Rongeurs

Greffées de cellules cancéreuses du foie, sous la peau ou directement dans le foie sous échographie selon les groupes, 640 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent un anticorps deux fois par semaine pendant quatre semaines, injecté sans anesthésie, certaines passent deux échographies hebdomadaires de 20 à 30 minutes sous anesthésie générale, et toutes sont mises à mort après un prélèvement de sang terminal pour récupérer tumeurs et foies. L'équipe veut confirmer chez des souris au système immunitaire fonctionnel l'effet de son anticorps, déjà entré en essai clinique pour d'autres maladies du foie, seul ou associé aux immunothérapies existantes. Le porteur qualifie les effets indésirables de "très limités", puis décrit des ulcérations possibles de la peau sur les tumeurs sous-cutanées, une gêne et des douleurs quand la tumeur du foie grossit, et des douleurs aux points d'injection répétés.

Objectifs

Le cancer du foie qui est le 3ème cancer le plus meurtrier dans le monde. Le traitement de référence des formes graves fait appel à des anticorps ciblant le système immunitaire, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du foie dans un modèle de souris ne présentant pas de système immunitaire. Nous avons également montré que le traitement de cellules issues de patients par notre anticorps permet d’activer les cellules immunitaires. Ceci suggère que notre anticorps pourrait améliorer l’efficacité des thérapies existantes ciblant le système immunitaire pour le traitement du cancer du foie. L’objectif de notre projet est tout d’abord de valider nos résultats précédents en confirmant la capacité de notre anticorps à inhiber la progression tumorale dans des souris présentant un système immunitaire fonctionnel, mais également d’évaluer l’efficacité de notre anticorps en combinaison avec des anticorps ciblant le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Le cancer du foie est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies actuelles qui ciblent le système immunitaire et ainsi la prise en charge des malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologie du foie.

Procédures

Une partie des animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses du foie. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Une autre partie des animaux recevra une injection unique de cellules cancéreuses directement dans le foie grâce à un système échographique, réalisée sous anesthésie générale, sans subir de procédure chirurgicale. Cette procédure prend environ 15 minutes à être réaliser. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 2 fois par semaine pendant 4 semaines par injection réalisée sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute à être réalisée. Certains animaux subiront une échographie de 20-30 minutes, sous anesthésie générale, 2 fois par semaine, afin de suivre la croissance tumorale dans le foie des animaux. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont très limités. Pour les souris injectées sous la peau, la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée. Pour les souris injectées dans le foie, la tumeur peut entrainer une gêne et des douleurs au cas où la tumeur dépasse une certaine taille. De même, les injections répétées intrapéritonéales peuvent parfois engendrer une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections répétées.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement

45 souris immunodéprimées NOD Scid vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour collecter leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le ventre ouvert sur 5 à 6 millimètres, chacune reçoit dans la prostate une greffe de cellules tumorales prostatiques humaines, puis un traitement de 120 secondes à la torche à plasma froid par la même voie, le protocole durant une semaine. L'équipe veut savoir si ce plasma pourrait éliminer les cellules tumorales restées en bordure de l'ablation chirurgicale de la prostate chez l'homme, et reconnaît que la réaction du site greffé au plasma "reste inconnue", d'où un suivi renforcé d'une possible réponse inflammatoire. Sur le remplacement, le porteur indique avoir mis au point la torche sur lignées cellulaires, et présente la souris comme correspondant "au standard pour la greffe de cellules tumorales humaines".

Objectifs

Le projet s’inscrit dans l’étude de l’évaluation du potentiel thérapeutique quant à l’utilisation d’une torche à plasma pour le traitement des marges chirurgicales au cours d’une chirurgie de prostatectomie radicale. Afin d’évaluer in vivo la pertinence de l’utilisation d’un tel dispositif, nous proposons de réaliser un traitement par torche à plasma sur des greffons de cellules PC3-GFP réaliser par implantation orthotopique intraprostatique.

Bénéfices attendus

Le cancer de la prostate peut, selon les options thérapeutiques retenues, conduite à une prostatectomie dans le but de supprimer le foyer tumoral primaire. Bien que les techniques actuelles soient aujourd’hui excellentes, notamment par le développement de procédure assistée par robotique, le risque de récidive par la présence de marges positives lors de la chirurgie reste un enjeu clinique de premier ordre. Ainsi, le développement de techniques permettant le traitement préventif du lit tumoral constitue un axe de recherche prioritaire. Les bénéfices attendus sont donc la validation par l'utilisation d'un modèle pré-clinique de l'efficacité du plasma froid pour le traitement des marges positives sur une chirurgie d'exérèse de tumeurs de la prostate et l'évaluation des risques de récidives avec ou sans traitemennt par plasma froid.

Procédures

Procédures chirurgicales : - 1 implantation intraprostatique par voie ventrale, ouverture sagitale de 5-6mm de la cavité peritonéale (6 minutes) - 1 traitement par plasma froid de 120 secondes, voie d'entrée identique à la première procédure (8 minutes)

Impact sur les animaux

a procédure d'implantation intraprostatiques des cellules PC3-GFP est maitrisée et a été conduite à plusieurs reprises dans le laboratoire. Ainsi nous avons un très bon recul sur cette procédure. L'implantation de cellules tumorales au long court sur une souris porte-greffe peut-être associée à certaines douleurs, voir altérer le statut sanitaire de l'animal. Toutefois, le protocole proposé se trouve en dehors de cette fenêtre puisque réduit à 1 semaine. Malgré tout, une attention particulière sera apportée sur l'état de bien être et de potentielle souffrance de l'animal pour identifier toutes nuisances inattendues. Concernant la réponse du traitement par la torche à plasma froid sur le site d'implantation, celle-ci reste inconnue. Ainsi comme indiqué pour cette procédure, un suivi renforcé des animaux sera mis en place, notamment pour évaluer une potentielle réponse inflammatoire qui pourrais dégrader l'état général de l'animal.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort pour collecte des tissus.

Remplacement

Cette étude in vivo a été précéder par une caractérisation des paramètres physiques de la torche à plasma et des effets biologiques obtenus sur lignées cellulaires. Ainsi, nous avons pu définir les paramètres optimales d’utilisation de la torche pour une utilisation sur l’animal. Ainsi tout la phase de mise au point a été réalisé sur des systèmes de substitution in cellulo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante à l’issue du protocole, ainsi 45 animaux seront utilisés.

Raffinement

En parallèle, la dissémination de cellules tumorales peut conduire à l’apparition de lésions douloureuse pour l’animal. Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques. Les points limites d’expérimentation seront particulièrement adaptés à ce risque et sont décrit dans la présnte demande. Un enrichissement important de la cage est prévu dans le but d’optimiser le bien-être animal

Choix des espèces

Le modèle murin correspond au standard pour la greffe de cellules tumorales humaines et l’étude de la dissémination métastatique chez les mammifères. En effet, le modèle souris vient en complément des modèles d’étude in vitro d’invasion et de mobilité cellulaire notamment permettant d’apprécier le tropisme tissulaire des cellules tumorales. Il est important de noter que l’utilisation de la torche à plasma in vivo, est consécutive à la validation des effets biologiques d’intérêts sur lignées cellulaires en culture. Nous utiliserons des individus de 2 à 4 mois. Les cellules utilisées étant des cellules prostatiques nous devons utiliser des animaux en période post-pubertaire.

Les femelles sont achetées déjà gestantes chez un fournisseur, et les mâles employés pour la défaite sociale sont d'anciens reproducteurs de plus de quatre mois. 510 souris C57Bl/6 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'équipe met au point un protocole de stress précoce dérivé de la défaite sociale, comparé à une séparation maternelle couplée à un sevrage précoce, pour faire apparaître chez les petits devenus adultes des comportements apparentés à l'anxiété et à la dépression. Une partie des souris subit jusqu'à deux prises de sang à la queue, éveillée, et des séances de comportement cinq jours sur sept pendant trois à quatre semaines, sous une restriction alimentaire qui maintient leur poids à 90 % de la normale, sans que les tests soient nommés. Les petits sont tués pour prélever leur cerveau, et les mâles et les mères sont tués ou réutilisés dans d'autres expériences du laboratoire "à chaque fois que ce sera possible", soit 150 souris déclarées réutilisées.

Objectifs

L’hypothèse de la programmation précoce des maladies de l’adulte souligne l’importance de la période périnatale comme fenêtre critique de sensibilité aux facteurs environnementaux. Ainsi, la littérature scientifique a révélé que l’adversité dans l’enfance (trauma, abus, négligence) augmente le développement de troubles anxieux et dépressif à l’âge adulte chez l’humain. Le modèle de séparation maternelle chez le rat engendre des altérations physiologiques et comportementales chez la descendance adulte, permettant ainsi l’étude des mécanismes physiologiques sous-tendant les effets à long terme du stress précoce. Cependant, ce modèle a donné des résultats inconsistants chez la souris, limitant grandement l’accès à des modèles génétiquement modifiés, et ainsi à la compréhension des mécanismes sous-jacents. Une des limites des études antérieures est l’utilisation systématique chez la souris du paradigme utilisé chez le rat, alors qu’il s’agit de 2 espèces distinctes. Nous proposons ainsi dans ce projet de caractériser et valider un nouveau protocole de stress précoce chez la souris en nous basant sur le modèle de défaite sociale déjà caractérisé et validé chez cette même espèce. Les conséquences de ce nouveau protocole seront étudiées chez la descendance mâle et femelle à l’âge adulte en évaluant les comportements de type « anxieux » et « dépressifs ». Ce protocole sera comparé à un nouveau protocole de séparation maternelle couplé à un sevrage précoce publié récemment pour identifier le protocole de stress précoce entrainant les comportements de type « anxieux » et « dépressifs » les plus robustes. L’objectif à plus long terme de ce projet sera de réemployer ce nouveau protocole en utilisant des modèles génétiquement modifiés qui permettront une meilleure compréhension des mécanismes sous-tendant la vulnérabilité émotionnelle dans un contexte d’adversité précoce.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de caractériser un nouveau modèle de stress précoce chez la souris. En effet les souris sont résistantes aux modèles couramment employés aujourd’hui (notamment la séparation maternelle), bloquant ainsi le potentiel accès à des modèles transgéniques. Cependant ces souris constituent le fond génétique de la plupart des modèles transgéniques de la littérature. Il est donc essentiel de valider une procédure robuste et reproductible de stress précoce. Ce projet servira ainsi de base pour de futurs projets s’intéressant à l’adversité dans l’enfance et nécessitant l’emploi du modèle murin. Ce dernier permet en effet d’accéder à des modèles génétiquement modifiés qui permettraient de mieux comprendre les bases moléculaires des liens entres stress précoce et développement de troubles anxieux et dépressif à l’âge adulte.

Procédures

Des prises de sang seront réalisées à la veine de la queue sur une partie des animaux vigiles pour mesurer les niveaux de stress des animaux. Le volume de sang sera adapté au poids de l’animal et il y aura un maximum de 2 prélèvements par animal. Une partie des animaux sera soumise à des procédures comportementales de façon journalière (5 jours sur 7) durant 3 à 4 semaines, nécessitant une légère déprivation alimentaire, qui n’entrainera qu’une légère perte de poids surveillée tout au long de la procédure.

Impact sur les animaux

- De par sa nature et son objectif le protocole de stress social que nous allons utiliser pour modéliser les pathologies psychiatriques entraine un stress chez la souris. Celle-ci présente une élévation des comportements de types anxieux. Néanmoins l’état général de la souris n’est pas altéré d’après notre expérience au laboratoire et la littérature disponible. En effet, les animaux ne perdent pas de poids au cours du protocole et leur activité locomotrice n’est pas affectée. Les animaux sont observés durant les tests et après les tests et des soins appropriés sont mis en place en cas de besoin - Concernant la descendance, les protocoles de stress précoce visent à générer des comportements émotionnels de type « anxieux » et « dépressifs », qui sont l’objet de cette étude. Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes et n’induisent pas de stress majeur induisant une altération de l’état général des animaux. Enfin, les procédures de conditionnement opérant nécessitent une restriction alimentaire légère limitée à la phase d’apprentissage (maintien à 90% du poids ad libitum).

Devenir

Pour les procédures 1, 2 et 3 : - Les souris mâles adultes utilisées pour la défaite sociale et les mères seront soit mises à mort soit réutilisées par des membres du laboratoire dans d’autres expériences à chaque fois que ce sera possible pour répondre aux besoins de réduction de la règle des 3R. - Les petits seront euthanasiés à la fin de la procédure par raison scientifique afin de récupérer le tissu cérébral pour des analyses biochimiques et histologiques.

Remplacement

L’objectif du projet étant de caractériser et de valider un nouveau protocole de stress précoce dans un modèle murin et d’étudier les conséquences de ce stress sur le développement de troubles anxieux et dépressifs chez la progéniture à l’âge adulte. L’emploi de modèle animaux est donc nécessaire pour répondre à la question posée. L’utilisation du modèle murin se justifie pour les prochaines étapes du projet qui nécessiteront l’emploi de modèles génétiquement modifiés pour comprendre les bases moléculaires de ces comportements.

Réduction

Pour respecter la règle de réduction du nombre d'animaux utilisés, les souris mâles adultes utilisées pour la défaite sociale seront employées durant plusieurs sessions consécutives de ce protocole. Ces animaux seront proposées aux autres utilisateurs puisqu'ils n'auront pas reçu de traitements particuliers. De la même manière, les mères pourront être proposées aux autres utilisateurs. Le nombre total maximal d’animaux prévus dans le projet est de 510, mais ce nombre est susceptible d’être revue à la baisse, en fonction du succès des reproductions réalisées.

Raffinement

- Les animaux seront hébergés en cages collectives (sauf exceptions précisées par la suite) et dans un environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). - Du fait de la restriction alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. - Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille qui peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. Nous choisissons de travailler chez la souris plutôt que chez le rat car de nombreuses souris transgéniques sont disponibles ce qui n’est pas le cas chez le rat, ce qui sera nécessaire pour la continuité du présent projet. - Les femelles seront achetées directement gestantes auprès du fournisseur. - Les souris utilisées pour la défaite sociale seront d’anciens mâles reproducteurs et arriveront donc à l’âge adulte (après 4 mois). - Les expériences de comportement sur la descendance démarreront sur des animaux âgés de 12 semaines et plus car le phénotype apparaît à l’âge adulte.

Pour étudier l'effet d'un régime riche en graisses sur les rythmes de 24 heures et la mémoire des mâles et des femelles, 96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever en même temps leur cerveau et leur sang. Elles vivent seules en cage pendant deux mois et demi, et la moitié reçoit ce régime pendant cinq mois et demi. Un groupe passe trois périodes de deux semaines sous des éclairages modifiés, l'autre cinq jours en cage métabolique et deux tests de comportement, et toutes subissent une brève chirurgie pour un prélèvement de sang terminal. Le porteur reconnaît un "stress d'isolement" chez un "animal grégaire" et indique que les tests "pourront induire de l'anxiété et une douleur modérée", sans dire lesquels.

Objectifs

Une alimentation riche en graisses et en sucres favorise la prise de masse et l’obésité. Chez les souris mâles, une telle alimentation provoque non seulement un surpoids, mais aussi des altérations des rythmes de 24 h et de la mémoire. Les souris femelles avec un régime gras grossiraient relativement moins que les souris mâles. Notre objectif est de mieux comprendre les mécanismes par lesquels un régime alimentaire riche en gras modifie la santé métabolique et la mémoire chez des souris mâles et femelles. Notre hypothèse principale est que, chez un même animal, les altérations de la mémoire seront corrélées aux altérations des rythmes de 24 h et du métabolisme. Notre hypothèse secondaire est que les altérations des rythmes de 24 h pourraient être réduites chez les souris femelles, ce qui pourrait se traduire par une résistance métabolique relative au régime gras et à moins de perturbations de la mémoire que chez les souris mâles.

Bénéfices attendus

La nature des facteurs nutritionnels qui modulent les rythmes de 24 h et les liens qui connectent la régulation des rythmes journaliers d'alimentation avec la mémoire sont encore très mal connus. L’identification des mécanismes sous-jacents pourrait permettre d’améliorer la prévention et le traitement des maladies métaboliques, comme le diabète ou l’obésité, ainsi que les altérations de la mémoire par des approches de nutrition prenant en compte les rythmes de 24 h.

Procédures

Les animaux seront hébergés en cages individuelles pendant 2.5 mois. La moitié sera nourrie avec un régime alimentaire riche en gras pendant 5.5 mois. Le premier groupe sera exposé à 3 conditions particulières d'éclairement (d'une durée de 2 semaines) pour étudier les rythmes de 24 h. Chaque étape sera séparée par 2 semaines de récupération. Le second groupe sera placé en cage métabolique (5 jours) et soumis à 2 tests comportementaux (l’un de 2 jours et l’autre de 3 jours)), séparés par 2 semaines de récupération. Un prélèvement terminal de sang sera effectué sur tous les animaux, suite à une chirurgie d'environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Les souris seront gardées en cages individuelles pour enregistrer des variables rythmiques individuelles, ce qui pourra créer un stress d'isolement. Les tests comportementaux pourront induire de l'anxiété et une douleur modérée. Le régime gras devrait entraîner un surpoids progressif des souris, ce qui est l'objet même du modèle expérimental.

Devenir

L’étude de la rythmicité de 24 h de l’expression des protéines dans différentes structures ainsi que celle des rythmes de 24 h des hormones et des métabolites plasmatiques impliquent la mise à mort des animaux pour prélever en même temps leur cerveau et leur sang.

Remplacement

La régulation des cycles journaliers de la prise alimentaire et du métabolisme impliquant plusieurs organes à la fois (notamment, cerveau, foie, pancréas, surrénales, muscles), l’investigation des interactions entre rythmes de 24 h et nutrition nécessite l’utilisation de modèles animaux. Ainsi est-il impossible de réaliser ces études sur des organes isolés ou des cultures cellulaires in vitro.

Réduction

Notre suivi longitudinal des animaux exposés à des tests physiolgoiques et comprtementaux succcessifs réduit le nombre d’individus utilisés. Le nombre d’animaux proposés (n=6 par point-horaire pour 4 temps par 24h) est basé sur une évaluation de la puissance statistique qui prend en compte les moyennes et la dispersion des données comportementales des études antérieures. La rythmicité à l'échelle de 24 h sera validée par une analyse statistique adaptée. L'effet d'un régime favorisant le surpoids sera évalué sur les rythmes de 24 h, le métabolisme et sur des tests de mémoire chez la souris mâle et la souris femelle par des analyses statistiques adaptées.

Raffinement

Les souris seront maintenues en cages individuelles pour enregistrer des variables rythmiques individuelles. Pour limiter ce stress d'isolement chez la souris qui est un animal grégaire, les cages seront ouvertes, de sorte que les animaux garderont des contacts olfactifs et auditifs avec leurs congénères de la même pièce. Un morceau de bois à ronger, du matériel de coton pour faire un nid constitueront un environnement enrichi pour la souris et devrait limiter le stress d’isolement. Avant les tests comportementaux, les animaux seront manipulés régulièrement afin de minimiser leur état relatif de stress. De plus, toutes les souris seront manipulées quotidiennement pendant la semaine précédant les tests comportementaux afin de les habituer à la manipulation et réduire ainsi le stress qui peut y être associé. De même, une attention particulière sera apportée lors des tests comportementaux pour qu’ils se déroulent dans les conditions les plus calmes possibles afin de ne pas perturber les souris, ce qui risquerait d’altérer leurs réponses comportementales. Entre chaque test, un délai de deux semaines sera respecté pour permettre aux animaux de récupérer. Tout au long de la procédure nous ferons un suivi de l'état général de l'animal à l'aide d'une grille de score et nous avons établi des points limites permettant de soustraire l'animal à la souffrance.

Choix des espèces

La souris est devenue un modèle animal classique en nutrition et en chronobiologie par l’existence de nombreuses lignées génétiquement modifiées. Une fois ce projet achevé qui permettra d'établir un modèle expérimental, nous pourrons chercher comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu, en étudiant des souris génétiquement modifiées exposées aux mêmes procédures expérimentales. Les souris traitées seront nourries dès le sevrage avec une alimentation riche en gras. Puis les souris seront phénotypées 3 mois plus tard au stade jeune adulte. Ce protocole a été validé chez la souris mâle pour ses effets sur le métabolisme et la mémoire. L'originalité du projet présent est de relier ces fonctions aux rythmes de 24 h et à leurs perturbations, à la fois chez les mâles et les femelles.

Chirurgie du cerveau, enregistrement de l'hippocampe sous anesthésie profonde, biberon d'éthanol pendant six semaines ou contention de quinze minutes selon les groupes : 380 souris de deux lignées mutantes du récepteur nicotinique α5 vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'équipe veut relier ces mutations, associées chez l'humain à la dépendance à l'alcool d'après des études génétiques, à la consommation d'éthanol et au comportement socio-émotionnel, mesuré par un test de reconnaissance des émotions avec enregistrement des vocalisations ultrasonores. Le porteur écrit que l'éthanol, consommé par "choix libre", produit des effets "positifs de type anxioloytiques, relaxant et euphorisants", et que les tests sociaux "peuvent être considéré comme un enrichissement". Il décrit la contention comme un geste "effectué une seule fois", puis comme un stress "auquel les animaux s'habituent".

Objectifs

L’OMS raporte que 5% de décès dans le monde peuvent être attribués à l’abus d’alcool. Le fléau sociétal et de santé publique que repésente l’alcoolisme motive la recherche de facteurs de risques génétiques et environnementaux, dans le but de développer des interventions thérapeutiques plus efficaces. Des études génétiques chez l’Homme ont permis de montrer un lien entre une modification du gène des récepteurs nicotiniques de type α5 et la probabilité de développer une dépendance à l’alcool. Malheureusement, le lien causal entre cette altération génétique et l’alcoolisme est difficile à étudier chez l’homme. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle de cette altération dans la consommation d’alcool, la gestion des émotions et comportements sociaux, à l’aide de lignées de souris exprimant la même altération génétique que l’Homme. Afin de connaitre les conséquences de cette altération génétique sur l’activité neuronale, nous enregistrerons la réponse à la stimulation des neurones situés dans les régions du cerveau impliquées dans la reconnaissance des émotions. Enfin, dans le cas ou des déficits sont observés chez les animaux porteurs de la modication génétique, nous tenterons d’améliorer le déficit socio-émotionel en corrigeant, par thérapie génique, l’altération génétique du récepteur α5 dans le cerveau de souris. Ce même traitement pourrait aussi régulariser leur consommation d’alcool.

Bénéfices attendus

Bien que des études génétiques chez l’Homme aient montré un lien entre une modification du gène responsable de l’expression des récepteurs nicotiniques de type α5 et la probabilité de développer une dépendance à l’alcool, les mécanismes à l’origine de cette vulnérabilité demeurent inconnus. Or, il existe différentes formes (ou types) d’alcoolisme associées à des comportements émotionnels et sociaux différents voire opposés, par exemple à une hyperanxiété ou une hypoanxiété. Chez l’Homme, il est très difficile de déterminer si ces traits comportementaux et émotionnels sont dus à la consommation d’alcool, ou s’ils correspondent à des traits de personnalité qui préexistent, voire facilitent cette consommation. A ce jour, les traitements ne prennent généralement pas en compte les différents types alcooliques, ce qui pourrait expliquer au moins en partie le taux de rechute élevé (80 à 90% selon les études). L’un des principaux intérêts de notre projet est donc de mieux comprendre la relation entre les traits comportementauxs socio-émotionnels et la consommation d’alcool, en permettant de dissocier les effets de la consommation chronique d’alcool du profil de personnalité préexistant. De façon importante, ces traits sont aussi fortement liés au sexe, par exemple les profils hyperanxieux sont principalement observés chez les patients de sexe féminin, à l’inverse l’hypoanxiété et l’émoussement émotionnel sont principalement observés chez les patients de sexe masculin. Pour cette raison, nous comparerons les réponses comportementales et neuronales de souris mâles et femelles. Ainsi, l’apport éventuel de notre projet pourrait se situer à plusieurs niveaux. Premièrement, en prenant en compte les profils émotionnels et non simplement le niveau de consommation, il pourrait aider à comprendre les mécanismes par lesquels une mutation des récepteurs a5 induit un risque de dépendance à l’alcool. Si le lien entre profils socio-émotionels et risque de dépendance à l’alcool est observé chez l’animal, cela permettrait de tester certaines interventions thérapeutiques, qu’elles soient pharmacologiques ou psychologiques, pour adapter les traitements de façon « personnalisée » chez l’Homme. De nouvelles stratégies pharmaco et/ou psychothérapeutiques prenant en compte le profil socioémotionnel des patients pourraient ainsi se révéler beaucoup plus efficaces pour faciliter l’arrêt de la consommation d'alcool, voire de diminuer les risques de rechute.

Procédures

Les animaux seront soumis à : • La chirurgie stéréotaxique d’injection de virus et/ou d’implantation de fibre optique (geste réalisé sous anésthesie générale avec suivi analgésique), dure environ 30 minutes (n=180). • L’enregistrement de l’activité electrophysiologique dans l’hippocampe (geste effectué sur animal anesthesié) pendant une période maximale de 60 minutes (n=180). • L’activation neuronale via photostimulation optogénétique sur animal vigile pendant 3 minutes lors d’une session par animal (n=60). • L’exposition volontaire d’un biberon contenant une solution d’éthanol toutes les 24 heures pendant 6 semaines (n=60). • Un test de reconnaissance des émotions avec enregistrement des vocalisations ultrasonores pendant 5 jours à raison de 10 minutes par jour (n=360). • Un stress de contention sur animal vigile pendant 15 minutes, geste effectué une seule fois (n=60).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à : • La chirurgie stéréotaxique d’injection de virus et/ou d’implantation de fibre optique (geste réalisé sous anésthesie générale avec suivi analgésique) qui dure environ 30 minutes (n=180). Cette procédure induit une perte de poids légère et transitoire normale (1-2j) et une douleur modérée qui répond bien à une injection sous-cutanée d’AINS (INFLACAM©) efficace pendant plus de 12h. • L’enregistrement de l’activité électrophysiologique de deux régions du cerveau : le CA1v et CA1d pendant une période maximale de 60 minutes (n=180). Ce geste est effectué sur animal en anesthésie générale profonde. • L’activation neuronale des voies BLA-CA1v via photostimulation optogénétique sur animal vigile pendant 3 minutes lors d’une session par animal (n=60). Ce geste peut générer éventuellement une anxiété légère qui n’est pas systématique (Feliz-Ortiz et al, 2015). • L’exposition volontaire d’un biberon contenant une solution d’éthanol toutes les 24 heures pendant 6 semaines (n=60). Ce traitement, qui dépend d’un choix libre de l’animal, génère plutôt des effets psychopharmacologiques et physiques positifs de type anxioloytiques, relaxant et euphorisants. • Un test de reconnaissance des émotions avec enregistrement des vocalisations ultrasonores pendant 5 jours à raison de 10 minutes par jour (n=360). Induit un stress léger, comparable au stress induit par de nombreux tests comportemntaux considérés comme faiblement stressants. • Un stress de contention sur animal vigile pendant 15 minutes, geste effectué une seule fois (n=60) et considéré comme un stress psychogène modéré auquel les animaux s’habituent.

Devenir

A la fin des procédures les animaux sont euthanasiés sous anesthésie générale profonde pour la conservation des tissus (cerveau), qui seront analysés ultérieurement.

Remplacement

Le projet étant basé sur la reconnaissance des émotions chez la souris et sa relation avec la consommation d’alcool, il n’est pas possible à ce jour de remplacer l’utilisation d’animaux par une autre approche. En revanche, les effectifs peuvent être optimisés en remplaçant les tests indépendants par l’utilisation d’une batterie de tests longitudinaux qui permet d’optimiser le recueil des données pour chaque animal. Ceci implique d’une part de choisir, sur la base de la littérature et de résultats préliminaires, des tests ne modifiant pas le comportement à long terme; et d’autre part d’espacer ces tests dans le temps. Ainsi, deux tests à court terme réalisés en séquentiel divisent par deux l’effectif total sans impacter significativement les résultats.

Réduction

En plus de l'utilisation de batteries de tests (voir ci-dessus), des études pilotes avec un petit nombre de sujets (n=4-5) permettront de déterminer si les effets justifient l'application d'un protocole complet, ce qui peut réduire de façon importante l'effectif total. Ce nombre n’est pas suffisant pour garantir un effet statistique solide mais il permet de décider, sur la base de statistiques descriptives, de compléter l’expérience à 10 animaux par groupe qui est l’effectif minimum nécessaire pour une significativité acceptable avec les tests statistiques paramétriques d’analyses de moyenne et de variance (Student apparié ou non-apparié, ANOVAs et Bonferroni post-hocs). La normalité des distributions est vérifiée avec le test de Kolmogorov-Smirnoff.

Raffinement

Toutes les dispositions permettant de préserver le bien-être des animaux seront prises: anesthésie générale pour l'opération (Isoflurane), traitement post-opératoire anti-inflammatoire préventif (Meloxycam). Par ailleurs l'ensemble des animaux est maintenu dans des conditions d'environnement enrichi, avec à disposition un matériau pour construction de nid. Après chaque intervention chirurgicale (classe modérée) les animaux seront isolés afin d’éviter tout risque de blessures ou de souffrance. Les animaux sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens formés en expérimentation animale (niveau appplicateur) qui informent le concepteur/expérimentateur immédiatement lorsque que des dispositions doivent être prises en cas de signe de souffrance. L'atteinte des points limites entraine l'application du protocole de réponse en fonction du score défini dans chaque procédure. Il faut noter que les tests sociaux utilisés, en permettant aux animaux d’interagir librement de façon quotidienne pendant la durée des expériences, peuvent être considéré comme un enrichissement. L’ensemble des expérimentateurs/soigneurs intervenant sur les animaux a suivi une formation à l’expérimentation animale (niveau 1 ou 2).

Choix des espèces

La souris représente une espèce de référence pour l’étude du système nerveux central chez les vertébrés supérieurs. L’organisation du système nerveux murin permet une extrapolation raisonnable des résultats obtenus chez la souris à l’espèce humaine. Par ailleurs, la souris est une espèce qui peut être manipulée génétiquement, fournissant des outils essentiels à la compréhension des mécanismes neurobiologiques et des mécanismes neuronaux impliqués dans de nombreuses maladies et déficits cognitifs. Grâce aux modèles transgéniques, il est aussi possible de relier les données de la génétique humaine des maladies à l'altération de molécules/récepteurs spécifiques dont la fonction peut être analysée avec des modèles précliniques de ces maladies. Par exemple, l'implication de mutations des récepteurs cholinergiques nicotiniques dans la dépendance à l’alcool peut être étudiée à l'aide des souris dépourvues (α5KO) de certains de ces récepteurs et à des souris exprimant un polymorphisme génétique humain (α5KI) qui sont utilisées dans le projet présent. Les animaux seront utilisés au stade âge adulte mature (3–6mois). Cet âge constitue une période de stabilité durant laquelle on considère que le développement est achevé et les effets liés au vieillissement minimum.

360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant une injection de vecteur viral et, chaque semaine, une injection sous la peau d'une substance luminescente pour suivre le virus par imagerie. La moitié est injectée dans l'abdomen dès le premier jour de vie, l'autre moitié dans la veine de la queue à six semaines, éveillée. L'équipe compare plusieurs dérivés du virus AAV9 pour retenir celui qui cible le mieux le muscle, une étape en amont de futures thérapies géniques des maladies musculaires. Toutes sont tuées pour le prélèvement de leurs organes, et le porteur ne dit pas combien de semaines dure le suivi, donc combien d'injections chaque souris subit.

Objectifs

Les vecteurs viraux sont des outils largement utilisés en thérapie génique. Parmi eux, les virus adéno-associés (AAV) présentent de nombreux avantages comparés aux autres vecteurs car ils ne sont pas pathogènes chez l’Homme et présentent une faible immunogénicité ainsi qu’une grande stabilité génétique. Il existe plusieurs sérotypes d’AAV dont l’AAV9 présentant un tropisme pour les muscles. Une des limites de l’utilisation des AAV en tant que vecteur est le manque de spécificité. D'autres AAV dérivés de l'AAV9 décrit dans différentes publications présenteraient une augmentation de la spécificité musculaire en vitro et en in vivo. L’objectif du projet est donc de pouvoir comparer l'efficacité des différents dérivés de l'AAV9 avec l'AAV9 ainsi qu'entre eux chez la souris et par la suite de sélectionner celui qui montrera la meilleure optimisation de l’efficacité et la spécificité dans le muscle tout en limitant celle dans les autres organes. Le but final est d’améliorer la thérapie génique pour traiter les maladies génétiques du système musculaire.

Bénéfices attendus

L’identification du meilleur sérotype d’AAV ciblant le plus spécifiquement les muscles et moins les autres organes permettra une meilleure efficacité des thérapies géniques applicables aux maladies musculaires.

Procédures

Les 180 souris de la cohorte « injections intrapéritonéales » seront soumises aux procédures suivantes : -Injection intrapéritonéale unique au premier jour post-natal, 1 minute par animal -Injection sous cutanée (1minute) de la substance émettrice de lumière chaque semaine à partir de la 2ème semaine de vie pour l’analyse en bioluminescence. Les 180 souris de la cohorte « injections intraveineuses » seront soumises aux procédures suivantes : - Injection intraveineuse (1 minute) unique par la veine caudale chez la souris éveillée -Injection sous cutanée (1 minute) de la substance émettrice de lumière chaque semaine à partir de la 2ème semaine de vie pour l’analyse en bioluminescence

Impact sur les animaux

L’injection peut provoquer chez l’animal un stress dû à l’acte, ainsi qu’une perte de poids. L’injection intrapéritonéale peut provoquer une douleur transitoire chez l’animal. Une anesthésie prolongée peut causer des troubles cognitifs chez l’animal.

Devenir

Notre projet nécessite la collection d’organes pour l’analyse au niveau histologique et moléculaire

Remplacement

Ces analyses ne peuvent pas être remplacées par des tests in vitro sur des lignées cellulaires musculaires car celles-ci ne permettent pas l’étude de l’impact de l’AAV sur un organisme entier. En effet seul le modèle animal pourra nous permettre l’étude de la bio distribution d’un produit injecté. De plus, le modèle murin est physiologiquement assez proche de l’Homme, ce qui va nous permettre une étude représentative de l’efficacité et de la spécificité des différents vecteurs viraux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été basé sur le nombre de virus et de doses à tester par âge. Ce nombre a été basée sur de précédentes études similaires et permet d’assurer une robustesse statistique nécessaire à l’interprétation des résultats. L’expérience de bioluminescence, qui est une expérience permettant de visualiser la localisation du virus dans l'animal, nous permet d’avoir un suivi hebdomadaire de l'expression du virus chez la souris, ce qui nous évite la création de plusieurs groupes de souris à différents âges.

Raffinement

Une alimentation enrichie en plus de l’alimentation inscrit dans l’agrément de l’EU sera mis en place si une perte de poids (inférieure à 22 grammes) est observée suite à l’injection des virus. Les animaux seront surveillés chaque semaine jusqu’à leur mise à mort. Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. De l’ocrygel sera appliqué dans l'ensemble des procédures expérimentales pour prévenir tout inconfort d’assèchement oculaire lors du réveil. Les point limites seront déterminés en fonction des observations faites d'une part pendant l'anesthésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l'animal) et d'autre part pendant et après l'injection de l'animal (changement du comportement, réponses à des stimuli externes). L'anesthésie et la procédure d'injection seront arrêtés si ces points limites sont atteints.

Choix des espèces

Pour tester l'éventuelle amélioration de l’efficacité et de la spécificité du vecteur viral, nous avons besoin d'effectuer des expériences in vivo sur modèle animal. Des projets similaires sur ce modèle animal ont déjà été publié, l’utilisation de ce modèle s’inscrit donc dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. La cohorte concernant le groupe de souris qui seront injectées par voie intrapéritonéale utilisera des souris dès le premier jour de naissance. Cela permettra d’évaluer l’efficacité des virus pour mettre en place une stratégie de thérapie génique préventive. La cohorte concernant le groupe de souris qui seront injectées par voie intraveineuse utilisera des souris de 6 semaines d’âge. Cela permettra d’évaluer l’efficacité des virus pour mettre en place une stratégie de thérapie génique curative.

7500 rongeurs, 3750 souris et 3750 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une mise à jeun de quatorze heures sur grille, ils reçoivent par gavage ou injection les composés testés ou des agents ulcérogènes comme l'éthanol ou des anti-inflammatoires, avant le prélèvement de l'estomac après la mise à mort. Ces études réglementaires évaluent le potentiel de nouvelles molécules à provoquer ou atténuer des ulcères. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative validée n'existe pour étudier un système digestif "intègre".

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer : - les effets potentiels ulcérogènes gastriques de nouveaux composés, - la capacité de modulation par de nouveaux composés des effets ulcérogènes gastriques de composés comme l’éthanol, les anti-inflammatoires non stéroïdiens (acide acétylsalicylique, indométacine), les acides (HCl). Les modèles expérimentaux développés chez le rongeur (principalement chez le rat) sont très largement décrits.

Bénéfices attendus

Dans le cadre d'étude de type pharmacologie de sécurité, ces études vont permettre de déterminer d'éventuels effets délétères sur la muqueuse gastrique de candidats médicament et fournir ainsi des indications réglementaires dans le champ de la pharmacologie de sécurité de nouveau candidat médicament. Dans le cadre d'étude d'efficacité/pharmacologie de sécurité de candidat médicament, ces études vont permettre de déterminer le potentiel de modulations par le candidat médicament des ulcères gastriques induits par des agents comme l’éthanol, les anti-inflammatoires non stéroïdiens (acide acétylsalicylique, indométacine). Cela apportera des indications réglementaires dans le champ de la pharmacologie de sécurité de nouveau candidat médicament ou en terme d'efficacité thérapeutique.

Procédures

Mise à jeun avec hébergement sur grille de 14h pour éviter les phénomènes de coprophagie (1 fois) avant traitements par gavage ou administration intra péritonéale (maximum deux traitements à 1h d'intervalle, durée d'un gavage ou d'une injection intrapéritonale de 15 secondes environ) suivi 6 heures au plus tard après le premier traitement d'une anesthésie pour prélèvement sanguin et prélèvement de l'estomac (et éventuellement d'autres tissus) après la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors de ce protocole sont celles liées à l'administration du produit à tester et à son éventuelle toxicité. Les nouvelles molécules ont déjà passé une batterie de tests in vitro qui permet de déterminer les molécules les plus sélectives et sans effet sur certaines cibles pouvant être à l'origine d'effet non désiré. Des nuisances peuvent être liées aux administrations (infection au site d’injection, lésion œsophagienne liée au gavage ou erreur de gavage). Les effets indésirables liés aux produits testés pourront être des troubles du comportement ou les nuisances consécutives de l'ulcération qui peuvent in vivo être objectivées par la présence de traces de sang dans la région périanale. Enfin, la mise à jeun sur grille est également source de nuisance pour les animaux, mais est requise pour éviter les phénomènes de coprophagie.

Devenir

Mise à mort selon les procédures réglementaires pour prélèvements terminaux post mortem requis

Remplacement

L’utilisation de souris ou de rats pour l'évaluation d'effet sur la muqueuse gastrique est justifiée par la nécessité de pouvoir déterminer les effets de nouvelles molécules sur un système gastrointestinal intègre, y compris dans le cadre des études de pharmacologie de sécurité. Il n'existe actuellement pas de méthode alternative connue et validée à ce jour.

Réduction

Les tests de plusieurs molécules pourront être groupés afin de n'utiliser qu'un seul groupe témoin et le cas échéant un groupe testant les effets de molécule(s) de référence. Une prise en compte des données de pharmacocinétique et de pharmacodynamie dans le choix de doses sera effectuée. L'analyse statistique évaluera les scores d'ulcérations comparant les effets des traitements.

Raffinement

La mise à mort des animaux est réalisée dans une pièce séparée de la pièce de traitement afin de minimiser le stress pour les animaux en attente. Lors du change des animaux (une fois par semaine) une feuille de Suivi Bien Être Animal est remplie en fonction d’une grille de 30 critères. Si nous constatons une déviation concernant au moins 3 critères sans qu’une action puisse corriger ces déviations, alors la mise à mort de l’animal est envisagée. Ces grilles de critères bien-être animal sont archivées. Les animaux resteront hébergés en groupe et des tunnels seront utilisés comme enrichissement.

Choix des espèces

L’évaluation de l’efficacité thérapeutique et de la sécurité pharmacologique des molécules destinées à devenir des médicaments est requise par les autorités. La 1ère évaluation préclinique des effets sur la sphère gastrique est généralement conduite chez les rongeurs (rats, souris). Le stade adulte sera généralement utilisé pour tester l’efficacité de nouvelles entités pharmacologiques, les applications thérapeutiques visant la population adulte. Néanmoins, des investigations pourront être réalisées sur des animaux après sevrage pour répondre à des besoins relatifs au plan d’investigation pédiatrique le cas échéant.

6500 rongeurs, 6200 souris et 300 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une induction tumorale, parfois une irradiation et un implant, puis des traitements répétés et des prélèvements de sang et de moelle osseuse, pour évaluer des composés contre des leucémies et des métastases. Le développement tumoral provoque une perte de poids et des difficultés à se déplacer. Le porteur reprend mot pour mot son argumentaire de remplacement pour justifier le nombre d'animaux, et affirme qu'aucune méthode alternative ne prédit l'efficacité in vivo.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux. En 2020, quelques 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer disséminés déjà mis en place ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la maladie humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour les traiter. Ces modèles permettront d’étudier des nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte physiologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une réelle évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers disséminés de type leucémie ou bien le développement des métastases chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques sur des leucémies ou des métastases. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera ainsi possible d’étudier dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme : -les mécanismes de dissémination des métastases, -les mécanismes d’évolution des leucémies, -les mécanismes de résistance à des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

Un système d’identification sera mis en place sur tous les animaux, sous anesthésie générale (moins de 1 minute, une seule fois). Induction tumorale de tous les animaux sous anesthésie (moins de 1 minute, généralement unique, mais pourra être répétée pour vérifier que la thérapie administrée peut empêcher des récidives). Si necessaire,en fonction de des cellules tumorales : transport vers le site où est réalisée l’irradiation (une seule fois, 2 heures). Pose d’un implant Sous Cutané (une seule fois, 1 minute) Test de composés chimiques, biologiques ou traitement par rayons ionisant administrés sous anesthésie générale (moins de 1 minute). Administration orale, intraveineuse, intrapéritonéale et sous cutanée sous contention sans anesthésie (moins de 1 minute). Ces administrations peuvent être uniques ou répétées, comme peut l’être la prise de médicament chez le patient. Pesée des animaux (moins de 1 minute) Prélèvements de sang potentiellement répétés en respectant les volumes maximum tolérés : -Prélèvements peu invasifs sous anesthésie générale (moins de 1 minute). -Prélèvement par piqûre à la veine caudale et marginale de la patte sous anesthésie, possible sous contention (moins de 3 minutes). -Prélèvements potentiellement répétés de moelle osseuse sous anesthésie (moins de 5 minutes). -Recueil d’urine individuel (potentiellement répété, avec isolement (moins d’une heure)). Technique d’imagerie, potentiellement répétée: sous anesthésie générale entre 10 et 45 minutes (en fonction des techniques).

Impact sur les animaux

Les gestes techniques suivants induiront un stress léger à l’animal: -Identification des animaux -Transport vers le site où est réalisée l’irradiation -Pose d’un implant Sous Cutané -Induction tumorale -Traitements par voies orale, Intraveineuse, intrapéritonéale, sous cutanée ou radiothérapie -Suivi des animaux par imagerie Les gestes suivants induiront une douleur plus marquée. -Les traitements par voie intramusculaire/intradermique Au début de l’étude, les animaux seront randomisés. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger. La prise de mesure des animaux (poids) induira un stress pouvant être considéré comme faible qui diminuera avec l’habituation Les prélèvements de sang ou de moelle osseuse en cours d’expérience induiront un stress plus important chez l’animal : Le développement tumoral induira une perte de poids et des difficultés locomotrices.

Devenir

Les animaux étant porteur de tumeur ils seront tous mis à mort.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Raffinement

Les procédures techniques sur les animaux seront réalisées selon les standards validés par le comité éthique. Toutes les procédures seront réalisées par des techniciens formés et dont les compétences ont été validées. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Chaque animal sera observé quotidiennement. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance seront suivis par la structure chargée du bien-être animal. Sous l’autorité du vétérinaire, des antalgiques pourront être prescrits. De l’enrichissement sera utilisé dans toutes les cages dès l’arrivée des animaux dans l’animalerie. L’induction tumorale se fera sous anesthésie. avec traitement antalgoique adaptée. L’induction tumrale fera l’objet d’une surveillance et de soins post induction seront pratiqués si nécessaires. Pour les traitements dont l’administration est douloureuse, les animaux en plus d’être anesthésiés recevront une antalgie adaptée. Les injections/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations du comité éthique en termes de volume, d’anesthésie, de fréquence et d’antalgie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. A partir de 10% de perte de poids, la fréquence de pesée sera augmentée pour tous les animaux Dans toutes les cages, un gel nutritif ou de l’eau gélifiée seront rajoutés, la quantité de nourriture en fond de cage sera augmentée. Chaque animal avec une perte de poids de 10% sera réhydratés.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines (modèles xénogéniques) dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (6 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets secondaires des composés à tester. Les effets du développement tumoral sera plus facilement supporté par des animaux adultes.