Rongeurs
Les nano anticorps, des outils potentiels pour soigner la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris génétiquement modifiées pour développer la maladie d'Alzheimer reçoivent une injection hebdomadaire de nano anticorps pendant six mois, puis des tests d'apprentissage et de mémoire à 9 et 12 mois, avant d'être tuées. Le porteur affirme que les déficits cognitifs "n'affectent pas le bien-être des souris" et n'attend aucune douleur liée au traitement. Il indique que le partenaire a validé les effets sur cultures cellulaires, mais juge le modèle animal "nécessaire" pour évaluer la mémoire.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer affecte environ un million de personnes en France, et plus de 14 millions en Europe, c'est la 1ere cause de démence. De nombreux essais thérapeutiques ce sont révélés infructueux, jusqu'à très récemment où un traitement basé sur des anticorps a été autorisé d'abord aux Etats-Unis, malgrè les controverses dues à des effets secondaires fréquents et importants chez les patients. Il a été récemment autorisé en France en septembre 2022, à titre expérimental. Le laboratoire avec qui nous collaborons a développé une nouvelle génération d'anticorps innovants, appelés nano anticorps qui sont des anticorps de petite taille présentant moins d'effets secondaires. L’objectif de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique de ces nano anticorps dans un modèle de souris génétiquement modifié représentatif de la maladie d’Alzheimer. Cette étude analysera les effets de ces nano anticorps sur trois récepteurs différents dont le fonctionnement est altéré dans la maladie d'Alzheimer.
Bénéfices attendus
A l'issue du projet, nous pensons pouvoir identifier des nano anticorps ayant un effet pharmacologique sur les marqueurs de la maladie d'Alzheimer, comme la réduction de la toxicité, de l'aggrégation des protéines dans le cerveau, et la neuroinflammation. La réduction de ces marqueurs devraient être associée à une amélioration des performances d'apprentissage et de mémoire chez les animaux. Nous pensons egalement, identifier des co-traitements pour augmenter les effets bénéfiques de ces outils.
Procédures
A partie de 6 mois d'âge, les souris seront administrées avec 1 dose de nano anticorps 1 fois/semaine par voie intra-péritonéale. Le traitement sera effectué pour une durée de 6 mois. A l'âge de 9 et 12 mois, les animaux auront deux tests comportementaux non invasifs afin d'évaluer leur capacité d'apprentissage et de mémorisation. L'objectif étant de voir si le traitemtent aux nano anticorps améliore les déficits de mémoire et d'apprentissage. Lorsque les animaux seront agés de 12 mois, ils seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Selon la littérature scientifique disponible, l'injection de nano anticorps ne provoque pas de réactions inflammatoires contrairement à l'injection d'anticorps traditionnels. L'utilisation de nano anticorps spécifiques d'un seul récepteur permet d'augmenter la spécificité de la cible et donc de limiter les effets indésirables (effets secondaires) décrits lors des études réalisées avec des composés non-sélectifs de ces récepteurs, comme des molécules chimiques. Tous ces éléments suggèrent que peu d'effets indésirables sont attendus avec les traitements par les nano anticorps. Concernant les souris génétiquement modifiées, elles vont développer des déficits d'apprentissage et de mémoire entre 9 et 12 mois d'âge. Ces déficicits cognitifs n'affectent pas le bien-être des souris. Ce modèle lent est représentatif de la maladie d'Alzheimer.
Devenir
A l'issue de la procédure de traitement des animaux par les nano anticorps, tous les animaux (432) seront euthanasiés et les tissus prélevés.
Remplacement
Notre partenaire, avec qui nous collaborons, a déjà validé sur des cultures cellulaires les effets pharmacologiques des nano anticorps sur les récepteurs d'intérêt. Ces nano anticorps sont capables d'activer, ou d'inhiber l'activité de ces récepteurs, impliqués dans la maladie d'Alzheimer. Toutefois, pour évaluer le potentiel des nano anticorps à restaurer les déficits d'apprentissage et de mémoire, critère qui n'est pas possible d'évaluer sur des modèles de cultures cellulaires, l'utilisation d'un modèle animal génétiquement modifié et représentatif de la maladie d'Alzheimer est nécessaire.
Réduction
L'étude sera réalisée sur des souris génétiquement modifiées, modèle progressif de la maladie d'Alzheimer, ainsi que des animaux contrôles non modifiés génétiquement. Les nano anticorps les plus aptes à diminuer la pathologie Alzheimer dans les cellules, seront alors testés dans le modèle de souris, soit seul ou en co-traitement pour cibler plusieurs récepteurs d'intérêts. Pour ce projet nous envisageons d'utiliser 432 souris sur la durée du projet, réparties en plusieurs groupes avec 1 seule procédure. Nous procéderons par étapes, avec des études pilotes avant de générer l'ensemble des expériences prévues. Le nombre d'animaux adéquat a été calculé grâce à un logiciel permettant d'avoir des analyses robustes. Nous avons également tenu compte de notre expertise de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en en gardant un nombre suffisant d'animaux pour ne pas compromettre la validité statistique des expériences qui seront menées. Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées.
Raffinement
Les données préliminaires obtenues au laboratoire de notre collaborateur et présentes dans la littérature scientifique n’indiquent pas de toxicité liée à l’injection des nano anticorps. Il n’est donc pas attendu de souffrance chez les animaux qui seront traités. Les animaux utilisés seront sous surveillance régulière. Si les points limites sont atteints lors de l’expérimentation (perte de poids de plus de 20%, blessures, prostration, léthargie, décubitus latéral, ou autres signes), les souris seront euthanasiées. Pour évaluer les effets de l'injection des nano anticorps, différents paramètres seront observés: les processus neuro-inflammatoires, suivi de paramètres comportementaux généraux (prostration, léthargie, activité,...). Pour évaluer l'effet thérapeutique des nano anticorps sur l'apprentissage et la mémoire, des tests comportementaux adaptés, non invasifs et sans douleur, seront réalisés. Au vu des données disponibles dans la littérature scientifique, aucun symptôme de douleur n’est attendu pour ces modèles. Les souris seront hébergées dans un milieu enrichi (copeaux et maisonnettes), avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum.
Choix des espèces
Le modèle choisi pour nos études, est un modèle murin génétiquement modifié, récapitulant la maladie d’Alzheimer à évolution lente, bien caractérisé au niveau des symptômes, tels que les déficits d'apprentissage et de mémoire. Ce modèle peut donc être utilisé pour évaluer une modification des marqueurs de la maladie d'Alzheimer lors des traitements avec les nano anticorps. L’utilisation de ce modèle génétiquement modifié justifie l’utilisation de souris contrôles, non modifiées génétiquement qui sont issues des mêmes portées et de même fond génétique. Les traitements seront effectués de 6 à 12 mois dans le modèle de souris génétiquement modifié, car c'est un modèle d'évolution lente de la pathologie Alzheimer, et nous souhaitons traiter les animaux à l'apparition des marqueurs de la maladie soit vers 6 mois. Les nano anticorps seront administrés à la dose de 10 mg/kg, à raison de 1 fois par semaine.
Validation de l’effet neuroprotecteur d’un traitement combiné DOX et ATT dans un modèle lésionnel murin de la maladie de Parkinson
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré modéré pour 24 d'entre eux et sévère pour 24. Ils reçoivent une injection intracérébrale de toxine reproduisant la maladie de Parkinson sous anesthésie, subissent un test locomoteur cinq fois après injection d'apomorphine, et 24 d'entre eux un gavage deux fois par jour pendant 19 jours. Le porteur teste une association d'un antibiotique et d'un anti-oxydant censée protéger les neurones, après des résultats obtenus in vitro. Il affirme que la validation dans un modèle animal est "indispensable" pour un passage en clinique.
Objectifs
La maladie de Parkinson est la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente chez l’homme après la maladie d’Alzheimer. Elle est causée par la dégénérescente progressive des neurones dopaminergiques (qui synthétisent la dopamine) dans une structure cérébale (substance noire pars compacta). Cette perte de neurones dopaminergiques a pour effet de réduire considérablement la quantité de dopamine dans une autre structure du cerveau (striatum). Cette absence de dopamine est à l’origine de l’apparition des symptômes moteurs. Le traitement de la maladie de Parkinson a pour objectif de rétablir la quantité de dopamine dans le cerveau et dans la majorité des cas permettent de corriger les symptômes. Toutefois, l’efficacité des traitements est limitée dans le temps et de nombreux effets indésirables apparaissent rapidement. Ces traitements n’ont d’effets que sur les symptômes et ne corrigent pas les causes de la maladie et sa progression. La possibilité de protéger les neurones de la dégénérescence constitue une des pistes prometteuses pour le développement de nouveau traitements de la maladie de Parkinson. Dans ce projet, nous testerons la capacité d’une combinaison de 2 molécules : antibiotique et anti-oxydant pour protéger les neurones dopaminergiques de la dégénérescence dans un modèle lésionnel de la maladie de Parkinson. Cette étude fait suite à une étude in vitro démontrant en culture les effets protecteurs de cette combinaison de molécules. La validation in vivo dans un modèle animal de la maladie est indispensable pour développer cette approche de protection en clinique chez l’homme.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est de valider l’efficacité thérapeutique de l’administration combinée de la molécule anti-oxydante par gavage avec un antibiotique dans l’eau de boisson, en utilisant un mode d’administration le moins invasif possible, afin de pouvoir l’appliquer chez les patients atteints de maladies neurodégénératives.
Procédures
Le projet inclut les interventions suivantes : l'injection intracérébrale d’une toxine permettant de reproduire un modèle de maladie de Parkinson pratiqué sur 48 rats une seule fois par animal, sous anesthésie générale de 30 minutes, avec prise en charge de la douleur par administration d'analgésique avant, après la chirurgie et un suivi pendant 48 heures après le jour de la chirurgie. Le test comportemental (test locomoteur) pratiqué sur 48 animaux 5 fois par rat sur animaux vigiles pour une durée de 30 minutes par session précédé d’une injection apomorphine en sous cutanée (moins d’une minute par animal). Le gavage 2 fois par jour (moins d’une minute par animal) pratiqué sur 24 animaux pendant 19 jours sur animal vigile. Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure.
Impact sur les animaux
Pour la partie comportementale : un stress peut être mis en évidence lors du test locomoteur et une douleur peut survenir au point d’injection intrapéritonéale d’apomorphine. Pour la partie chirugie : une douleur peut être provoquée par la mise en barre d’oreille des animaux, un risque de saignement au moment de la craniotomie, un traumatisme mecanique locale relativement faible au moment de l’insertion de l’aiguille au site d’injection, un risque d’hypothermie et anesthésique pouvant entrainer des séquelles chez l’animal. Une perte de poids suite à la chirurgie peut être observée.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par méthode autorisée afin de pouvoir prélever leurs tissus cérébraux et d’analyser les neurones dopaminergiques.
Remplacement
La combinaison du traitement anti-oxydant associé à un antibiotique de la famille des tétracycline a déjà montré son efficacité de neuroprotection in vitro dans des cultures primaires de neurones dopaminergiques de souris. Dans cette démonstration l’effet de la combinaison est largement supérieur à l’effet observé pour chaque molécule individuellement. L’étape suivante est de réaliser in vivo cette étude dans un modèle lésionnel de rat de la maladie de Parkinson.
Réduction
La conception des procédures permet de réduire le nombre d’animaux utilisés, à 48 au total, en effectuant un suivi longitudinal plutôt que l’établissement d’une nouvelle cohorte pour chaque temps post-lésion étudié. En effet, des études précédentes sur la réalisation de la lésion dopaminergique ont montré une grande efficacité à réaliser le modèle Parkinsionien et des données publiées sur le traitement antibiotique nous permet de connaitre les procédures expérimentales à utiliser afin d’étudier notre combinaison de molécules dans ce projet. Finalement, le nombre d’animaux inclus dans les procédures expérimentales pour chaque condition, 12 animaux par condition, a été établi sur la base de calcul de puissance statistique. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques en fin d'expérimentation pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les rats seront hébergés par 2 en portoir ventilé, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h (8h - 20h). L’eau et la nourriture seront fournies ad libitum. Un environnement enrichi par un tunnel et du kraft sera fourni aux animaux. Une période d’acclimatation d’une semaine est prévue avant toute manipulation des animaux lors de leur arrivée. Une surveillance accrue sera mise en place en cas d’approche d’un point limite, en particulier en cas de perte de poids corporel constatée lors du suivi hebdomadaire. Lors des injections intracérébrales, les rats âgés de deux mois seront anesthésiés par inhalation de gaz anesthésiant et recevront une injection d'analgésie avant, après l’injection intracérébrale ainsi qu'un suivi pendant 48 heures post-chirurgie. La température corporelle des animaux sera maintenue avec un tapis retrocontrolé via la sonde rectale. Des larmes artificielles seront placées sur les yeux pour éviter tout dessèchement. Une crème analgésique sera également appliquée au niveau des points de contact entre les oreilles et le cadre stéréotaxique.
Choix des espèces
Le modèle lésionnel chez le rat est le modèle de référence pour la maladie de Parkinson car il permet de reproduire de nombreux aspects de la maladie de Parkinson Tous les animaux utilisés auront deux mois au début des procédures correspondant au début de l’âge adulte, idéal pour l’injection du neurotoxique et pour la réalisation du test comportemental
Cibler les récepteurs à l’histamine pour traiter les cancers associés à EBV chez la souris.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
354 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger pour 90 d'entre elles et modéré pour 264. Elles reçoivent une série d'injections, dont un virus EBV et des cellules humaines, pour développer un lymphome, puis un ligand testé contre les cancers liés au virus, avant d'être tuées par dislocation cervicale. Le suivi de la tumeur va jusqu'à un volume de 2 000 mm³ ou l'apparition de signes de douleur. Le porteur mentionne des organoïdes en développement mais affirme que seul le modèle murin permet de tester les deux phases du traitement.
Objectifs
Le virus Epstein-Barr (EBV) est associé à plusieurs cancers d’origine épithéliale ou lymphoïde. Ce virus infecte plus de 90% des humains et la mononucléose infectieuse est la manifestation commune de l’infection primaire. EBV établit ensuite une infection chronique dormante c'est à dire qui passe inaperçue, durant laquelle son potentiel oncogénique peut s’activer et conduire notamment à des cancers comme des carcinomes nasopharyngés et des lymphomes. La réplication du virus EBV entraine la lyse des cellules infectées (cycle lytique). La réactivation du virus dormant dans les cellules épithéliales et les lymphocytes B est par conséquent une piste explorée pour éliminer le réservoir viral et les cellules infectées prolifératives, avant ou après leur transformation en cellules cancéreuses. Si des progrès importants ont été réalisés dans la découverte d’inducteurs du cycle lytique, des molécules sures et spécifiques sont toujours attendues. Un récepteur cellulaire a été identifié comme étant une cible majeure impliquée dans la réactivation du cycle lytique d'EBV, et donc une cible pour développer des molécules antivirales contre EBV. S’appuyant sur de solides résultats, le projet qui sera developpé ici vise à tester des ligands de ces récepteurs cellulaires ayant les meilleures structures chimiques autorisant un transfert vers la clinique. Pour cela, des modèles murins précliniques permettant de reconstituer des lymphoproliférations humaines EBV positives à partir de souris immunodéficientes seront développés et permettront de tester l'efficacité de ces ligands in vivo.
Bénéfices attendus
Ce projet qui vise à tester de nouvelles molécules dans des modèles précliniques de tumeurs EBV+ devrait avoir un impact en santé humaine à moyen terme. En effet, si les molécules testées s'avèrent avoir un effet dans ces modèles précliniques, un essai clinique de phase I voire II pourrait être mis en place afin de tester ces molécules chez l'homme.
Procédures
1. Injection unique de Bulsulfan en intrapéritonéale (durée de quelques secondes). 2. Injection unique du virus EBV en intrapéritonéale (durée de quelques secondes). 3. Injection unique de cellules CD34+ humaines (durée de quelques secondes) en intraveineux après anesthésie gazeuse. 4. Injection répétée (1 fois par jour pendant 5 jours jusqu'au développement du lymphome) d'anticorps anti-CD3 humain (durée quelques secondes) en intraveineux après anesthésie gazeuse. 5. Injection répétée (toutes les 12h, pendant 2 semaines) du ligand du récepteur à l'histamine JNJ7777120 en intrapéritonéal (durée quelques secondes). 6. Prélèvement de sang par ponction submandibulaire, 1 fois par semaine jusqu'à reconstitution d'un système hématopoiétique humain, à l'aide d'une lancette (durée de quelques secondes). 7. Injection unique en sous-cutanée des cellules Daudi dans 100µl de Matrigel (durée de quelques secondes) après anesthésie gazeuse. 8. Injection en sous-cutanée d'un fragment de 1 à 2 mm3 de PDX T1 ou T2 dans100µl de PBS qui seront mélangés à 100µl de Matrigel (durée de quelques secondes).
Impact sur les animaux
1. Nuisances légères attendues liées aux injections en intrapéritonéale, durer que quelques secondes, temps requis pour effectuer l'injection. 2. Nuisances modérées attendues liées aux injections en intraveineux. Afin de limiter les nuisances de ces injections, les souris seront préalablement anesthésiées. 3. Nuisances modérées attendues liées aux prélèvementx de sang par ponction submandibulaire (limités à 2 gouttes soit 50µl). 4. Nuisances légères attendues suite à l'injection unique en sous-cutanée des cellules Daudi ou d'un fragment de PDX. Afin de limiter les nuisances de ces injections, les souris seront préalablement anesthésiées. 5. Nuisances modérées attendues liées au développement du lymphome. Afin de limiter au minimum les effets indésirables associés au développement du lymphome, les animaux seront observés 3 jours par semaine afin de mettre en évidence tous signes évoquant une éventuelle douleur (gonflement de l'abdomen, réduction de l’activité (prostration), poil hérissé et dos vouté). Si un de ces signes cliniques est observé, les souris seront mises à mort par dislocation cervicale. Pour les lymphomes greffés en sous-cutané le suivi sera réalisé par mesure de la tumeur à l'aide d'un pied à coulisse et les souris seront mises à mort dès que la tumeur atteinsra un volume de 2000 mm3.
Devenir
A l’issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale afin de réaliser les prélèvements nécessaires pour analyser l'impact des molécules thérapeutiques sur le développement des tumeurs associées à EBV.
Remplacement
Des modèles d'organoïdes de tumeurs sont actuellement en cours de développement qui pourraient à terme remplacer une partie des expériences actuellement réalisées chez la souris. Il n'existe cependant pas de modèle de ce type permettant d'analyser à la fois l'effet des molécules testées dans ce projet directement sur les tumeurs et leur impact indirecte sur la réactivation du système immunitaire pour aider à détruire ces tumeurs. Seuls ces modèles murins précliniques permettent de tester les 2 phases potentielles de l'activité de ces traitements qui visent à réactiver le cycle lytique d'EBV.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à l’expérimentation nous allons : - mutualiser au sein de l’équipe les ressources cellulaires post-mortem afin qu’un même échantillon puisse être exploité pour différents projets et ainsi éviter l'utilisation itérative de souris. - effectuer une étude statistique descriptive (Test t) qui déterminera les différences qualitatives et quantitatives entre les groupes des souris. Cela permettra d’éviter la répétition de l’expérience et de réduire au minimum l’utilisation des animaux - optimiser le matériel issu des tumeurs pour production multiple (cellules des différents organes congelés en DMSO, extraction des acides nucléiques (ADN, ARN), et inclusion des organes pour histologie) et éviter ainsi la répétition de l’expérience. - quantifier la viabilité cellulaire des échantillons humains avant toute injection ou greffe pour limiter les échecs.
Raffinement
Les souris seront laissées en acclimatation en zone expérimentale pendant une semaine. Dans la procédure 2, les souris seront observées de façon journalière afin de mettre en évidence les points limites définis dans la procédure. Dans la procédure 3, avant injection des cellules en sous-cutanée, les souris seront anesthésiées. Lors du suivi des animaux, la prise tumorale sera évaluée par palpation jusqu'à apparition des signes cliniques. Dans la procédure 4, lors de l'humanisation des souris, celles-ci seront observées 2 fois par semaine jusqu'à reconstitution à hauteur de 40% de cellules humaines dans le sang des souris. A partir de l'infection par EBV, les animaux seront alors surveillés 3 fois par semaine afin de mettre en évidence le développement de lymphome qui se caractérisera par la mise en évidence des signes suivant : gonflement de l'abdomen, réduction de l’activité (prostration), poil hérissé et dos vouté. Si un de ces signes cliniques est observé, les souris seront mises à mort par dislocation cervicale. Dans la procédure 5, les tumeurs qui se développeront en sous-cutanée seront mesurées 2 fois par semaine jusqu'à obtenir un point limite de 2000mm3 maximum, la souris sera également mise à mort si la tumeur nécrose ou si elle empêche un déplacement normal de la souris. Si l'un de ces points limites est atteint, la souris sera mise à mort par dislocation cervicale.
Choix des espèces
Chez la souris, des modèles très immunodéficients tels que les souris NSG sont accessibles à la communauté scientifique. Ces souris représentent donc un modèle de choix pour reconstituer soit un système immunitaire proche de l'homme soit des pathologies humaines telles que des lymphomes. Les souris seront utilisées à partir de 8 semaines qui correspond à l'âge adulte de ces animaux.
Evaluation chez le rongeur de la pharmacocinétique, biodistribution et innocuité de candidats médicaments pour lutter contre le cancer
- Recherche appliquée
- Cancers
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection puis deux prélèvements sanguins sous anesthésie sur une période de 6 à 72 heures, avant d'être tué pour prélever ses organes. Le projet mesure la persistance et la toxicité de dix candidats médicaments d'immunothérapie anticancéreuse. Le porteur affirme qu'aucune technique in vitro ne mesure la persistance dans un "organisme entier" et présente l'animal comme la "seule approche" possible.
Objectifs
Au cours de la dernière décennie, les approches immunothérapeutiques ont révolutionné le traitement des cancers et constituent un domaine de recherche en plein essor. Les immunothérapies visent à rendre le système immunitaire plus à même de reconnaitre les cellules tumorales et de les détruire. Cependant, la proportion de patients qui répond à ce type de médicaments est pour l’instant trop faible. Nous avons récemment développé et breveté une technologie permettant de produire un panel de protéines immunomodulatrices, c’est-à-dire capables de moduler l’activité du système immunitaire. Sur la base de cribles d’activités réalisés in vitro nous avons sélectionné deux premières protéines qui s’avèrent capables de contrôler la croissance tumorale chez la souris ce qui indique le potentiel immunothérapeutique de notre technologie. A l’aide des mêmes cribles, nous travaillons actuellement à la sélection de nouvelles protéines présentant des activités immunomodulatrices encore plus optimisées qui représenteraient de ce fait de nouveaux candidats médicaments pour le traitement de cancers. Avant d’étudier l’efficacité thérapeutique des candidats sélectionnés, nous devrons caractériser leur devenir chez l’animal de laboratoire ainsi que leur toxicité potentielle. Ces travaux permettront en effet de définir les conditions de délivrance les plus appropriées pour tenter d’obtenir un effet thérapeutique optimal avec un risque de toxicité nul ou très limité. L’objectif de notre projet est donc de caractériser chez l’animal de laboratoire le devenir dans l’organisme au cours du temps ainsi que la toxicité potentielle de dix nouveaux candidats médicaments générés par notre technologie et préalablement sélectionnés in vitro. La persistance des protéines candidates dans l’organisme sera déterminée par immunodosage. Pour ces travaux, nous utiliserons des souris qui représentent des références pour la communauté scientifique impliquée dans le domaine de l’immunothérapie des cancers.
Bénéfices attendus
Les médicaments utilisés chez l’homme ou chez l’animal doivent être capables de générer des effets thérapeutiques significatifs en absence de toxicité ou avec une toxicité minimale par rapport au bénéfice attendu. Les candidats médicaments générés par notre approche technologique doivent répondre à ces deux critères. Pour évaluer l’efficacité thérapeutique dans des conditions optimales, il faut cependant définir dans un premier temps les conditions de délivrance les plus appropriées. Les études de persistance dans l’organisme réalisées dans ce projet seront d’un apport crucial dans ce contexte. En effet, le suivi de la demi-vie des candidats médicaments dans l’organisme permettra de connaître les paramètres d’absorption et d’élimination ainsi que l’atteinte des tissus cibles. Ces données permettront de définir i) la dose à injecter, ii) le temps entre deux injections, iii) la voie d’injection, pour obtenir une persistance significative des candidats médicaments durant les études d’efficacité réalisées ultérieurement. Les études de toxicité seront quant à elles essentielles pour évaluer l’innocuité des différents candidats médicaments. Les bénéfices du projet sont donc attendus aussi bien en terme de définition des conditions optimales de délivrance des candidats médicaments que du point de vue de la caractérisation de leur innocuité.
Procédures
Les animaux subiront une seule injection et deux prélèvements de sang sur une période de 72 heures. Dans ces deux cas, pour éviter tout stress, les animaux seront anesthésiés. Les études seront réalisées sur des temps courts, compris entre 6 heures et 72 heures. La présence des candidats médicaments dans le sang sera déterminée par immunodosage.
Impact sur les animaux
Au cours de nos études nous auront pour objectif de surveiller les animaux afin d’évaluer si des effets indésirables inattendus apparaissent. Les effets indésirables peuvent être une perte de poids, une perte de mobilité, un stress, des difficultés respiratoires, une inflammation au point d’injection. Il n’est pas possible d’évaluer, à priori, la durée d’effets inattendus. Cependant, si des effets apparaissent, leur durée sera comprise entre 6h à 72h au maximum car les animaux seront euthanasiés de 6 à 72 heures après le début de l’expérience.
Devenir
Les souris seront euthanasiées à la fin des expériences afin de prélever de prélever différents organes pour étudier la distribution des candidats médicaments dans les tissus.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer le devenir dans l’organisme ainsi que la toxicité potentielle de nouvelles immunothérapies. Ces travaux ne peuvent être réalisés sans se passer de l’animal car, aucune technique in vitro ne permet d’évaluer la persistance ou la localisation dans un organisme entier. L’utilisation d’animaux de laboratoire représente donc la seule approche permettant une évaluation du devenir et de la toxicité potentielle d’un candidat médicament.
Réduction
Notre technologie nous permet de produire des centaines de protéines dotées d’activité immunomodulatrice. Pour limiter le nombre d’immunothérapies à évaluer chez l’animal, les protéines produites seront dans un premier temps évaluées in vitro pour leur capacité à induire des cellules du système immunitaire. Seules celles qui présenteront la capacité immunomodulatrice la plus optimale seront sélectionnées pour être évaluées chez l’animal. Les expérimentations sont basées sur des modèles de souris chez lesquelles il existe une variabilité interindividuelle. Pour tenir compte de cette variabilité, trois animaux par temps de cinétique seront utilisés. Pour étudier le devenir des immunothérapies de façon fiable au cours du temps, il est recommandé d’effectuer des prélèvements sanguins à au moins 6 temps différents. Dix-huit animaux sont donc théoriquement requis pour l’étude d’une immunothérapie via une voie d’injection. Nous limiterons cependant le nombre d’animaux à douze en réalisant un deuxième point de cinétique au moment de l’euthanasie de neuf des animaux inclus dans l’expérience. Enfin, nous mènerons les études de biodistribution et de toxicité sur les rongeurs soumis aux études de pharmacocinétique ce qui permettra de réduire le nombre de rongeurs utilisés.
Raffinement
Les protocoles que nous utiliserons sont classiquement employés chez l’homme ou chez l’animal. Pour limiter le stress des animaux, permettre une manipulation aisée et douce, nous anesthésierons les animaux avant l’injection des immunothérapies et avant les prélèvements. Pour préserver le bien-être des animaux, ceux-ci seront hébergés au calme en respectant des cycles diurne/nocturne. De plus, ils seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué afin d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. L’application de critères d’arrêt et le suivi régulier des animaux hébergés en groupe permettront de garantir le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Pour évaluer le devenir dans l’organisme des immunothérapies ainsi que la toxicité potentielle, nous travaillerons chez la souris. Pour ce type d’étude, elle représente en effet une référence utilisée par la plupart des chercheurs académiques ou de l’industrie pharmaceutique. Les rongeurs auront entre 8 et 12 semaines car ils présentent un système immunitaire et une physiologie pleinement mature qui s’avère cruciale pour évaluer le devenir dans l’organisme au cours du temps et l’innocuité d’immunothérapies.
Evaluation d’un modèle d’infection à Mycobacterium avium
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger pour 56 d'entre elles et modéré pour 16. Elles sont infectées par nébulisation avec la mycobactérie M. avium, et 16 d'entre elles reçoivent en plus un gavage quotidien d'antibiotiques pendant un à deux mois. Le projet cherche à caler un modèle d'infection pulmonaire pour tester ensuite de nouveaux antibiotiques. Le porteur affirme qu'aucun autre modèle ne peut remplacer l'animal car l'infection touche plusieurs organes, et signale que le gavage peut être inconfortable.
Objectifs
Les infections à mycobactéries non tuberculeuses ont une prévalence en augmentation. Leur prise en charge est complexe et lourde, basée actuellement sur une association d’au moins trois antibiotiques pour une durée minimale de 12 mois après négativation des prélèvements respiratoires. M. avium (MAC) fait partie des espèces de mycobactérie les plus souvent responsables d’infections pulmonaires chez l’homme. Ces infections surviennent généralement chez des patients ayant des comorbidités respiratoires : mucoviscidose, bronchectasies, bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO). Pour améliorer la prise en charge de ces patients, il faut pouvoir évaluer, sur un modèle adapté, de nouvelles associations d’antibiotiques ainsi que de nouvelles molécules. L’objectif de cette étude est d’évaluer le meilleur modèle d’infection à M. avium en vue d’évaluer de nouvelles associations de traitement antibiotiques ou de nouvelles molécules.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont d’obtenir un modèle d’infection à mycobactérie proche de ce qui se passe sur l’homme afin de pouvoir l’utiliser pour tester de nouveaux antibiotiques (qui pourraient être plus efficace et/ou avec moins d’effets indésirables que les traitements actuellement utilisés). L'amélioration du modèle permettra aussi de réduire l'utilisation des animaux dans le cadre de ces études.
Procédures
Chaque souris subira une infection unique par nébulisation (geste non invasif, durée 30 minutes de nébulisation, avec une durée totale dans le nébuliseur de 1h30) de mycobactéries. 16 souris (8 souris de chaque espèce) sur les 72 infectées auront un gavage quotidien d'antibiotiques de 5 à 10 secondes par jour (5 jours sur 7) pendant 1 mois pour 8 d’entre elles (4 de chaque groupe) et pendant 2 mois pour les 8 autres (4 de chaque groupe). Les animaux seront hébergés jusque 3 mois après l'infection
Impact sur les animaux
La nébulisation de mycobactérie pourra induire un stress le temps de l’aérosol (durée totale de 1h30 de cette partie de la procédure). Aucune douleur n’est attendue. Sur l’ensemble des données disponibles sur le modèle murin d’infection à mycobactéries non tuberculeuses, il n’y a pas de perte de poids ou de mobilité après infection. Par précaution, les souris seront pesées de manière bi-hebdomadaire au minimum. Le gavage peut être inconfortable, surtout les premiers jours. Le nombre d'expérimentateur sera limité pour habituer les souris et améliorer la technicité.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements et analyses
Remplacement
Le remplacement du modèle animal par un autre modèle n'est pas possible du fait que l'infection à myobactérie touche différents organes et différents types de cellules. Des premiers travaux peuvent être faits sur cellule, mais néanmoins pour évaluer complètement un nouvel antibiotique il faut ensuite vérifier son efficacité sur les différents organes, ce qui ne peut être reproduit in vitro.
Réduction
Ce modèle permet de mimer mieux l’infection telle qu’elle est chez l’homme et elle a l’avantage de produire une infection homogène au sein des souris, permettant ainsi de limiter le nombre de souris par groupe pour obtenir des résultats scientifiquement solides. Le nombre de souris a donc été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l'analyse statistique.
Raffinement
Les souris seront dans des hébergements en groupe. Il sera utilisé un enrichissement dans les cages pour permettre le jeu des souris. Le projet commencera au minimum 15 jours après leur arrivée dans l’animalerie pour permettre aux souris de s’habituer aux nouveaux locaux. Deux personnes seulement pratiqueront le gavage afin de permettre l’habituation des souris. les souris seront surveillées de manière quotidienne, avec une évaluation approfondie et une pesée bi-hebdomadaire au minimum. Des points limites ont été déterminés avec l'utilisation d'une grille de score.
Choix des espèces
Les souris possédent un système respiratoire proche de l'homme. Elles entreront dans l'étude au stade de jeunes adultes, soit 6 semaines (infection à mycobactéries principalement chez les adultes chez l'homme)
Mise au point d’une Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) pour le meilleur suivi d’un modèle préclinique de greffes de cellules tumorales dans l’hypophyse de souris (2/2)
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
22 souris vont être utilisées et toutes tuées, 8 opérées puis tuées sans réveil et 14 exposées à un niveau de souffrance sévère. Les 14 souris greffées reçoivent une injection de cellules tumorales dans l'hypophyse par chirurgie, puis un suivi par IRM sous anesthésie avec injection d'un produit de contraste. Le porteur présente une étude pilote de faisabilité, sans répétition ni test statistique, pour vérifier qu'une IRM peut mesurer le volume tumoral. Il reconnaît que la greffe sous la peau est "peu représentative" mais affirme ne pas pouvoir remplacer le modèle murin par des approches in vitro.
Objectifs
Les tumeurs hypophysaires humaines ont une incidence élevée (1/1500). Bien que bénignes, elles provoquent des maux de tête, des troubles visuels et peuvent être invasives et agressives. Elles répondent mal aux traitements thérapeutiques classiques et il est indispensable de trouver de nouvelles molécules pouvant limiter leur développement. Il existe peu d’outils d’étude pour caractériser leur comportement, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et tester de nouveaux traitements. Leur étude est donc tributaire de modèles précliniques qui soient représentatifs des tumeurs hypophysaires humaines. Bien que le nombre de lignées tumorales soit limité et la mise en culture de cellules dérivées de tumeur soit délicate, la greffe de ces différents modèles sous la peau des souris constitue actuellement la seule possibilité de modèle préclinique pour mettre au point et valider de nouveaux traitements thérapeutiques. Les greffes sous-cutanées sont toutefois peu représentatives du contexte intracrânien dans lequel se développent et évoluent ces lésions tumorales chez l’Homme. Notre projet vise à approfondir le développement d’un modèle expérimental de greffe de cellules tumorales dans l’hypophyse de souris pour disposer de modèles précliniques qui permettront : i) d’étudier le comportement et la biologie de différentes lignées et cellules tumorales dans leur environnement naturel de développement et ii) de valider de nouveaux modèles précliniques pour évaluer l’effet de drogues thérapeutiques. La mise en place et la validation de ce nouveau modèle de greffes intra-hypophysaires a déjà été réalisé par le biais d’une micro-injection automatisée dans l’hypophyse de souris sur des animaux profondément endormis. Notre projet vise à réaliser une étude pilote qui confirmera la faisabilité de mettre en place un suivi par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) et de quantifier le volume tumoral de cellules greffées à un stade précoce de développement tumoral.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à tester la faisabilité de réaliser des imageries IRM de l’hypophyse et développer de nouveaux modèles précliniques pour l’étude d’outils thérapeutiques dédiés aux atteintes tumorales de la glande hypophysaire. Le modèle qui sera mis en place permettra d'obtenir des résultats plus fiables que ceux obtenus sur tumeurs qui ont poussées sous la peau. L'imagerie IRM permet de tirer beaucoup d'informations et permet de reconstruire la tumeur en 3D. Il devrait enfin améliorer le suivi des animaux expérimentaux en prévenant mieux le développement de lésions tumorales et limitant ainsi leur exposition à de possibles gênes ou souffrances inutiles.
Procédures
Lors de l’injection des cellules tumorales dans leur hypophyse, les animaux subiront une chirurgie de 30 minutes maximum sous anesthésie générale et sous analgésie. Cet acte n’aura lieu qu’une fois. Les animaux subiront une anesthésie gazeuse d’une heure maximum lors de la procédure d’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM). Une injection de produit de contraste dans la cavité abdominale sera réalisé durant l’imagerie pour permettre de mieux visualiser les tumeurs.
Impact sur les animaux
Un acte chirurgical sera réalisé sous anesthésie pour injecter les cellules dans l’hypophyse. La chirurgie (incision de 0.5 cm) va entrainer de la démangeaison pendant la cicatrisation. La greffe de cellules tumorales dans l’hypophyse entrainera le développement de lésions tumorales intracrânienne. Ces lésions pourront comme chez l’homme entrainer une compression intracrânienne, conduisant à des maux de tête et une pression sur les nerfs optiques altérant la vision. Les souris ne devraient toutefois jamais atteindre ces stades tumoraux avancés qui sont fréquemment retrouvés chez l’homme et sont déclencheurs d’une chirurgie. La procédure d’imagerie sera intégralement réalisée sous anesthésie gazeuse tout comme l’injection d’un produit de contraste pour mieux visualiser les tumeurs.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales réalisées. Nous procéderons également à de nombreuses analyses sur les tumeurs collectées post-mortem, Des analyses histologiques permettront d’exploiter au mieux nos résultats et compléter les analyses d’image réalisées par IRM.
Remplacement
Les modèles de greffes tumorales orthotopiques (injection de cellules tumorales dans les tissus où se développent naturellement les tumeurs greffées) représentent actuellement les modèles précliniques les plus convaincants, car ils permettent d’étudier le comportement des cellules tumorales (pousse tumorale, remodelage du microenvironnement, réponse à certains traitements, …) dans leur environnement cellulaire natif. En raison de la nature complexe de la recherche proposée, qui vise à évaluer la prise de greffe et l’impact de l’environnement hypophysaire sain sur la progression tumorale de cellules injectées, nous ne pouvons malheureusement pas remplacer l’utilisation de modèles murins par des outils cellulaires ou des approches in vitro.
Réduction
Afin de nous conformer à la règle de réduction, le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre le taux de succès de nos greffes et l’obtention d’un nombre suffisant de tumeurs que nous pourrons étudier par imagerie. Dans le cadre des travaux proposés, 22 souris devraient nous permettre d’aboutir à la démonstration ou non de la faisabilité de développer des outils d’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) permettant de raffiner nos analyses, identifier plus rapidement l’apparition de lésions et espérer suivre l’effet de nouveaux composés thérapeutiques. Nous ne réaliserons pas de répétition expérimentale ni de test statistique, notre procédure se limitant à la mise au point d’une IRM sur un nouveau modèle préclinique. L’utilisation de 8 souris non-greffées et la greffe de 14 souris au maximum sur 1 an nous permettra de confirmer la faisabilité de réaliser des imageries IRM et quantifier la taille des tumeurs étudiées.
Raffinement
L’imagerie de type IRM que nous souhaitons mettre en place vise par définition à raffiner le suivi et le bien-être du modèle préclinique de greffe intra-hypophysaire que nous développons. En parallèle de l’utilisation de cet outil, nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin d’assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance inutile. Ce suivi individuel permettra d’identifier l’apparition de signes évocateurs de mal-être ou de souffrance (prostration, comportement erratique). L’identification de ces signes entrainerait alors une fin d’expérimentation immédiate et une mise à mort des animaux concernés. Les analyses post-mortem que nous réaliserons sur le matériel biologique collecté nous permettrons de valider la faisabilité mais aussi la sensibilité de l’imagerie par IRM que nous souhaitons mettre en place pour un meilleur suivi éthique de nos modèles expérimentaux. Les examens d'imagerie et d'injection stéréotaxique se feront sous anesthésie gazeuse Isoflurane ; pour les injections stéréotaxiques l'analgésie sera assurée par l'utilisation de Buprenorphine et d'un anti-inflammatoire Metacam.
Choix des espèces
Le modèle de souris choisi possède un système immunitaire appauvri. Il s’agit d’un modèle indispensable pour greffer du tissu humain ou des lignées rongeurs de fonds génétiques mixtes afin qu'il n'y ait pas de rejet du greffon. Il est réceptif aux lignées choisies et aux tumeurs humaines hypophysaires. Il est donc idéal pour les greffes dans l’hypophyse et permettra également l’étude du microenvironnement et de l’interaction entre la tumeur et son environnement. Les protocoles d’injection seront réalisés sur des souris âgées de 12 à 16 semaines. Ce sont à ces âges que nous avons validé nos 70% d’efficacité d’injection avec les coordonnées définies.
AVC : Développement de nouvelles stratégies thrombolytiques chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit trois chirurgies, dont la pose d'une prothèse crânienne et une craniotomie, puis une induction d'accident vasculaire cérébral sur animal éveillé, avec habituation à la contention et imagerie par IRM. Le porteur justifie ce modèle sur animal éveillé par la volonté de supprimer l'anesthésie, qu'il juge en partie responsable de l'échec des traitements testés chez l'humain. Il précise qu'aucun animal n'est gardé vivant, invoquant le risque d'infection et l'isolement en cage individuelle, et applique un point limite de perte de poids de 20 %.
Objectifs
L’Accident Vasculaire Cérébral (AVC) est la 1ère cause de handicap acquis chez l’adulte, posant un problème majeur tant dans le domaine de la santé publique que sur le plan humain. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (
Bénéfices attendus
L'objectif du projet étant de proposer un protocole de modélisation de l'ischémie plus pertinent et au plus près des conditions cliniques (patient éveillé lors de la survenue de l'AVC, de l'imagerie et du traitement), les bénéfices seraient de pouvoir progressivement remplacer les protocoles existants chez l'animal anesthésié par des protocoles chez l'animal vigile, ce qui augmenterait les chances de translation des résultats précliniques vers la clinique, sans pour autant déroger au respect de l'éthique de l'animal utilisé à des fins expérimentales. Le but ici est de proposer un protocole solide et reproductible, permettant d'obtenir des résultats fiables tant sur une stratégie de traitement fibrinolytique, ou neuroprotecteur. En supprimant l'anesthésie générale des prochaines études dont l'objectif serait de tester un traitement prometteur, il sera alors possible de tester les effets du traitement seul, et non plus du traitement couplé aux anesthésiques. Cela permettrait en cas d'échec chez le petit animal d'éviter de poursuivre ces études chez le gros animal ou chez le primate non humain (où l'anesthésie est de même utilisée contrairement à la clinique), dans un soucis de Réduction du nombre d'animaux. Le bénéfice attendu concernant la deuxième partie du projet serait d'exploiter ce modèle d'ischémie vigile pour caractériser et étudier les évènements vasculaires de manière très précoce, et ainsi comprendre les mécanismes physiopathologiques entrant en jeu selon la composition du caillot et des collatérales différentes. Le fait de mieux comprendre les évènements survenant lors d'un AVC et ce le plus tôt possible pourrait ensuite orienter les futures stratégies de prise en charge et/ou de traitement de l'AVC.
Procédures
Les animaux seront soumis : A 3 chirurgies : Une chirurgie de pose de prothèse crânienne sous anesthésie générale et couverture analgésique d'une durée de 20 minutes. Une chirurgie permettant une pose de cathéter caudal et l'accès à l'artère cérébrale moyenne par craniotomie sous anesthésie générale et couverture analgésique d'une durée de 30 à 45 minutes. Une chirurgie d'induction de l'ischémie sans anesthésie générale, sous couverture analgésique et sous anesthésie locale. A 2 protocoles comportementaux : Un protocole d'habituation à la contention et à l'IRM vigiles par jour pendant 5 jours consécutifs, avec des cessions augmentant progressivement de 15 min jusqu'à 1h30 au total. Un protocole de récupération fonctionnelle sur 5 jours, avec des sessions durant moins de 5 minutes par souris au total. A 3 protocoles d'imagerie vigile : Une à 3 acquisitions à l'imagerie ultrasonore, où chaque acquisition dure 5 minutes avec une injection de produit de contraste lors de chaque acquisition. Une à 2 acquisitions à l'IRM où chaque acquisition dure 30 minutes. Une acquisition en microscopie biphotonique durant 10 minutes avec injection de produit de contraste.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d'appraître chez les animaux seraient : Des douleurs post opératoires après la pose de prothèse, un ennui ou un stress dus à la solitude des animaux (placés 1 par cage afin d'éviter les arrachements de prothèse) , un stress lors des premières sessions d'habituation à la contention, une perte de masse corporelle après les anesthésies et l'induction de l'AVC,des douleurs post opératoires après la chirurgie d'accès à l'ACM, un stress dû à la survenue de l'AVC chez la souris éveillée, des déficits fonctionnels à la suite de l'AVC.
Devenir
Tous les animaux utilisés au cours de ce projet (540) seront mis à mort. Il a été décidé de ne garder aucun animal en vie car il n'est pas concevable pour leur bien-être de réhabiliter ou réutiliser des souris ayant subit une procédure sévère telle qu'une ischémie. De plus, le risque d'infection au niveau de la prothèse crânienne et de la craniotomie sont trop importants pour garder les souris en vie. Enfin, ces souris vivent dans des cages individuelles, et il n'est pas souhaitable pour leur bien-être au quotidien de rester trop longtemps solitaires.
Remplacement
Dans ce projet, il n’est pas possible de remplacer le modèle animal, il s’agit d’étudier un modèle in vivo avec tous les mécanismes vasculaires physiopathologiques associés, survenant lors d'un l'AVC. Les effets de molécules pharmacologiques sur le développement des lésions cérébrales ainsi que la récupération fonctionnelle ne peuvent être investigués autrement que via un modèle in vivo.
Réduction
Le nombre d'animaux a été determiné en reprenant les données d'études antérieures testant des molécules pharmacologiques sur le devenir des lésions ischémiques à la suite d'un AVC chez la souris, et ayant montré des résultats significatifs en réduisant le plus possible les effectifs. Au cours de ce projet, chaque animal faisant l'objet d'un suivi longitudinal est son propre contrôle, grâce à l'utilisation de l'imagerie. Cela permet de ne pas faire de groupes supplémentaires pour chaque étape du projet où il est nécessaire de caractériser l'ischémie cérébrale, en plus de renforcer la validité des résultats. Conformément à la règle des 3R, le nombre d'animaux nécessaires au projet à été réduit au maximum, en se basant sur les études déjà réalisées au sein du laboratoire et dans la littérature, ainsi que sur un calcul de puissance statistique, permettant d'avoir des résultats significatifs avec un minimum d'animaux. D'après les premières données obtenues sur l'ischémie vigile chez la souris, on observe une moyenne du volume de lésion lié à l'ischémie de 14 mm3 (+/- 9 mm3) dans le groupe contrôle, et de 5 mm3 dans le groupe traité. Pour un seuil de significativité à 95 % et une puissance de 80 % (beta = 20%), 16 animaux seraient nécessaires dans chaque groupe. Cependant, il peut arriver d'avoir de la mortalité ou des exclusions durant les nombreuses étapes de l'étude (arrachements de prothèse, perte de poids, stress trop intense lors des premières habituations ...). Le nombre d'animaux a donc été augmenté à 20 par groupe, sachant qu'il sera réduit à 16 si aucun incident ne survient au cours du protocole.
Raffinement
Les souris sont surveillées quotidiennement par du personnel qualifié. Une attention particulière est accordée à l'état général, à l'évolution de la masse corporelle, ainsi qu'au comportement de chaque animal. Les animaux auront le temps de s'acclimater à la nouvelle animalerie après leur réception auprès du fournisseur pendant une semaine, puis seront habitués à la manipulation chaque jour pendant une semaine avant le début du protocole, afin de limiter le stress lié à l'expérimentateur, et apprendre aux souris à coopérer. Pour la partie nécessitant la pose d'une prothèse crânienne, les souris seront placées dans des cages individuelles afin de limiter les risques d'arrachement de la prothèse. Afin de palier au mieux à la solitude induite par la séparation, les cages seront enrichies (coton en quantité pour la fabrication d'un nid, ainsi que paillettes). Une période de récupération de 3 jours et prévue après la pose de la prothèse crânienne, durant laquelle les souris bénéficieront de croquettes humides dans une coupelle au sol afin de favoriser la prise de nourriture et l'hydratation. Le protocole d'habituation progressif à la contention permet de réduire le stress des souris lors de l'induction de l'AVC et de l'imagerie vigiles. Durant l'induction de l'AVC, les souris sont sous analgésie (buprénorphine, injection sous cutanée avec une aiguille de 25 G, minimum 20 min avant le début de la chirurgie afin d'atteindre le pic d'activité), et sous anesthésie locale au niveau de l'ACM à la Xylocaine (nébuliseur). Les yeux de la souris sont couverts afin de ne pas l'éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire, et des bouchons d'oreilles sont prévus pour l'IRM vigile, réduisant le bruit ambiant de 27 dB (selon les informations du fabricant). Après la chirurgie d'induction de l'AVC, les souris disposent de croquettes humides dans une coupelle au sol pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation. Concernant l'application des point limites, les animaux seront mis à mort (anesthésie profonde à l'Isoflurane suivie d'une dislocation cervicale) dans les 24 heures dans l'une des situations suivantes : - signes de douleur extérieure indexés sur le grimace-scale souris (NC3Rs) (Score >5 plus de 48h) ; - absence de réaction ; - animal inactif dans sa cage ; - complications chirurgicales inattendues (hémorragie impossible à stoper, détresse cadiorespiratoire, échec) ; - perte de poids >20%. - décollement de la prothèse crânienne
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences, et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l’influence de l’anesthésie sur le devenir des lésions induites par un AVC ischémique. L'étude se déroulera sur deux souches de souris (Swiss et C57/BL6) présentant des profils de collatérales différentes, et des réponses physiologiques à l'ischémie différentes, comme observé chez l'humain. De plus, ces deux souches sont régulièrement utilisées pour la recherche, d'où l'intérêt de valider ce modèle sur ces dernières. Les souris utilisées seront de jeunes adultes, entre 6 et 10 semaines (6 semaines lors du début du protocole, et 10 semaines arrivées à la fin du protocole). Le projet est réalisé avec des jeunes adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.
Etude du rôle d’une protéine (serine/thréonine kinase) dans le développement des lymphocytes T in vivo
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
117 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger pour 81 d'entre elles et modéré pour 36. Elles sont irradiées puis reçoivent une greffe de cellules immunitaires par voie intraveineuse, suivie de prélèvements sanguins et d'injections intrapéritonéales répétées. Le projet étudie une protéine kinase dont l'inactivation provoque chez la souris un syndrome proche du lupus. Le porteur indique tuer les animaux pour analyses ou parce qu'ils ne portent pas le génotype recherché, et affirme que le modèle souris reste "indispensable" après une étape in vitro.
Objectifs
La réponse immunitaire résulte de l’action combinée des cellules de l’immunité innée comme les cellules dendritiques dont la mission est de patrouiller dans l’organisme à la recherche de cellules infectées ou tumorales, et des cellules de l’immunité adaptative comme les lymphocytes B et T qui reconnaissent de manière spécifique les pathogènes. L’interaction entre toutes les cellules de l'immunité est indispensable pour permettre une réponse immunitaire efficace et l’éradication des pathogènes. S’il doit nous protéger contre les agressions extérieures, le système immunitaire doit aussi apprendre à tolérer ses propres constituants, c’est-à-dire le « soi ». Cependant dans certains cas, une sur-activation des lymphocytes T et/ou un défaut de la régulation de la réponse immunitaire peuvent provoquer l’apparition de maladies auto-immunes. Dans ce cas, des lymphocytes T auto-réactifs vont s’attaquer spécifiquement à des tissus ou organes au lieu de les protéger comme dans le cas du syndrome du Lupus. Ce projet va porter sur l’étude du rôle d’une protéine importante pour l’activation du lymphocyte T et dont nous étudions le rôle in vitro et in vivo.
Bénéfices attendus
Une dérégulation du système immunitaire peut entrainer l’apparition de maladies auto-immunes chez l’homme. Nous avons identifié une protéine dont l’inactivation dans les lymphocytes T chez la souris entraine le développement d’un syndrome auto-immun ayant des caractéristiques du syndrome lupique chez l’homme. Caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires de cette molécule dans l’apparition des symptômes lupiques et plus généralement dans l’apparition de maladie auto-immune pourrait donc de la considérer comme une éventuelle cible thérapeutique de maladies auto-immunes.
Procédures
Dans une première procédure des souris vigiles seront irradiées. Quatre heures après l’irradiation, les animaux anesthésiés seront injectés par voie intraveineuse (durée de l’anesthésie < 5 minutes). Six semaines après l’injection, un prélèvement sanguin sera réalisé sur les animaux vigiles (durée du geste 10 secondes). Un second prélèvement sanguin pourra être réalisé sur certains animaux, deux semaines après le premier prélèvement (durée du geste 10 sec). Dans une seconde procédure, un prélèvement sanguin sur animal anesthésié (anesthésie
Impact sur les animaux
Intervention subie : Irradiation et greffe. L’irradiation des animaux entrainera une éradication des cellules de la moelle osseuse des animaux. L’irradiation et l’aplasie qui en découlent ne sont pas douloureux pour les animaux. Les animaux recevront 4 heures après l’irradiation, une injection intraveineuse de cellules immunitaires (=greffe) pour reconstituer leur système immunitaire. Les nuisances attendues suite à cette administration seront celles liées à l’injection d’un produit non douloureux par voie intraveineuse. Néanmoins dans le cas, où la greffe ne prendrait pas (cas rare), les animaux pourraient présenter une altération de l’état général (perte de poids/prostration) qui conduirait à la mise à mort des animaux concernés. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements dans l’abdomen seront celles liées à l’injection de produits non douloureux et non toxiques en intrapéritonéale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem ou parce qu'ils ne présentent pas le génotype d'intérêt.
Remplacement
Après des premières étapes d’analyse et de validation dans des lignées cellulaires in vitro, le projet a pour but maintenant d’étudier le rôle de notre molécule d’intérêt dans le système immunitaire d’un organisme vivant et intégré comme la souris. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation du modèle souris reste indispensable pour le présent projet.
Réduction
Le nombre de souris par groupe est réduit au maximum afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante. Le nombre d'animaux a été calculé à l'aide d'un outil statistique De plus les croisements des lignées de souris ont été optimisés afin d’obtenir le maximum d’animaux avec un phénotype utilisable dans nos expériences.
Raffinement
Les souris sont manipulées par des personnes entrainées aux injections. Les injections intraveineuses seront effectuées sous anesthésie gazeuse afin d’éviter tout stress et douleur chez la souris. L’état général des souris ayant été irradiées sera suivi quotidiennement pendant les 2 premières semaines afin de détecter le mal être dû à une éventuelle non-reconstitution. Des antibiotiques pourront le cas échéant être mis dans l’eau de boisson afin de prévenir les risques d’infection. Les animaux seront suivis quotidiennement grâce à une grille de score qui permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en immunologie, car la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle de choix pour étudier les mécanismes de tolérance et le développement d’auto-immunité. Enfin, la connaissance complète du génome murin permet de disposer de souches murines parfaitement définies et de modèles génétiquement modifiés. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 12 semaines afin que leur système immunitaire soit mature.
ONCO-SC-HIS-hydrodynamique : Evaluation de thérapies cancéreuses en immunologie sur des modèles de tumeurs greffées en sous cutané sur des souris humanisées, avec injections hydrodynamiques
- Recherche appliquée
- Cancers
3 750 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cette prestation commerciale greffe des tumeurs humaines sous la peau ou dans la graisse mammaire, avec injections hydrodynamiques à fort volume, imagerie et parfois rayonnements ionisants, jusqu'à des pertes de poids et des nécroses tumorales. Le porteur teste des candidats médicaments pour des clients et greffe 10 % d'animaux surnuméraires pour compenser les échecs de prise. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne prédit l'efficacité in vivo et juge les modèles 3D "marginaux".
Objectifs
Dans le monde, il est constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, 19 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués avec 10 millions de décès des suites de cette maladie. Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. 1/8 hommes et 1/11 femmes en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation du processus contrôlant la prolifération, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Bien que possédant des caractéristiques communes, les differents cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente aux traitements. Une des cibles communes à tous les cancer est une approche thérapeutique qui agit sur le système immunitaire d’un patient pour lutter contre sa maladie. En effet, les cellules cancéreuses sont capables d’inactiver les défenses de l’organisme. Le microenvironnement tumoral devient alors immunosuppresseur et empêche l’arrivée sur place des défenses immunitaires. Cette approche se fonde sur l’utilisation de différents outils : vaccination, anticorps monoclonaux, immunomodulateurs, cytokines. Afin d’étudier les interactions physiologiques des cellules immunitaires avec les cellule cancéreuses il est nécessaire de disposer de modèle murins contenant des cellules immunitaires humaines. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles déjà mis en place dans notre société, et de les humaniser afin de les rendre plus prédictifs pour mieux évaluer de nouveaux médicaments. Cette évaluation permettra d’étudier ces molécules dans un contexte physiologique le plus proche possible de l’homme avant les essais cliniques. Les animaux sont utilisés pour déterminer l’efficacité antitumorale des composés testés, déterminer leur pharmacocinétique, leur toxicité, leur concentration active, et pour les comparer avec des composés cliniques de références. A ce jour, aucune méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation des animaux pour évaluer l’efficacité d’un composé. De plus, les animaux autorisent une grande variété de techniques d’administration, de prélèvements et de chirurgies permettant de créer des modèles dans lesquels l’évolution de la maladie et le traitement sont proches de la situation clinique.
Bénéfices attendus
Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer, spécifiquement les cancers d’origine osseuse ou à métastases osseuses. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.
Procédures
L’implantation de transpondeur pour identifier l’animal est réalisée sous anesthésie générale 0-3 jours avant la greffe (
Impact sur les animaux
Trois types de greffe pourront être faites : Sous cutanée, intradermique et graisse mammaire. Il y aura une évolution du volume tumoral ce qui entrainera une distension de la peau. Pour limiter cette tension qui peut engendrer une douleur ou une gêne dans la mobilité, le volume tumoral maximal sera limité. Il est possible que des nécroses apparaissent. La tumeur n’étant pas innervée, seules les plaies en surface peuvent engendrer une douleur. Par conséquent, la taille de la nécrose en surface sera limitée et des soins seront apportés. Il est aussi possible, que la progression tumorale entraîne une cachexie constatée par une perte de poids. Dans ce dernier cas, dès la greffe tumorale, de la nourriture enrichie sera apportée afin de limiter la perte de poids. Il est possible, que la progression tumorale entraîne une cachexie constatée par une perte de poids. Afin d’observer des effets de composé sur l’évolution de la tumeur, les animaux recevront des traitements de différents composés par voie IM, ID, SC, IP, IV et/ou seront exposés à des rayonnements ionisants. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress de 1 à 2 jours. En fonction du comportement des animaux ou bien des besoins de l’étude, il sera possible d’isoler des animaux.. Il est possible que l’injection hydrodynamique engendre une douleur et une perte de poids transitoire. L’injection hydrodynamique sera réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane) et les souris seront placées sur un tapis thermochauffant pendant 15 min à 37°C et traitées par un antalgique avant et après l’injection (buprénorphine). Les souris seront observées pendant une heure suivant l’injection hydrodynamique. Le poids des animaux sera enregistré 4 fois par semaine incluant le jour de l’injection la semaine qui suit cette injection. Les mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation. Ces mesures seront faites dans les salles de stabulation. Les autres manipulations seront faites en laboratoire afin de ne pas stresser les autres animaux.
Devenir
Du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, ils seront tous mis à mort en fin de procédure.
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposable à l’homme.
Réduction
Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (volume tumoral et niveau d’humanisation). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés : en général un groupe non traité puis un groupe par schéma de traitement (différentes doses, voies, molécules etc). Au minimum, une étude comportera un groupe avec tumeur, non traité, et un groupe avec tumeur, traité avec le composé à tester. Toutefois, dans la mesure du possible, le maximum de composés seront testés au cours de la même étude afin de ne pas démultiplier les animaux contrôles. Le nombre d’animaux par groupe est choisi sur la base des précédentes études réalisées dans nos laboratoires pour les modèles connus (en général 6 à 15 animaux) afin de sélectionner le nombre d’animaux minimum pour observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et volume tumoral). Moins de 5 études sont réalisées chaque année, mais le nombre peut varier en fonction des commandes des clients. Une étude peut être composée de 1 (dans le cas d’un développement d’un nouveau modèle) à 10 groupes. Le nombre d’animaux par groupe varie généralement entre 6 et 15 par dose de produit, ce nombre sera adapté en fonction de la connaissance interne du modèle ou en fonction des études réalisées dans la littérature. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal pour remplacer des analyses terminales en cours d’étude et donc éviter de multiplier les groupes nécessaires. Pour compenser le taux de prise variable de certaines tumeurs, et la variabilité intrinsèques de certains modèles, il sera nécessaire d’inclure des animaux surnuméraires. Ce nombre d’animaux surnuméraire est réduit à un maximum de 10% (pour 100 animaux, 110 seront greffés). Ces animaux exclus seront valorisés soit pour remplacer des animaux des groupes traités constitués, soit pour servir de contrôle ou de calbration lors des analyses (par exemple en cytométrie de flux pour les calibrations.
Raffinement
Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine et 4 fois par semaine la semaine qui suit l’injection hydrodynamique: • 5% sera observée sur certains animaux. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, les traitements seront interrompus.
Choix des espèces
Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. Le statut immunodéprimé de l’animal choisi est également important pour évaluer l’immunothérapie du cancer, car l’espèce choisie doit simultanément tolérer la transplantation de tumeurs humaines et de cellules immunitaires humaines. Pour finir, les souris et les rats autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (6 semaines d’âge minimum pour leur réception et 8 semaines pour la manipulation).
Evaluation de molécules à visée thérapeutique sur l’inflammation et la douleur viscérale dans un modèle de maladies chroniques de l’intestin (MICI) induit par le Dextran Sulfate Sodium (DSS) chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
1 580 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un colorant chimique dans l'eau de boisson provoque une inflammation douloureuse du côlon, puis les souris subissent des distensions colorectales par une sonde introduite dans le rectum jusqu'à l'apparition de crampes, ainsi qu'un test de douleur de Von Frey. Le porteur teste des molécules de clients "dont il ne connaît ni la nature ni les effets secondaires possibles", ce qui l'empêche d'anticiper les nuisances. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la maladie et juge le recours à l'animal "incontournable".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur l’inflammation et la douleur dans un modèle de maladies chroniques de l’intestin (MICI) induit par le DSS (Dextran Sulfate Sodium) chez la souris.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI).
Procédures
Le modèle d’hypersensibilité viscérale induit par le Dextran Sulfate Sodium dans l’eau de boisson provoque des douleurs abdominales, une inflammation du colon provoquant une douleur importante pouvant s’accompagner d’une perte de poids, une diminution de l’état général et du comportement pouvant conduire à la mort de l’animal. Le test de Von Frey peut provoquer un stress du fait de la manipulation des animaux et une certaine douleur lors de l’application de filaments. Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux occasionnés par le traitement pharmacologique.Tous les animaux subiront au minimum deux séances de distensions colorectales (1 séance dure environ 1H entre le temps d’introduction du ballon et du système d’enregistrement et la distension en elle-même). Ceci consiste à introduire une sonde dans le colon de l’animal via le rectum et à appliquer des pressions croissantes par palier jusqu’à l’obtention d’un comportement douloureux chez l’animal (observation de crampe abdominale). Un système de sonde d’enregistrement des pressions intra-coliques est également introduit dans le colon via le rectum. Selon les souhaits des clients, des prélèvements sanguins sur animal vigile ou anesthésié pourront être réalisés (environ 5-10 min par prélèvement). Les animaux seront pesés fréquemment et la consistance de leur fèces sera observée et évaluée (méthode non invasive pour l’animal qui va durer environ 5-10 min). Les candidats médicaments étant définis par le(s) client(s), la fréquence, la voie et le volume des administrations seront variables (compter environ 5 min par administration maximum). Les animaux subiront également un test de Von Frey qui est un test de sensibilité à un stimulus douloureux (application de filaments de forces croissantes et observation de la réaction de l’animal, habituation au set up de 30 min environ puis le test en lui-même dure 15-30 min selon le nombre d’animaux, sachant que pour chaque animal cela va durer 5 min maximum).
Impact sur les animaux
Nous savons que le DSS va induire une inflammation du colon provoquant chez les animaux des diarrhées, des ulcérations et autres phénomènes inflammatoires du colon avec tous les problèmes digestifs et douloureux qui en découlent. Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront soit gardés en vie pour suivre une autre procédure, soit sacrifiés à la fin de l’expérimentation car des prélèvements tissulaires (colon par exemple) seront réalisés.
Remplacement
Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). Actuellement, aucun modèle in vitro ne peut mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. 10 animaux/groupe est le minimum nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs dû à la variabilité interindividuelle des réponses étudiées.
Raffinement
Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés 5 /cage maximum pour respecter l’espace de chaque animal dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux (igloo, carré de coton, aspen brick…). L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 48h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.
Choix des espèces
Ce modèle est bien décrit dans la littérature chez la souris. Classiquement les animaux utilisés seront au moins âgés de 6 à 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines. Toutefois, selon des demandes particulières des clients, l’âge des animaux pourrait être différent.
Développement d’une stratégie thérapeutique par administration intrapéritonéale capable de ralentir la progression ou de guérir la néphronophtise chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections intrapéritonéales répétées tous les quatre à sept jours pendant deux à sept mois, un séjour de 48 heures en cage métabolique, un prélèvement rétro-orbital, puis une mise à mort par dislocation cervicale pour prélever les organes. Le projet teste des doses croissantes d'une molécule contre la néphronophtise, une maladie rénale génétique. Le porteur indique avoir mené les premières recherches sur cellules mais affirme qu'aucun modèle cellulaire ne permet d'étudier un rein, et renvoie le bénéfice, éviter la greffe rénale, au long terme.
Objectifs
Récemment, une molecule a montré un potentiel thérapeutique après 2 mois de traitement dans un modèle murin qui reproduit en partie la néphronophtise humaine, avec l’observation de lesions rénales à partir de 3 mois. L’objectif de ce travail est d’évaluer dans ce modèle murin l’efficacité thérapeutique de doses croissantes de la molécule, administrée pendant une durée plus longue (de 1 à 5 mois de vie) pour prévenir l’apparition de lésions rénales, ou administrée à un stade plus tardif de la maladie (5 mois de vie) pour évaluer l’efficacité à guérir les lésions rénales apparues.
Bénéfices attendus
L’ensemble des résultats de ce projet devrait permettre de valider l’administration intrapéritonéale d’un composé thérapeutique, participant ainsi au développement d’un médicament qui permettra à terme d’éviter la greffe rénale aux patients souffrant de néphronophtise.
Procédures
Les 920 animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales uniques (durée : 5-10 secondes/injection), ou répétées tous les 4 ou 7 jours pendant 2, 4 ou 7 mois à l’aide de seringues très fines qui donnent une injection quasi indolore grâce à la forme biseautée de l’aiguille. Les 920 animaux seront également soumis à une mise en cage métabolique, dans le calme dans une pièce dédiée, pendant 48 h : 24h d’adaptation et 24h de recueil des urines. Pendant les 48h, les souris ont accès à l’eau et à la nourriture. A la fin du recueil, les souris sont regroupées dans leur cage d’origine dont la litière n’a pas été changée. Enfin, chacun des 920 animaux sera soumis à un prélèvement rétro-orbital sous anesthésie générale (durée : 30 secondes/prélèvement), une seule fois le jour de la mise à mort à l’aide de micro-capillaires héparinés. A la fin du prélèvement, les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale (durée : 2 secondes/dislocation).
Impact sur les animaux
L’administration répétée par injection intrapéritonéale comporte un risque d’irritation au point d’injection. Si cela est observé, les injections seront suspendues jusqu’à disparition de celle-ci et une solution apaisante sera appliquée. Par ailleurs, la mise en cages métaboliques des animaux pendant 48h peut générer un stress lié à l’isolement.
Devenir
A la fin de ce projet, les 920 animaux seront mis à mort afin de collecter les organes post-mortem pour analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Les recherches préliminaires ayant permis l’identification de la molécule thérapeutique qui fait l’objet de cette étude ont été menées sur des lignées de cellules afin de limiter le recours à l’expérimentation animale. Néanmoins, compte tenu de l’absence de modèle cellulaire permettant l’étude d’un rein, il n’a pas été possible du substituer des approches cellulaires aux modèles murins impliqués dans ce projet à visée thérapeutique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum (entre 5 et 20 animaux par groupe de traitement) permettant d’atteindre des résultats statistiquement significatifs. Pour l’étude statistique, nous utiliserons un test approprié pour comparer les groupes d’animaux deux à deux.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie et deux fois par semaine par le responsable du projet afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne en charge du projet. Afin d'assurer aux animaux les meilleures conditions d'hébergement, nous ajouterons dans la cage du coton, des maisonnettes en carton ou des tunnels ainsi que des bâtonnets de bois à ronger. Les souris seront hébergées par 5 en cage ventilée. Afin de limiter la possibilité d’une souffrance due aux injections i.p. répétées, les injections seront réalisées avec des seringues Insuline très fines qui donnent une injection quasi indolore grâce au biseau à trois facettes. Si la zone d’injection présente une irritation, les injections seront suspendues jusqu’à disparition de celle-ci et une solution apaisante sera appliquée (Douxo Calm). Par ailleurs, la mise en cages métaboliques des animaux pendant 48h peut générer un stress lié à l’isolement. Afin de limiter ce stress, une période d’adaptation de 24h est réalisée. La mise en cage métabolique s’effectue dans le calme dans une pièce dédiée afin de diminuer au maximum le stress occasionné. Les souris ont accès à l’eau et à la nourriture. A la fin du recueil, les souris sont regroupées dans leur cage d’origine dont la litière n’a pas été changée. Avant la mise à mort, lors de la phase terminale, les animaux seront anesthésiés via une injection intrapéritonéale d’un mélange de Kétamine/Xylazine (0,1mL/10g souris) à la dose de 160mg/kg pour la Kétamine et 8mg/kg pour la Xylazine. Des points limites spécifiques ont été définis sur une grille de score de sévérité allant de 0 à 3. Les souris sans perte de poids ayant un score compris entre 2 et 3 recevront un analgésique (Ketoprofen 5mg/kg) et seront observées quotidiennement. Les souris avec un score ≥3 ou ayant une perte de poids de plus de 20% par rapport à leur poids initial, seront mises à mort par inhalation progressive de CO2 dans un système dédié. Les souris ayant une perte de poids comprise entre 10 et 20% par rapport à leur poids initial seront observées tous les jours et auront accès à un complément nutritionnel hydraté (DietGel). En cas d’échec de la complémentation ou du traitement par analgésique, les animaux seront mis à mort par inhalation progressive de CO2 dans un appareil dédié.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction et elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, la souris partage avec l’homme un nombre de néphrons fixés après la fin de la néphrogénèse contrairement aux poissons et aux batraciens. C’est également un modèle indispensable pour les essais pré-cliniques. Pour étudier l’efficacité du traitement à prévenir l’apparition de lésions rénales, le traitement sera initié à 1 mois de vie (avant le début de la maladie) et sera poursuivi jusqu’à 5 semaines de vie pour analyser un marqueur de réponse rapidement après le traitement ou jusqu’à 5 mois de vie, pour évaluer l’état des lésions rénales à l’âge de la phase exponentielle de la maladie. Pour évaluer l’efficacité du traitement à guérir les lésions rénales, le traitement sera initié à 5 mois de vie, après apparition des lésions rénales, et l’efficacité du traitement à guérir ces lésions sera évaluée entre 7 et 12 mois de vie.
Étude de la locomotion, de la force musculaire et de la susceptibilité à l’épilepsie de souris modèle pour des maladies neurodégénératives et neuromusculaires à inclusions intranucléaires
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Pour étudier l'effet de mutations responsables de maladies neuromusculaires et neurodégénératives à inclusions intranucléaires, elles reçoivent des vecteurs viraux AAV dans le muscle ou derrière l'œil, puis passent chaque mois, pendant 18 mois, une batterie de rotarod, grip test, marche sur planche à trous et open field, ainsi qu'une mesure de force musculaire sous anesthésie. Le suivi s'achève par une injection de pentylènetétrazole, un agent pro-convulsivant qui peut déclencher des crises myocloniques, cloniques ou toniques, et toute souris dont la crise dépasse dix secondes est mise à mort. Le porteur classe pourtant tout le projet au niveau léger, et juge "indispensable" de disposer de souris pour identifier l'effet de ces mutations "à l'échelle de l'organisme entier".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier le phénotype locomoteur, la force musculaire et la survenue de crises d'épilepsie dans des souris modèles de maladies humaines neurodégénératives et neuromusculaires. Ces maladies sont dues à des anomalies de l’ADN qui entrainent une perturbation du fonctionnement des neurones et des muscles squelettiques des patients, conduisant à des altérations de leur locomotion et de leur mouvements (perte d’équilibre, tremblements, faiblesse musculaire, etc.), ainsi qu’à des crises d‘épilepsies. Nous souhaitons donc générer des modèles de souris pour ces maladies pour ainsi étudier leur phénotype locomoteur, leur force musculaire ainsi que leur susceptibilité à l’épilepsie. Pour cela nous effectueront une batterie de test non invasif de leur locomotion et de leur force musculaire, ainsi qu’un test de susceptibilité à l’épilepsie par injection d’une dose modérée de l’agent pro-convulsivant pentylènetétrazole (PTZ). La compréhension de l’effet de ces mutations sur le fonctionnement du cerveau et des muscles squelettiques nous permettra ainsi de mieux comprendre ce type de maladie chez l’homme et ainsi espérer découvrir des pistes thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Nous avons besoin de modèles animaux pour reproduire et étudier les maladies à inclusion intranucléaire car il n’existe pas de modèle in vitro ou de système cellulaire pour étudier les symptômes neurodégénératifs, la faiblesse musculaire et les altérations de la locomotion caractéristiques de ces pathologies. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour étudier des altérations de la locomotion, de la force musculaire et des troubles neurodégénératifs (ataxie, tremblements, épilepsies, etc.). Enfin, l’expression de mutation humaine et la création de modèle de maladie est très bien maitrisée chez la souris. Nous souhaitons donc analyser l’altération de la locomotion et de la force musculaire et l’apparition de troubles neurodégénératifs, notamment d’épilepsie par un test de sensibilité à l’agent pro-convulsivant pentylènetétrazole (PTZ), dans des souris porteuses des mutations responsables de pathologies neuromusculaires et/ou neurodégénératives : les maladies à inclusions intranucléaires. En conclusion, le développement et l’analyse de ces nouveaux modèles murins nous permettront de mieux comprendre les mécanismes pathologiques de ces mutations. De plus, à l’avenir ces modèles animaux seront essentiels pour tester la pertinence de pistes thérapeutique pour le traitement de ces patients.
Procédures
1 – L’injection de produits anesthésiques (xylazine/kétamine) en intrapéritonéale requiert moins d'une minute. 2 – Les injections intramusculaires ou rétro-orbitaires de constructions adénovirales (AAV) requièrent entre 30 secondes et 1 minute par animal. 3 – L’analyse de la locomotion se fait par une batterie de tests non invasifs réalisés chaque mois et ceci sur une période de 18 mois. Ces tests s’étalent sur une durée de 2 semaines selon un protocole classique : pour le rotarod, 3 tests de 5 min sont réalisés par souris ; le grip test et la marche en équilibre sur planche à trou sont aussi réalisés trois fois (environ 5 min) par souris et l’open field est un test de 30 minutes par animal. 4 – La mesure de la force musculaire est réalisée en 4 à 8 minutes sous anesthésie gazeuse par inhalation d’isoflurane (0,5 à 1,5% mélangé à de l’oxygène). Cette mesure est répétée chaque mois (mais en décalage de 15 jours avec les tests locomoteurs) et ceci sur une période de 18 mois. 5 – L’injection du pentylenetetrazole (PTZ) en intrapéritonéale requiert moins d'une minute.
Impact sur les animaux
Nous souhaitons étudier des maladies neurodégénératives et neuromusculaires touchant les adultes, et ceci en utilisant un modèle animal, nous nous attendons donc à l’éventuelle apparition d’altérations locomotrices, de faiblesse musculaire et/ ou de signes neurodégénératifs (épilepsie, tremblements, etc.) chez ces souris. Toutefois, afin de limiter la douleur induite par les symptômes, nous n’étudierons que les premières étapes de l’apparition de ces symptômes et les animaux seront euthanasiés avant que la phase terminale de la maladie n’apparaisse. De plus, les tests locomoteurs que nous utiliserons pour évaluer l’apparition de ces altérations sont classiques, non invasifs et sans douleur. De même, il est à noter que la mesure de la force musculaire se fait tous sous anesthésie. Enfin, concernant le test de susceptibilité à l’épilepsie, suite à l’injection d’une dose modérée de pentylènetétrazole (PTZ), des crises myocloniques, myocloniques (contractions rapides et brutales des muscles), cloniques (spasmes rythmés) ou toniques (augmentation accrue du tonus musculaire ou raideur) peuvent éventuellement survenir. Toutefois, si une crise durait exceptionnellement plus de 10 secondes, l’animal serait immédiatement mis à mort pour éviter toute souffrance.
Devenir
Les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure afin d’étudier leurs tissus (muscle, cerveaux, etc.) pour des analyses histopathologiques et moléculaires.
Remplacement
Cette étude a pour but l'étude de maladies neuromusculaires et/ou neurodégénératives causées par des mutations génétiques. Nous souhaitons comprendre les mécanismes biologiques qui découlent de ces mutations et notamment leurs effets sur la locomotion, la force musculaire et l’apparition de troubles neurodégénératifs (ataxie, tremblements, etc.) avec notamment l’apparition d’éventuelles crises épileptiques typiques de ces maladies. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal pour identifier l’effet de ces mutations à l’échelle de l’organisme entier ; des modèles cellulaires ou un in vitro ne peuvent pas reproduire ces troubles de la locomotion, de la force musculaire et/ou des crises épileptiques et apporter un même niveau d’information. De plus, nous avons établi précédemment que le modèle souris est un bon modèle animal d'étude de ces maladies.
Réduction
L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Des travaux précédents nous ont permis d’établir les doses de virus à injecter, les temps d'analyses et que l’étude de groupes de 10 animaux chacun permettait d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le facteur de comparaison sera la présence de la mutation (comparaison des souris exprimant la mutation génétique versus des souris contrôles). Compte tenu de notre projet d’analyser les conséquences de mutations responsables de plusieurs maladies à inclusions intranucléaires à la fois sur les muscles squelettiques et les neurones du système nerveux central, nous estimons que l’étude d’environ 200 animaux sur 5 ans est nécessaire.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. De plus, afin de limiter d’éventuelles douleur induite par l’apparition de symptômes locomoteurs, nous n’étudierons que les premières étapes de l’apparition de ces symptômes et les animaux seront euthanasiés avant que la phase terminale de la maladie n’apparaisse. Toutefois, si des signes de douleur apparaissaient (réduction de l’appétit, diminution de la mobilité et du comportement exploratoire, tendance à l’isolement, poil terne et hérissé, dos voûté), nous ferons alors un traitement analgésique et anti-inflammatoire. De plus, de la nourriture gélifiée sera de plus mise à disposition de l'animal dans la cage dès les premiers signes de problème moteur pour palier tout risque de réduction de prise de nourriture. Enfin, en cas de douleur forte (isolement, immobilité, automutilation, cachexie, etc.) et/ou d’échec des traitements précèdent ; les animaux seront euthanasiés rapidement pour éviter toute souffrance et l’expérience stoppée.
Choix des espèces
La souris est l'animal de choix pour l'études de mutations génétiques responsables de pathologies à l’échelle de l’organisme entier. Notre objectif est d'étudier l’importance de mutations responsables de maladies neuromusculaires et/ou neurodégénératives et plus précisément sur l’apparition d’altérations locomotrices, d’une faiblesse musculaire et/ou de crises d'épilepsies. Aucun modèle d’expérimentation in vitro ou cellulaire ne peut mimer ou refléter toute la complexité de ces mécanismes biologiques. Nous allons étudier le comportement locomoteur et la force musculaire chez des souris adultes, en effet les mutations que nous étudions s’expriment vers l’âge de deux mois, donc des souris sevrée et adultes. Enfin, nous suivrons le comportement locomoteur et la force musculaire de ces animaux sur une période de 18 mois suivie par un test de sensibilité au pentylènetétrazole (PTZ). Ce protocole a été choisi d’après l’étude de la littérature et afin de reproduire l’aspect progressif et neurodégénératif des maladies étudiées.