Rongeurs

25 000 rongeurs, souris, rats, hamsters dorés et gerbilles, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit sous anesthésie une chirurgie de l'appareil reproducteur, ovariectomie, hystérectomie, ligature des trompes, vasectomie ou castration, avant d'être expédié vers d'autres laboratoires pour leurs propres expériences. Le porteur décrit ce projet comme la fourniture de rongeurs "préparés", à raison d'environ 5 000 par an, et indique n'appliquer aucune approche statistique sur les effectifs. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode de substitution" pour évaluer les réactions du "corps vivant entier".

Objectifs

Les rongeurs sont les animaux les plus utilisés dans la recherche expérimentale étant un modèle présentant des caractéristiques proches de l'humain et une grande définition et stabilité génétique, ce qui en fait un modèle de choix pour les pathologies humaines. Ils représentent les modèles animaux de choix dans les domaines tels que les maladies cardiovasculaires, neurodégénératives et métaboliques, l'immunologie, l'oncologie, etc. Ce projet a pour but de fournir des rongeurs préparés en vue de leur utilisation dans leurs études expérimentales. Plusieurs sessions sont réalisées chaque année sur rats, souris, hamsters et gerbilles ; pour les femelles (ovariectomie, hystérectomie, ovario-hystérectomie, ligature des trompes) et pour les males (vasectomie, castration) (environ : 5000/an).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la mise au point de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s). Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Le bénéfice est aussi de ne pas avoir l’influence hormonale ou de modifier le comportement dans les tests ou d'obtenir des femelles pseudogestantes.

Procédures

Chaque animal subira sous anesthésie, une chirurge du système reproducteur (ovariectomie, hystérectomie, ovario-hystérectomie, ligature des trompes, vasectomie ou castration).

Impact sur les animaux

La chirurgie du système reproducteur est composée d’un protocole chirurgical et analgésique maitrisé ainsi que d’un suivi post-opératoire adapté. L’impact négatif pour l’animal est réduit au maximum. Les animaux sont maintenus en groupe.

Devenir

La majorité des animaux seront expédiés dans des laboratoires de recherche, pour une utilisation dans leurs projets de recherche

Remplacement

Pour l’étude d’une pathologie, l’utilisation d’animaux permet de comprendre le fonctionnement d’un organisme. L'utilisation d'animaux est donc rendue nécessaire car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les réactions du corps vivant entier (ensemble complexe). Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. Des méthodes alternatives (ex: in vitro) ne sont pas réalisables, l'objectif du projet étant de fournir des modèles animaux préparés utilisés dans des études expérimentales

Réduction

Nous réalisons ce protocole avec nos partenaires avec qui nous échangeons sur le nombre minimal et suffisant d’animaux utilisés. Aucune approche statistique ne sera réalisée.

Raffinement

Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long du projet. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation spécifique au modèle. Les chirurgies seront réalisées par un personnel formé et expérimenté avec un protocole anesthésique et analgésique adapté et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adapté afin de permettre une bonne récupération des animaux.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit candidat médicament car les rongeurs ont un système nerveux développé et d'autres système métabolique proche de celui de l'Homme. Leur génétique est parfaitement connu ce qui permet d'avoir des résultats reproductibles permettant d'élaborer des conclusions fiables. Le choix de l'espèce au sein de l'ordre des rongeurs est conditionné par les besoins de nos partenaires suivant les éléments cibles de l'organisme. Les animaux commenceront le projet à partir de l’âge de 4 semaines (âge minimum).

130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe intracérébrale de cellules tumorales sous anesthésie, des séances d'irradiation, un médicament par voie orale cinq jours sur sept et des injections avec imagerie de suivi, pour tester un inhibiteur de PARP contre un gliome pédiatrique du tronc cérébral. Le porteur indique que les souris développeront des symptômes neurologiques, principalement de l'apathie, correspondant à la fin de la procédure. Il conclut qu'il est "indispensable" d'évaluer le passage du médicament dans un "organisme vivant entier" avant un éventuel essai clinique, l'espoir d'améliorer la survie des enfants restant à court terme.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales constituent la première cause de mortalité et de morbidité par cancer chez l'enfant et l'adulte jeune. Les gliomes infiltrant de la ligne médiane (ou DMG), qui représentent 10 à 15% des tumeurs cérébrales pédiatriques, sont les formes les plus graves et les plus mal connues sur le plan biologique. Ces tumeurs sont inopérables en raison de leur nature infiltrante et de leur localisation profonde dans le tronc cérébral. Elles sont chimiorésistantes et la radiothérapie, traitement standard, n'est efficace que transitoirement. En cela, ces tumeurs sont universellement incurables et constituent le plus grand défi thérapeutique de l'oncologie pédiatrique à ce jour. Une famille des polymerases a de nombreuses fonctions essentielles dans les processus cellulaires tels que la transcription, le remodelage de la chromatine, la réponse et la réparation des dommages à l'ADN ainsi que l'apoptose. Un inhibiteur de ces polymérases, a été évalué in vitro et a montré une excellente efficacité cytotoxique ainsi qu'une activation très importante du mécanisme de réparation de l'ADN en combinaison avec l'irradiation. De plus, cette molécule pénètre la barrière hémato-encéphalique (BHE), obstacle très limitant dans le traitement des DMG, tumeurs isolées par la BHE non perméable à la plupart des médicaments. L'utilisation de cet inhibiteur semble être donc très prometteur pour traiter nos modèles in vivo de DMG. Dans ce projet, nous souhaitons mettre en évidence un effet antitumoral du médicament en combinaison à la radiothérapie dans nos modèles de xénogreffes de DMG. Nous évaluerons l’effet antitumoral de la molécule sur deux modèles de xénogreffes de DMG par un suivi longitudinal de la croissance tumorale couplée à une étude de survie. Dans le cas où ses objectifs seraient atteints, des molécules pourraient être directement transférées en clinique chez des patients pédiatriques en phase I, la molécule étant déjà entrée en phase clinique dans le cancer du sein.

Bénéfices attendus

Les DMG sont des tumeurs pédiatriques universellement incurables et constituent le plus grand défi thérapeutique de l'oncologie pédiatrique à ce jour car aucun traitement ne permet d’améliorer de façon importante la survie des patients. Le traitement par des PARPi est un nouvel espoir thérapeutique pour traiter ses tumeurs. Nous espérons pouvoir améliorer la survie des enfants atteints à court terme.

Procédures

Les animaux subiront : - une greffe intracérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale: durée 15 minutes - les souris pourront être irradiées sous anesthésie générale 1x/jour pendant 5 jours: durée 5 minutes- administrations par voie orale avec le médicament 5x par semaine entre 1 et 3 mois: durée 20 secondes - injections sous anesthésie générale et imagerie 1x/15j pour le suivi de la croissance tumorale: durée 15 minutes.

Impact sur les animaux

Du fait de leurs tumeurs cérébrales,, en fin de protocole, les animaux présenteront des symptômes neurologiques (principalement apathie) qui correspondront à la fin de la procédure. Les doses de radiothérapie utilisées ici sont très bien tolérées chez l’animal et n’engendrent aucun effet secondaire. Les doses de médicament utilisées pour traiter les souris sont très inférieures au doses maximales tolérées.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés car ils seront porteurs de tumeur.

Remplacement

L’efficacité des médicaments a été évaluée dans un premier temps in vitro, avec un bénéfice supérieur lorqu’ils sont utilisés en combinaison avec de l’irradiation. Toutefois, il est reconnu que la barrière hématoencéphalique est un réel frein aux passages de molécules dans les tumeurs cérébrales. Il est donc indispensable d'évaluer dans un contexte in vivo leur passage et leur pharmacodynamique dans un organisme vivant entier. De plus, dans la perspective du passage d'un médicament vers un essai clinique humain, il demeure indispensable d’avoir des données précliniques chez l’animal démontrant son efficacité.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé au plus juste au moyen de calculs de puissance. Le suivi longitudinal par imagerie pemettra de réduire considéablement le nombre d'animaux,et d'obtenir des résultats statistiquement plus puissants. De plus, les animaux développent des tumeurs de façon homogènes et reproductibles (100% de prise tumorale). Pour l'analyse des résultats, des tests statistiques non paramétriques seront utilisés, pour les comparaisons de plusieurs groupes et pour les comparaisons de groupes deux à deux, ainsi que pour les suivis longitudinaux.

Raffinement

Nos xénogreffes sont suivies par bioluminescence. Ce suivi longitudinal permet d'extrapoler le volume tumoral sans avoir besoin d'euthanasier des animaux (réduction et raffinement). Cela permet donc de diminuer le nombre d'animaux par procédures et de prévoir au plus tôt la souffrance des animaux. Pour limiter la contrainte liée à la progression tumorale, les animaux seront suivis chaque jour pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe clinique de douleur, ils recevront un antalgique . Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. La dose du médicament évalué est très inférieure à la dose maximale tolérée chez l’homme et des études d’efficacité chez la souris dans d’autres types tumoraux n’ont montré aucun effet toxique à la dose que nous utiliserons. Nous n’attendons donc pas à avoir de la toxicité. Des points limite ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Une singularité des gliome infiltrants de la ligne médiane réside dans leur phénotype systématique d’infiltration des structures normales, l’absence de masse tumorale et l’importante capacité d’invasion du tronc cérébral dans un premier temps, puis plus largement du cerveau au décours de la maladie. Ces particularités résultent des interactions des cellules tumorales avec leur stroma qui ne peuvent être appréhendées que dans des modèles in vivo, où la variété et la complexité du microenvironnement tumoral peut être reproduite. De plus, la BHE est une limitation très importante dans le traitement de cette maladie (barrière non rompue) et il est nécessaire d’évaluer les traitements in vivo sur des modèles stéréotaxiques afin de pouvoir prétendre à une nouvelle médication pour les phases cliniques. Pour ces études, la souris immnodéficiente est l'espèce la plus pertinente du fait du recul déjà accumulé en oncologie préclinique. Les animaux utilisés auront entre 4 et 6 semaines correspondant à l’âge de l'adolescent/ jeune adulte.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation de l'intestin est provoquée par un produit qui altère la barrière intestinale, avec perte de poids et sang dans les selles, avant gavages, prélèvement de sang par ponction du cœur et mise à mort pour prélever plusieurs organes. Le porteur restreint l'étude aux mâles, décrits comme plus sensibles, au nom de la réduction du nombre d'animaux. Le projet teste si un produit laitier riche en certains lipides prévient cette inflammation.

Objectifs

L’intestin a plusieurs fonctions essentielles à l'intégrité de l'organisme et au maintien d'une santé optimale dont une fonction de barrière sélective limitant le passage de molécules délétères et une fonction d'absorption indispensable aux apports nutritionnels. L'inflammation intestinale modérée est associée à de nombreuses pathologies chroniques comme l'obésité, le syndrome métabolique, le diabète de type II et les maladies cardiovasculaires. L'inflammation est un mécanisme physiopathologique pouvant altérer l'intégrité de l'intestin. L’alimentation joue un rôle important dans le développement et la sévérité de l’inflammation intestinale. La consommation de certains produits laitiers contenant notamment des lipides polaires laitiers pourrait contribuer à réduire l’incidence ou les symptômes liés à l’inflammation intestinale. Les objectifs de ce projet sont de mettre en évidence, dans un modèle de souris avec inflammation intestinale modérée induite par un produit altérant la barrière intestinale pendant 8 jours, les effets préventifs d’une supplémentation en babeurre (riche en lipides polaires) sur l’inflammation, l’intégrité et la fonction de barrière intestinale, le microbiote et d’identifier les mécanismes en lien avec le métabolisme et le devenir intestinal des lipides polaires laitiers.

Bénéfices attendus

La prévalence des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin est en forte augmentation sur les dernières décennies (environ 4 millions en 1990 à environ 7 millions en 2017), non seulement dans les pays occidentaux mais aussi les pays émergents. Ce projet devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes reliant la consommation de produits laitiers riches en lipides polaires et la modulation de la barrière intestinale. Les résultats pourraient contribuer à proposer des pistes de nutrition préventive associées au babeurre et aux lipides polaires laitiers dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin ainsi que dans les pathologies humaines marquées par une inflammation modérée comme l’obésité ou le diabète de type 2.

Procédures

Toutes les souris seront gavées oralement une seule fois au cours du test lactulose-mannitol-sucralose pour tester fonctionnellement la perméabilité intestinale. Après un jeûne réduit à 4h sur litière propre, les souris recevront une injection d’une dizaine de secondes en deux points sous-cutanés de 0.5 mL de solution saline afin de stimuler la miction. Après 30 minutes, les souris seront gavées en 10 secondes avec 0.2 mL de solution de lactulose/mannitol/sucralose. Pour le prélèvement de sang par ponction cardiaque, les animaux recevront un analgésique par voie sous-cutanée en moins de 5 secondes afin de réduire au maximun la douleur liée à ce type de prélèvement. Après 30 minutes, les animaux seront anesthésiés par un mélange analgésique/anesthésique par voie sous-cutanée en moins de 5 secondes.

Impact sur les animaux

L’induction d’une inflammation intestinale par le traitement des animaux avec un produit altérant la barrière intestinale peut induire après quelques jours et en fonction de la dose administrée une perte de poids significative, une altération de la consistance des selles et la présence de sang dans les selles. Ces modifications physiologiques peuvent donc être responsables d’une douleur ou d’un stress de l’animal provoquant alors des comportements anormaux. Une étude pilote a été menée en amont afin de déterminer une dose et un temps pouvant induire une inflammation modérée avec augmentation de la perméabilité intestinale. Au-delà de 8 jours de traitement à 1%, les effets du produit altérant la barrière intestinale sont plus marqués avec une diminution du poids corporel (

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à la fin des procédures. En effet, le sang des animaux doit être collecté pour mesurer les marqueurs sanguins de l'inflammation tels que les cytokines. Certains organes (le côlon, l'intestin grêle, rate, foie, reins) seront également prélevés pour mesurer leur poids et leur taille et étudier leur histologie. Il est alors impossible d’obtenir ces mesures sans la mise à mort des souris.

Remplacement

Il est trop invasif d’étudier les désordres intestinaux inflammatoires humains à travers des biopsies, des coloscopies qui ne sont pas autorisées dans le cadre de la recherche. Il est donc important d’étudier les inflammations intestinales dans un contexte où l’ensemble du système organique peut être étudié et où les données obtenues sont transposables à l’homme. La physiologie des souris, en particulier l’inflammation intestinale et systémique est similaire aux humains. Ces stratégies nutritionnelles pour diminuer ou prévenir l’inflammation devraient permettre d’accroitre les connaissances quant au développement et à la manière de prévenir l’inflammation..

Réduction

Il est désormais clairement établi que le sexe joue un rôle non négligeable dans divers facteurs physiologiques, métaboliques et comportementaux chez la souris. Les données de la littérature ont montré que les souris mâles sont plus prédisposées à développer une inflammation intestinale par un produit altérant la perméabilité intestinale que les souris femelles. Dans un but de réduction du nombre d’animaux, cette étude sera réalisée uniquement sur des souris mâles. Des calculs statistiques ont été réalisés afin de déterminer le nombre minimum d’animaux pour obtenir un effet significatif.

Raffinement

Durant le protocole, les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne (Week-End inclus) pour déceler un potentiel mal-être. Si des signes de souffrance des animaux sont observés, la surveillance sera accrue avec éventuellement la réhydratation des animaux, la mise de la nourriture dans la cage, le changement de la litière. Si l’état des animaux ne s’améliore pas dans des délais définis, la procédure sera stoppée.

Choix des espèces

Les travaux effectués dans ce domaine dans la communauté scientifique sont majoritairement réalisés chez la souris permettant ainsi la discussion et la comparaison des résultats entre eux. De plus, la régulation du métabolisme lipidique chez la souris est proche de celle de l’Homme. Pour les études sur l’inflammation induite par un produit altérant la perméabilité intestinale, les souches de souris les plus utilisées sont les souris C57BL/6J. De plus, les modèles d’inflammation intestinale induite par un produit altérant la perméabilité intestinale chez la souris sont considérés comme modèle pertinent des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin pour la transposition des résultats à l’Homme. Les souris seront commandées à 6 semaines de vie et le protocole débutera à 7 semaines de vie après une semaine d’acclimatation. Ce protocole doit être réalisé sur des animaux jeunes adultes pour que les effets des traitements ne soient pas liés à la croissance ou au vieillissement des animaux.

240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie cérébrale reproduisant la maladie de Parkinson, des injections quotidiennes pendant six semaines et un isolement de cinquante jours, avant une perfusion mortelle dans le cœur. Le porteur reconnaît que l'isolement rompt le groupe social et provoque un stress, et décrit un ralentissement des mouvements lié à la lésion. L'objectif est de créer un modèle de prise compulsive de nourriture, un effet secondaire des traitements chez une partie des patients parkinsoniens.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont multiples. Il s'agit donc de modéliser la prise compulsive de nourriture, un effet secondaire non moteur des traitements anti-Parkinsoniens retrouvé jusqu'à chez un tiers des patients, afin de mieux en comprendre la pathophysiologie. Pour cela, nous regarderons, d'une part les effets des traitements seuls, et d'autre part les effets des traitements cumulés à la lésion dopaminergique caractéristique de la maladie de Parkinson. Effectivement, aucun modèle animal de trouble de contrôle des impulsions (effet secondaire non-moteur des traitements) n'est actuellement disponible et l’étude de leurs développement et conséquences reste donc difficile. De plus, l’incidence de la maladie de Parkinson ne cesse d’augmenter du fait du vieillissement de la population. Les troubles du contrôle des impulsions affectent de façon non négligeable la qualité de vie des patients, notamment la prise compulsive de nourriture qui entraîne des perturbations importantes du sommeil (les patients grignottent beaucoup, notamment au cours de la nuit) et des difficultés sociales au sein de l'entourage proche. Les troubles du contrôle des impulsions touchant jusqu’à un tiers des patients parkinsoniens traités, la compréhension des causes et conséquences est un réel enjeu de santé publique.

Bénéfices attendus

Ce projet va avoir deux pans majeurs d’avancées scientifiques : il va permettre la création d'un modèle de prise compulsive de nourriture, à l’heure actuelle inexistant, par le biais d’une évaluation comportementale et va également permettre d’étayer les connaissances sur les causes biologiques, biochimiques de leur développement ainsi que les conséquences induites dans la maladie de Parkinson. Les analyses sanguines pourront permettre l'identification de biomarqueurs du développement des troubles du contrôle des impulsions. Au point de vue clinique la compréhension des causes et conséquences de l'apparition de troubles du contrôle des impulsions est cruciale pour adapter les stratégies thérapeutiques proposées aux patients parkinsoniens.

Procédures

Le projet est composé d'une procédure regroupant 5 interventions réalisées sur la totalité des animaux inclus dans le projet: une chirurgie cérébrale sous anesthésie gazeuse avec antalgique périphérique et locale (240 animaux), trois prélèvements sanguins sous anesthésie (240 animaux), une évaluation comportementale de 7 semaines (240 animaux) associé à un traitement par injection quotidienne intrapéritonéale sur animaux vigiles (1minute d'injection, 42 injections, 120 animaux) ou sous cutanée sur animaux vigiles (30secondes d'injection, 42 injections, 180 animaux) dépendamment de la molécule testée. Enfin, une perfusion intracardiaque après une injection létale d'anesthésique en fin de procédure (20minutes, 240 animaux).

Impact sur les animaux

- La chirurgie stéréotaxique peut induire une légère perte de poids et un stress notamment au réveil - L'induction de la dégénérescence neuronale permettant de modéliser la maladie de Parkinson va induire un léger ralentissement de la courbe de croissance des animaux ainsi qu'un ralentissement global de l'activité locomotrice - L’isolement de plusieurs semaines (50 jours d'isolement après 85 jours de vie en groupe) induira un stress dû à la rupture du groupe social pendant l'évaluation comportementale - Les prélèvements sanguins peuvent ponctuellement induire un hématome au niveau de la veine caudale - Les injections répétées quotidiennement du traitement au cours des 6 semaines d’expérimentation peuvent induire un stress potentiel de l’animal au moment de la piqûre ou un hématome à l'endroit de l'injection.

Devenir

Tous les animaux (n=240) seront mis à mort à la fin de l'étude de façon à coupler les résultats comportementaux à des analyses de biologie moléculaire sur les échantillons sanguins ainsi qu'à des anaylses histologiques et biochimiques des cerveaux.

Remplacement

Certaines recherches sur la maladie de Parkinson peuvent être effectuées à l'aide de modélisation basée sur des cultures cellulaires (in vitro) dans le cadre d'études sur les causes de la mort neuronale observée dans la maladie de Parkinson. En revanche, cette approche n'est pas adaptée lorsque l'on s'intéresse aux modifications comportementales. Notre étude ayant pour objectif de modéliser des comportements de prise alimentaire ainsi que d'étudier leurs conséquences cérébrales, ne peut se faire que sur l’animal entier car nécessite l’intégrité des réseaux neuronaux et ne peut donc pas être réalisée in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque groupe expérimental a été obtenu grâce à des calculs de puissance. Ces critères impliquent d’utiliser pour des groupes expérimentaux de 15 animaux par traitement testé, par condition expérimentale, et par sexe soit 240 rats afin d'obtenir des résultats statistiques interprétables. De plus, trois prélèvements sanguins seront effectués sur chaque animal de façon à réaliser une étude longitudinale de la modification des facteurs sanguins par la lésion dopaminergique et/ou le traitement permettant une réduction du nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les expérimentations sont réfléchies de façon à minimiser au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux au cours des différentes procédures de ce projet (actes réalisés par du personnel expérimenté, médicamentation définie avec le vétérinaire référent et prise de nourriture basés sur le comportement spontané des animaux dans leur cage d'hébergement et ne nécessitant pas d’intervention directe de l’expérimentateur). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale avec monotoring de la température corporelle, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgique. Le traitement antalgique sera poursuivie au lendemain de la chirurgie voire 48h post-opératoire si l'état de l'animal le nécessite. Des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites et aboutir à une gestion optimale de ceux-ci. Des critères d'arrêt de souffrances, appelés points limites terminaux sont définis au bout de arbre décisionnel. Les rats sont hébergés deux par cage dès que possible, avec eau et nourriture ad libitum, sauf à partir de J85 et pendant 50 jours soit jusqu'à J135. L’hébergement en animalerie est réalisé en portoir ventilé, dans des pièces à température et hygrométrie régulées et contrôlées selon les normes en vigueur. Un enrichissement par bâton de bois à rogner est disponible. Un tunnel sera également rajouté lorsque les animaux seront isolés. Les animaux sont manipulés de façon hebdomadaire dès la chirurgie puis quotidiennement au cours du protocole comportemental, leur permettant une habituation à un binôme d’expérimentateurs, qui reste le même tout au long de l’étude.

Choix des espèces

Le rat possède des réponses neuronales proches de celles observées chez l'Homme. Aussi, la modélisation de la maladie de Parkinson est détaillée et maîtrisée chez cette espèce. Le rat est un animal couramment utilisé dans les évaluations comportementales, notamment dans ce test de prise compulsive de nourriture. Nous utiliserons des rats avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus afin de modéliser au mieux la variabilité interindividuelle humaine. Les animaux utilisés seront adultes, permettant de se rapprocher du stade de développement de la maladie de Parkinson.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une atrophie musculaire est déclenchée chez la souris adulte par injections, puis une partie reçoit un métabolite dans l'eau de boisson, avant la mise à mort pour prélever les muscles. Le porteur indique que les animaux ne montrent pas de signe de souffrance avant sept mois et fixe les expériences au plus tard à douze semaines après le déclenchement. L'étude teste si ce complément freine la fonte musculaire liée au cancer, aux myopathies ou au vieillissement.

Objectifs

Une fonte musculaire sévère est associée à de nombreuses pathologies chroniques comme le cancer, les myopathies et le vieillissement. Cette perte de masse musculaire (atrophie) est très délétère pour le patient, affectant sa qualité de vie mais aussi réduisant la réponse aux traitements et la survie. Il n’existe aujourd’hui pas de traitement efficace permettant de freiner cette fonte musculaire. Un nouveau modèle de souris génétiquement modifiées a été généré, développant une perte de masse musculaire progressive, induite chez l’animal adulte, et récapitulant l'atteinte musculaire observée dans les maladies chroniques. Les travaux portent sur la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans cette atrophie afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. L’atrophie est induite chez l'animal adulte par des injections d'une molécule inductrice. Avant ce traitement inducteur, les animaux ne présentent aucune pathologie. Les premiers résultats expérimentaux sur ce modèle, montrent que la perte de masse musculaire est en partie causée par un déséquilibre entre la synthèse et la dégradation des protéines musculaires. Une diminution d’un métabolite essentiel à de multiples fonctions cellulaires a été mise en évidence dans les muscles atrophiés. L'objectif du projet est de tester, dans un premier temps, si la restauration de ce défaut par supplémentation orale avec le métabolite pendant 4 à 12 semaines pourrait avoir un effet bénéfique sur le muscle, comme cela a déjà été observé dans d’autres modèles de pathologie musculaire. Les souris seront mises à mort à 4 et 12 semaines après le traitement inducteur. Dans un second temps, l'évaluation de la pathologie musculaire nécessite l'injection d'un inhibiteur du processus de dégradation des protéines nommé autophagie et la mesure de l’accumulation de protéines marqueurs dans le muscle des animaux. Les souris seront mises à mort 24 heures après les injections de l'inhibiteur. Les muscles seront prélevés et analysés. Pour ce projet un maximum de 200 souris seront nécessaire.

Bénéfices attendus

A ce jour il n’existe pas de traitement permettant de maintenir ou de récupérer la masse musculaire dans les cas d’atrophies pathologiques ou lors du vieillissement. Le métabolite auquel nous nous intéressons est une piste prometteuse dans le traitement de l’atrophie et l’amélioration de la qualité de vie et la survie des patients, il a déjà fait ses preuves dans d'autres modèles de pathologie musculaire. En supplémentant les animaux ,nous espérons voir une amélioration de l'état du muscle, un ralentissement de l’atrophie.

Procédures

Tous les animaux recevront 4 injections consécutives à l’âge de 10 semaines environ, espacées de 24heures. Ensuite, 4 semaines après ces injections, un lot d'animaux recevra 2 injections, espacées de 12 heures. Les souris seront mises à mort après ces injections. Les animaux seront vigiles lors des injections qui ne durent que quelques secondes et sont réalisées par des personnels expérimentés. Une partie des animaux sera traitée par voie oral via une solution buvable contenant un métabolite pendant 4 à 12 semaines après induction du transgène. Ce traitement sera introduit dans l'eau de boisson. Un prélèvement de sang sera fait en point terminal sous anesthésie générale profonde et ces souris seront mises à mort sous anesthésie.

Impact sur les animaux

La présence du métabolite dans l’eau de boisson pourrait induire une diminution transitoire de consommation de boisson, notamment par la présence d’un gout inhabituel. Nous vérifierons que l'hydratation des animaux est correcte en évaluant les plis de peau. Suite au traitement inducteur de notre mutation, chez la souris adulte, les animaux développent une perte de masse musculaire progressive récapitulant l'atteinte musculaire observée dans les maladies chroniques. Les souris ne présentent pas de signe de souffrance avant 7 mois après cette induction. Les expériences seront réalisées au plus tard 12 semaines après l’induction du processus d’atrophie musculaire, à un stade où leur état général n’est pas altéré, et où aucune modification de leurs déplacements et prise de nourriture n’est observée. L’évaluation du flux de dégradation des protéines nécessite l'injection d'un inhibiteur du processus de dégradation des protéines nommé autophagie. Les souris seront mises à mort maximum 24 heures après les injections de l'inhibiteur. Les injections régulières sur 4 jours et sur 24h peuvent induire une douleur transitoire au point injection.

Devenir

mise à mort afin de collecter les muscles et les organes pour des analyses biochimique, histologiques et métabolomiques approfondies

Remplacement

Des expériences dans les cellules seront réalisées en amont, et de manière complémentaire. Cependant, les modèles in-vitro ne permettent pas une étude de traitement au-delà de quelques jours. Le modèle murin est essentiel pour étudier les conséquences musculaires des maladies chroniques et également étudier l’impact des défauts musculaires sur le métabolisme global de l’organisme.

Réduction

Le nombre d’animaux minimal permettant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs sera utilisé. Le maximum de données pouvant être générées à partir d’un même groupe d’animaux sera recherché. Des conseils auprès de collaborateurs expérimentés et une consultation approfondie de la littérature permettent d'optimiser les expériences et réduire la variabilité donc le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Des effectifs de 10 animaux maximum par groupe seront utilisés. Des tests statistiques seront utilisés pour s'assurer de la robustesse des résultats obtenus. Afin de réduire le nombre d’animaux, la seconde partie du projet ne sera réalisée que si le traitement, réalisé en première partie du projet, montre un effet satisfaisant sur le maintien de la masse musculaire. Enfin, des échantillons collectés dans la première partie seront utilisés comme controle de la seconde partie du projet.

Raffinement

Le traitement avec le métabolite d'intérêt sera ajouté à l'eau de boisson, cela limitera le stress chez l’animal. Une surveillance quotidienne des animaux sera réalisée pour détecter les signes de mal-être ou de souffrance. Les animaux seront pesés 2 à 3 fois par semaine pendant les 4 premières semaines de traitement (en même temps que le renouvellement de l’eau tous les 2 à 3 jours) puis toutes les semaines. La durée du traitement pourra être ajustée en fonction du comportement, du poids et de l'état des animaux. Des points limites suffisamment prédictifs seront mis en place pour éviter toute souffrance des animaux et au-delà desquels la procédure sera arrêtée. Les animaux seront mis à mort immédiatement si signes de souffrance.

Choix des espèces

Le modèle murin permet le développement d'animaux génétiquement modifiés. La physiologie musculaire des souris est considérée suffisamment proche de celle de l’homme pour que l’on puisse en tirer des données extrapolables. La souris est un modèle très accessible, de maintien aisé et manipulable génétiquement afin de répondre au questionnement scientifique. Le projet porte sur la compréhension des mécanismes impliqués dans l'atrophie musculaire induite par l'activation d'une signalisation d'intérêt, après la phase de croissance post-natale du muscle, dans le muscle adulte. L’induction du transgène est donc réalisée à la fin de cette croissance post-natale vers 10 semaines environ. L'étude à deux stades 4 semaine et 12 semaines après l'induction de l'expression du transgène est motivée par des résultats expérimentaux préalables.

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une plaie est créée chirurgicalement sous anesthésie, puis un substitut de peau humaine est greffé sous leur peau, avant leur mise à mort échelonnée à deux, quatre et douze semaines pour prélever la zone greffée. Le porteur signale la douleur de la chirurgie et le stress de l'isolement d'une semaine, atténués selon lui par l'analgésie et des cages transparentes. Le projet évalue la tenue dans le temps d'un substitut cutané destiné à traiter des plaies humaines.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont d’évaluer chez la souris la fonctionnalité au cours du temps d’un substitut cutané humain greffé sous la peau, ainsi que la dégradation progressive de la matrice support de ce substitut cutané humain. Le substitut cutané humain est un produit de thérapie innovante développé en utilisant des cellules humaines isolées à partir d’un prélèvement de peau humaine et cultivées sur une matrice biologique support. Le substitut cutané humain, ou la matrice biologique support, sera greffé sur des souris dépourvues d’un système immunitaire fonctionnel, afin d’éviter tout rejet. Des prélèvements de la région greffée seront effectués à différents temps après réalisation de la greffe de substitut cutané humain ou de la matrice biologique support afin de réaliser un ensemble d'analyses.

Bénéfices attendus

Les substituts cutanés sont des biomatériaux capables de remplacer tout ou partie de la peau et constituent une alternative précieuse pour la gestion des plaies lorsque les thérapies standards sont un échec. Cependant, sélectionner le bon substitut n’est pas une décision thérapeutique aisée. De nombreux substituts cutanés biosynthétiques ont été développés et sont pour certains utilisés pour traiter les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, les greffes de tissus mous chez les patients présentant des brûlures à épaisseur partielle, des plaies chirurgicales, ulcères du pied diabétique,… mais leur efficacité et leur tenue dans le temps ne sont pas très bonnes. Il est donc important et nécessaire d’évaluer la fonctionnalité et la stabilité de nouveaux substituts cutanés sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation des plaies ou de remplacer une peau nécrosante.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction de la plaie cutanée et la réalisation de la greffe de substitut cutané humain ou de matrice biologique support effectuée sous anesthésie générale. Un substitut cutané humain ou une matrice biologique support sera placé sous la peau par l’intermédiaire d'une incision qui sera ensuite refermée. Un traitement analgésique des souris sera administré 1 heure avant la chirurgie puis 6 heures après. La chirurgie sera réalisée en 15 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les greffes seront observées quotidiennement et photographiées 2 fois par semaine, et un scoring de différents paramètres sera effectué. Un suivi quotidien de l’ensemble des souris sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Le maintien des souris greffées en cage individuelle sera nécessaire pendant une semaine après la réalisation de la greffe de substitut cutané humain ou de matrice biologique support pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles les points de suture effectués au niveau de la peau incisée, et qu’elles ne se retirent le substitut cutané humain ou la matrice biologique support placé sous la peau, puis elles seront replacées à 2 par cage.

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale pour l’induction de la plaie cutanée et la réalisation de la greffe de substitut cutané humain ou de matrice biologique support peut engendrer une souffrance mais sera limiter au maximum pa r l'utilisation d’une couverture analgésique. L’hébergement en cage individuelle des souris greffées pendant une période transitoire d‘une semaine, nécessaire pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles les points de suture au niveau de la peau incisée et qu’elles ne se retirent le substitut cutané humain ou la matrice biologique support placé sous la peau, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque souris au cours de cette période transitoire d’une semaine de voir au moins une de ses congénères. A l’issue de la semaine d’hébergement en cage individuelle, les souris seront replacées à 2 par cage.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 30 souris seront mises à mort à différents temps après réalisation de la greffe de substitut cutané humain ou de la matrice biologique support, 2 semaines, 4 semaines et 12 semaines, avec 5 souris par temps de prélèvement, par injection intrapéritonéale d’une surdose d’euthanasique effectuée sous anesthésie gazeuse . Un prélèvement sera effectué au large de la zone de greffe de substitut cutané humain ou de la matrice biologique support pour la réalisation d’un ensemble d'analyses qui permettront de caractériser la fonctionnalité du substitut cutané humain évalué et de suivre la dégradation progressive de la matrice biologique support au cours du temps.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité de substituts cutanés greffés, processus dépendant de mécanismes complexes. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études précédentes obtenus sur modèle de greffe cutané. D’autre part, la réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permet de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction de la plaie cutanée puis de la réalisation de la greffe cutanée (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) ainsi qu’après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal atteint est observée, ou si des signes d’infection de la plaie greffée ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, vocalises, convulsions…), ceux-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Des bâtonnets d’ouate seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant la réalisation de greffes cutanées. Son utilisation est largement décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées et pour le développement de substituts cutanés. Les animaux seront des souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).

270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du sein dans la glande mammaire, puis des injections répétées d'un candidat médicament sous contention, avant d'être tuées par rupture des vertèbres cervicales. Le porteur signale une possible cachexie et une gêne à la marche liée au volume de la tumeur. Il affirme n'avoir "pas d'autre choix" que la souris pour reproduire un "organisme entier", l'étude constituant une étape vers un dossier réglementaire commercial.

Objectifs

Depuis plus de 10 ans, le cancer est la première cause de mortalité en France. Or il a été démontré qu'une molécule est exprimée, voire fortement surexprimée, au sein du microenvironnement tumoral (humain et murin). Ainsi, cette protéine est considérée comme un marqueur de mauvais pronostic et de récurrence dans de nombreux cancers tels que le cancer du sein, principal cancer retrouvé chez les femmes en France. Il y a donc une nécessité de développer de nouveaux traitements à l’heure actuelle afin d’améliorer la survie des patientes. Ce projet a pour but d’évaluer le potentiel anti-tumoral d’un candidat médicament qui en plus d’inhiber la vascularisation tumorale, a d’ores et déjà démontré des effets anti-tumoraux dans différents modèles murins de cancer tels que le cancer de la peau, cancer cérébral et le cancer ovarien. Il a également été montré dans ce dernier modèle la capacité du candidat médicament à activer l’immunité anti-tumorale. L’objectif de notre projet sera donc d’évaluer le potentiel thérapeutique et la pharmacologie du candidat médicament. Pour cela, un effet dose sera évalué en analysant la croissance tumorale au sein d'un modèle de cancer mammaire ainsi que la vascularisation grâce à la technique dite de "matrigel plug". Ces deux premières procédures permettront la détermination des paramètres pharmacologiques et pharmacocinétiques. Une fois la dose efficace déterminée à l'aide de ces deux premières études, nous analyserons l’effet de la dose efficace sur la réponse immunitaire dans les tumeurs. Pour cela, le modèle de tumeur mammaire est un modèle intéressant pour étudier les relations entre la tumeur et le système immunitaire en respectant la physiologie de développement tumoral. Enfin, le 3e volet de l’étude consistera à comparer quatre formulations du candidat médicament afin de déterminer celle qui pourrait améliorer l'efficacité du traitement.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus par le candidat médicament sont une diminution de la croissance tumorale liée à une augmentation de la réponse immunitaire ainsi qu’une diminution de la vascularisation tumorale selon un effet dose. La réalisation de ce projet d’expérimentation animale permettrait de valider les résultats obtenus in vitro et ex vivo et confirmerait la pertinence de la stratégie thérapeutique associée au candidat médicament dans un modèle complexe de progression tumorale in vivo (tumeurs vascularisées et système immuno-compétent). Cette étape, associée à la détermination d’une dose efficace de traitement et d’une formulation adaptée, constitue un prérequis à la constitution de dossier réglementaire lors du developpement pharmaceutique.

Procédures

Pour toutes les procédures (toutes les souris) : identification des souris par tatoo au niveau des oreilles (durée: moins d'1min) sous anesthésie générale par inhalation de gaz anesthésique (1 fois). Procédures 1, 3 et 4 (pour toutes les souris) : - Injection de cellules tumorales au niveau de la glande mammaire sous anesthésie générale par inhalation de gaz anesthésique (1 fois, durée: moins de 5min) - Injection de traitement par voie intraveineuse dans la veine de la queue sur animaux vigiles placés dans un tube de contention (durée: 5min) 3 fois par semaine pendant 3 semaines Procédure 2 (pour toutes les souris) : - Injection d’une solution de protéines matricielles, contenant un facteur favorisant la vascularisation, dans le flanc des animaux, sous anesthésie générale par inhalation de gaz anesthésique (1 fois, durée: moins de 5min) - Injection de traitement par voie intraveineuse, dans la veine de la queue, sur animaux vigiles placés dans un tube de contention (durée: 5min), 3 fois par semaine pendant 2 semaines. Procédure 1 (souris du groupe satellite) : - Prélèvements sanguins sous anesthésie générale par inhalation de gaz anesthésique (5 fois : submandibulaire gauche, submandibulaire droite (durée: 1min), rétoorbital gauche, rétroorbital droit (durée: moins d'1min), ponction intracardiaque après euthanasie) répartis au cours du temps jusqu'au sacrifice des animaux.

Impact sur les animaux

Une cachexie : d'après la bibliographie, la cachexie apparaît principalement au stade métastatique du développement tumoral environ 5 à 6 semaines suivant l’inoculation des cellules tumorales. Il est donc peu probable que la cachexie apparaisse après les 3 semaines de traitements néanmoins le risque que quelques animaux en présente n’est pas totalement exclu. Une gêne à la locomotion due au volume tumoral en raison de la localisation de la tumeur. Un stress des animaux lors des injections sur animaux vigiles ainsi que préalablement à l'imagerie. Une douleur transitoire lors de l'injection intraveineuse. Une inflammation et/ou une dépilation dans de rare cas à l'emplacement de la tumeur croissante ou de la solution matricielle.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés par rupture des vertèbres cervicales sous anesthésie générale (isoflurane 4%).

Remplacement

Une étude in vitro seule ne peut suffire pour représenter les mécanismes physiologiques d’un organisme entier et les approches informatiques ne permettent pas à ce jour de mimer la fonction d’un organisme et sa réaction face aux traitements. En effet, il est notamment très difficile de recréer exactement, in vitro, l’environnement tumoral. Ainsi, nous n’avons pas d’autres choix que d’utiliser le modèle animal pour apporter la preuve de concept de l’efficacité thérapeutique du candidat médicament et de définir sa dose efficace et la formulation adaptée avant l’éventuelle réalisation d’essais cliniques.

Réduction

Afin d’être adapté au modèle de cancer mammaire, uniquement des souris femelles seront considérées dans les procédures comportant ce modèle. Pour le modèle in vivo de vascularisation, il s’agira de souris mâles et femelles afin de pouvoir identifier, si nécessaire, une réponse différentielle liée à la synthèse hormonale. Le nombre d’animaux nécessaires a été calculé de manière à réduire au maximum la quantité d’animaux tout en permettant une interprétation fiable des résultats basée sur des analyses statistiques adaptées.

Raffinement

Une observation quotidienne des souris sera réalisée afin de garantir leur bien-être et détecter d’éventuels signes de douleur ou de stress. L’utilisation d’anesthésiques, d’analgésiques et d’antalgiques permettra de prévenir et/ou traiter toute douleur éventuelle. Une attention particulière sera portée à l’observation des points limites fixés tout au long du projet afin d’éviter toute souffrance non soulagée par les soins apportés, auquel cas l’animal sera mis à mort. Un soin sera apporté aux conditions d’hébergement permettant de limiter le stress (enrichissement du milieu de vie, respect de leur vie en groupe, surveillance quotidienne) Des outils d’imagerie non invasifs seront utilisés.

Choix des espèces

Souris Balb/c, syngéniques de la lignée de carcinome mammaire 4T1 Travaux antérieurs justifiant de la pertinence de ce modèle murin dans le cadre de l’évaluation de nouveaux agents thérapeutiques dans le traitement de différents cancers. Homologie de la protéine cible Animalerie agréée pour l’espèce souris Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique, les souris seront utilisées à l’âge de 8 semaines, ce qui correspond à un stade adulte (jusque environ 1 an chez la souris).