Rongeurs

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sur cinq ans. Issues de croisements, elles développent les symptômes de l'ataxie de Friedreich, démarche titubante, tremblements et parfois crises d'épilepsie spontanées servant de point limite, puis reçoivent une injection unique de vecteur et passent des tests comportementaux. Le porteur teste une thérapie génique visant à réintroduire une protéine manquante et affirme que le recours à l'animal est "obligatoire" pour avoir une vue globale des effets. Il indique avoir d'abord testé les vecteurs en culture cellulaire.

Objectifs

L’ataxie de Friedreich est une maladie génétique caractérisée principalement par une perte progressive de la coordination des mouvements volontaires, ce qui entraîne une démarche ébrieuse. Ce symptôme s’accompagne d’autres atteintes, comme des problèmes cardiaques entraînant souvent le décès des patients. Cette maladie touche 1 personne sur 30 000 et est à ce jour incurable, ce qui rend indispensable le développement de stratégies thérapeutiques. Au vu de la complexité de la maladie, le recours au travail sur animal est obligatoire afin d’avoir une vue globale sur tous les effets du traitement. Dans cet objectif, nous avons généré une souris modèle reproduisant les symptômes neurologiques de la maladie. Notre approche thérapeutique consiste en de la thérapie génique qui va permettre de réintroduire la protéine manquante, la frataxine. L’équipe a déjà mené des essais prometteurs, qui doivent désormais être optimisés avec de nouveaux vecteurs. Il est connu qu’un excès de frataxine entraîne une toxicité. Notre étude va se diviser en deux axes principaux : la validation de l’efficacité du vecteur après injection intraveineuse, et une étude de dose-réponse pour déterminer la quantité minimale de vecteur suffisante pour corriger les symptômes de manière significative. Le vecteur qui permet de restaurer un faible taux de frataxine sera injecté par voie intraveineuse. Deux cohortes seront utilisées : une traitée avant l’apparition des symptômes (60 souris) et une traitée après l’apparition des symptômes (100 souris). Les souris seront suivies au cours du temps par des tests comportementaux et de conduction nerveuse (procédures modérées). La dernière partie de l’étude consistera à étudier un éventuel effet dose-réponse du traitement, afin de déterminer la dose minimale efficace (120 souris). Aucune nuisance n’est attendue dans ces procédures, et les animaux seront surveillés de manière à détecter précocement tout éventuel effet délétère. Ce projet mobilisera au total un maximum de 280 animaux en procédure de classe « modérée ». Tous les animaux seront utilisés pour les analyses et il n’y aura donc pas d’animaux laissés en vie à la fin de ce projet.

Bénéfices attendus

L’ataxie de Friedreich touche environ 1 personne sur 30 000, et aucun traitement n’est développé à ce jour. Le but ultime de ce projet est donc de trouver une thérapie efficace pour l’ataxie de Friedreich afin d’améliorer la vie des patients et si possible de stopper ou au moins ralentir la progression de la maladie.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection unique, pratiquée sous anesthésie par inhalation d’isoflurane. Cette procédure dure quelques minutes du début de l’endormissement à la fin de l’injection. Les tests comportementaux pratiqués par la suite de façon hebdomadaire ne provoquent pas de douleur.

Impact sur les animaux

Les lignées utilisées pour l'élevage n'ont pas de phénotype dommageable, seuls les animaux issus de ces croisements présentent le phénotype ataxique à partir de 9 semaines et présentent un phénotype dommageable à partir de 19 semaines. Le phénotype exprimé se traduit par des difficultés progressives de mouvement et coordination qui apparaissent à partir de 4 semaines, mais non visible en cage d’hébergement. Les difficultés de mouvement sont accompagnées de tremblements qui s’intensifient avec l’âge. Le phénotype n’est toutefois pas considéré comme ataxique avant 9 semaines. A ce stade, les animaux présentent une démarche ébrieuse typique des ataxies, qui est retrouvée également chez les patients. A partir de 19 semaines, les souris mutantes peuvent présentér des crises épileptiques spontannées, ce qui est un point limite pour l’euthanasie. Aucun effet indésirable n’est attendu suite à l’injection ni aux tests de comportement.

Devenir

Les animaux sont euthenasiés pour prélever des tissues pour des analyses histologiques et moléculaires

Remplacement

Le but ultime du projet est de trouver une thérapie efficace pour l’ataxie de Friedreich afin d’améliorer la vie des patients et si possible de stopper ou au moins ralentir la progression de la maladie. Les nouveaux vecteurs utilisés ont d’abord été testé dans des cellules en culture afin de remplacer l’animal, mais afin de déterminer leur efficacité in vivo, il est indispensable de réaliser notre approche sur un modèle murin de la maladie.

Réduction

Il est estimé que le projet mobilisera sur 5 ans 280 animaux au maximum avec enchainement séquentiel et conditionnel des procédures. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaire afin d’obtenir une puissance statistique suffisante. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux, les mêmes animaux seront utilisées pour réaliser les analyses fonctionnelles, histologiques, moléculaires et biochimiques.

Raffinement

Un soin particulier sera apporté aux animaux et dès les premiers signes d’ataxie de la nourriture gélifiée sera mise à disposition dans la cage. Nous avons établi des points limites suffisamment prédictifs adaptés à notre modèle. De plus, nous avons mis en place une grille de suivi individuel pour suivre au plus près la santé de chaque animal.

Choix des espèces

La souris est l’espèce privilégiée pour ce projet en raison de sa proximité génétique avec l’Homme (98% d’homologie). Son anatomie et physiologie sont très bien caractérisées. De plus, plusieurs modèles de l’ataxie de Friedreich ont déjà été développés chez la souris.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sur cinq ans. Elles reçoivent des injections répétées d'antigènes du parasite du paludisme avec l'adjuvant complet de Freund, qui peut provoquer des péritonites granulomateuses, de la douleur et de l'angoisse, avant d'être saignées à mort par ponction cardiaque. Le porteur produit ainsi des anticorps et reconnaît l'existence d'alternatives non animales, anticorps recombinants et aptamères, qu'il écarte faute de moyens techniques. Il conclut au recours "nécessaire" à l'animal pour obtenir ces anticorps.

Objectifs

Le paludisme est un problème de sante publique, majeur qui sévit dans plus de 100 pays et fait plus de 600 000 morts par an surtout chez les jeunes enfants. Chez les femmes enceintes, l’infection par Plasmodium peut causer leur mort et celle de leur enfant ainsi qu’un poids de naissance inférieur à la normale entraînant une mortalité très fréquente après la naissance. Depuis 2021, un vaccin est disponible sur le marché. La prise d’antipaludéens et l’utilisation de moustiquaires imprégnées augmentent la résistance du parasite aux antipaludéens. La maladie est causée par le parasite Plasmodium, un protozoaire appartenant au phylum des Apicomplexes. Parmi les 6 espèces qui infectent l’Homme, deux sont les plus repandues : Plasmodium faciparum et Plasmodium vivax. Le cycle de vie du parasite, entre un hôte mammifère et un moustique du genre Anophèle, est complexe. La partie la mieux connue de ce cycle est la phase érythrocytaire se déroulant chez le mammifère, durant laquelle les parasites se multiplient dans les érythrocytes de l’hôte. Cette phase est responsable de la classique anémie fébrile ainsi que des complications liées à l’adhérence des érythrocytes infectés par Plasmodium aux cellules endothéliales de la microcirculation sanguine, en particulier celles des vaisseaux sanguins du cerveau. Notre laboratoire étudie les facteurs de virulence de Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax, les deux espèces les plus mortelles pour l’Homme. Nous nous intéressons, en particulier, au stade sanguin du cycle du parasite. Nous étudions les mécanismes mis en jeu par le parasite pour s’attacher au globule rouge, y pénétrer et s’y développer. Cette phase érythrocytaire, peut-être reproduite in vitro dans des systèmes de culture de globules rouges humains. Nous avons identifié plusieurs protéines d’intérêt exprimées par le parasite lors de son cycle de vie dans le globule rouge. Afin de les étudier, nous allons produire, chez le rongeur, des anticorps polyclonaux (AcP) dirigés contre ces protéines. Ces anticorps nous permettrons de localiser ces protéines dans le parasite, d’étudier leur niveau d’expression ainsi que leur importance dans les autres stades du cycle de vie de Plasmodium.

Bénéfices attendus

Notre compréhension du paludisme est limitée par des outils de recherche tels que les anticorps. Il existe en effet peu d’anticorps spécifiques contre les différentes espèces disponibles. Ce projet a pour but de produire un outil qui sera indispensable dans la lutte contre cette maladie. Les anticorps sont essentiels pour faire progresser notre connaissance sur le fonctionnement du parasite. Nous pouvons étudier l’expression de ces molécules dans les différents stades du parasite en utilisant les techniques suivantes : ELISA, Western Blot, les procédures d’immunoprécipitation, l’immunofluoromicroscopie et l’immunoélectromicroscopie. Avec des anticorps spécifiques nous sommes en mesure de mieux comprendre l’implication des protéines responsables de la virulence chez Plasmodium.

Procédures

1) Une prise de sang (une minute) par animal par mois pendant 2 mois. 2) Une injection IP (une minute) chaque 3 semaines par animal pendant 9 semaines. 3) L'exsanguination par ponction intra-cardiaque (5 minutes) à la fin de l’expérience, préalablement anesthésiées par injection par voie intrapéritonéale (une minute).

Impact sur les animaux

Dans des très rares cas les animaux peuvent mal supporter les protéines recombinantes et ils peuvent montrer une réaction inflammatoire élevée. Les souris recevront les protéines individuelles en présence d’adjuvant Complet de Freund (CFA) pour la première injection et l'adjuvant Incomplète de Freund (IFA) pour les autres. L’utilisation de l’adjuvant CFA par voie IP peut induire des effets indésirables comme des péritonites granulomateuses et de la douleur et de l'angoisse. Les souris peuvent montrer des signes cliniques et comportementaux de souffrance et ou d’angoisse, comme les yeux mi- fermé, le poil hérisse, le dos vouté ou il ne veut plus bouger, l'absence de toilettage ou il se tienne à l'écart du groupe.

Devenir

Tous les animaux ayant un titre d’anticorps satisfaisant seront mis à mort afin d’obtenir une quantité de sérum suffisant. Tous les animaux n’ayant de titre d’anticorps satisfaisant seront mis à mort à la fin de chaque procédure, car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés.

Remplacement

L’alternative possible à l’emploi de sérums murins serait d’employer les sérums prélevés chez des personnes vivant en zone d’endémie, porteuses d’anticorps contre les antigènes d’intérêts et d’immuno-purifier les immunoglobulines spécifiques par affinité sur les antigènes recombinants. Les expériences d’autre groupes de recherche ont montré que les anticorps ainsi obtenus sont de faible affinité pour des protéines spécifiques, avec un titre très faible et ne fonctionnent pas pour les protéines intracellulaires qui ne sont pas exposée à la réponse immunitaire de l'hôte. Il existe aujourd'hui des alternatives non animales pour produire les anticorps telles que les anticorps recombinants et les aptamères (courts fragments d'ADN ou d'ARN qui peuvent se lier à des cibles telles que des protéines). Cependant, une bibliothèque de gènes d'anticorps de plasmodium n'a pas encore été constituée, ce qui rend cette technique hors de portée pour le moment. Pour nos besoins de recherche, la sélection d'aptamères spécifiques à une cible nécessiterait des protéines recombinantes solubles relativement pures. Le génome de Plasmodium est riche en adénine et en thymine, jusqu'à 70 %. Ce biais est un problème omniprésent lorsque l'on essaie de produire des protéines recombinantes solubles et, par conséquent, il est relativement rare d'avoir des protéines recombinantes pures à utiliser. Le manque de pureté de ces protéines recombinantes entraînera une sélection d'aptamères non spécifiques conduisant à des signaux non spécifiques. Pour le moment nous n'avons pas la capacité technique pour développer cette méthode. Le recours à l’animal est nécessaire car ces anticorps ne peuvent être obtenus qu’après immunisation d’une espèce animale.

Réduction

Nous avons choisi d’immuniser un seul groupe de 5 souris par protéine recombinante pour connaître dans un premier temps, leur degré d’immunogénicité et dans un deuxième temps les sérums de souris qui présentent une forte immunogénicité dans chaque groupe seront poolés afin d’avoir une quantité de sérums suffisante pour une étude approfondie et répétée. Par expérience, le nombre de souris minimum pour avoir suffisamment de sérum pour nos tests immunologiques est de 5 souris. Sachant que les souris peuvent réagir différemment à l'immunisation et certaines souris présentent une immunogénicite élevée tandis que d'autres présentent une faible immunogénicité. Nous prévoyons de fabriquer en moyenne 6 anticorps par an, ce qui porte le nombre final à 150 souris sur une période de cinq ans. SEBA à répondu que pour ce projet il n'y a pas de considérations statistiques à évaluer.

Raffinement

Les souris peuvent tolérer plus ou moins bien les protéines recombinantes injectées. Dans de rares cas, ces immunisations peuvent entrainer une réaction inflammatoire élevée. Elles peuvent induire des signes cliniques et comportementaux de souffrance et/ou d’angoisse, comme les yeux mi-fermés, le poil hérissé, le dos vouté voire même une paralysie partielle, l'absence de toilettage ou se tenir à l'écart du groupe. En fonction de la grille standard comportementale/clinique de la SBEA, les animaux obtenant un score de 2 points pourront bénéficier, si nécessaire, de mesures d’amélioration des conditions d’hébergement (enrichissement, chaufferette) et de l’alimentation (gel diététique). Les souris présentant un score supérieur à 2, considéré comme point limite, seront mises à mort par exposition au CO2 suivie d’une dislocation cervicale afin de s’assurer de la mort de l'animal par un arrêt total et durable des mouvements cardio-respiratoires. Les animaux feront l'objet d'une surveillance régulière et dans le cas où des signes de souffrance sont détectés, il sera envisagé de réduire la quantité de protéine injectée, voire d’arrêter la procédure pour limiter la douleur. Dans les cas où les signes de souffrance apparaissent immédiatement après l'injection de l’antigène, nous pouvons également limiter la douleur par l'utilisation d'une anesthésie et d'une analgésie avant chaque immunisation.

Choix des espèces

Nous avons choisi de produire nos anticorps chez la souris car nous savons par des expériences antérieures que les protéines recombinantes de plasmodium sont très immunogènes chez la souris. Les souris utilisées pour les immunisations seront âgées de 6 semaines, âge auquel on obtient une bonne réponse immune et une préhension correcte pour l’immunisation et le prélèvement sanguin.

768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'un inducteur chimique de tumeurs une fois par semaine pendant six semaines et des inoculations bactériennes par voie oro-gastrique, avec une perte de poids attendue dans les derniers mois. Le porteur étudie comment la co-infection par Helicobacter pylori et Escherichia coli favorise le cancer gastrique et colorectal, et affirme que seul un "organisme entier" permet d'étudier cette réponse. Les souris atteignant 20 % de perte de poids ou des signes de souffrance seront mises à mort avant le terme.

Objectifs

Environ 18% des cancers sont causés par un agent infectieux, dont la bactérie Helicobacter pylori, responsable de l’infection chronique la plus répandue dans la population mondiale. H. pylori est reconnue comme le facteur de risque majeur du cancer gastrique (CG), souvent associé à un mauvais pronostic. H. pylori pourrait aussi être impliquée dans le développement du cancer colorectal (CCR), tout comme des souches pathogènes de la bactérie Escherichia coli. Un évènement important dans la genèse de ces cancers, est la dysbiose du microbiote gastrique et intestinal, respectivement observée chez les patients atteints de CG et de CCR, et confirmée dans le modèle animal murin. Comment la co-habitation de différentes bactéries dans le même hôte peut influencer leur potentiel pathogène respectif, est la question principale à laquelle se propose de répondre ce projet. Notre hypothèse est que H. pylori et E. coli pourraient favoriser des mécanismes oncogènes communs, exacerbés par leur co-habitation dans le même hôte et impactant leur pathogenèse respective. Basé sur le développement du modèle souris de co-infection, H. pylori-E. coli, les objectifs de ce projet sont : - D’analyser si la sévérité des lésions inflammatoires gastriques induites par H. pylori peut être modulée par la présence de E. coli dans le compartiment intestinal et inversement. - De déterminer si ces mécanismes sont associés à des effets locaux ou systémiques. - De définir si les mécanismes impliqués dans les processus de tumorigenèse sont communs aux deux infections. Les évènements d’instabilités génétiques et de régulation épigénétique jouent un rôle essentiel dans la promotion des mécanismes de tumorigenèse. Ainsi, une fois établi le modèle de co-infection chez la souris et combinant différentes approches, les conséquences de la présence de ces deux bactéries seront analysées sur les mécanismes de régulation à l’origine d’un développement tumoral, dont la méthylation de l’ADN et son impact sur la réponse globale de l’hôte à ces conditions d’infection.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera une meilleure compréhension des mécanismes à l'origine du développement des cancers gastrique et colorectaux induit par H. pylori et E.coli pathogène. D’autre part, peu de chose sont connues sur l’impact réel de la co-infection par ces deux pathogènes dans l’initiation et/ou promotion de la tumorigenèse. De plus ces données peuvent aboutir à des stratégies de dépistage et/ou prévention du développement du cancer gastrique ou colorectal ou nous permettre d’identifier certaines cibles thérapeutiques.

Procédures

- Injections intra-péritonéales (30 secondes) d’inducteur de tumeurs une fois par semaine pendant 6 semaines ou d’inhibiteur pharmacologique trois fois par semaine pendant 1 mois (fréquence sur l’ensemble de la procédure = 1 fois ou 2 fois avec intervalle de 2 mois ou fois avec intervalle de 2 mois). - Inoculations de suspensions bactériennes ou de streptomycine par voie oro-gastrique 2 fois toutes les deux semaines à 2 reprises espacées de 24 heures (30 secondes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables potentiellement attendus sont modérés. Ils sont attendus durant la période de traitement par l’inducteur de tumeurs pendant 6 semaines sous forme de baisse de mobilité dans les 48h suivant l’injection IP, comme cela a été rapporté pour la lignée murine particulièrement sensible A/J. Nous ne savons pas si ces effets seront observés pour les C57BL/6, ils ne sont pas rapportés dans la littérature. Durant la progression du protocole, il est envisageable que les groupes recevant une double-infection, et pour lesquels nous anticipons une accélération ou aggravation des lésions pré-tumorales, présentent une perte de poids modérée dans la dernière phase de l’essai (6 à 9 mois post-infection).

Devenir

La mise à mort des souris à la fin de l'expérience est indispensable pour nous permettre de prélever l'estomac et donc de quantifier les bactéries H. pylori qui ont colonisé cet organe. D’autres organes seront également prélevés pour analyses histologiques et moléculaires qui sont indispensables pour le but final de l’étude qui est d’évaluer la carcinogenèse.

Remplacement

Seul un modèle in vivo permet de répondre aux questions complexes soulevées par ce projet, i.e. étudier la réponse d’un organisme entier à une infection ou une co-infection via la mobilisation de son système immunitaire et les conséquences sur les mécanismes de tumorigenèse. Dans le cas de l’infection par H. pylori, le modèle souris permet de récapituler l’ensemble de la cascade d’évènements décrits en pathologie humaine, allant de la gastrite chronique aux lésions pré-cancéreuses que sont les dysplasies gastriques. La réponse immunitaire observée chez la souris reflète parfaitement celle observée chez l’Homme. De même, la souris est une espèce de choix pour l’étude des facteurs de virulence de E. coli car elle est permissive à l’infection par ce pathogène opportuniste sans nécessité de manipulations génétiques ou de modification du statut immunitaire des animaux. De plus la littérature concernant ces infections est abondante et les modèles expérimentaux bien établis, ce qui permettra d’obtenir des résultats fiables en limitant le nombre d’animaux utilisés. Ainsi, l’utilisation du modèle souris se justifie parfaitement car il remplit la condition essentielle de reproduire plusieurs aspects des pathologies observées chez l’Homme. D’autre part, l’utilisation d’un carcinogène est nécessaire pour diminuer les temps d’expérience. Dans ce contexte, le modèle murin de carcinogenèse AOM-induit est parfaitement adapté.

Réduction

Dans nos expériences, le nombre d’animaux par groupe test est calculé au plus juste pour être statistiquement significatif en utilisant des modèles hiérarchiques (ou modèles à effets mixtes). Ce projet comprend trois procédures qui s'articulent sur un nombre de 16 animaux par groupe. Ce nombre est similaire à certaines études du même type et il est proche des estimations que réalisées par notre statisticien (pour des tailles d'effets proches de 1). Les effectifs proposés semblent donc dimensionnés par rapport aux objectifs du projet. Le succès d'infection par animal rentre également en considération. L’ensemble des organes d’intérêt sera prélevé à l’issue des différentes expériences, de fait les animaux ne pourront pas être réutilisés. Les fèces seront prélevées longitudinalement (toutes les deux semaines) et conservés congelés en vue d’étude futures visant à définir les dysbioses associées aux infections et au développement de la pathologie sans avoir à reprogrammer des expériences similaires.

Raffinement

Les faibles doses d’inducteur de tumeurs utilisées engendreront des effets néfastes modérés sur les souris. Nous serons vigilants en particulier au cours des 6 semaines de traitement par l’inducteur de tumeurs afin de prévenir au plus tôt tout signe évident de détérioration de l’état général des animaux. Des hydrogels seront mis à disposition des animaux. Nous utiliserons une feuille d'observation : tout animal présentant des signes de souffrance, tels que l'apparence du poil affectée ou un changement de leur comportement, sera noté selon une grille et mis à mort si son état le nécessite ou en cas de perte de poids >20%. En référence à notre expertise de ces modèles murins d’infection, l’observation des animaux infectés par chaque bactérie en absence d’inducteur de tumeurs ne montre aucune modification de comportement ou physique qui pourrait indiquer une quelconque souffrance. Chacune des bactéries n’induit pas de signes digestifs tels que la diarrhée après administration. Si la procédure 1 indique que la co-infection permet d’observer une synergie dans le développement pathologique sans adjonction d’inducteur de tumeurs, les procédures 2 et 3 seront menées sans inducteur de tumeurs, ce qui réduira les nuisances et améliorera le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Nos deux laboratoires ont une longue expérience du modèle souris d’infection par H. pylori ou par E. coli et nous possédons des souches adaptées à la colonisation des souris. De plus, dans le cadre de notre étude, le modèle murin est adapté car il reproduit de nombreux aspects des pathologies humaines étudiées. Nous utilisons des souris C57BL/ 6, mâles, âgées au début de l’expérience de 4 à 6 semaines. Les souris seront utilisées au stade de jeunes adultes (environ 6 semaines). Il s’agit du stade le plus largement décrit et validé dans les publications. A cet âge, nous limitons les biais liés à l’utilisation de souris vieillissantes. De plus, leur taille est suffisante pour une manipulation aisée et leur système immunitaire est mature.

80 rats Wistar âgés de 18 mois vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent chaque jour une solution bactérienne et subissent quinze prélèvements de sang sur animal vigile, une restriction alimentaire entraînant environ 10 % de perte de poids et une mise en cage individuelle. Le porteur teste un probiotique censé limiter la fonte musculaire, présenté comme un futur produit à destination des séniors. Il affirme qu'évaluer l'effet sur le muscle rend "nécessaire" le passage par l'animal.

Objectifs

Le projet vise à valider in vivo la capacité d'un probiotique (Limosilactobacillus muscosae seul ou en association avec L. casei) à limiter la fonte musculaire chez des rats dénutris, animaux modèles du syndrome de fragilité de l'Homme.

Bénéfices attendus

Le projet participera au développement d'un nouveau probiotique à destination des séniors favorisant la sensibilité à l'insuline et améliorant la régulation de la glycémie. Cet effet santé du probiotique permettra de limiter la fonte musculaire liée à l'âge (sarcopénie) et donc de limiter la dépendance des personnes âgées fragiles.

Procédures

Les animaux recevront une solution bactérienne quotidiennement et subiront des mesures de composition corporelle, de mesure de leur métabolisme protéique et l'analyse de leur sensibilité à l'insuline. ceci impliquera au total 15 prélèvements de sang sur animaux vigiles répartis sur la durée du projet de 1 mois.

Impact sur les animaux

Perte de poids (environ 10%) associée à une restriction alimentaire. Stress associé à une mise en cage individuelle.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure, des prélèvements d'organes devant être effectués pour analyses.

Remplacement

Ce projet vise à valider cette propriété in vivo et à tester son efficacité sur la masse musculaire. L'action d'un probiotique est à la fois directe (sur les cellules intestinales) mais aussi indirecte (sur d'autres organes via des médiateurs). Pour tester l'effet de ce probiotique sur le métabolisme musculaire, il est donc nécessaire de passer par une expérimentation sur animaux modèles.

Réduction

Pour ce projet 80 animaux seront utilisés. Ils seront répartis en 5 groupes de 16 animaux. Le nombre d'animaux a été limité au nombre minimum nous permettant d'avoir des résultats significativement différents entre les groupes, ce nombre a été déterminé par test statistique et grâce à l'expérience du laboratoire sur l'utilisation de ce modèle animal.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d'un enrichissement de leur milieu de vie et seront observés quotidiennement, y compris le week-end et les jours fériés, par des animaliers expérimentés. En cas d’apparition d’un point limite l’animalier alertera les responsables de l’étude. Les animaliers et les responsables de l’étude effectueront une observation plus poussée de l’animal et renseigneront le tableau d’observation des points limites. Si 3 points limites notables ou 1 point limite grave sont observés, nous utiliserons l’arbre décisionnel afin de décider si l’animal sera soigné ou euthanasié.

Choix des espèces

Les animaux utilisés seront des rats Wistar âgés de 18 mois. Notre laboratoire possède une forte expérience d'utilisation du rat âgé en tant que modèle de la sarcopénie humaine. Le rat est un animal de choix pour les études sur le vieillissement, son espérance de vie étant de 24 mois.

48 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une inoculation d'alpha-synucléine agrégée dans le cerveau par chirurgie stéréotaxique sous anesthésie, pour accélérer une pathologie proche de la maladie de Parkinson et chercher des marqueurs de la maladie dans leur sang. Le porteur indique que les souris développent une démarche saccadée et des troubles de l'équilibre, signes à l'apparition desquels elles sont tuées avant que ne survienne une paralysie du train postérieur. Sur le remplacement, il affirme que le projet ne peut être réalisé qu'in vivo et qu'il n'existe "pas de méthode alternative" à l'expérimentation animale.

Objectifs

Le projet vise à identifier des marqueurs moléculaires de la maladie dans le sang de souris modifiées génétiquement pour développer une maladie associée à l’agrégation de l’alpha-synucléine, une protéine qui est le constituant principal des lésions cérébrales dans la maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

Le projet vise à rechercher si de nouveaux marqueurs moléculaires de la maladie peuvent être identifiés dans ce modèle expérimental à partir d’un prélèvement de sang. Réalisable du vivant de l’animal et au cours de l’incubation de la maladie, cette identification ouvrirait la voie à des recherches de marqueurs précoces de la maladie.

Procédures

Les souris font l’objet d’une inoculation par stéréotaxie dans le cerveau de jeunes souris M83 (6-8 semaines) réalisée sous anesthésie générale et locale chez les 48 animaux prévus dans l’étude. L’intervention chirugicale dure 30 à 45 minutes.

Impact sur les animaux

L’inoculation d’alpha-synucléine agrégée est réalisée afin d’accélérer l’apparition des signes cliniques moteurs, qui se manifestent par une démarche saccadée de l’animal et une perte d’équilibre. La confirmation de ces anomalies de locomotion détermine la décision de mise à mort des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin du protocole d’expérimentation. En effet, les souris modifiées génétiquement M83 utilisées dans ce projet développent des signes cliniques lors de leur vieillissement qui conduiraient irrémédiablement à leur mort suite à la progression d’une paralysie. Leur mise à mort dès l’apparition des premiers symptômes permet de leur éviter des souffrances ultérieures.

Remplacement

Le projet ne peut être réalisé qu’in vivo, visant à rechercher des biomarqueurs dans le sang. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative permettant de remplacer l’expérimentation animale.

Réduction

Dans le cadre de cette étude pilote, les nombres de 12 animaux par lot sont déterminés afin de permettre la collecte d’une quantité de sang suffisante chez au moins 8 souris, pour isoler une quantité suffisante de vésicules extracellulaires d’origine neuronale. Concernant la détection d‘alpha-synucléine pathologique dans les vésicules extracellulaires neuronales, le test t de Student bilatéral non apparié et l'ANOVA bidirectionnelle avec le test de comparaison multiple de Sidak seront appliqués. Concernant les analyses des microARN, les tests P-value, test exact de Fisher et FDR (False Discovery Rate) seront utilisés.

Raffinement

Pour les inoculations par voie stéréotaxique, l’anesthésie de la peau est réalisée chez un animal soumis à une anesthésie générale, permettant de limiter la douleur post-opératoire. Les animaux sont hébergés dans un portoir ventilé et maintenus dans un environnement enrichi (igloos, nestlets ou sizzles) pendant toute la durée de l’expérimentation. Ces enrichissements, comme les cachettes et les éléments de nidification, sont doublés en cas de dépilations qui peuvent être observées chez quelques souris femelles au delà de l’âge de 7 mois. Les souris sont suivies quotidiennement et de façon individuelle lorsque la maladie apparaît dans le lot expérimental. La maladie se manifeste d'abord par des signes de démarche saccadée et des troubles de l’équilibre dont la manifestation constitue le stade auquel les animaux sont mis à mort, afin d’éviter des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris. Une fiche individuelle de suivi pour chaque souris est renseignée, consignant les signes cliniques observés et justifiant la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Le projet prévoit des inoculations dans le cerveau chez des souris, espèce qui peut être modifiée génétiquement pour produire une forme de la protéine alpha-synucléine humaine entraînant le développement d’une pathologie de cette protéine accompagnée d’une symptomatologie motrice. L’expresssion de cette protéine dans cette espèce permet l’accélération de la maladie après inoculation d‘alpha-synucléine agrégée. Les souris sont adultes lors de l’inoculation, âgées de 6 à 8 semaines, permettant l’inoculation des extraits cérébraux dans une région précise du cerveau, et sont ensuite entretenues et surveillées cliniquement jusqu’à l’apparition de la maladie avant son délai d’apparition normale lors du vieillissement spontané de cette lignée, lors de laquelle les souris sont mises à mort sous anesthésie par perfusion intra-cardiaque sans réveil afin de pouvoir réaliser des prélèvements de sang.