Rongeurs
STEROHD Effets protecteurs de CYP46A1 et implication des astrocytes dans un modèle murin de la maladie de Huntington
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle de la maladie de Huntington, elles subissent des injections intracérébrales sous anesthésie, des gavages répétés sur quatre mois, de l'imagerie cérébrale et une batterie de tests comportementaux évaluant motricité, sociabilité, vocalisation, anxiété et anhédonie, avant la mise à mort pour analyser les tissus. Le porteur n'attend que peu d'effets indésirables hormis la douleur des chirurgies et le stress de la contention. Il affirme que les interactions entre neurones et astrocytes ne sont pas reproduites in vitro ou in silico et qu'un modèle murin est nécessaire pour tester cette thérapie génique.
Objectifs
La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative d’origine génétique sans traitement curatif. Elle se caractérise par la mort de neurones du système nerveux central, ce qui provoque d’importants troubles moteurs, cognitifs et comportementaux chez les patients. Un défi majeur est de retarder l’âge d'apparition des symptômes et de ralentir la progression de la maladie de Huntington. La production et l’élimination du cholestérol, qui est essentiel pour le cerveau, est altéré dans la maladie de Huntington. Le métabolisme du cholestérol implique un dialogue finement régulé encore mal compris entre les neurones mais aussi leurs partenaires, les astrocytes. Les études pilotes montrent que la thérapie génique avec CYP46A1, qui vise à rétablir le métabolisme du cholestérol, impacte aussi les astrocytes et les rend réactifs. Nous faisons l’hypothèse que les astrocytes réactifs sont impliqués dans les effets bénéfiques de cette stratégie thérapeutique. L’objectif de ce projet est de mieux définir le potentiel thérapeutique de CYP46A1 dans un modèle murin pertinent de la maladie de Huntington et de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. D’une part, il s’agit d’établir si les astrocytes réactifs sont impliqués dans les effets thérapeutiques de la CYP46A1 : une approche préclinique complète évaluera les effets thérapeutiques au niveau moléculaire, histologique, biochimique, métabolique, comportemental et de la connectivité cérébrale. Il s’agit également de comprendre quels sont les effets de CYP46A1 sur la morphologie des astrocytes du striatum et leur transcriptome (ensemble des gènes exprimés par une cellule). Pour cela, les souris anesthésiées recevront des injections intracérébrales de vecteurs viraux dans le striatum ou un traitement pharmacologique oral qui mime les effets d’une surexpression de CYP46A1. Ces souris seront analysées par un panel d’approches précliniques (analyse des performances motrices et des altérations comportementales par des tests du comportement, de l’imagerie cérébrale non invasive sur souris anesthésiée, par résonance magnétique nucléaire pour identifier des altérations morphologiques et du métabolisme cérébral et enfin par des techniques d’analyses post-mortem variées).
Bénéfices attendus
Cette analyse préclinique va permettre de confirmer les effets bénéfiques d’une thérapie génique et pharmacologique sur les altérations comportementales typiques de la maladie de Huntington mais rarement étudiées dans les protocoles précliniques. De plus, l’analyse par une méthode non-invasive par imagerie cérébrale va permettre d’évaluer l’effet de ces approches thérapeutiques sur un ensemble de paramètres fonctionnels pertinents pour une future étude clinique. Enfin une meilleure compréhension du rôle des astrocytes, des partenaires essentiels aux neurones, permettra de mieux comprendre les effets intracérébraux de ces thérapies et d’affiner leur utilisation clinique.
Procédures
Certaines souris seront soumises à une injection unique intracérébrales sous anesthésie et analgésie pendant environ 30 min, puis à des tests comportementaux étalés sur plusieurs jours avec au moins 2 jours de repos entre chaque tests, qui visent à évaluer les capacités motrices, la sociabilité, la vocalisation, l’anxiété et l’anhédonie des souris. Chacun de ces tests durent moins de 30 min par souris, sauf la cage d’activité qui permet de suivre le comportement spontané de la souris dans une cage dédiée pendant 24h. Certaines souris auront aussi deux sessions d’imagerie cérébrale sous anesthésie (moins de 2h30/souris). Certaines souris recevront à des injections intracérébrales sous anesthésie et analgésie de 30 min, puis une injection retro-orbitaire 6 mois plus tard, sous anesthésie gazeuse, pendant 5 min. D’autres souris recevront des gavages en contention pendant 1 min, 3 fois par semaine pendant 4 mois. souris seront habituées à l’expérimentateur et à la contention avant de démarrer les gavages.
Impact sur les animaux
Très peu d’effets indésirables sont attendus sur les animaux utilisés dans ce protocole à part la douleur lors des chirurgies intracérébrales, le stress lié à la contention lors du gavage et à la manipulation lors des tests comportementaux.
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés par des méthodes adaptées et validées, pour la réalisation d’une analyse post mortem complète des tissus.
Remplacement
Ce projet est basé sur des résultats obtenus in vitro qui ont mis en évidence les effets bénéfiques de la modulation du métabolisme du cholestérol dans le contexte de la maladie de Huntington. Le cerveau est un organe complexe dans lequel interviennent de nombreuses interactions entre neurones et différentes cellules, dont les astrocytes. Ces interactions qui sont très probablement à la base des effets thérapeutiques ne sont pour le moment pas fidèlement reproduites dans des modèles in vitro ou in silico, ce qui nécessite l’utilisation de modèles animaux. En particulier, il existe des souris transgéniques modèles de la maladie de Huntington qui ont la mutation génétique responsable de cette maladie et permettent d’étudier les neurones et les astrocytes dans leur environnement cérébral. Ces souris modèles ont également l’avantage de permettre d’évaluer des symptômes cliniques très importants de la maladie de Huntington : les altérations comportementales (ex. atteintes motrices, anxiété), les déficits métaboliques et les altérations des connections cérébrales, ainsi que leur potentielle restauration par nos stratégies thérapeutiques.
Réduction
Le projet prévoit au maximum 370 souris. Le nombre d’animaux dans chacun des groupes expérimentaux sera réduit au minimum nécessaire permettant une interprétation statistique fiable des résultats. Plusieurs paramètres sont mesurés sur les mêmes souris. Par exemple, les mêmes souris auront une évaluation extensive de leur comportement ainsi qu’une analyse de plusieurs paramètres par imagerie et pour finir une analyse histologique complète du cerveau avec quantification d’une dizaine de paramètres/souris. Ceci permet d’exploiter au mieux les informations biologiques de chaque souris, et de réduire le nombre total d’animaux utilisés, selon le principe des 3R.
Raffinement
Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation, permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. La gestion de la douleur et de l’inconfort liée aux procédures expérimentales mettra en œuvre des méthodes d’anesthésie et d’analgésie pré- et post-opératoire, un soutien nutritionnel et thermique, ainsi qu’un suivi clinique post-opératoire incluant la prolongation des traitements analgésiques si besoin. L’habituation des souris à l’expérimentateur avant les sessions de tests comportementaux et l’habituation à la contention permet de réduire le stress des souris. Un soutien thermique sera mis en place lors des chirurgies et sessions d’imagerie.
Choix des espèces
Les souris modèles de la maladie de Huntington permettent d’étudier les cellules cérébrales (neurones, astrocytes…) in situ, dans un contexte génétique permettant le développement de la maladie de Huntington. Ces souris présentent des altérations moléculaires, cellulaires et comportementales caractéristiques de la maladie de Huntington. Les souris seront injectées à l’âge de 4 mois et seront analysées entre 7 et 12 mois en fonction du décours des symptômes analysés. La MH est une maladie qui se déclare chez l’adulte. Les souris seront injectées à l’âge de 4 mois et seront analysées entre 7 et 12 mois en fonction du décours des symptômes analysés.
Impact de l’invalidation du gène Jarid2 sur la lymphomagenèse NKT chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
411 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est génétiquement modifiée et suivie jusqu'au développement de lymphomes, une autre reçoit une injection de cellules de lymphome puis des anticorps, avant la mise à mort pour étudier le rôle du gène Jarid2. Le porteur indique que les lymphomes provoquent de gros ganglions et une augmentation de la rate et du foie, la mise à mort intervenant à la palpation d'une hépatosplénomégalie ou à 20 % de perte de poids. Il affirme que ce cancer exige un microenvironnement complet et que les modèles génétiques ne sont disponibles que chez la souris.
Objectifs
Il a été décrit ces dernières années une nouvelle entité de lymphome, à la fois chez la souris et chez l'homme, dont la cellule d'origine est un lymphocyte T non conventionnelle appelé lymphocyte NKT. Afin de comprendre les mécanismes impliqués dans ce cancer, des études du génome c'est à dire au niveau de l'ADN, ont été réalisées sur les lymphomes générés chez la souris et ont mis en évidence des altérations du gène Jarid2. Ce gène est particulièrement intéressant car son implication dans la biologie des lymphocytes NKT normaux a déjà été décrit. Ces résultats suggèrent que ce gène pourrait jouer un rôle essentiel dans les mécanismes à l'origine de ce cancer. L'objectif de ce projet est donc d'étudier chez la souris l'impact de l'invalidation du gène Jarid2 sur la survenue de ces cancers et d'identifier de potentielles voies thérapeutiques qui pourront être testées dans ces modèles de souris.
Bénéfices attendus
Les mécanismes moléculaires associés à ces lymphomes sont encore mal connus et la mise en évidence d'un gène responsable de ce cancer peut constituer une nouvelle approche thérapeutique pour des patients dont la survie à 5 ans ne dépasse actuellement pas 30% et pour lequel les solutions thérapeutiques sont mimines.
Procédures
Génération d'une nouvelle lignée par croisement de souris avec différentes modifications génétiques puis observation des souris afin de mettre en évidence le dévelopement de rares lymphomes. Injection unique de cellules de lymphome par voie intraveineuse après anesthésie (durée de quelques secondes). Injections répétées d'anticorps 1 jour sur deux pendant 2 semaines par voie intrapéritonéale (durée de quelques secondes).
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables seront associés au développement de tumeur et en particulier de lymphome qui se caractèrisent par des adénopathies (gros ganglions) ou des hépato-splénomégalie (grosse rate, gros foie). Cependant, les nuisances de ces souris seront modérées car les points limites mis en place permettront de mettre à mort la souris dès les premiers signes de souffrance. Suite aux transferts de lymphomes aux souris C57BL/6, celles-ci vont développer assez rapidement (de 30 à 60 jours post-transfert) des lymphomes NKT. Les nuisances seront alors modérées car les points limites mis en place permettront de mettre à mort la souris au premier signe de souffrance. L'injection des cellules de lymphomes préalablement congelées dans des souris receveuses syngéniques C57BL/6 n'entrainera qu'une nuisance légère. L'injection des anticorps bloquants anti-ICOS se fera sur animaux vigiles par voie intrapéritonéale et n'entrainera qu'une nuisance légère.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort soit parce qu'elles développent une pathologie soit en raison d'un vieillissement avancé. Pour les expériences de transfert de lymphome, toutes les souris seront mises à mort car elles auront toutes été transférées avec des cellules de lymphome NKT et développeront donc toutes une lymphome.
Remplacement
Les objectifs du projet ne peuvent pas être réalisés en faisant des expériences alternatives in vitro car le développement des lymphomes NKT nécessite la présence d’un microenvironnement qui joue un rôle clef dans le développement et le maintien du lymphome. Aussi les invalidations génétiques nécessaires à ce projet ne sont disponibles que chez la souris, justifiant le développement de ces modèles chez la souris.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à l’expérimentation nous allons : 1- mutualiser au sein de l’équipe les ressources cellulaires post-mortem en congelant le maximum de cellules et de morceaux d'organes afin que ceux-ci soient exploités pour diverses études in vitro sur ces lymphomes et ainsi éviter l'utilisation itérative de souris. 2- effectuer une étude statistique descriptive qui déterminera les différences qualitatives et quantitatives entre les groupes des souris. Cela permettra d’éviter la répétition de l’expérience et de réduire au minimum l’utilisation des animaux.
Raffinement
Pour réduire au minimum la douleur associée aux lymphomes, des points limites prédictifs pour limiter les souffrances seront mise en place. La mise à mort sera pratiquée lorsque l'un des points limites suivants sera atteint : mise en évidence d'une hépatosplénomégalie par palpation de l'abdomen des souris, réduction de l’activité (prostration), poil hérissé et dos vouté. Dans le cadre des premiers travaux, la plupart des souris ne développeront pas de lymphome et un grand nombre d'entre elles vont entrer dans un processus de vieillissement avancé. Au delà de 15 mois, ces souris seront donc surveillées 3 fois par semaine avec prise de poids et prise de température. Dès qu'une perte de poids de 10% sera constatée, il sera ajouté de la gelée et des croquettes mouillées dans la cage. Si une perte de poids de 20% est constatée, la souris sera immédiatement mise à mort. Pour les souris ayant une température entre 34 et 36°C, placer les souris dans une enceinte chauffante pendant 48h. En dessous de 34°C, l’animal devra être mis à mort.
Choix des espèces
La souris est une espèce animale de choix pour étudier l'impact de l'invalidation d'un gène sur le développement de lymphome. En effet, nous disposons chez cette espèce des souris pour lesquelles le gène Jarid2 a été invalidé. D'autre part, le modèle de lymphome étudié a été développé chez la souris p53KO et le croisement de ces souris p53KO avec les souris invalidées par Jarid2 permettra de comprendre le rôle de ce gène dans le développement de ce cancer. Les souris seront générées par croisement au sein de notre établissement utilisateur et seront suivis jusqu'à la mise à mort des souris lorsque les points limites seront atteints. Pour les expériences de transfert, les souris receveuses seront commandées à l'âge de 6 à 7 semaines et seront utilisées à l'âge de 8 à 12 semaines correspondant à l'âge adulte de ces souris. L'utilisation de souris adultes est justifiée par le besoin d'avoir des souris receveuses ayant un système immunitaire mature.
Caractérisation des cellules d’origine d’un cancer pédiatrique musculaire dans un modèle souris.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une greffe de cellules dans la patte sous anesthésie, puis un suivi hebdomadaire de la tumeur et de la prise de poids, avant la mise à mort pour analyser les tumeurs. Le porteur indique que le développement tumoral peut provoquer une douleur modérée et que les mesures sur animal vigile causent un stress léger. Il présente le projet comme un moyen de déterminer l'origine cellulaire d'un cancer pédiatrique et affirme que le modèle murin est "nécessaire" pour tenir compte des facteurs physiologiques absents des études in vitro.
Objectifs
Les cancers touchent chaque année plus de 2500 enfants en France. On estime qu’un enfant sur 440 sera atteint par un cancer avant l’âge de 15 ans. Malgré des essais cliniques internationaux, leur taux de survie ne s’améliore plus depuis 20 ans. Il est donc indispensable de mieux comprendre leurs particularités moléculaires pour développer des traitements plus efficaces et moins toxiques. Ce projet a pour objectif de déterminer si des cancers du muscle fréquemment observés chez les enfants et les adolescents peuvent dériver non pas seulement de la transformation de cellules du muscle mais aussi d’une autre population de cellules neuronales. Cette question est importante, car la réponse aux chimiothérapies peut varier en fonction de la cellule à l’origine des tumeurs. Il a été montré que lorsqu’on exprime des gènes mutés chez les patients atteints par ces cancers du muscle dans les cellules neuronales, celles-ci prolifèrent et expriment des marqueurs de ces cancers. Il faut maintenant vérifier que les cellules neuronales transformées donnent des tumeurs dans les muscles. Ce projet permettra de fournir de nouvelles pistes pour comprendre l’origine de ces cancers et améliorer leur traitement.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de déterminer si un type de cellules embryonnaires peut être l’origine de certains cancers pédiatriques afin d'améliorer leur prise en charge thérapeutique.
Procédures
Injection anti-douleur / analgésie avant la greffe (Nombre : 1 fois maxi - Durée : 30 s). Anesthésie lors de la greffe (Nombre : 1 fois au moment de la greffe tumorale - Durée : 5 min) Pesée en début de procédure puis 1 fois par semaine (Nombre : 8 fois maxi - Durée : 30 s). Mesure de l’épaisseur de la patte greffée et de la patte controlatérale avant la greffe puis 1 fois par semaine (Nombre : 8 fois maxi - Durée : 1 min).
Impact sur les animaux
Avant l’implantation intra-musculaire (IM), l’injection en sous-cutanée d’un anti-douleur engendre une douleur légère. L’implantation IM sous anesthésie quant à elle entraine une douleur légère. Le suivi de la prise tumorale va engendrer un stress léger lors de la mesure de l’épaisseur de la patte greffée et de la patte car ces mesures sont réalisées sur animaux vigiles. Le développement de tumeurs peut engendrer une douleur modérée. L’administration de doxycycline dans l’eau de boisson n’est pas connue pour entrainer de nuisances. En effet, la consommation de l'eau de boisson des souris sera évaluée (moyenne sur 3 jours pendant l'acclimatation) puis après l'ajout de la doxycycline pour évaluer si la consommation d'eau des animaux est réduite.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort si aucune prise tumorale n’est observée ou si un point limite est atteient ou pour effectuer des analyses sur les tumeurs.
Remplacement
Des analyses d'expressions de gènes ont montré que certains rhabdomyosarcomes partageaient des similitudes avec les cellules neuronales. Le modèle animal est le seul permettant de prendre en compte de nombreux facteurs physiologiques susceptibles d'intervenir dans le potentiel tumorigénique de ces lignées cellulaires embryonnaires. Des études in vitro précedemment réalisées ne permettent pas de répondre aux objectifs.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des études précédentes ont permis de sélectionner les mutations d’intérêt. D’après les données de la littérature et notre expérience, le taux de prise de greffe sera de minimum 50%. Ces données ont été prises en compte afin d’utiliser le nombre minimum d’animaux permettant de s’assurer de la reproductibilité et de réaliser une analyse statistique des résultats. De plus, les procédures prévues dans ce projet sont séquentielles, ce qui permettra de réduire au maximum le nombre de souris impliquées dans le projet.
Raffinement
Au cours de ce projet, les précautions seront prises pour stresser au minimum l’animal. Dès leur arrivée, les souris seront hébergées par groupe de 5 animaux par cage. Une période d’acclimatation sera respectée avant l’entrée des animaux dans l’une des procédures présentées ci-après. L'administration d’antidouleur, d'anesthésique, un suivi adapté des animaux et la définition précise des points limites précoces et prédictifs d'un mal être, permettent de limiter au maximum la souffrance animale. Post greffe, de la nourriture humidifiée sera ajoutée au fond de la cage au cas où les animaux présenteraient des difficultés à se déplacer.
Choix des espèces
L’utilisation de ce modèle souris est nécessaire pour étudier le potentiel tumoral des cellules embryonnaires modifiées car ces dernières sont issues du même modèle murin, permettant de s’affranchir du risque de rejet de greffe par le système immunitaire. Les rhabdomyosarcomes sont des tumeurs pédiatriques rares, pour lesquelles un sexe-ratio Mâle/Femelle légèrement supérieur à 1 a été rapporté. Toutefois, très variable selon les études, l’âge et la localisation des tumeurs primaires. Par conséquent, nous utiliserons des souris mâles et femelles dans cette procédure afin de ne pas introduire de biais lié au sexe. Les greffes seront réalisées sur des souris de 6 semaines pour une réalisation optimale de l’expérience. En effet à cet âge, d'après la littérature, la prise de greffe est optimale.
Evaluation de la tolérabilité d’un candidat médicament chez le rongeur.
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 750
750 souris et 750 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un candidat médicament leur est administré par différentes voies, dont une injection dans le cerveau après chirurgie sous anesthésie, avec des prélèvements de sang, un isolement après opération et un jeûne de dix-huit à vingt heures. Le porteur indique s'attendre à des effets secondaires liés à la molécule testée et justifie la mise à mort par des prélèvements d'organes incompatibles avec la survie. Il affirme que l'animal est un "passage obligatoire" avant toute administration à l'humain et qu'aucune méthode de substitution n'est suffisante.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'évaluer la tolérabilité de futurs candidats médicaments après leur administration chez le rongeur (rat et souris). Dans le cadre de développement de nouveaux candidats médicaments, une modification de la formulation, de la voie d'administration ou un ajustement de la dose thérapeutique peut amener à étudier les effets sur l'état général de l'animal ou les effets uniquement en local vis à vis du composé dans ces nouvelles conditions. Le projet consiste donc à évaluer sur un petit groupe d'animaux ces effets avant de continuer sur une étude avec un nombre plus grand d'animaux. Après administration du composé, une observation régulière des animaux sera réalisée grâce à un outil de surveillance spécifique (par exemple observations du comportement, des réflexes, de la température) à chaque espèce utilisée.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Suivant la cible thérapeutique, ce composé pourrait avoir aussi une application en médecine vétérinaire.
Procédures
Afin d'administrer les candidats médicament aux animaux, différentes voies d'administration pourront être utilisées (2 minutes ou moins). Pour réaliser l'administration du produit dans le cerveau, les animaux pourront être soumis à une anesthésie et une chirurgie sous anesthésie (45 minutes), des administrations d'anti-douleur (jusqu'à 5 administrations, moins de 30 secondes pour chaque administration), des prélèvements de sang sur animaux vigiles (2 minutes) ou anesthésiés (environ 5 minutes).
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une injection du candidat médicament par différentes voies d'administration. Les animaux seront anesthésiés pour réaliser l'injection des candidats médicaments dans le cerveau et ils recevront jusqu'à 5 injections d'anti-douleur. Selon le mécanisme d'action de la/des substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet, on s'attend à observer des effets secondaires qui disparaitront une fois que la substance sera éliminée par l'organisme. Egalement, les animaux pourront être isolés dès après la chirurgie, jusqu'à la fin de l'étude pour les souris, et jusqu'à la cicatrisation avancée des plaies pour les rats. Les animaux pourront également être mis à jeun pour une période de 18-20h avec complémentation en glucose ou non.
Devenir
Sacrifice des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur l'organisme. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat et la souris sont les espèces qui sont la plus adaptées à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences. Une analyse statistique pourra éventuellement être envisagée et sera adaptée au modèle.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuels signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont parmi les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer la tolérabilité d'un candidat médicament. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Régénération de cellules productrices d’insuline chez la souris à partir des cellules gastrointestinales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Rendues diabétiques par la streptozotocine, ces souris immunodéficientes subissent une à deux chirurgies de greffe d'organoïdes intestinaux, des injections répétées et des prélèvements de sang pour suivre la glycémie, avant la mise à mort pour examiner les greffons. Le porteur indique un risque d'infection et de détresse après chirurgie et une hyperglycémie pouvant être mortelle si elle est trop élevée. Il affirme que le diabète s'exprime à l'échelle de l'"organisme" entier et que son étude sur l'animal "ne peut être remplacée".
Objectifs
Le pancréas joue un rôle clé dans l'homéostasie nutritionnelle. Il contient des cellules exocrines et endocrines (îlots de Langerhans). Ces îlots se composent majoritairement de cellules α et β synthétisant respectivement les hormones glucagon et insuline, responsables de la régulation de la glycémie. Notre recherche se concentre sur le diabète de type 1, une maladie caractérisée par la perte sélective des cellules β. Sans traitement, cette condition peut avoir de graves complications telles que des dommages vasculaires. Le seul traitement efficace est la supplémentation en insuline exogène. Cependant des facteurs environnementaux peuvent provoquer de fortes variations de la glycémie malgré un traitement à l’insuline, et donc éventuellement conduire aux complications mentionnées. Nos travaux s’intéressent à la régénération des cellules β. Nous avons montré que la surexpression du gène Pax4 dans les cellules α résulte en leur régénération et conversion en cellules « β-like », capables de « soigner » un diabète chez la souris. Il est intéressant de noter qu'une telle conversion est aussi visible dans le tractus gastrointestinal (TGI). Cependant, il est difficile de savoir si les effets observés sur la glycémie sont causés par la contribution du TGI ou pancréatique. Pour solutionner ce problème, nous proposons de réaliser des expériences de transplantation (et transplantectomie) d’organoïdes gastrointestinaux dans un modèle murin diabétique afin d’étudier spécifiquement la fonctionnalité des cellules « β-like » gastrointestinales. Les organoïdes sont des micro-tissus multicellulaires en trois dimensions, dérivés de cellules souches et conçus pour imiter la structure et la fonctionnalité des organes. Nous utiliserons 144 souris pour l’ensemble de ce projet en accordant une attention particulière à l’application stricte de la règle des 3R : Remplacement : Le diabète résulte de l’intégration de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée. Réduction : Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible. L’application de tests statistiques (G power) nous a permis de réduire le nombre d’animaux au minimum. Raffinement : Nous utiliserons une grille de score permettant de mesurer les éventuelles souffrances avec des points limites précoces et adaptés. Des dispositions (habituation) sont prises pour minimiser tout stress aux animaux, ceux-ci étant hébergés dans un environnement enrichi et en groupes sociaux.
Bénéfices attendus
Le but de ces travaux est de démontrer in-vivo la fonctionnalité des cellules « β-like » gastrointestinales et de mettre en lumière le potentiel des cellules endocrines du tractus gastrointestinal à constituer une source renouvelable de cellules β après reprogrammation pour restaurer la masse des cellules β chez les patients diabétiques de type 1.
Procédures
Des transplantations/transplantectomies d’organoïdes gastrointestinaux sont prévues (durée de l’intervention : ~20 min/animal, 1 ou 2 interventions espacées de 10 semaines, en fonction du groupe), nécessitant une mise à jeun de 5 heures avant la chirurgie et une anesthésie (durée totale de l’anesthésie : 30 min, 1 ou 2 interventions espacées de 10 semaines, en fonction du groupe). Les animaux recevront des injections quotidiennes (3 jours/semaine pendant 9 semaines, durée de l’intervention : ~5 s). Des prélèvements sont prévus pour suivre la glycémie des animaux (1 fois par semaine pendant 10 semaines, 1 goutte de sang, durée du prélèvement : ~10 s). En fin d'expérience, il sera réalisé un test nécessitant une mise à jeun de 5 heures puis une injection d’un produit augmentant transitoirement la glycémie (durée de l’intervention : ~5 s) suivie de 6 prélèvements d’une très faible quantité de sang à la queue (classiquement, l'expérimentateur fait perler le sang et 6 "perles" sont ainsi utilisées pour lectures de glycémie, durée d'un prélèvement : 10 s) à des intervalles de temps de plus en plus longs (entre 15 et 120 min).
Impact sur les animaux
Des transplantations/transplantectomies d’organoïdes gastrointestinaux sont prévues. Les animaux peuvent éventuellement développer une infection ou montrer des signes de douleur ou de détresse à la suite de la chirurgie. Le traitement à la streptozotocine va entrainer une hyperglycémie (qui peut s’avérer létale si elle est trop élevée). Pour ce projet, les animaux vont développer un diabète très modéré (hyperglycémie ne dépassant pas les 350 mg/dL). Concernant le traitement au tamoxifène, aucune douleur n’est escomptée. Cependant un léger gonflement des testicules peut être observer à forte dose. Cet effet indésirable, qui plus est indolore, n’altère en rien la fertilité et le comportement des animaux. Enfin, des prélèvements et injections sont prévus, et peuvent éventuellement être source de désagréments pour les animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour examen post-mortem des organes et des greffons en particulier.
Remplacement
Le diabète est une maladie d’origine multifactorielle (y compris environnementale). De plus, cette pathologie s’exprime à l’échelle d’un organisme et fait donc intervenir tous les organes susceptibles de stocker ou consommer du glucose (la plupart des organes). Ainsi, son apparition et sa gravité résultent de l’intégration de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée. De plus, nos résultats préliminaires obtenus ex-vivo sur des organoïdes gastrointestinaux sont très encourageants et justifient le développement de la partie in-vivo de ce projet.
Réduction
Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible. L’application de tests statistiques (G power sur des lots d'animaux précédant - puissance : 0,8 - p
Raffinement
Un anesthésique (isoflurane, 2L/min avec 2% O2) sera utilisé pour réduire le stress et angoisse chez l'animal et pour rendre l'anesthésie plus stable. Avant l'anesthésie, un analgésique (méloxicam, 2 mg/kg) sera administré afin de prévenir les sensations de douleur pendant et après la chirurgie. Durant toute la procédure, les animaux seront suivis en s’appuyant sur une grille de score permettant d’évaluer et d’objectiver les éventuelles souffrances, et de mettre en œuvre des points limites précoces et adaptés. La bonne santé ou la souffrance des animaux seront observées selon des grilles d'évaluations indiquées ci-dessous et en annexe. En amont de chaque procédure, des dispositions (habituation) sont prises pour minimiser tout stress aux animaux. Les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnent enrichi (maisonnettes, buchettes), en groupes sociaux et en accord avec la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
Ce projet a pour but de déterminer la fonctionnalité des cellules « β-like » gastrointestinales induites par l’expression du gène Pax4 dans un système biologique intégré. La souris correspond au meilleur compromis pour suivre sur le long terme le devenir de organoïdes transplantés. En effet, la souris est très proche de l’homme pour ce qui est des mécanismes de régulation de la glycémie/du nombre de cellules β. Nous utiliserons des animaux immunodéficients NSG âgés de 10 et 20 semaines. Des âges correspondant au stade adulte, un stade sélectionné comme le meilleur compromis. En effet, les souris sont alors considérées comme adultes et ne sont plus soumises aux conséquences métaboliques du sevrage. Elles sont donc obtenues rapidement et ne sont pas considérées comme trop âgées. De plus, nous avons choisi de travailler sur deux âges différents afin de déterminer si l’âge/le vieillissement pourraient impacter la régénération des cellules gastrointestinales.
Modification spécifique du microbiote intestinal pour lutter contre l’inflammation du myocarde
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
4 307 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va de léger à sévère. Elles reçoivent par gavage des bactéries intestinales et des injections de cellules immunitaires, avec des prélèvements répétés de sang et de fèces, pour tester une technique visant à bloquer un mimétisme moléculaire lié à une myocardite. Le porteur indique que le modèle de myocardite devient progressivement mortel et que, sur vingt semaines, jusqu'à la moitié des souris succomberaient ou seraient mises à mort, période qu'il prévoit de ramener à douze semaines. Il affirme que la complexité du microbiote et du système immunitaire ne peut être reproduite in vitro et qu'un modèle murin est "nécessaire".
Objectifs
Les maladies auto-immunes sont des maladies chroniques déclenchées par la perte de tolérance immunologique de l’organisme face à ses propres constituants. Dans leur grande majorité, ces dysfonctionnements du système immunitaire sont multifactoriels, compliquant de fait la détermination de l’origine exacte. Différents facteurs, tels que les facteurs génétiques, endogènes, exogènes et/ou environnementaux peuvent ainsi conduire ce dernier à s’attaquer aux constituants du soi. Notre susceptibilité à développer des maladies auto-immunes découlerait de l’exposition de notre système immunitaire aux micro-organismes viraux ou bactériens. L’une des théories est celle du mimétisme moléculaire. Celle-ci repose sur l’idée que les antigènes exposés par des micro-organismes puissent présenter des similitudes structurelles avec les antigènes du soi, ce qui induirait une réaction immunitaire chronique. Dans ce projet, nous nous intéressons au mimétisme moléculaire impliqué chez certains patients souffrant d’une myocardite inflammatoire. Une étude récente a démontré l’existence d’un mimétisme moléculaire entre un peptide de la myosine et celui d’une bactérie commensale du tractus gastro intestinal. Ce mimétisme peut causer ou aggraver la situation chez les patients souffrant de myocardite. Cette bactérie est une bactérie commensale retrouvée chez environ 80% de la population mondiale. Cette bactérie occupe de nombreuses fonctions indispensables pour notre santé, telle que l’absorption des fibres non digestibles de l’alimentation. Dans ce projet, nous avons pour ambition de développer une technologie nous permettant d’inhiber le mimétisme moléculaire de notre bactérie d’intérêt sans pour autant altérer sa présence dans l’intestin. En effet, au contraire des antibiotiques, notre technologie nous permettra de soulager les patients souffrant de myocardite sans pour autant impacter l’intégrité du microbiote intestinal. La réussite de ce projet ouvrira de nombreuses portes dans le développement thérapeutique de demain avec notamment le développement de traitements spécifiques contre toutes les pathologies auto-immunes déclenchées ou aggravées par ce phénomène de mimétisme bactérien.
Bénéfices attendus
Le mimétisme bactérien fait l’état d’une attention toute particulière ces dernières années. En effet, de nombreux laboratoires se sont lancés dans la compréhension des intéractions entre les maladies auto-immunes et le mimétisme bactérien de résidents du microbiote intestinal, afin de cibler spécifiquement cette communication dynamique pour le développement de nouvelle stratégie thérapeutique. Dans notre étude, nous nous intéressons au mimétisme moléculaire d’une espèce commensale du microbiote intestinal, présente chez environ 80% de la population humaine mondiale et qui pourrait avoir un impact important sur le développement et l’aggravation de la myocardite inflammatoire. À notre connaissance, aucun traitement efficace n’a été développé pour soigner ces patients. Ce projet servira non seulement à démontrer la puissance et la spécificité des stratégies développées dans un environnement aussi complexe que l’intestin de mammifère, mais permettra également de mieux appréhender les intéractions entre les bactéries de l’espèce B. theta et le système immunitaire de l'hôte. Par ailleurs, nous développerons un modèle de transfert de matériel fécal humain chez la souris. Notre étude permettra également d’en apprendre plus sur ce nouveau modèle au vu d’un développement futur. En effet, ce modèle murin à flore humanisée correspond aux conditions les plus proches de celles retrouvées chez l’Homme. Pour finir, le bénéfice ultime de ce projet concerne les patients souffrant de myocardite inflammatoire. A l'issue des 5 ans d’expérimentation, nous espérons acquérir des connaissances solides sur le développement d’une stratégie de traitement efficace pour lutter contre la survenue et l’évolution de cette maladie en forme grave. Cette preuve de principe ouvrira le chemin à de nombreuses applications de traitement contre d‘autres maladies auto-immunes liées au mimétisme bactérien.
Procédures
Dans ce protocole, les animaux recevront un gavage oral de quelques secondes avec des souches bactériennes. Celui-ci sera effectué à l’aide d’une canule souple adaptée à une utilisation chez la souris par un manipulateur expérimenté à cette technique. Des prélèvements de sang de quelques secondes seront effectués sur certains animaux de ce protocole à la fréquence d’une fois par mois pendant 3 mois. Des prélèvements de fèces seront également réalisés de façon non invasive sur nos animaux durant toute la durée des procédures de ce protocole (maximum 5 fois par semaine pendant 1 mois, puis 1 fois par semaine pendant 2 mois). L’injection intraveineuse de cellules immunitaires sera effectuée une fois dans la vie de certains animaux, pendant quelques secondes. L’ensemble de ces gestes seront effectués par des manipulateurs expérimentés à ces techniques.
Impact sur les animaux
Nos souches bactériennes d’intérêt ne sont pas des pathogènes murins et ne devraient déclencher aucun symptôme à elles seules dans le modèle d’intérêt. Un léger stress est attendu lors du gavage des animaux, mais la présence de praticiens expérimentés réduira ce stress au minimum. Les souris génétiquement modifiées d’intérêt vont-elles développer des symptômes d'inflammation après injection des cellules immunitaires reconnaissant la bactérie d’intérêt. Aucun symptôme n’est attendu en l’absence de cette bactérie. D’après la littérature, l’inflammation attendue se limitera à une augmentation des cytokines inflammatoires dans le sang, et une infiltration de cellules immunitaires sans avoir d’atteintes physiques sur les animaux. Enfin, le modèle de myocardite inflammatoire devrait entrainer une activation de ces cellules immunitaires et une inflammation chronique, en particulier au niveau du cœur. Après 6-8 semaines de colonisation, ce phénotype devient progressivement létal; après 20 semaines de colonisation, jusqu’à 50% des animaux succomberont ou seront mis à morts (données issues de la littérature). Nous prévoyons de réduire la période d’observation à 12 semaines, ce qui est le minimum requis pour obtenir des données exploitables. Dans tous les cas, ces souris seront surveillées de très près, et les points limites décrits dans les procédures correspondantes seront appliqués.
Devenir
Tous les animaux étant soit génétiquement modifiés soit colonisés par une bactérie (ou les deux), ils seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Dans un but de remplacement, une partie de notre étude se base sur des expériences préliminaires avec des cellules immunitaires en culture que l’on a stimulées en présence de différents peptides candidats pour être ‘non immunogènes'. Cependant, les résultats obtenus avec des cellules isolées ne sont pas représentatifs de la complexité du système immunitaire et des interactions qui peuvent avoir lieu dans un milieu structuré tel qu'un organisme vivant. De plus, les interactions entre membres du microbiote intestinal ne peuvent pas être totalement reproduites in vitro; or ces interactions sont primordiales pour évaluer l’efficacité de nos approches thérapeutiques, qui doivent pouvoir atteindre les bactéries cibles dans un contexte anatomique précis (survie des traitements dans le tractus gastro-intestinal, bactéries dans le lumen vs mucus du côlon, etc).
Réduction
Afin de réduire autant que possible le nombre d'animaux utilisés, une même expérience pourra être mise en place de manière à pouvoir répondre à plus d'une question scientifique en utilisant un même lot d’animaux. En amont de la phase d'expérimentation animale, nous avons comparé une collection de peptides candidats pour leur capacité à ne pas déclencher une activité dans des lymphocytes T répondants . Basés sur cette expérience, nous avons pré-sélectionné les meilleurs candidats pour ne pas avoir à comparer un trop grand nombre de peptides chez l’animal. De plus, nous allons vérifier la colonisation bactérienne dans l’intestin des animaux au cours de l’expérience à partir du matériel fécal; ce type de stratégie non invasive, que nous avons déjà mis en place dans le passé, nous permettra de réduire le nombre d’animaux à sacrifier sans perte de connaissance essentielle pour le développement et l'interprétation de nos expérimentations. En outre, pour investiguer la réduction de symptômes après traitement, nous avons choisi un modèle qui présente une très haute pénétrance dans le développement de la pathologie, afin d’optimiserle condtions expérimentales en réduisant le nombre d’animaux utilisés. L’utilisation de tests statistiques (t-test, Mann Whitney et ANOVA), et la consultation au besoin de biostatisticiens tout au long des séries d’expérimentation nous permettra de réduire au maximum le nombre d’animaux à utiliser tout en garantissant la qualité et la reproductibilité des résultats.
Raffinement
Dans un souci de raffinement, les animaux ne seront jamais laissés seuls dans une cage pour faciliter les intéractions sociales. Les souris seront manipulées avant le début des expériences afin de les habituer et leur enlever un maximum de stress en début d’expérimentation. Les modèles animaux sont choisis avec soin en fonction de l’état actuel des connaissances ainsi que la finalité recherchée. Les procédures sélectionnées ont été préalablement étudiées pour réduire au maximum la souffrance animale. Ainsi, nous donnons une préférence aux procédures non invasives. Certaines mises seront effectuées autant que possible sur des animaux/modèles ne présentant pas de symptômes de pathologie, afin de minimiser le nombre d’animaux concernés par une procédure sévère. Les points limites établis préalablement seront bien évidemment respectés, et raffinés en fonction des résultats des premières expériences. Des tests statistiques seront utilisés tout au long du projet pour réajuster le nombre d’animaux en fonction des résultats obtenus. Dans le but de vérifier le niveau d’anxiété des animaux axéniques inoculés avec un microbiote, nous réaliserons un contrôle des expressions faciales. Aussi, dans le cadre de la seule procédure sévère de ce protocole, les animaux souffrant de déshydratation recevront une injection sous-cutanée d’une solution saline à 37°C.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous effectuerons au préalable des tests d’activités in vitro en conditions reflétant au maximum la réponse immunitaire des cellules T aux peptides candidats afin de sélectionner uniquement les meilleurs pour nos expériences chez l’animal. Cependant, un modèle qui mime les symptômes et qui nous permettra de quantifier l'efficacité de notre traitement est nécessaire; un tel modèle n’existe à notre connaissance que chez la souris, où il a déjà été développé par un chercheur expert de ce champ de recherche. De plus, il existe une version de ce modèle avec des symptômes beaucoup moins sévères, également en souris, ce qui nous permettra de répondre à de nombreuses questions scientifiques avant l’utilisation du modèle le plus symptomatique en fin de projet. Nous utiliserons dans ce projet des animaux jeunes adultes, entre 5 et 9 semaines, afin de laisser la flore intestinale se stabiliser post-sevrage avant notre intervention.
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 150
300 rongeurs, 150 souris et 150 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés d'une séance à l'autre. Les animaux sont utilisés lors de travaux pratiques où des stagiaires apprennent la préhension, la contention, les injections sous-cutanées et intra-gastriques et la surveillance sous anesthésie gazeuse. Le porteur indique une douleur légère liée aux injections et un stress de manipulation, les gestes étant d'abord répétés sur mannequins et cadavres. Il présente cette formation réglementaire à l'expérimentation comme "indispensable" et met en avant la sensibilisation au "bien-être" des animaux non-humains.
Objectifs
Notre formation a pour vocation à former des personnels à la manipulation et la réalisation de procédures expérimentales sur animaux de laboratoire. Cette formation est ouverte aux techniciens des laboratoires publics et privés dans le cadre de la formation continue, ainsi qu’à des étudiants en cursus initial de licence professionnelle. Ce type de formation réglementaire à l’expérimentation animale doit permettre l’acquisition de compétences théoriques et pratiques permettant la manipulation d’animaux dans le respect de leur bien-être. Au cours d’une procédure, le technicien doit ainsi être en mesure d’évaluer le degré de mal-être causé à l’animal et d'adapter ses pratiques afin de prévenir et de limiter ce mal-être au maximum. Cela nécessite un apprentissage, réalisé durant plusieurs séances de travaux pratiques. Les objectifs pédagogiques de ces travaux pratiques sont multiples : familiarisation des stagiaires avec les animaux et sensibilisation au respect du bien-être animal ; apprentissage des règles d’hygiène et de sécurité propres à la pratique de l’expérimentation animale ; apprentissage des calculs de dilution et de dose à injecter, connaissance du matériel nécessaire aux injections et aux prélèvements, préparation de ce matériel, notions d’asepsie ; acquisition des compétences techniques de préhension, contention et d'injections (sous-cutanée, intra-gastrique) ; acquisition de connaissances théoriques sur l’anesthésie et apprentissage des paramètres à prendre en compte et à surveiller pour assurer le confort de l’animal sous anesthésie ; acquisition de connaissance sur les cycles de reproduction et les méthodes d'élevage des rongeurs et lagomorphes. Pour répondre à ces objectifs, les travaux pratiques que nous souhaitons réaliser permettent une familiarisation progressive des techniciens avec les rongeurs de laboratoire. Ils sont réalisés en effectif réduit, sous la tutelle d’enseignants qualifiés et expérimentés portant grande attention au bien-être animal. Des enseignements plus théoriques de réglementation et d’éthique, d’éthologie, de physiologie du stress et de la douleur viennent compléter ces connaissances afin que les étudiants soient en mesure d’adapter leur pratique au comportement de l’animal qu’ils manipulent.
Bénéfices attendus
A l’issue de notre formation, il est attendu que les stagiaires se soient familiarisés avec les rongeurs de laboratoire (souris et rats), et qu’ils aient acquis des gestes techniques couramment utilisés en expérimentation animale (préhension/contention, injections, surveillance et soins pendant l'anesthésie). Nous souhaitons avant tout les sensibiliser au bien-être animal et à l’importance de l’éthique en expérimentation animale.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs interventions. La première consistera uniquement à de la préhension-contention, et les stagiaires se seront préalablement entraînés sur des mannequins rats. Pour ce faire, chaque animal sera manipulé par un stagiaire quelques minutes, pour familiarisation, puis redéposé dans sa cage. Après un temps de pause, l’animal sera à nouveau manipulé, cette fois dans le but d’acquérir la technique de contention. Cette nouvelle manipulation pourra durer plus longtemps que la première, mais sans toutefois excéder 10 min, dans l’éventualité où le stagiaire éprouverait des difficultés à réaliser le geste correctement dès le premier essai. La seconde intervention impliquera jusqu’à deux types d’injection : sous-cutanée et intra-gastrique. Chaque injection ne sera réalisée que si la contention de l’animal est maîtrisée, et sous supervision par l’enseignant. Seule l’injection sous-cutanée sera obligatoire. Les stagiaires s’entraineront une première fois sur cadavre (lors de la séance de TP anatomie), puis pratiqueront le geste sur l’animal une première fois avec une seringue sans aiguille, avant de réaliser l’injection. L’injection intra-gastrique sera facultative, en fonction des attentes et des besoins de formation des stagiaires. Les stagiaires s’entraîneront préalablement sur des mannequins rats. Dans les deux cas, la réalisation de la procédure (contention suivie de l’injection) ne devra pas dépasser 1 min. Enfin, un nombre très limité d’animaux subira une anesthésie gazeuse, qui constituera la troisième intervention. L’induction de l’anesthésie sera réalisée par l’enseignant et les stagiaires seront chargés de surveiller l’animal et de tester ses réflexes pendant la narcose (sous la supervision de l’enseignant). L’anesthésie gazeuse ne sera pas maintenue au-delà du temps nécessaire pour que chaque stagiaire puisse réaliser les contrôles, et sera limitée à 20 min maximum. Chaque animal ne sera soumis qu’une seule fois à chacune des interventions, à l’exception de la contention dont l’apprentissage pourra nécessiter que certains stagiaires réalisent plusieurs tentatives avant de maîtriser la technique.
Impact sur les animaux
L’ensemble des procédures appliquées lors des séances de TP sont de degré de sévérité modéré. Pour chaque procédure, il est prévu que l’enseignant en explique le principe et les étapes, puis qu’il réalise une démonstration avant que les stagiaires s’y exercent, toujours sous sa surveillance. Il n’est donc pas attendu que les animaux souffrent au-delà du stress induit par la manipulation et de la douleur légère liée à une injection. Si un accident venait toutefois à se produire, lors d’une mauvaise manipulation par un stagiaire malhabile et/ou stressé par exemple, l’enseignant veillera au bien-être immédiat de l’animal et les zootechniciens le prendront en charge. Ils surveilleront quotidiennement les animaux à l’animalerie, via l’emploi d’une grille d’évaluation du bien-être, et un traitement antalgique sera administré si besoin.
Devenir
Les procédures réalisées étant de sévérité modérée, les animaux peuvent être réutilisés au sein de ce même projet d'une séance de TP à l'autre (TP préhensions/contention, puis injections, puis anesthésie), après rétablissement complet (délai de quelques jours entre les séances de TP), ou pour d’autres projets se déroulant au sein de notre établissement (TP d'apprentissage de préhension/contention et d’injections, TP de physiologie-pharmacologie), après vérification de leur rétablissement complet si jamais ils avaient présenté des signes de souffrance.
Remplacement
Le recours à la pratique de l’expérimentation animale est nécessaire à la formation des personnes qui appliqueront des procédures expérimentales sur animaux, et conforme à l’agrément de cette formation réglementaire. Il apparaît indispensable que les stagiaires se familiarisent avec les animaux et qu'ils maîtrisent des gestes techniques classiquement utilisés lors de procédures expérimentales. Toutefois, les stagiaires commenceront par s’entraîner aux gestes techniques sur des modèles inertes (cadavres et/ou mannequins), afin de remplacer l’animal au stade le plus critique de l’apprentissage.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés est limité au strict nécessaire, à savoir un animal de chacune des deux espèces considérées (c'est-à-dire un rat et une souris) par stagiaire et par séance, afin que les stagiaires soient en mesure de s'entraîner et d'acquérir les gestes techniques dispensés au cours des séances de TP de la formation. Cependant, les mêmes animaux seront réutilisés d'une séance à l'autre, afin de limiter le nombre total d'animaux utilisés. De plus, chaque animal ne sera soumis qu’une seule fois à chacune des procédures (à l’exception de la contention), et le nombre de procédures est très limité (certains actes ne sont abordés que par des vidéos de démonstration).
Raffinement
Le respect du bien-être animal est au cœur de l'approche pédagogique employée pendant les séances de TP, et les encadrants veillent à enseigner les bonnes pratiques pour la réalisation des gestes techniques dans un cadre éthique et réglementaire. Avant de pratiquer les procédures sur les animaux, les stagiaires doivent s’entrainer en répétant les gestes sur des mannequins (contention, injection intra-gastrique) ou des cadavres (injection sous-cutanée). Dans le cadre des injections, ils doivent également réaliser le geste une première fois sans aiguille ou sans sonde, avant de procéder à l’injection. Enfin, dans le cadre de l’anesthésie, le bien-être de l’animal est assuré par l’application d’un gel hydratant sur les yeux et l’utilisation d’un tapis chauffant pour prévenir l’hypothermie.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les animaux de laboratoire les plus utilisés. La souris et le rat représentent ainsi les modèles animaux que les stagiaires seront le plus susceptibles de rencontrer dans leurs activités professionnelles. Nous utiliserons des adultes de plus de 6 semaines, plus faciles à manipuler que de jeunes animaux. Pour les rats, nous utiliserons des femelles afin de permettre la réalisation de frottis vaginaux lors de la 3ème séance de TP. Pour les souris, nous utiliserons également des femelles, plus dociles que les mâles.
Evaluation chez le rongeur, de la dose maximale tolérée (MTD) de composés biologiques ou chimiques d’intérêt.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 12500
Hamsters dorés : 500
Gerbilles de Mongolie : 200
25 700 rongeurs, souris, rats, hamsters dorés et gerbilles, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, une partie réutilisée, 20 gerbilles placées et la grande majorité tuée. Ils reçoivent des composés chimiques ou biologiques par toutes les voies possibles, jusqu'à des administrations intracérébrales et par minipompe implantée, sur une période pouvant aller jusqu'à un an, pour déterminer la dose maximale tolérée. Le porteur décrit perte de poids, posture voûtée, cyanose et détérioration de l'état général, avec mise à mort dès 20 % de perte de poids ou lorsque 20 % des animaux d'un groupe ont dû être euthanasiés. Il affirme que les données in vitro sont "souvent insuffisantes" pour prédire la toxicité réelle et que la vérification chez le rongeur reste nécessaire.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer la tolérance des animaux pour un composé biologique ou chimique après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Ce projet permettra d’identifier la dose maximale aprés une ou plusieurs administrations qui n’engendre pas d’effet toxique chez les animaux (tolérance, Maximum Tolerated Dose, MTD).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer toxicité et la tolérabilité in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 1 an . Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite réaliser des études d’efficacité.
Procédures
Afin d’évaluer la tolérabilité de potentiels traitements, des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon); ou par minipompe (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Des administrations intravésicales (par cystocentèse ou cathéter) pourront être réalisées (anesthésie générale de moins d’une heure) après privation d’eau sur maximum 4h et vidange de la vessie par pression légère sur le ventre. Il sera aussi possible de réaliser des administrations intracérébrales. Ce geste sera réalisé lors d’une anesthésie de moins d’une heure avec analgésie. Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 1 an. Des effets secondaires des traitements (toxicité) pourront être observés et une grille de scoring et des points limites adaptés à l’objectif de l’étude ont été mis en place. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés.. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement (max une heure). En fin de projet, la plupart des animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie. Les animaux ayant subi une administration unique de produit n’ayant pas présenté d’effets secondaires ou de signes cliniques et ayant été gardés en procédure au maximum une semaine pourront être gardés en vies sur avis du vétérinaire.
Impact sur les animaux
Lors de l’injection pour la première fois d’un composé les effets sur l’animal peuvent être : une perte de poids, un aspect corporel détérioré, une distension abdominale, une posture courbée, la texture de la fourrure altérée, une couleur des oreilles et des pattes plus pâles ou cyanosées, des expressions faciales de douleur, une respiration et des habitudes naturelles détériorées ; critères d’observation avancés : comportement provoqué anormal, déshydratation, diarrhée, hypothermie… Pour certaines administrations intravésicales, il pourra être nécessaire de priver les animaux d’eau au maximum 4h, cela pourra engendrer une sensation de soif. Dans le cas d’administrations par injections ou dans le cas de prélèvements sanguins, ceux-ci génèreront une douleur limitée à celle d’une piqûre d’aiguille. Dans le cas d’intervention chirurgicale (pose de minipompe, implant, stéréotaxie etc), une douleur modérée transitoire pourrait être générée mais sera gérée par un traitement antalgique adéquat.
Devenir
Après chacune des deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés.
Remplacement
Les molécules chimiques ou biologiques dont la toxicité et la tolérabilité seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro (toxicité et efficacité cellulaire) afin d’éviter l’administration des composés présentant un mauvais index thérapeutique. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire les effets in vivo des molécules. La toxicité et la tolérabilité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal.
Réduction
Dans la mesure du possible, afin de limiter le nombre d’animaux inclus dans une étude, le même animal recevra des doses croissantes du même composé (au minimum 72h d’élimination entre deux doses) plutôt que d’avoir recours à des animaux différents pour chaque dose. Dans le cas de recherche de toxicité aigüe avec différents groupes pour les différentes doses, dans la mesure du possible, le premier traitement des différents groupes sera décalé d’au minimum 24h, avec un lancement initialement du groupe recevant la plus faible dose. Ainsi l’administration n’aura pas lieu pour les groupes qui auraient dû recevoir une dose supérieure à celle du premier groupe dans lequel des effets secondaires seront observés. En pratique, si 20% c ou plus des animaux recevant une dose ont été euthanasiés sur point limite, le traitement à cette dose et à toute dose supérieure sera stoppé et il ne sera pas envisagé d’administrer de dose supérieure. Sur la base des expériences passées dans notre centre, le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure a été déterminé : 3 à 5 animaux par groupe seront utilisés. Ce nombre pourra augmenter jusqu’à 10 si nécessaire pour obtenir une puissance statistique différente, compte tenu des analyses ex-vivo prévues et de leur variabilité. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux par groupe. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Les analyses statistiques à réaliser sur les autres paramètres mesurés en cours d’étude seront effectuées au moyen du test ANOVA.
Raffinement
Une grille de scoring clinique a été mise en place (voir procédure). Les animaux seront pesés tous les jours dès l’administration de composés. Une perte de poids de plus de 20% constituera un point limite. Dans le contexte de première administration de composé non testé in vivo, les animaux sont scorés toutes les deux heures pendant les 6 premières heures post-administration. Un scoring clinique sera réalisé quotidiennement dès l’administration des composés. Si 20% iou plus des animaux recevant une dose ont été euthanasiés sur point limite, le traitement à cette dose et à toute dose supérieure sera stoppé et il ne sera pas envisagé d’administrer de dose supérieure. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernaent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Dans le cas où l’administration de composé nécessite une chirurgie, une analgésie, un suivi adapté et des mesures post-chirurgicales sont mises en place pour prévenir la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Si le profil pharmacocinétique in vitro est adéquat dans cette espèce, la souris sera privilégiée pour évaluer la toxicité/tolérabilité des composés in vivo, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. Pour certaines études pré-réglementaires le rat sera l’espèce préférée. Des hamsters et des gerbilles pourront être occasionnellement utilisés si besoin, en cas d’études préalables à la mise en place d’un modèle particulier bien décrit dans ces espèces (exemple : hamster pour une étude préalable à une étude d’infection au SARS-CoV2). Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.
Analyse des effets de différents antalgiques à la suite de l’induction de blessure musculaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une lésion musculaire est provoquée par injection d'une toxine dans la patte, puis leur activité est mesurée dans des roues pendant un isolement, avec des injections d'antalgiques, avant la mise à mort pour prélever le muscle. Le porteur présente le projet comme un raffinement visant à mieux évaluer la douleur d'un modèle de blessure musculaire par la mesure de l'activité motrice. Il affirme que ce raffinement d'un protocole in vivo rend l'expérimentation animale "indispensable".
Objectifs
Le muscle squelettique peut se réparer complètement après une blessure grâce au processus de régénération musculaire. Ce processus, habituellement efficace, peut être compromis dans certaines conditions (maladies métaboliques, vieillissement, myopathies). Le modèle standard de blessure musculaire est celui de l'injection d'une toxine dans la patte arrière de l'animal. Ce modèle est très courant et très standardisé. La lésion musculaire induit une douleur qui n'est pas quantifiable en analysant le comportement de l'animal. En vue de raffiner le protocole, l'étude vise à analyser l'effet de deux antalgiques sur l'activité motrice des animaux, indicative de la douleur, à la suite de l'induction de la lésion.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de définir le meilleur protocole pour raffiner le modèle expérimental. Il s'agit d'une part de valider l'impact de la blessure sur l'activité des animaux, d'analyse l'impact des analgésiques sur cette activité (les analyses seront réalisées en aveugle) et d'autre part de s'assurer que la prise d'antalgique n'impacte pas le processus de régénération musculaire.
Procédures
Les souris seront installés dans des cages individuelles équipées de roues d'activité pendant 24h. Les souris subiront des injections de faible volume en sous cutané (1 au maximum) et en intramusculaire (2 au maximum). La durée de ces injections est d'environ 10 secondes (contention totale 30 secondes).
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables modérés sont attendus du fait d’un cumul d’actes (injections intramusculaire, anesthésies, blessure musculaire), qui induisent du stress et une douleur modérés et de l'isolement des animaux pendant 48h, le temps de la mesure de leur activité physique avant et après la lésion.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en vue de récupérer le tissu musculaire pour des analyses histologiques et cellulaires.
Remplacement
L'analyse de la régénération musculaire peut être en partie étudiée in vitro. Cependant, la coordination des processus biologiques qui la régule ne peut se faire qu'in vivo. L'étude de composés favorisant la régénération musculaire ne peut se faire qu'in vivo, justifiant le recours à l'expérimentation animale. En outre, cette étude ayant pour but de raffiner un protocole expérimental in vivo, l'expérimentation animale est indispensable.
Réduction
L'expérience du laboratoire permet de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour les analyses. Le nombre de souris est diminué par deux car les deux pattes des animaux sont utilisées, sans que cela n'impacte la mobilité de l'animal.
Raffinement
L'étude vise à évaluer la meilleure prise en charge de la douleur à la suite d'une induction de lésion musculaire. Aucun comportement anormal n'est attendu dans ce protocole, les animaux reprenant une activité normale après l'induction de la lésion. L'évaluation de la douleur sera donc estimée par la mesure de l'activité physique des souris. Lors de l'induction de la lésion, des anesthésiques sont utilisés, et différents analgésiques seront comparés.
Choix des espèces
Des travaux précédents ont montré que les processus mis en œuvre au cours de la régénération musculaire chez la souris sont proches de ceux observés chez l’homme. Les animaux sont utilisés entre 6-8 semaines, à l'âge adulte.
Effet d’une stimulation non invasive sur l’insuffisance cardiaque
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Porteuses d'une insuffisance cardiaque induite par délétion d'un gène, elles reçoivent des injections de tamoxifène, sont maintenues chaque jour dans un tube de contention pour une stimulation électromagnétique pendant trois à quatre semaines, puis subissent une échocardiographie sous anesthésie avant la mise à mort pour prélever le cœur. Le porteur indique un stress lié à la contention, atténué par une habituation préalable. Il présente cette stimulation non invasive comme une piste transposable à l'humain et affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la régulation cardiaque intégrée.
Objectifs
L’insuffisance cardiaque est une pathologie sévère caractérisée par une incapacité du cœur à assurer sa fonction de pompe et à irriguer correctement les organes périphériques. Ainsi, une modification des propriétés contractiles et une altération de l'architecture cellulaire du muscle cardiaque conduisent à des phénomènes de remodelage cardiaque (hypertrophie/dilatation) aboutissant dans un deuxième temps à l'insuffisance cardiaque. Bien que la transplantation cardiaque demeure le seul traitement radical, la pénurie de donneurs et les complications d’une lourde immunosuppression en limitent nécessairement les indications. L’assistance ventriculaire mécanique reste principalement une solution temporaire dans l’attente d’une transplantation et la resynchronisation bi-ventriculaire ne s’adresse qu’à une catégorie ciblée de patients. Il y a donc un besoin réel d’options thérapeutiques nouvelles et c’est dans ce cadre que s'inscrit notre projet de stimulation électromagnétique répétée de basse intensité (LI-rMS) avec pour objectif premier d’améliorer la fonction cardiaque chroniquement défaillante. Ses principes reposent sur l’induction de manière non invasive et de manière focale des courants électriques dans des régions endommagées, et ceci en fonction de la fréquence et de la durée de la stimulation.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en place et valider l'effet potentiellement bénéfique de la stimulation électromagnétique répétée de basse intensité (LI-rMS) avec pour objectif premier d’améliorer la fonction cardiaque chroniquement défaillante. A plus long terme nous pensons que cette stratégie serait transposable chez l'Homme.
Procédures
Les interventions sur les animaux seront: 1) 3 injections de tamoxifène (1 injection par jour) la durée de l'intervention est de 15 secondes par souris. 2 ) Stimulation éléctromagnétique (la durée de la stimulation est de 10 minutes quotidienne, pendant 21 ou 28 jours successives selon les groupes de souris avec une fréquence de 20Hz ou 40Hz. 3) Echocardiographie réalisé en dernière étape de la procédure sous anethésie (durée environ 30 minutes, 5 mesures).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables consistent en une réduction de la fonction cardiaque chez les souris suite à la délétion du gène étudié. La contention pour l'injection de tamoxifène et l'utilisation d'un tube à contention pour la stimulation éléctromagnétique pourrait générer du stress à l'animal, cependant le même expérimentateur sera chargé de l'acte et les souris seront préalablement habituées à la personne et le tube de contention.
Devenir
L'ensemble des animaux (n=180) sera euthanasié suite à cette procédure après la dernière étape d'echocardiographie, le tissu cardiaque sera prélevé pour des analyses morphologiques et moléculaires et ceci afin d'évaluer les effets potentiellement bénéfiques de la LI-rMS sur le coeur au niveau morphologique et moléculaire.
Remplacement
Seules des études sur les animaux permettent de savoir si l’inactivation ou la surexpression d’un gène ont un impact sur le remodelage et la fonction cardiaque. Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle cellulaire in vitro qui puisse reproduire de manière intégrée la régulation physiologique et métabolique des paramètres cardiaques.
Réduction
L’utilisation du même matériel biologique pour 3 types d’analyse (morphologie, ARN et protéine) permet de diviser par trois le nombre de souris nécessaire. Le principe de réduction est appliqué par le calcul de puissance statistique de nos test basés sur des expériences de même type dans d’autres modèles de souris qui nous permettent de réduire à 15 souris par groupe, le nombre de souris utilisées. Ce projet nécessitera l’utilisation de 90 souris de la lignée SRF ainsi qu'un nombre équivalent en souris contrôle. Ainsi 180 souris sont prévues pour l'ensemble du projet.
Raffinement
Les souris seront maintenues en cages (5/cages) et suivies par un personnel compétent et le milieu sera enrichi avec des nids et des maisons en carton.La stimulation la stimulation électromagnétique de basse intensité (LI-rMS) sera précédée par une étape d'adaptation et d'habituation des souris au tube de contention afin de minimiser les phénomènes de stress. L’évolution du phénotype des souris sera surveillée par des personnes compétentes selon une grille de suivi qui sera mise en place. L'administration d’analgésique sera envisagée en cas de besoin. Enfin, la définition du point limite est clairement établie à partir d’un seuil d’insuffisance cardiaque observé qui déclenchera l’arrêt de l’expérience et l’euthanasie
Choix des espèces
La souris a été sélectionnée pour la possibilité de générer par recombinaison homologue ou transgénèse des modèles d’invalidation ou surexpression du gène. Les animaux utilisés auront entre 2 et 4mois d'âge (considéré comme l'âge où le coeur a fini sa croissance et represente les caractéristiques d'un coeur adulte) au début de la procédure. Les souris seront maintenues en cages (5/cages) et le milieu sera enrichi avec des nids et des maisons en carton.
Rôle du récepteur des glucocorticoïdes et de son co-régulateur Lsd1 dans l’atrophie musculaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent du tamoxifène puis des glucocorticoïdes par injection ou gavage, ou sont mises à jeun de 24 à 48 heures, pour étudier l'atrophie musculaire, avec des prélèvements de sang répétés à la queue. Le porteur indique une fonte musculaire pouvant atteindre 20 à 30 % du poids du muscle et affaiblir fortement les animaux, et précise ne prévoir ni anesthésie ni analgésique, l'anesthésie étant jugée plus "traumatisante" que les injections. Il affirme que l'étude de l'atrophie musculaire exige un "organisme entier" et que la souris est un modèle de référence.
Objectifs
Les glucocorticoïdes (cortisol chez l'homme et corticostérone chez la souris) ont différents effets chez les mammifères, contribuant au métabolisme, à la réaction immunitaire et à la réponse au stress. En raison de leurs propriétés anti-inflammatoires, les glucocorticoïdes sont des traitements largement prescrits qui ont révolutionné le domaine de la médecine. En effet, les agonistes synthétiques, par ex. la prednisone et la dexaméthasone (Dex) sont couramment utilisés pour traiter les maladies inflammatoires chroniques telles que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques, l'asthme, et certaines myopathies. Néanmoins, l'utilisation chronique de ces composés peut entraîner d'importants effets secondaires, comme le diabète de type 2, l'ostéoporose, ou une atrophie musculaire. Les effets des glucocorticoïdes sont médiés par le récepteur des glucocorticoïdes (GR), un membre de la superfamille des récepteurs nucléaires. Dans le modèle classique, GR lié à une hormone est convoyé dans le noyau, où il se lie à ses éléments de réponse sur l'ADN de manière coopérative avec d'autres protéines appelées des corégulateurs. De plus en plus de preuves indiquent une spécificité tissulaire de ces corégulateurs. Lsd1 est un corégulateur qui interagit avec un autre membre des récepteurs nucléaires, le récepteur aux androgènes, dans les cellules cancéreuses de la prostate humaine. Nos données préliminaires montrent que Lsd1 interagit avec GR dans le muscle squelettique et que les niveaux de Lsd1 augmentent lors de la fonte musculaire induite par les glucocorticoïdes. De plus, les souris dépourvues de Lsd1 dans les myofibres ne parviennent pas à induire l’expression des gènes impliqués dans la protéolyse en réponse à la mise à jeun, ce qui indique que Lsd1 pourrait agir comme un coactivateur de GR pour favoriser le catabolisme musculaire. L'objectif de ce projet est d'identifier le rôle de Lsd1 dans les fibres musculaires adultes dans des conditions physiologiques et dans l'atrophie musculaire induite par les glucocorticoïdes soit par des traitements avec des composés analogues, soit par la mise à jeun.
Bénéfices attendus
Contrôler l'activité des GR en modulant celle des co-régulateurs tels que Lsd1 ouvrirait de nouvelles perspectives pour réduire les effets indésirables induits par les glucocorticoïdes.
Procédures
L'ensemble des animaux sera injecté au Tamoxifène par voie intra-péritonéale pendant 5 jours (30 sec/ souris). Le groupe 1 qui nous servira à étudier le rôle de Lsd1 dans le muscle sain subira ensuite une mesure de poids (30 sec/ souris), de glycémie (1 min/ souris), ainsi qu'un test de tolérance au glucose (IPGTT) et un test de tolérance à l’insuline (IPIST) (180 min au total / souris) par prélèvements sanguins au niveau de la veine caudale. Le groupe 2 qui nous permettra de comprendre le rôle de Lsd1 dans l'atrophie musculaire induite par un traitement aigü aux glucocorticoïdes sera injecté une seule fois à la dexaméthasone ou avec un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 3 qui nous permettra de comprendre le rôle de Lsd1 dans l'atrophie musculaire induite par un traitement prolongé aux glucocorticoïdes sera traité à la prednisone ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Le groupe 4 ne subira pas di'ntervention en dehors de l'injection au Tamoxifène mais sera mis à jeun de 24 à 48h.
Impact sur les animaux
L’injection de tamoxifène, de glucose, d'insuline et de dexaméthasone peut causer des infections. Le site d'injection sera surveillé chaque jour, et désinfecté si besoin. La mise à jeun sur 24 - 48h pourra fortement affaiblir les animaux. L'injection d'insuline pourra éventuellement provoquer une hypoglycémie. Le gavage peut conduire à des fausses routes. L'incision au niveau de la queue pour les mesures de glycémie n'est pas douloureuse mais peut entrainer un inconfort chez l'animal. La présence de sang dans la cage peut générer un comportement agressif et ses congénères. Les traitements aux glucocorticoïdes peuvent entrainer une fonte musculaire allant jusqu'à une perte de 20% du poids du muscle. Il en va de même avec la mise à jeun pour laquelle la fonte musculaire peut atteindre 30%, pouvant de ce fait impacter la mobilité des animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque PE pour des études moléculaires et histologiques.
Remplacement
Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes endogènes (mise à jeun) et synthétiques (Dex et Prednisone) sur l'atrophie musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. Par ailleurs, de nombreux facteurs et hormones interviennent dans l’homéostasie tissulaire. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte. A ce titre, la souris est un modèle de référence. En effet, l'histologie des muscles de la souris est similaire à celle de l'homme. Par ailleurs, le temps de gestation de la souris est relativement court (21 jours en moyenne) et permet la production de larges cohortes, contribuant à la production de résultats significatifs.
Réduction
De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance du modèle de mutation et de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. Pour réaliser le type d’analyses envisagées, un faible nombre d’animaux est requis par groupe, à savoir 10 animaux par condition. En effet, les études montrent qu’il faut 10 animaux par condition pour détecter la différence escomptée à l’aide d’un test statistique. De plus, pour une même souris une patte sera utilisée pour l'analyse d'expression des gènes et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux.
Raffinement
Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection du tamoxifène et des glucocorticoïdes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés quotidiennement. L’état de chaque souris sera référencé dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité. Par exemple, si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, ces observations seront référencées dans le tableau. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, une euthanasie sera réalisée. Une seule injection de dexaméthasone n'est en général pas problématique pour l'animal. Néanmoins, si l'injection est mal effectuée et entraine des souffrances pour l'animal pouvant éventuellement causer sa mort, celui-ci sera euthanasié afin d'éviter toute douleur inutile. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur animal vigile car l'anesthésie serait plus "traumatisante" que les injections sur animaux non anesthésiés. Nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques.
Choix des espèces
Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Le projet s’intéresse au rôle de GR et son co-régulateur Lsd1 dans l'atrophie musculaire de l’organisme adulte. Les animaux seront donc injectés au tamoxifène entre 7 et 11 semaines d'âge et étudiés dans les semaines suivant l'injection. Pour les études métaboliques, les animaux seront mis à mort à deux temps : (i) à 15 semaines, âge auquel le muscle utilise essentiellement des acides gras pour produire de l'énergie, (ii) à 30 semaines, âge auquel le muscle squelettique utilise principalement des sucres.
Etudes des mécanismes cellulaires et moléculaires de la mémoire associée au contexte de consommation d’alcool et cibler ces mécanismes avec la psilocybine
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 802
320 souris et 802 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux sont entraînés à consommer de l'alcool pendant plusieurs semaines, reçoivent des injections répétées d'alcool, de lithium ou de psilocybine, une partie subissant une chirurgie cérébrale pour implanter des cannules ou injecter un vecteur viral, avant la mise à mort pour prélever le cerveau. Le porteur indique des douleurs post-chirurgicales et un isolement sans enrichissement pour certains animaux. Il affirme que l'addiction est un mécanisme trop complexe pour être remplacé par des méthodes in vitro ou in silico.
Objectifs
L'objectif principal de cette étude est d'étudier le rôle de la mémoire associée au contexte de la consommation d'alcool sur l'efficacité de la psilocybine à réduire la consommation d'alcool. Les objectifs secondaires seront d'étudier l'implication des récepteurs à la sérotonine et à la dopamine dans la réponse à la psilocybine en fonction des différents contextes de consommation d'alcool.
Bénéfices attendus
L'utilisation des psychédéliques dans le traitement de maladies psychiatriques est en plein renouveau depuis une petite dizaine d'années. Notre projet se place dans ce contexte et vise à mieux identifier les cibles moléculaires et les mécanismes cellulaires responsables de l'effet bénéfique de la psilocybine, un psychédélique issue de champignons, sur la réduction de la consommation d'alcool et sur la rechute après une période d'abstinence.
Procédures
Les souris seront soumises à des injections répétées (x 3) d'alcool ou de chlorure de lithium et une injection supplémentaire de psilocybine. Les rats recevront des injections de psilocybine et certains rats seront soumis à une chirurgie (30 minutes environ) visant soit à injecter un vecteur viral directement dans les structures cérébrales ciblées, soit à implanter des cannules d'enregistrement de l'activité dopaminergique. Les animaux seront également entrainés à consommer de l'alcool volontairement sur une période de 8 semaines à 4 mois.
Impact sur les animaux
Au cours des différentes expériences, les animaux ne subiront que des nuisances légères (injections uniques) ou modérées de courte durée (injections répétées - douleurs post-chirurgicales de palier 1-2). Les animaux consommeront volontairement de l'alcool pendant plusieurs semaines, certains animaux seront intégrés dans un protocole chirurgical visant à injecter un vecteur viral dans différentes structures du cerveau (durée de la nuisance: 3-4 jours). Les rats recevront 4 injections (3 de solution saline et une de psilocybine) au total. Les souris recevront entre 7 et 12 injections au cours des expériences de conditionnement de place. Dans certaines procédures, les animaux seront isolés et stabulés sans enrichissement du milieu. Ce manque d'enrichissement du milieu sera contrebalancé par des manipulations régulières voire quotidienne pour la majorité des animaux et par l'exposition à des contextes environnementaux différents aux cours des procédures fournissant ainsi un enricissement cognitif et psychomoteur.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque expérience. En effet, nous aurons besoin de récupérer les cerveaux pour effectuer des vérifications histologiques des sites d'injections et d'implantation, ou nous effectuerons des études de biochimie et de biologie moléculaire sur les tissus collectés.
Remplacement
Les études de mécanismes complexes de maladies psychiatriques comme l'addiction ne sont pour le moment pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in sillico. Les mécanismes impliqués sont trop complexes pour pouvoir être simplifiés à ce jour. Le modèle que nous avons choisi fait partie des modèles les plus utilisés et les plus complets avec une validité de ressemblance, une validité de construction et une validité de prédiction très bien décrites dans la littérature.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire à une analyse statistique correcte pour chacune des expériences a été estimé sur la base de nos précédentes expériences utilisant les mêmes modèles de consommation d'alcool. Nous avons également pris en compte la variabilité inter-individuelle observée dans les différents paradigmes comportementaux utilisés. Nous utiliserons au maximum les mêmes animaux entre les différentes procédures pour limiter le nombre total d'animaux utilisés dans ce projet.
Raffinement
Nous utiliserons une échelle de suivi du bien-être animl par espèce. Ces 2 échelles sont mondialement reconnues pour être suffisament prédictive de tout mal-être/douleur ou souffrance perçue par l'animal. En fonction des scores obtenus à ces échelles nous apporterons une réponse antalgique adaptée (dose croissante d'antalgique en fonction du score observé) et dose modérée immédiate pour les périodes post-opératoires chez le rat. Les animaux seront stabulés à plusieurs (sauf période transitoire de mesure de la consommation d'alcool individuelle pour certains rats), ils seront manipulés quotidiennement (enrichissement inter-espèces) et différents contextes environnementaux (texture du sol, décoration des murs, appuis sur des leviers conduisant à l'apparition de stimuli visuels et sonores) leur seront présentés (enrichissement environnemental).
Choix des espèces
Le rat est actuellement le modèle animal le plus couramment utilisé dans les études utilisant le paradigme de l'auto-administration opérante. Néanmoins, pour les études de préférence de place conditionné, le rat n'est pas le modèle idéal. En effet le rat ne développe pas de préférence de place conditionnée pour l'alcool. Donc pour les quelques expériences utilisant ce paradigme spécifique nous utiliserons la souris et plus précisemment la souche DBA /2J qui est connue pour présenter un comportement de préférence de place pour l'alcool supérieur à celui d'autres souches commes les C57Bl/6J ou encore les Swiss. Tous les animaux seront utilisés à l'âge adulte pour nous permettre de mimer les troubles de la consommation d'alcool observés chez l'être humain adulte.