendu que ce projet améliore de façon significative la compréhension des mécanismes de la sclérose latérale amyotrophique.

Procédures

Les animaux subiront soit une chirurgie unique durant environ 1,5 heure, soit deux chirurgies à 2 semaine d'écart, chacune durant au plus 1 heure. Au minimum une semaine après la dernière chirurgie, les animaux effectueront des tâches comportementales de locomotion fine.

Impact sur les animaux

Les chirurgies entrainent inévitablement un stress et des douleurs chez la souris. Une perte de poids est souvent constatée les jours suivant la chirurgie mais l’animal récupère son poids initial en 3-4 jours. Les sutures peuvent aussi entrainer une gêne ou des démangeaisons qui poussent l’animal à se gratter et, très rarement, à endommager sa cicatrice. Cette gêne disparait également en quelques jours. La lignée SOD1 G93A développe un phénotype dommageable avec des premiers signes cliniques (non invalidants, membre postérieur partiellement affaissé dans le test de suspension de la queue) à P90, puis avec une partie du pied arrière qui traine à partir de P110. Si les animaux seront utilisés avant l’apparition de ces signes dans les procédures 2 et 3, ils seront maintenus au-delà dans la procédure 1 d’élevage, jusqu’à l’apparition d’une atteinte sévère (paralysie du train arrière à P120, âge médian).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement.

Remplacement

Les expériences de ce projet ont pour but d'étudier l’atteinte des circuits locomoteurs chez la souris dans un modèle pathologique. Les neurones étudiés sont parmi les plus longs de l’organisme, allant du cortex à la partie lombaire de la moelle épinière. Ils sont impossibles à reconstituer avec des techniques de remplacement de type culture cellulaire et doivent être intacts pour pouvoir être étudiés. Ils sont impossibles à modéliser numériquement car leur évolution au cours de la pathologie est encore méconnue. Nous devons donc recourir à l’animal pour atteindre les objectifs du projet.

Réduction

Les mesures pour réduire le nombre d’animaux ont été étudiées en adéquation avec le projet. Le nombre d’animaux utilisé a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement valides. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire et produire des résultats spécifiques de genre. Afin de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés, les procédures regroupent un ensemble de tests comportementaux dont l'enchaînement est compatible avec le bien-être de l'animal, ce qui permet de réduire grandement l’effectif.

Raffinement

Les souris sont hébergées en cohorte, elles font l’objet d’observations quotidiennes et l'enrichissement des cages est systématique (bâton à ronger, matériaux de nidification). Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire et la température de l’animal est maintenue grâce çà un tapis chauffant thermostaté relié à une sonde rectale. Les yeux sont hydratés avec un gel oculaire. L’état de santé des animaux est surveillé quotidiennement après la procédure chirurgicale et estimé selon une grille de score pondérée qui évalue l'apparence générale de l'animal, l'apparence de la plaie, le comportement spontané, le comportement provoqué et le poids. Des points limites ont été établis pour chaque item permettant de soustraire l’animal à la souffrance. L’âge médian d’apparition des premiers signes de la pathologie est de 90 jours après la naissance, mais il existe toutefois une variabilité individuelle autour de cette date. Nous prévoyons donc un suivi avec observation bi-hebdomadaire des animaux à partir de 76 jours après la naissance. De plus, à partir de cette date, des croquettes alimentaires seront placées dans le fond de la cage, ainsi que de l’aliment gélifié et un biberon à tétine longue afin de faciliter la prise d’eau et d’aliment.

Choix des espèces

Le modèle choisi est basé sur une forme familiale de la SLA chez l’homme, due à une mutation de la protéine SOD1 (G93A). Cette mutation (gène humain), introduite chez la souris entraîne une série de symptômes proches de la SLA. Il s’agit donc d’un modèle pré-clinique bien documenté de la sclérose latérale amyotrophique. Animaux utilisés à partir de 30 jours après la naissance, car c’est l’âge à partir duquel la voie de communication entre le cortex et la moelle a fini son développement

482 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie sont des souriceaux nouveau-nés soumis à des injections dans le foie pour caler le geste technique, avec une mortalité attendue, les autres reçoivent une greffe tumorale et des injections répétées sur plusieurs semaines. Le porteur teste des cellules progénitrices modifiées contre un lymphome, l'application clinique restant présentée comme un espoir à valider. Il affirme qu'aucun modèle in vitro n'obtient des globules blancs matures et que seule la xénogreffe le permet.

Objectifs

Une nouvelle approche thérapeutique pour traiter les patients atteints de cancer consiste à prélever leurs globules blancs en les modifiant pour leur permettre de reconnaitre et de cibler des protéines présentes à la surface des cellules cancéreuses. Après réinjection aux patients, ces cellules modifiées sont ainsi capables de reconnaitre et de détruire spécifiquement les cellules cancéreuses. Elles représentent aujourd’hui un espoir dans le traitement de certaines leucémies réfractaires ou en rechute et ont considérablement amélioré le résultat global des patients. Cependant plusieurs obstacles restent à résoudre dans ce domaine. Tout d'abord, malgré un taux élevé de patients montrant une réponse complète à ce traitement par thérapie cellulaire, la rechute de la maladie reste un défi important avec des taux de survie sans progression inférieurs à 50 %. Après le traitement, la survie à 3 ans est de seulement 16,1 %. Plusieurs raisons expliquent cet échec à obtenir des rémissions durables. La perte précoce, la faible expansion et l'épuisement des cellules thérapeutiques modifiées, sont des facteurs d’échec importants. La reconstitution tardive des cellules immunitaires effectrices possédant une activité anti-tumorale après la thérapie cellulaire, représente un autre défi important. Cette immunodéficience augmente non seulement les risques de rechute, mais entraîne également un taux important d’infection post-greffe. Dans ce contexte, une stratégie d'implantation de cellules progénitrices pourrait contourner certains de ces principaux défis (disponibilité immédiate, expansion efficace et réponse antitumorale durable) en accélérant la reconstitution d'un thymus chez les patients. Le modèle animal développant une tumeur de lymphome, ainsi que l’efficacité des cellules thérapeutiques modifiées matures ont été validés précédemment. Dans le cadre de ce projet, nous allons évaluer l’effet thérapeutique des cellules progénitrices, en suivant notamment la régression des tumeurs, la maturation des cellules anti-cancéreuses et leur persistance in vivo.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de valider et justifier la mise en place d'une stratégie thérapeutique utilisant des cellules progénitrices, et donc d'une plateforme de développement de ces cellules à visée d'utilisation clinique. L’acquisition de ces données est indispensable au développement de cette thérapie innovante, à fort potentiel translationnel. Cette stratégie pourrait offrir des réponses anti-cancéreuses durables et efficaces en contournant les obstacles majeurs reportés à ce jour dans le domaine des immunothérapies pour le cancer.

Procédures

Durant cette étude, nous procéderons à : - des injections intrahépatiques (1X; durée 5 sec); - des injections par voie sous-cutanée (1X/sem pendant 5 semaines; durée 5-10 sec); - des injections par voie intraveineuse (1 ou 2X selon la procédure; durée 2-3 minutes); - des injections par voie intrapéritonéale (6X/sem pendant 6 à 14 semaines selon la procédure; durée 5-10 sec); - des anesthésies sous isoflurane (1X/semaine, pendant 5 à 13 semaines selon la procédure; durée 20 min maximum ); - des prélèvements sanguins par ponction dans la veine temporale superficielle (1X ou 3X maximum selon la procédure; durée 2-3 min); - un prélèvement sanguin par ponction intracardiaque (1X, après euthanasie).

Impact sur les animaux

Les animaux seront maintenus en hébergement en cage individuelle ventilée et manipulés sous hotte par du personnel compétent pour éviter tout risque d’infection lié à leur immunodéficience. Lors de la mise au point de la technique d’injection intra-hépatique, une perte du nombre d’animaux peut être attendue en raison du jeune âge des animaux, ainsi que du rejet de la mère après les manipulations. Par ailleurs, les cellules matures pourraient occasionner au long cours une réaction des globules blancs humains contre les tissus de souris. Cet effet peut être observé chez la souris immunodéficiente greffée depuis plus de six mois avec des cellules-souches sanguines humaines. Bien que cet effet soit moins attendu avec les cellules progénitrices grâce à leur maturation dans le thymus de la souris, et donc une tolérance contre les cellules murines, la durée de nos études ne dépassera pas six mois pour éviter cet éventuel effet indésirable. D'autre part, ce projet comprenant l’apparition de tumeurs, le bien-être des animaux sera surveillé de manière attentive. Le poids des animaux et la croissance tumorale suivie par imagerie seront ainsi enregistrés tout au long de l’étude. Enfin, des difficultés respiratoires peuvent apparaitre, signe de présence de cellules tumorales au niveau des poumons, ou de métastases.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des procédures afin de prélever le sang en vue d'analyses post-mortem.

Remplacement

Toutes les étapes visant à améliorer la performance du produit de thérapie cellulaire ont été mises au point avec des expériences exclusivement in vitro et notamment des caractérisations du produit final par des méthodes de séquençage et d'analyse de populations cellulaires. Néanmoins il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro permettant d’obtenir les globules blancs matures du point de vue fonctionnel. La seule méthode existante consiste en un système de co-culture des cellules-souches sanguines avec des cellules-souches nourricières . Bien que ce modèle permette d’obtenir des globules blancs exprimant les marqueurs de différenciation, les cellules n’atteignent pas la maturité fonctionnelle. Seule l’injection dans un modèle de xénogreffe permettra de répondre à ce point, modèle où le greffon provient d'une espèce différente du receveur, respectivement cellules d'origine humaine implantées dans un modèle de souris. Cette xénogreffe permettra la maturation et la différenciation complète des progéniteurs des globules blancs dans l’environnement du thymus de la souris. Les expériences chez l’animal interviennent donc au terme d’un long processus et s’inscrivent dans le cadre d’une validation in vivo de l’effet thérapeutique de ces cellules avant un développement clinique.

Réduction

La première étape de ce projet vise à acquérir le geste technique d’injection intra-hépatique chez le souriceau nouveau-né, notamment la reproductibilité du mode opératoire et l’inter-opérabilité, ainsi que le suivi de la survie des animaux. Nous utiliserons à cet effet 4 portées par stade post-natal, soit environ 152 souriceaux agés de 0 à 3 jours. Il n'y aura pas d'analyse statistique pour cette première étape de mise au point technique. La deuxième étape du projet consiste à injecter les cellules progénitrices et à valider leur effet thérapeutique dans un modèle de cancer . Le produit avec lequel nous envisageons d’effectuer les tests fonctionnels in vivo a été optimisé au préalable, augmentant ainsi la probabilité d’obtention de réponses favorables dès les premières séries d’expérimentations. Par ailleurs, le modèle animal choisi dans cette étude est un modèle murin immunodéficient, utilisé avec succès comme souris receveuses de greffe de cellules-souches sanguines humaines. L’utilisation de ces souris nous permettra d’obtenir des résultats homogènes et de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental; nous utiliserons ainsi 6 souris par groupe et par condition. En utilisant des tests statistiques non paramétriques, selon le paramètre mesuré (croissance tumorale, poids des souris, analyse des globules blancs), nous réaliserons des études permettant de mettre en évidence des différences significatives entre les groupes expérimentaux.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en hébergement en cage individuelle ventilée et manipulés sous hotte par du personnel compétent pour éviter tout risque d’infection lié à leur immunodéficience. Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance de l'animal. Une surveillance quotidienne de l'état de santé des animaux sera assurée, avec un suivi de leur poids et de la croissance tumorale. En cas de signe de souffrance, le personnel qualifié et le vétérinaire pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l'euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes sont utilisées avec succès comme souris receveuses de greffe de cellules humaines. Cette lignée ne présente pas de phénotype dommageable. Le profond déficit immunitaire de ces souris permet la prise de greffe de cellules-souches sanguines humaines, et offre la possibilité d’étudier l’effet d’immunothérapies avec des cellules humaines dans un hôte murin. Ce modèle est notamment très utilisé pour tester l’efficacité anti-cancéreuse de globules blancs modifiés ou de leurs cellules progénitrices. Par ailleurs, le thymus de ces souris, tout comme celui des patients atteints de déficits immunitaires ou conditionnés pour recevoir une allogreffe de cellules-souches sanguines (greffon et hôte de même espèce), sont caractérisés par une atrophie majeure et une architecture altérée. Ces souris présentent donc un environment similaire à celui des patients. Nous utiliserons des souris nouveaux-nés (P0), permettant une bonne prise de greffe des cellules progénitrices. Nos précédentes études ont démontré que les cellules progénitrices pourraient se greffer dans le thymus sans conditionnement (irradiation ou chimiothérapie) chez les souriceaux nouveau-nés (0 à 3 jours post naissance). Une fois cette période passée, afin d’obtenir une prise de greffe dans le thymus, il faut irradier les animaux et co-administrer les cellules progénitrices modifiées avec les cellules souche hématopoïétiques.

42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une administration orale quotidienne pendant huit semaines et des pesées hebdomadaires, avec un risque de fausse route lors du gavage. Le porteur mesure l'accumulation musculaire d'un composé X pour le compte d'un client, un éventuel médicament contre la faiblesse musculaire restant renvoyé aux étapes suivantes. Il affirme qu'il n'existe "pas de modèle de substitution suffisamment prédictif" pour un traitement chronique chez l'animal entier.

Objectifs

Le présent projet constitue une étape préliminaire visant à étudier la capacité du composé X à s'accumuler au niveau tissulaire (et tout particulièrement au niveau musculaire) afin d'atteindre des quantités seuils nécessaires à son activité biologique. Il s'agit donc d'une étude d'accumulation tissulaire à long terme (56 jours d'administration). L'étude sera néanmoins optimisée par une analyse de la composition des fibres musculaires afin d'obtenir des premiers indices d'efficacité.

Bénéfices attendus

Ce projet constitue une phase préliminaire dans le développement du composé X visant, en premier lieu, à étudier la propriété pharmacocinétique d'accumulation tissulaire. Si ce paramètre s'avère satisfaisant, le développement du composé X sera poursuivi dans les étapes précliniques (efficacité et sécurité) et clinique. A terme, le composé X pourrait devenir un médicament visant à traiter la faiblesse musculaire chez l'adulte pathologique ou liée au vieillissement.

Procédures

Les animaux seront pesés une fois par semaine pendant 10 semaines. Ils recevront également des administrations quotidiennes par voie orale pendant 9 semaines (1 semaine pour les habituer à la voie d'administration et 8 semaines de traitement).

Impact sur les animaux

L'ensemble des traitements quotidiens par voie orale et les pesées hebdomadaires peuvent être source de nuisances pour les souris. En effet, ces procédures nécessitent une brève manipulation des animaux qui peut être source de stress. Par ailleurs, bien que cela soit extrêmement rare, les traitements par gavage sont susceptibles d'être source de fausses routes. Dans ce cas, l'animal concerné serait immédiatement euthanasié.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des analyses biochimiques et histologiques sur les organes qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.

Remplacement

Les composés testés ont d'abord été développés à l'aide de méthodes sur cultures cellulaires (myocytes) et sur explants tissulaires (muscle gastrocnémien) afin de déterminer leur action sur l'activité mitochondriale. Des résultats positifs ayant été obtenus dans ce cadre, il est nécessaire de vérifier que les données restent cohérentes sur l'animal entier. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe pas de modèle de substitution suffisamment prédictif pour garantir une bonne accumulation tissulaire d’un composé dans le cadre d'un traitement chronique chez l'animal entier.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire et par notre client sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de réaliser les dosages tissulaires du composé X (4 animaux/groupe) et de réaliser par ailleurs les analyses relatives à l'activité mitochondriale et à la composition des fibres musculaires (5 animaux/groupe). Nous avons donc fixé à 9 le nombre d'animaux nécessaire pour chacun des groupes. Concernant les groupes constitués de souris âgées (21 mois à réception), nous avons ajouté 3 animaux supplémentaire par groupe afin de prendre en compte la mortalité naturelle attendue entre 21 et 23 mois d'âge. Le projet emploiera donc un total de 2 x 9 + 2 x 12 = 42 souris.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés par groupes de 3 par cage afin de leur permettre de maintenir une interaction sociale. Un enrichissement sera apporté sous forme de dômes en cartons et de matériel de nidification spécifiques pour rongeur de laboratoire. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis, notamment l'emploi d'analgésie (buprénorphine) pour soulager la douleur le cas échéant.

Choix des espèces

La physiologie musculaire est bien documentée dans la littérature chez la souris c57Bl/6, ce qui permettra des comparaisons avec les résultats obtenus au cours de la présente étude. Par ailleurs, le client de l'étude a déjà obtenus des résultats préliminaires sur ce même modèle avec d'autres composés en développement et souhaite donc conserver le modèle à des fins de comparaison. La partie des animaux seront au stade jeune adulte (8 semaines) alors que l'autre sera au stade de souris âgées (21 mois). Ces stades de développement correspondent aux âges des population cibles du composé X en développement (jeune adulte pathologique ou sujets âgés).

170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis trois injections de traitement par semaine pendant huit semaines, avec un suivi de la tumeur au pied à coulisse. Le porteur teste un pro-médicament censé cibler le métabolisme des cellules cancéreuses, les retombées thérapeutiques restant renvoyées à de futures approches. Sur le remplacement, il affirme qu'il est "absolument nécessaire" de recourir à un modèle in vivo, aucune méthode ne reconstituant selon lui la complexité du système immunitaire.

Objectifs

Les cellules tumorales sont souvent caractérisées par un niveau élevé des espèces réactives de l’oxygène mais aussi par des composants cellulaires déficients (mitochondries). C’est pourquoi les cibler simultanément représente une stratégie de traitement intéressante. Des expérimentations in vitro ont permis de déterminer qu’un agent ciblant les espèces réactives et les mitochondries a une action cytotoxique sur des lignées cancéreuses et induit la production d'espèces réactives mitochondriales. Nous souhaitions confirmer in vivo l’effet anti-tumoral de ce composé. L’analyse des tumeurs après traitement nous informera sur la capacité de cette molécule à stimuler les réponses immunitaires anticancéreuses et donc à rétablir une immunosurveillance défaillante caractéristique des tumeurs. Si notre hypothèse est validée, nous testerons aussi l’effet de cet agent en présence d’une chimiothérapie immunogène et stimulant le système immunitaire.

Bénéfices attendus

. Ce projet permettra de valider in vivo l’application thérapeutique d'une nouvelle classe de molécule en ouvrant ainsi des nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Toutes les souris recevront des injections de cellules tumorales une fois. Cette procédure durera en moyenne 5 min. Par la suite, les souris seront manipulées brièvement 1min à chaque fois pour mesurer la croissance tumorale. Tous les animaux recevront 3 injections de traitement sous anesthésie locale par semaine, pendant 8 semaines. L’injection prend 1 min.

Impact sur les animaux

Les nuisances découleront des interventions et greffes suite à une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie, des injections de traitements intra péritonéaux par contention de l’animal avec anesthésie locale, des suivis de croissance tumorale par contention de l’animal vigile à l'aide d'un pied à coulisse 3 fois par semaine. Ces différentes manipulations pouvant entrainer du stress chez l’animal. Les traitements chimiotherapeutiques peuvent entrainer une perte d’appétit et donc une perte de poids chez la souris.

Devenir

Toutes les souris ayant reçu des cellules cancéreuses, elles seront euthanasiées en fin de procédure.

Remplacement

Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenus in vitro. Ce projet ayant pour objectif de tester si notre composé induit une réduction de la croissance tumorale et une activation du système immunitaire, il est nécessaire d’utiliser un modèle mimant le plus fidèlement possible l’environnement tumoral et le système immunitaire. Il est actuellement impossible de reconstituer un système immunitaire in vitro/ex vivo du fait de sa complexité. Il est donc absolument nécessaire pour ce projet d’utiliser un modèle in vivo.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes de d'une taille permettant une évaluation statistique solide des effets analysés. Le calcul de puissance nous a permis de calculer le nombre de souris nécessaires par groupe . Nous regrouperons les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux témoins. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, et plusieurs fois par semaine lors de l'expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids, de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation. Des mesures seront prises pour limiter le stress: plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux,, animaux hébergés au calme. Les interventions seront réaliséés sous anesthésie générale ou locale selon le geste à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limite ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Plusieurs justifications d’ordre scientifique, pratique et éthique sont à la base du choix de la souris comme modèle préclinique, notamment le fait que la souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale. Cela permet de travailler sur un modèle de mammifère suffisamment petit pour en avoir un certain nombre, suffisamment grand pour une mise en place des méthodologies envisagées relativement aisée et dont la génétique est la mieux connue. La souris est le modèle le plus utilisé dans notre centre de recherche, ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. De plus, la pratique expérimentale que nous avons acquise sur cette espèce est désormais confirmée. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire mature.

1170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une sécheresse oculaire est provoquée par mutation génétique ou par instillation quotidienne d'un conservateur allergène, puis des tests de douleur et des échographies sont menés, avant la mise à mort pour analyses. Le porteur indique qu'aucun analgésique ne peut soulager cette douleur oculaire, c'est le paramètre évalué. Il présente les résultats obtenus chez le rat comme "très encourageants" et défend une molécule sous brevet.

Objectifs

La sècheresse oculaire (Dry Eye Disease ou DED) est l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie. Sa prévalence varie de 5 à 35 % chez des sujets âgés de plus de 50 ans. Cette pathologie du segment antérieur de l’oeil est caractérisée par des sensations de douleur variables en intensité, allant du simple inconfort à une douleur oculaire prononcée. Les douleurs oculaires sont très difficiles à traiter et leurs mécanismes physiopathologiques demeurent peu connus. Nous avons récemment conçu une molécule qui induit la sécrétion d’eau à partir des glandes lacrymales. Une simple goutte de cette molécule dans les yeux de rats augmente la production de larmes pendant 24h au moins. Notre projet a pour but d’apporter la preuve de concept nécessaire pour proposer cette molécule comme thérapie de la sécheresse oculaire en recherchant 1) si la composition des larmes induites est équilibrée et stable au cours du temps et 2) si, en induisant cette sécrétion naturelle, la molécule prévient l’inflammation et réduit l’activation des nocicepteurs responsables de la douleur oculaire. Nous utiliserons deux modèles de souris complémentaires, validés pour l’étude du DED : l’un, pharmacologique, permettant d’étudier la mise en place et la progression du syndrome, et l’autre, génétique, présentant une anomalie des glandes lacrymales pouvant mimer une sécheresse oculaire modérée. Les effets de la molécule d’intérêt (sous brevet) seront analysés dans chaque modèle in vivo en utilisant différents tests (nociception, volume des larmes et aspect de la cornée) et post mortem par des techniques de biologie cellulaire et histologie. Cette étude chez l'animal est un prérequis pour évaluer de manière intégrée les conséquences d'un traitement du DED par notre molécule. Au total ce projet utilisera au maximum 1170 animaux dans le respect de la règle des 3R. Grâce à nos études préalables in vitro, nous avons déjà caractérisé le mode d'action de la molécule et ses effets (remplacement). Le recours aux séances d'habituation et à l'anesthésie gazeuse légère et rapide permet de limiter le stress des animaux (raffinement). Enfin, les prévisions obtenues avec l'utilisation de logiciels statistiques nous permet d'anticiper le nombre optimal d'animaux pour obtenir des résultats significatifs et reproductibles et nous réduirons en cours de projet ce nombre dès lors que nos résultats nous indiqueront que nos données sont suffisamment robustes (réduction).

Bénéfices attendus

La sécheresse oculaire est à l’origine d’une douleur oculaire chronique pouvant être accompagnée de troubles de la vision, de photoallodynie (sensibilité accrue à la lumière) et de dommages de la surface oculaire, et elle représente l’un des principaux motifs de consultation en ophtalmologie. C’est le plus important signe d’alerte en réaction à une inflammation ou à un traumatisme des structures du segment antérieur de l’oeil (cornée, conjonctive, sclère et structures uvéales). Elle affecte la qualité de la vie et près de 60 % des patients se déclarent gênés dans leurs activités quotidiennes. En outre, 80 % des patients qui souffrent de douleur oculaire ne l’estiment pas suffisamment prise en considération tant par leur entourage que par leur médecin. La douleur chronique oculaire est très difficile à traiter et les mécanismes physiopathologiques, de nature neurogène et/ou inflammatoire, demeurent de nos jours très mal connus. Les traitements actuels sont invasifs, peu efficaces et diminuent la qualité de vie des patients. De ce fait, la sécheresse oculaire est considérée comme un désert thérapeutique malgré son incidence grandissante liée au vieillissement global de la population, l’augmentation du recours à la chirurgie réfractive, l’usage des écrans et la pollution environnementale. La molécule que nous avons caractérisée représente donc une stratégie thérapeutique prometteuse: en effet, une expérience pilote menée sur le rat a montré clairement que l'administration de cette molécule permet de restaurer une production de larmes équivalente à celle des rats contrôles, ce qui nous permet d'envisager que cette molécule soulagera efficacement la sécheresse oculaire. Le protocole mené chez la souris sera similaire à celui utilisé chez le rat, à la simple différence que rats et souris sont caractérisés par des seuils de sensibilité légèrement différents mais très bien caractérisés que nous prendrons en compte. Les bénéfices suceptibles de découler de ce projet sont une avancée significative dans la prise en charge de la sécheresse oculaire et un premier pas vers la création du médicament et l'industrialisation de ce traitement.

Procédures

Un phénotype de sécheresse oculaire modérée sera induit chez les animaux soit génétiquement soit pharmacologiquement par administration quotidienne dans l'oeil pendant 7 jours d'un produit conservateur allergène. Chaque procédure dure 5 à 6 semaines. Le test d'évaluation de la gêne/douleur associée à la sécheresse oculaire dure environ 1h. Les tests de mesure du volume et de la stabilité des larmes et l'échographie Dopler seront réalisés sous anesthésie légère (15-20 minutes). Les groupes d'animaux étudiés subiront entre 1 et 4 fois fois la série de tests (avec une semaine d'intervalle entre chaque série de tests).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont associés à la sécheresse oculaire qui sera induite soit par le BAC (conservateur traditionnellement utilisé dans les gouttes pour les yeux et le nez chez l'homme et décrit pour induire une sensibilisation) soit par la mutation Tabby qui induit une réduction de la taille des glandes lacrymales et donc une réduction de la production de larmes. Ces deux modèles murins présentent donc une sécheresse oculaire d'intensité modérée. Cette sécheresse oculaire engendre potentiellement un inconfort voire une douleur (comme chez certains patients humains) qui ne pourront être soulagés par des analgésiques puisque c’est ce paramètre (et son soulagement) que nous évaluerons. Nos résultats pilotes obtenus sur le rat indiquent clairement que notre molécule soulage efficacement cet inconfort et nous laissent envisager des résultats très positifs pour ce projet puisque nous utiliserons le même protocole. Nous compenserons et limiterons l'inconfort et les nuisances infligées aux animaux par l’observation stricte de points limites spécifiques et adaptés. Les effets du traitement seront évalués sur 28 jours puis les animaux seront mis à mort. Les animaux auront 3 mois lors de leur entrée en procédure. La durée des nuisances et effets indésirables auxquels ils seront exposés sera donc de 6 semaines maximum pour les souris BAC (habituation aux tests la semaine précédant le démarrage du protocole, 1 semaine d'établissement du phénotype et entre 1 et 4 semaines de traitement et de tests) et de 4,5 mois pour les souris Tabby (à l'âge de 3 mois, habituation aux tests la semaine précédant le démarrage du protocole, et entre 1 et 4 semaines de traitement et de tests).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses histologiques post mortem.

Remplacement

Nos études préalables ont permis de caractériser et de breveter la molécule d'intérêt, de déterminer sa structure et son mode d'action dans différentes cultures cellulaires sur le transport de chlore. De plus, nous avons établi une première collaboration qui nous a permis de montrer que l'administration de cette molécule dans l'oeil de rat wild-type induit la sécrétion naturelle de larmes et qu'elle restaure un volume normal de larmes dans un modèle de rats atteints de sécheresse oculaire. Ces résultats préliminaires sont très encourageants et justifient le développement de la partie in vivo de ce projet et sa prématuration pour développer et industrialiser la molécule comme stratégie thérapeutique novatrice. Cette phase de prématuration du projet exige maintenant un système biologique intégré tel qu’un organisme vivant pour caractériser précisément et quantifier les effets de la molécule in vivo. Le syndrome de sécheresse oculaire est d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Son apparition et sa gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts (neuro-inflammation etc) et les études sur l’animal intact sont essentielles et ne peuvent être remplacées. Ceci ne peut malheureusement pas être modélisé in vitro à ce stade du projet. Néanmoins, nous mènerons en parallèle des analyses protéomiques sur des cultures immortalisées de cellules de l'oeil.

Réduction

Le nombre d‘animaux correspond au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs. Il sera réduit chaque fois que possible, et toute expérience rendue inutile par des résultats précédents obtenus ne sera pas réalisée. Nos prédictions suggèrent que des lots de 10 animaux par condition permettront une analyse statistique valide permettant d’exclure toute répétition additionnelle. Nous anticipons et choisissons a priori d’inclure 15 animaux/groupe par précaution, et nous réduirons ce nombre dès lors que les résultats seront statistiquement significatifs et en particulier si les deux sexes donnent des résultats similaires. Les rares médicaments utilisés pour réduire la sécheresse oculaire sont peu efficaces et nécessitent des administrations quotidiennes répétées (3 à 6 fois), ce qui représente un inconvénient majeur pour les patients. Nous avons donc décidé d'administrer notre molécule 1 ou 2 fois par jour maximum, et d'évaluer son effet après 1 ou 2 applications. Cependant, l'effet après 1 application sera évalué en 1ere intention, l'effet après 2 applications étant évalué seulement si les résultats avec 1 application montrent une efficacité partielle. Si l'étude après 1 seule application donne les résultats escomptés, nous ne procèderons pas à l'analyse de 2 applications et le nombre d'animaux sera donc réduit de moitié. Au total, nous utiliserons 1170 animaux maximum.

Raffinement

Notre expertise nous permet de mettre en place des conditions de raffinement adaptées et de réaliser les gestes techniques requis de manière précise et rapide. Nous porterons une attention particulière à limiter au niveau le plus faible le stress occasionné aux animaux. Ceux-ci seront hébergés et manipulés avec calme dans un environnement limitant toute source de nuisances, dans une salle calme uniquement dédiée à ces tests dans laquelle nous pouvons moduler l'intensité lumineuse et avec un équipement spécialement conçu pour la bonne réalisation des procédures. Ainsi, nous mettrons en place des séances d'habituation en amont de chaque test et nous réaliserons certains de ces tests sous anesthésie gazeuse légère. En cours de procédure, nous suivrons les animaux en nous appuyant sur une grille de score permettant de mettre en oeuvre des points limites précoces et un arbre décisionnel: utilisation de solutions analgésiques oculaires en fonction de l'aspect de l'oeil (oeil fermé, sécrétions) et du comportement de l'animal (démangeaisons...) ou mise à mort en cas de souffrance. Les animaux seront hébergés avec un environnent enrichi, sans isolement, en accord avec la réglementation en vigueur. Enfin, l'utilisation de l'imagerie par échographie-Dopler représente un avantage dans le respect de la règle des 3R et permet non seulement de réduire le nombre d'animaux mais de diminuer leur manipulation car c'est une technique non invasive et rapide sous anesthésie.

Choix des espèces

Nous avons choisi Mus musculus comme modèle d’étude en raison de ses similarités génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. Les deux modèles murins reproduisant le syndrome de l’œil sec (DED, Dry Eye Disease) sont des modèles validés et classiquement utilisés dans la littérature. Des animaux âgés de 3 à 5 mois seront utilisés. A cet âge les animaux sont de jeunes adultes, ce qui nous permet de déterminer l'efficacité de notre molécule sur la physiologie oculaire en nous affranchissant de biais potentiels liés au vieillissement.