Rongeurs

3 900 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent jusqu'à deux chirurgies cérébrales, l'une pouvant durer quatre heures, puis des manipulations optogénétiques, des enregistrements électrophysiologiques et des injections intracérébrales, sous restriction d'eau et récompensés au sucrose pour apprendre à appuyer sur un levier à un signal sonore. Une partie subit une induction de la maladie de Parkinson, avec réduction de l'activité motrice et comportement de rotation. Le porteur revendique le rat comme "espèce de choix" et affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut reproduire la complexité des ganglions de la base.

Objectifs

La mise en œuvre de ces protocoles expérimentaux vise la compréhension et l’identification des activités neuronales impliquées au cours de l’exécution d’un mouvement volontaire chez des rats en situations physiologique ou lors de maladies motrices graves comme la maladie de Parkinson et une des complications motrices associées telle que les dyskinésies levodopa induite. Pour ce projet, nous utiliserons soit des rats de souche sauvage (Long Evans, ou GAERS) ou modifiés génétiquement (11 lignées différentes de rats transgéniques). Les objectifs principaux de ces protocoles sont l'identification et la manipulation de large ensembles et circuits neuronaux permettant l'expression et/ou l'inhibition de comportements moteurs. Pour réaliser ces objectifs, nous utilisons des approches technologiques de pointes chez l'animal combinant manipulations optogénétiques, enregistrements électrophysiologiques, et manipulations pharmacologiques (par injection intracérébrale). La tâche comportementale que nous avons mis au point consiste à entrainés des rats à effectuer un mouvement d’appuie sur un levier avec leur patte avant en réponse à un stimulus sonore ‘Go !’. L’accès à l’eau sera rationalisé pour ces animaux (restriction hydrique) et pour chaque essai réussi, ils recevront une dose de 40μL de solution de sucrose à 5%. Les expériences optogénétiques, d’enregistrement électrophysiologiques, et de manipulations pharmacologiques commenceront après apprentissage de la tâche chez des animaux normaux ou après induction de la maladie de Parkinson. Les effets de nos manipulations optogénétiques/pharmacologiques seront évalués sur les niveaux de performance moteurs liés à notre tâche et sur l’activité électrophysiologique enregistré en parallèle.

Bénéfices attendus

Ce projet original permettra d’amener des connaissances nouvelles et fondamentales sur le mode de fonctionnement normal et pathologique des ganglions de la base. Il permettra de définir les circuits neuronaux permettant l'expression et/ou l'inhibition de comportements moteurs et ainsi de mieux comprendre le mode d’action de stratégies thérapeutiques utilisées quotidiennement en clinique.

Procédures

Nos procédures expérimentales comportent aux maximum deux chirurgies, la première aura une durée maximale de 4 heures, la deuxième sera inférieure à 1 heure. Les procédures postopératoires et l'analgésie se feront sans douleur. Le stress sera limité avec une habituation progressive à l'expérimentateur. Toutes les procédures ont été régulièrement utilisées en laboratoire. Les expérimentateurs auront une solide expérience dans l'exécution des procédures. Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux enregistrements électrophysiologiques. 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte. 4/ des effets indésirables moteurs unilatéraux inhérents à l'induction de la maladie de Parkinson (réduction de l'activité locomotrice et comportement rotatoire).

Devenir

Toutes les procédures sont terminales car les cerveaux des animaux seront prélevés pour analyse immunohistochimique.

Remplacement

Le but de se projet est de comprendre la physiologie et physiopathologie du réseau des ganglions de la base dans le contrôle de la motrivité volontaire. La seule manière d'atteindre nos objectifs est d'utiliser des approches in vivo mises en place chez l'animal se comportant ce qui nécessite donc le recours à l'utilisation d'animaux. A l'heure actuel, aucun modèle "in vitro" ou "in silico" ne peuvent reproduire la complexité et le mode de fonctionnement des ganglions de la base.

Réduction

Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production: en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés (t-test apparié pour des données paramétriques ou le test de Wilcoxon pour des données non parametrique).

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur, la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’anesthésiques et d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupes sociaux et ont à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. Lors de la partie comportementale, les animaux sont manipulés quotidiennement par l’expérimentateur pour diminuer leur niveau de stress lors des tests. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après chirurgie, et accrue dès qu’un signe d’appel est constaté. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances prolongées aux animaux avec des mesures de soulagement mis en place (réhydratation, réchauffement, et traitements vétérinaires si nécessaire).

Choix des espèces

Le rat est une espèces de choix car l’organisation des ganglions de base est inchangée au cours de l'évolution ce qui nous permet d'extrapoler les résultats que nous observerons à l'espèce humaine et donc de mieux comprendre le rôle de ces circuits dans certains troubles moteurs comme la maladie de Parkinson. Les rats sont des sujets de choix (par rapport au souris) pour toutes les expériences de comportements car ils sont moins sujet au stress et peuvent apprendre des tâches motrices plus complexes. La disponibilité et l'utilisation de rats transgéniques représente un outil précieux pour nos expériences d'optogénétique car elles permettent de manipuler de manière sélective des populations neuronales cibles. Dans ce projet nous utiliserons des rats génétiquement modifiés de type afin de manipuler différentes populations neuronales des ganglions de la bases. Le projet sera réalisé sur des rats agés de plus de 6 semaines, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène pour une bonne reproductibilité des sites d’injection

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle de la maladie d'Alzheimer, elles subissent une neurochirurgie pour implanter un dispositif d'enregistrement, puis des séances d'électroencéphalographie hebdomadaires pendant deux mois et, pour une partie, des injections quotidiennes dans l'abdomen, avant la mise à mort pour analyser le cerveau. Le porteur indique des douleurs post-opératoires et un hébergement en cage individuelle pour éviter que les animaux ne rongent le dispositif. Il présente cette technique comme un futur outil de diagnostic précoce chez l'humain, et affirme que ni la culture cellulaire ni les modèles informatiques ne reproduisent les interactions neurones-astrocytes visées.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer est la plus fréquente des maladies neurodégénératives (900 000 personnes atteintes en France en 2021). Elle est caractérisée par une évolution lente mais progressive de l'atteinte neuronale affectant les capacités de mémorisation et de cognition des patients réduisant progressivement leur autonomie. Cette pathologie complexe est liée à un dysfonctionnement des connections entre neurones qui aboutit à la dégénérescence des neurones de l'hippocampe (structure impliquée dans la mémoire) puis de l'ensemble du cerveau. Les patients doivent endurer une perte irréversible de leurs fonctions cognitives puisqu'à l'heure actuelle, aucun traitement ne permet de stopper l'évolution de la pathologie. Ce constat est notamment dû au fait qu’on ne peut pas diagnostiquer la maladie suffisamment tôt pour proposer un traitement dans la phase de mise en place, encore réversible, de la maladie. Il a été récemment identifié un stade auquel il est possible de stopper la progression de la maladie avec une substance pharmacologique originale. Ce stade est notamment caractérisé par une activité anormale de l’hippocampe chez la souris. De manière intéressante, cette activité anormale de l’hippocampe a également été identifiée chez l’homme par des techniques d’imagerie médicale, qui restent couteuses et invasives. Cette activité de l’hippocampe est prédictive de l’apparition ultérieure de la pathologie chez l’homme. Ce projet vise à étudier la mise en place de cette activité par des techniques in vivo d’électroencéphalographie chez la souris afin de proposer cette technique en complément des techniques de diagnostic actuelles (reposant essentiellement sur des questionnaires cliniques) ou futures (marqueurs sanguins en cours de développement) mais également en suivi de l’efficacité d’un traitement. Des souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer qui manifestent, in vitro, cette activité anormale de l’hippocampe entre 1 mois et 3 mois post-natal seront utilisées. Cette technique in vivo d’enregistrement éléctroencéphalographique pourrait être facilement adaptable à l’homme et proposée en médecine de ville afin de statuer précocement sur la mise en place de la pathologie et proposer des thérapeutiques curatives précoces.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de proposer une méthode diagnostique non invasive et peu couteuse, facilement mise en œuvre en médecine hospitalière et en médecine de ville et visant à mesurer l’activité hippocampale chez des patients susceptibles de présenter des troubles associées à la maladie d’Alzheimer. Chez l’homme, cette activité (mise en évidence par IRM) a été récemment associée aux phases précoces réversibles de la pathologie et est prédictive de l’évolution de la pathologie. Généraliser sa détection, par des techniques non invasives, pourrait permettre de proposer des traitements curatifs empêchant ou retardant l’évolution de la maladie. A l’heure actuelle, le diagnostic de la maladie est tardif car il est essentiellement clinique et s’appuie peu sur les techniques d’imagerie médicale qui restent couteuses. La technique d’électroencéphalographie pourra être envisagée à large échelle et proposée en médecine de ville ou en ambulatoire. Elle pourra également être associée aux méthodes de diagnostic en cours de développement (marqueurs sanguins, etc) pour confirmer le diagnostic, attester du stade de la maladie et proposer des thérapeutiques adaptées. Elle permettra également de suivre l’efficacité des thérapeutiques futures puisque la mise en place de l’activité anormale hippocampale semble être une des étapes critiques induisant l’irréversibilité de la neurodégénérescence.

Procédures

Les souris subissent une neurochirurgie pour une durée de 45 minutes, anesthésie incluse. L'activité des neurones cérébraux des souris sera enregistrée une fois par semaine pendant 1 heure sur une durée de 2 mois. Une partie des souris aura également des injections dans l'abdomen (durée 30 secondes) une fois par jour pendant 2 mois et demi.

Impact sur les animaux

Lors de l'installation du dispositif pour enregistrer l'activité des neurones, sous anesthésie générale, les nuisances ou effets indésirables pourront concerner d'eventuelles douleurs post-opératoires. Cet équipement nécessite de maintenir les animaux isolés en cages individuelles afin d’empêcher que les animaux ne cherchent à ronger le dispositif de leurs congénères. La perte du dispositif est un effet indésirable rare qui conduira à la mis eà mort de l'animal. L’injection quotidienne d’un traitement pharmacologique en intrapéritonéal peut éventuellement induire une douleur légère.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour effectuer des analyses des tissus cérébraux.

Remplacement

Notre approche méthodologique permet d'avoir accès à l’activité d’une structure dans un réseau complexe au sein du cerveau. L'activité des neurones est fortement influencée par la région à laquelle ils appartiennent mais également par l'interaction de ces neurones avec d'autres types cellulaires comme les astrocytes, notamment au sein de l'hippocampe. Ce modèle ne peut donc pas être remplacé par un modèle dépourvu de cette régionalisation et de ces interactions comme la culture cellulaire (in vitro). Même les modèles in vitro les plus performants (cultures tri-dimensionnelles ou organoïdes) ne permettent pas de reconstituer les interactions neurone-astrocyte qui sont impliquées dans la mise en place de l'hyperactivité de l'hippocampe. Par ailleurs, s'agissant des modèles computationnels, ceux-ci ne permettent pas de reproduire l'environnement physiologique dans lequel le peptide β-amyloide est libéré. Ils ne permettent pas non plus d'inclure tous les acteurs potentiels perturbés par cette pathologie.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupes et le nombre de répétitions des expériences sont réduites au maximum tout en optimisant l'interprétation statistique des résultats. Nous testerons 4 lots d'animaux transgéniques et contrôles que nous suivrons de manière hebdomadaire pour les enregistrements EEG : 1) Souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer suivis de 1 mois à 3 mois (périodes d’hyper puis d’hypoactivité hippocampique) : 15 animaux, 2) Souris non transgéniques contrôles suivis de1 mois à 3 mois : 15 animaux, 3) Souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer traitées par HC 030031 (Tocris) en injection ip (5 mg/kg/jour) de 14 jours post-natal à 3 mois : 15 animaux. 4) Souris non transgéniques contrôles traitées par HC 030031 (Tocris) en injection ip (5 mg/kg/jour) de 14 jours post-natal à 3 mois : 15 animaux. Soit, au total, 60 animaux sur 5 ans. Afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées, nous commencerons les enregistrements sur les animaux de 1 mois : si l’hyperactivité n’est pas mise en évidence ou peu perceptible, le projet ne sera pas poursuivi.

Raffinement

Deux jours avant la phase d’implantation, de la nourriture hydratée appétante est disposée dans la cage des animaux à opérer afin de les conditionner à cette prise de nourriture pour une meilleure récupération post-opératoire. L’état de santé des animaux sera suivi quotidiennement tout au long de l’expérience, notamment suite à la chirurgie qui sera effectuée sous anesthésie générale. En post-opératoire les animaux seront placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Les douleurs post-opératoires seront prévenues par injection systématique d’un antalgique. Les cages sont enrichies selon un programme mis en place dans l'animalerie. L'isolement sera limité par le fait que nous utilisons des cages avec grilles, en portoir ouvert, proches les unes des autres. Ainsi, des interactions soaciales persitent, notamment à travers l'olfaction (essentielle), la vision et l'audition. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés avant chaque enregistrement. Les critères de poids, d’apparence physique et de comportement seront pris en compte dans ce suivi. Nous utilisons des seringues microfines pour éviter des nuisances liées aux injections quotidiennes. Les injections seront réalisées en amont des procédures d’implantation et d’enregistrement électroencéphalographique pour éviter d’interférer avec celles-ci (au moins deux heures avant).

Choix des espèces

Les animaux seront utilisés dès 14 jours post-natal (groupe traité pharmacologiquement) car c'est le stade correspondant à la mise en place de la pathologie dans ce modèle. Les implantations seront effectuées à 26 jours post-natal pour démarrer les enregistrements à 1 mois qui correspond au stade pré-symptomatqiue de la maladie dans notre modèle. Les enregistrements seront effectués de manière longitudinale (1 fois/semaine) entre 1 et 3 mois post-natal, qui correspondent respectivement à la phase d’hyperactivité (phase critique réversible) et d'hypoactivité (phase irréversible) dans l’évolution de la maladie d’Alzheimer. La phase d'hyperactivité semble être une étape critique dans le développement de la maladie et son identification par enregistrements électro-encépaholographiques permettrait un diagnostic précoce chez l'homme.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'une alimentation riche en graisses, elles subissent des prélèvements sanguins et des injections intrapéritonéales destinées à provoquer une fibrose du foie, avant la mise à mort. Le porteur décrit une perte de poids et des lésions possibles au site d'injection, rougeur, infection ou nécrose. Il indique mener des travaux in vitro en parallèle, mais affirme l'expérimentation in vivo "nécessaire" pour reproduire les interactions entre organes.

Objectifs

L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires mais s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées, en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, pouvant progresser jusqu’au cancer du foie. Plusieurs facteurs sont impliqués dans la progression de ces complications, comme la résistance à l'insuline, le microbiote intestinal, les stress cellulaires et l'inflammation. Cependant, aucun traitement pharmacologique n’est encore disponible et une meilleure compréhension de l'évolution de ces complications est nécessaire pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine que l’on retrouve à la surface des cellules immunitaires, appelée CD44. Celle-ci joue un rôle dans l’inflammation du foie. Chez les patients atteints de complications hépatiques, la présence de CD44 est augmentée dans le foie en comparaison aux patients sains. De plus, la neutralisation de CD44 prévient et corrige les complications hépatiques, en régulant le recrutement et l’activation de cellules immunitaires dans le foie. Par l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour inactiver le gène CD44 dans toutes les cellules de l’organisme (CD44 Knock Out (KO) systémique), et soumis à un régime favorisant l’apparition de complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer l’implication et le rôle de CD44 et d'observer les conséquences biologiques lors de sa suppression au cours des complications hépatiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la validation in vivo du rôle de la glycoprotéine CD44 dans un contexte de complications hépatiques liées à l’obésité et de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie.

Procédures

En fonction des procédures, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Les animaux nourris avec une alimentation riche en graisses seront prélevés deux fois, en milieu et en fin de régime. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Des injections intra-péritonéales seront également effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Ces injections ne durent que quelques secondes et leur fréquence ne dépassera pas deux injections par semaine.

Impact sur les animaux

Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Ces effets indésirables sont principalement la perte de poids chez l’animal. Les injections par voie intra-péritonéale pourront entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose...).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Nous utiliserons pour chaque procédure un nombre minimum d'animaux qui nous permet de réaliser des études statistiques robustes et pertinentes.

Remplacement

Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons un schéma de croisement qui génère 50% de souris WT et 50% de souris KO (50% de souris contrôles et 50% de souris dont le CD44 est non-fonctionnel) ce qui évite la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes (tests non-paramétriques de Mann-Whitney et ANOVA). Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites une seconde fois pour confirmer la significativité statistique quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expérience.

Raffinement

Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et sacrifices des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.

Choix des espèces

La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour la procédure 1 (souris mâles), la mise sous HFD ou Western Diet sera effectuée à environ 8-10 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. En effet, un régime riche en graisse induit une prise de poids importante. L’utilisation d’un tel régime peut durer jusqu’à 32 semaines, d’où la nécessité d’avoir des animaux relativement jeunes. Pour la procédure 2 (souris mâles ou femelles), le traitement au CCl4 débutera à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie sous anesthésie, implantation d'un cathéter ou d'un dispositif médical, non pour produire des connaissances mais pour former et entretenir les compétences chirurgicales du personnel, puis est mis à mort pour vérifier la qualité du geste. Le porteur décrit une douleur et un stress attendus, une perte de poids et une baisse d'activité dans les quarante-huit heures. Il indique que des mannequins couvrent les gestes de base, mais présente l'entraînement sur souris vivantes comme "requis" par la réglementation et par la maîtrise des interventions.

Objectifs

Tous les personnels impliqués dans des études menées sur des animaux ont pour obligation d'acquérir et de maintenir leurs compétences tout au long de leur carrière. L’objectif de ce projet est de former et d'actualiser les compétences du personnel sur différents actes techniques impliquant de la chirurgie dans le but de réaliser les gestes techniques nécessaires aux études pré cliniques développées au sein de la société. Les actes chirurgicaux nécessitant une expertise élevée, l'acquisition de ces compétences est requise afin que ceux-ci soient réalisés de façon maîtrisée et reproductible.

Bénéfices attendus

L'acquisition et le maintien de compétences de gestes techniques en chirurgie est un requis réglementaire et permet d’acquérir et de maintenir la dextérité et la technicité permettant de limiter les dommages infligés à l’animal et les niveaux de douleurs non conformes au type de chirurgie réalisée. La maitrise des techniques chirurgicales obtenues par le maintien des compétences contribue par la suite à une réduction du nombre d’animaux dans les procédures. En effet, un geste technique maitrisé permet de réduire au strict minimum le nombre d’animaux nécéssaires. D’où l’importance de ce projet, quant à l'acquisition et au maintien des compétences du personnel intervenant sur les animaux.

Procédures

Au cours de sa vie, un animal ne pourra être impliqué que dans une procédure maximum de cette demande de projet. Pour tous les animaux l’identification (quelle que soit l’identification) dure 30 secondes. Pour les procédures comportant l’anesthésie chimique, le temps d’injection de l’anesthésique est estimé à 30 secondes. Les temps d’intervention sur l’animal estimés pour chaque procédure chirurgicale sont les suivants : - Procédure 1 (Implantation de cathéter) : environ 1 heure - Procédure 2 (Implantation de dispositifs médicaux) : environ 30 minutes. Les temps d’injection des anti douleurs sont estimés à 30 secondes.

Impact sur les animaux

Toutes les procédures de ce projet incluant des gestes chirurgicaux, un certain niveau de douleur et de stress est attendu nécessitant une anesthésie et analgésie pré et post-opératoires appropriées. Pour chaque procédure, la possibilité d’administrer une dose supplémentaire d’analgésique durant la période opératoire et post-opératoire en cas de signe visible de douleur est prévue. Une perte de poids et une réduction de l’activité peuvent être observées dans les 48h suivant les interventions, ces paramètres font l’objet d’un suivi durant la période de rétablissement des animaux. Le port de colerette éventuel ainsi que l'implantation d'un dispositif médical peuvent aussi impacter le comportement de l'animal et les décisions appropriées seront prises.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin d’expérimentation afin de vérifier que le geste technique a été réalisé correctement et valider la formation du personnel. De plus, si nécessaire des études histologiques pourront être réalisées afin de caractériser l’état des tissus après chirurgie.

Remplacement

Des modèles animaux artificiels (exemple : souris mannequins, peau synthétique) existent afin de permettre à l’expérimentateur en formation d’acquérir certains gestes de base tels que la pose de points de suture ou des injections et prélèvements simples. Cependant, l’apprentissage des bons gestes en chirurgie ainsi que de la surveillance de la profondeur d’anesthésie/analgésie et du suivi post-opératoire ne peuvent être réalisés que sur des animaux vivants. Néanmoins, certains gestes de base (exemples : sutures, incision, etc...) inclus dans les différentes procédures décrites dans ce projet pourront être réalisés sur ce type de support dans un but de remplacer l'utilisation de l'animal.

Réduction

Une meilleure maîtrise des gestes techniques permettra une réduction du nombre d’animaux impliqué dans les études. De plus, nous utiliserons dans la mesure du possible des animaux surnuméraires ou issus d’un précédent projet, naïfs de toute expérimentation (après avis favorable de la Structure du bien être animal et du vétérinaire référent) ce qui rentre dans le cadre d’une réduction du nombre d’animaux utilisés. Le nombre d'animaux impliqués dans cette demande pourra également être revu à la baisse dans les cas suivants : - lorsque les gestes techniques auront été pratiqués par un collaborateur lors d'une étude - lorsqu'un collaborateur maitrise le geste technique qu'il aurait pratiqué dans une autre société /laboratoire de recherche.

Raffinement

Le tuteur sera vigilant sur l’exécution des manipulations/gestes réalisés sur l’animal tout au long de la formation/maintien des compétences. Le tuteur s’assurera que toute manipulation sera conforme à la réglementation en vigueur et entrainera un minimum de stress ou une douleur chez l’animal. Préalablement à toute formation, des points limites seront définis en accord avec la littérature scientifique et la réglementation en vigueur. Ces points limites permettront un meilleur suivi des animaux lors de la réalisation des gestes techniques mais également de maintenir leur bien-être tout au long de l’expérimentation ainsi que la mise en place d’une intervention précoce et adaptée si cela est nécessaire. Dans le cas où la santé de l’animal serait dégradée après 48h, une euthanasie sera réalisée immédiatement sur décision du tuteur de la formation. Avant tout acte de chirurgie, l’anesthésie ainsi que l’analgésie nécessaires au suivi pré et post opératoire de l’animal devront être validées par un vétérinaire compétent. Le réveil des animaux s’effectuera dans un environnement permettant le maintien de la température corporelle (ex: lampe chauffante, enceinte chauffée, etc…). Les animaux seront hébergés individuellement après les chirurgies le nécessitant jusqu’à la fin du suivi post opératoire (7 à 10 jours). Afin de limiter le stress dû à l’isolement et de maximiser le bien-être de l’animal, de l’enrichissement spécifique à l'espèce sera utilisé (exemple : igloo, bûchette, coton, etc…) bien que le contact visuel entre les animaux soit tout de même maintenu.

Choix des espèces

L’utilisation de souris est justifiée par le fait que les modèles de maladies sur lesquels nous travaillons pour les projets de recherche de la société sont exclusivement des modèles souris. Le maintien des compétences sur des souris non malades nous permet donc ensuite de pouvoir réaliser ces gestes sur des souris malades. Les procédures peuvent être réalisées sur des animaux juvéniles (à partir de J15) jusqu’à l’âge adulte de 3-4 mois environ et jusqu’à 7-8 mois maximum car cela correspond aux âges nécessaires dans nos différents projets, .

Les 70 rats de ce projet portent un gène ABCA4 non fonctionnel, une lignée de la maladie de Stargardt, et les 6 macaques à longue queue, des primates, sont sains. Ces 76 animaux non-humains vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Outre une injection de vecteurs viraux sous la rétine des deux yeux, chaque macaque peut subir en six mois jusqu'à 15 séances d'imagerie sous anesthésie, avec prise de sang, et jusqu'à 8 tests de la fonction rétinienne, eux aussi sous anesthésie, et le porteur indique que ces anesthésies répétées peuvent stresser rats et macaques. Il affirme qu'une toxicité immunitaire liée aux intéines ne peut être mise en évidence chez les rongeurs, et qu'il est donc "nécessaire de passer au modèle macaque". Tous sont tués pour prélever sang, yeux, foie, rate, nerf optique et cerveau.

Objectifs

La maladie de Stargardt est une maladie génétique liée à des mutations sur le gène ABCA4. Elle a une prévalence de 1 pour 8000 à 10000 personnes, et se traduit par une dégénérescence rétinienne avec une cécite diurne, qui impacte à la fois les hommes et les femmes à partir de l’adolescence. La protéine ABCA4 est un transporteur essentiel pour le métabolisme des photorécepteurs, les cellules photosensibles de la rétine. En absence d’ABCA4, on observe une accumulation de déchets métaboliques dans les photorécepteurs, qui finissent par dégénérer. Actuellement, il n’existe pas de traitement efficace pour cette maladie. La thérapie génique, qui consisterait à venir ramener une copie fonctionnelle du gène ABCA4 dans les cellules rétiennes, est une approche prometteuse. Mais une limite de cette approche est que le gène ABCA4 est trop grand pour être intégré dans les vecteurs viraux adéno-associés recombinants (rAAV), vecteurs de choix pour transférer un gène dans la rétine. Une approche alternative consiste à délivrer deux vecteurs rAAVs, chacun porteur d’une moitié du gène ABCA4, associé à des structures spécifiques appelées ‘intéines’. Les deux moitiés de la protéine ABCA4 sont produites dans les cellules transduites, et une ligation s’effectue grâce aux intéines pour reconstruire une protéine ABCA4 entière. L’objectif du présent projet est de tester l’efficacité et la potentielle toxicité d’un traitement de thérapie génique basé sur l’utilisation de vecteurs recombinants «AAV-ABCA4-intéine» pour la maladie de Stargardt. L’évaluation de l’efficacité de ces vecteurs sera réalisée après injection sous-rétinienne chez le rat ABCA4-/-, modèle de la maladie de Stargardt dans lequel le gène ABCA4 est non fonctionnel. L’objectif sera de réduire le taux de déchets métaboliques dans la rétine, après expression de la protéine complète d’ABCA4, tout en vérifiant qu’une structure correcte de la rétine est maintenue. En parallèle de cette étude d’efficacité chez ce modèle de rat, nous évaluerons le risque de toxicité des «AAV-ABCA4-intéine» chez le macaque sain. En effet, les intéines étant des éléments protéiques exogènes, étrangers au système immunitaire, elles pourraient induire une toxicité immunitaire. Une telle toxicité ne pouvant pas être mise en évidence chez les rongeurs (connus pour tolérer un certain nombre de protéines exogènes, après transfert avec un vecteur AAV), il est donc nécessaire de passer au modèle macaque pour répondre à cette question.

Bénéfices attendus

Le but de cette étude est d’évaluer l’effet thérapeutique des vecteurs les vecteurs «AAV-ABCA4-intéine» après injection sous rétinienne chez des rats pour lesquels le gène ABCA4 n’est pas fonctionnel et de valider l’absence de toxicité de cette approche thérapeutique chez le macaque. L’évaluation in vivo des vecteurs «AAV-ABCA4-intéine » nous permettra de statuer sur la faisabilité et les bénéfices d’une telle approche chez les patients. De plus, si cette approche est validée pour le gène ABCA4, elle pourra potentiellement être transposée pour soigner d’autres maladies génétiques ayant un gène trop grand pour être inséré dans un seul vecteur AAV.

Procédures

(i) Injection sous-rétinienne des vecteurs «AAV-ABCA4-intéine » dans les 2 yeux : Geste réalisé une fois par animal sous anesthésie générale, durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats et 2h maximum pour les macaques. (ii) Imagerie rétinienne : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois par mois, soit au maximum 3 fois pour les animaux gardés 3 mois, pour les macaques une fois avant l’injection des vecteurs, 4 fois le premier mois puis maximum deux fois par mois, soit un maximum de 15 fois pour les animaux gardés 6 mois. Durée de l’anesthésie 20 minutes maximum pour les rats et 1h pour les macaques. (iii) Test de fonctionnalité de la rétine : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois par mois, soit au maximum 3 fois pour les animaux gardés 3 mois, pour les macaques une fois avant l’injection des vecteurs, 2 fois le premier mois puis maximum une fois par mois, soit un maximum de 8 fois pour les animaux gardés 6 mois. Durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats et 1h30 pour les macaques. (iv) Prélèvements sanguins : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois avant l’injection des vecteurs puis une fois par mois post-injection, soit au maximum 4 fois pour les animaux gardés 3 mois. Pour les macaques lors des mêmes anesthésies que les imageries rétiniennes soit un maximum de 15 fois pour les animaux gardés 6 mois. Durée du geste 10 minutes maximum pour les deux espèces.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons donc à une douleur minime liée à l’injection sous rétinienne. Cette douleur ne devrait pas dépasser les 12 heures post chirurgical. Les animaux peuvent être stressés par les anesthésies répétées mais celles-ci seront espacées d’au moins une semaine et les animaux seront surveillés au moins une heure après leur réveil par l’expérimentateur. La récupération devrait être rapide car les animaux seront soit sous anesthésie.

Devenir

L'euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les prélèvements (sang, yeux, foie, rate, nerf optique, cerveau) sur lesquels s'appuieront les analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques réalisées.

Remplacement

La rétine, structure complexe composée de multiples couches de neurones et cellules nourricières, ne peut être reconstituée parfaitement in vitro. Il existe aujourd’hui des protocoles modélisant la rétine à partir de cellules souches différentiées, mais l’interaction complexe du cycle visuel ne peut pas être testée in vitro. L’utilisation de modèles animaux est donc la seule option pour étudier la pathophysiologie et le transfert de gènes dans la rétine avant de commencer des études cliniques chez l’homme. D’autre part, la pathologie de Stargardt est induite par une toxicité liée au métabolisme de la vitamine A présent dans l’œil à la naissance et supplémenté via la circulation choroidale. Cet effet systémique de la vitamine A ne peut pas être reproduit in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Il est basé sur notre expérience précédente de précédents projets, lors desquels des résultats cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de ces tailles, que ce soit avec le modèle de rat ABCA4-/- ou le macaque sain. Pour les rats ABCA4-/-, nous nous laissons la possibilité d’inclure entre 1 et 3 animaux supplémentaires par groupe, en cas d’échec des injections sous-rétiniennes. Le nombre d’animaux par groupe a été choisi pour les analyses quantitatives et généré par une analyse de puissance (puissance de 80% et significativité de 5%). Le nombre d’animaux inclus dans les groupes injectés avec le vecteur thérapeutique est plus important que le nombre d’animaux inclus dans les groupes non injectés ou injectés avec un tampon, pour tenir compte du fait d’une certaine variabilité de l’efficacité thérapeutique. Avec 10 animaux (20 yeux) maximum par groupe nous pourrons réaliser un certain nombre d’analyses post-mortem avec des analyses statistiques pertinentes. Le suivi longitudinal non invasif par imagerie de la rétine permettra aussi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Pour les analyses chez le macaque le nombre d'animaux utilisés est réduit à son strict minimum (n= 4 animaux injectés avec le vecteur, et n=2 animaux injectés avec un tampon, avec injections bilatérales). Malgré tout, nous savons que ce nombre permettra d'apporter les réponses aux questions posées dans cette étude. Les facteurs d’évaluation principaux seront la quantification de l’expression du gène ABCA4, la présence ou non s’il y a une réponse immunogénique contre ABCA4 et une analyse statistique sur les amplitudes des résultats d’électrorétinogrammes (analyse de la réponse électrique de la rétine). Après l’expérience, nous nous attendons à obtenir des variables (liées à nos données) ordinales.

Raffinement

Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. Les animaux sont observés quotidiennement et le vétérinaire de l’installation sera alerté dès l’apparition de signes cliniques afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à plusieurs par cage dans un milieu enrichi comprenant des frisottis de papier, buchettes de bois et tunnels pour les rats, et dans un milieu enrichi comprenant des enrichissements alimentaires, physiques, sonores et visuels variés pour les macaques. L’enrichissement serait renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. Les animaux auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. L'application de critères d'arrêts et un suivi des animaux à l’aide de grilles de score, d’un arbre décisionnel nous permettra d'intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés voir de décider d'une mise à mort prématurés.

Choix des espèces

Le modèle rat est un très bon modèle préclinique pour l’évaluation d’un traitement par thérapie génique avec un œil suffisamment large pour permettre une distribution uniforme du fluide sous la rétine. De plus, les modèles utilisés ici sont des rats transgéniques pour la maladie de Stargardt. Nous avons validé que ce modèle montre le phénotype attendu avec des défauts métaboliques des rétinoïdes dans la rétine. Mais les études menées chez les rongeurs ne peuvent être translatées de façon sûre et efficace à l’homme sans passer par une étude intermédiaire dans une espèce présentant une organisation de l’œil comparable à celle de l’homme, comme c’est le cas chez les cercopithécidés. Le choix de macaca fascicularis se trouve pleinement justifié par le fait que l’on trouve dans cette espèce une organisation du système visuel, une dimension et une structure du globe oculaire mais également de la rétine, avec la présence d’une macula (absente chez les rongeurs) ainsi qu’un système immunitaire comparable à ceux de l’homme.

Après une craniotomie pour injecter un virus dans l'hippocampe, des rats sont placés dans une piscine où ils doivent trouver une plateforme immergée, à raison de quatre essais de 90 secondes au plus par jour pendant six jours. 1 360 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, gardés pour certains jusqu'à 18 mois, puis tous tués à l'issue, sous anesthésie profonde suivie d'une perfusion intracardiaque, pour le prélèvement de leur cerveau. L'équipe cherche à savoir si les astrocytes aident les neurones formés à l'âge adulte à s'intégrer dans l'hippocampe, et si cela distingue les rats qui gardent leur mémoire en vieillissant de ceux qui la perdent. Le porteur exclut de l'étude les rats âgés qui développent arthrite, tumeurs, cécité ou cataracte, sans dire ce qu'il advient d'eux.

Objectifs

Au cours du vieillissement, certains individus voient leur mémoire décliner beaucoup plus précocement que d’autres. Ces individus sont dits vulnérables, en comparaison aux individus résilients qui conservent de bonnes capacités mnésiques. La compréhension des processus qui sous-tendent ces différences inter-individuelles est une étape clé pour le développement de stratégies innovantes visant à prévenir les troubles cognitifs liés à l'âge. L’hippocampe est une structure cérébrale jouant un rôle clé dans les mécanismes de mémoire, qui reposent en partie sur la génération de nouveaux neurones tout au long de la vie, processus appelé neurogenèse adulte. Un des mécanismes permettant d’expliquer les différences inter-individuelles de mémoire au cours du vieillissement serait la capacité de ces nouveaux neurones créés à l’âge adulte à s’intégrer (individus résilients) ou pas (individus vulnérables) dans le réseau de l’hippocampe. Il est important de noter que les astrocytes, aussi appelés cellules gliales, sont des partenaires actifs des neurones, notamment au cours des processus de mémoire. En effet, les astrocytes sont capables de détecter l’activité neuronale et d’y répondre en libérant des messagers chimiques. Nous proposons d’identifier si la libération de ces messagers est importante pour l’intégration des nouveaux neurones dans le réseau de l’hippocampe et donc le maintien des capacités mnésiques au cours du vieillissement.

Bénéfices attendus

Le déclin cognitif associé au vieillissement, dont la maladie d'Alzheimer est la forme la plus extrême, représente un problème de santé majeur auquel la société occidentale est confrontée. Compte tenu de l'augmentation du nombre de personnes âgées, le fardeau économique de ces troubles est élevé ; il s'agit actuellement du problème de santé le plus coûteux dans l'UE. Il est donc de plus en plus important de comprendre les changements cognitifs qui accompagnent le vieillissement aussi bien normal que pathologique. L’une des plaintes cognitives les plus courantes chez les personnes âgées est l'altération de la mémoire. Aussi, comprendre pourquoi certains individus conservent de bonnes capacités de mémorisation, alors que d'autres présentent une perte de mémoire impactant leur vie quotidienne, est essentiel pour développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre les troubles cognitifs liés à l'âge. Notre stratégie de recherche consiste à tirer parti de ces différences inter-individuelles pour identifier de nouveaux mécanismes de préservation du fonctionnement mnésique au fil du vieillissement. Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes astrocytaires sous-tendant la préservation des capacités de mémoire et d’apprentissage au cours du vieillissement. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercutions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux maladies neurodégénératives touchant la mémoire, comme la maladie d'Alzheimer, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 7 : • Injections intra-hippocampiques : Les animaux seront sous anesthésie gaseuse durant toute la chirurgie (soit environ 1h par animal). Elle consiste en une incision de la peau au niveau du crâne, suivie d’une craniotomie permettant la descente d’une canule d’injection au niveau de l’hippocampe gauche, de l’injection de virus, et enfin de la suture de la peau. La totalité des animaux seront concernés par ces chirurgies. • Injections sous-cutanées d’un marqueur de prolifération cellulaire : Ces injections seront réalisées sur animal vigile. Les animaux recevront au total 4 injections sur 4 jours consécutifs. 400 animaux seront concernés. • Labyrinthe aquatique : Au cours de ce test, les rats nagent dans une piscine et doivent apprendre à localiser une plateforme immergée en s’aidant des indices disposés dans la pièce. Lors de la phase d’habituation, ils passeront deux fois 60s dans la piscine sans la plateforme. Ensuite, lors de la phase l’apprentissage, les animaux seront soumis chaque jour à 4 essais consécutifs, pendant 6 jours. Pour chaque essai, les animaux passeront au maximum 90s dans l’eau (i.e temps maximum passé dans l’eau au cours d’une session = 4 x 90s = 360s soit 6min). Au fil des jours, les animaux apprennent à localiser la plateforme et le temps passé dans l’eau diminue. Tous les animaux seront concernés, à l’exception des groupes contrôles (74 animaux), soit un total de 1286 animaux. • Anesthésie pour perfusion de fixateur ou de liquide cérébro-spinal artificiel : Avant de réaliser les perfusions intracardiaques, les animaux vigiles recevront une injection intra-péritonéale unique d’un mélange d’anesthésique/euthanasiant (400 animaux, Procédure 1) ou d’un mélange d’analgésique/anesthésique (960 animaux, Procédure 2). • Perfusions intra-cardiaques de fixateur ou de liquide cérébro-spinal artificiel : Après obtention d’une anesthésie profonde, une perfusion intra-cardiaque de fixateur (400 animaux, Procédure 1) ou de liquide cérébro-spinal artificiel (960 animaux, Procédure 2) sera réalisée.

Impact sur les animaux

Comme lors de tout projet incluant des injections et des chirurgies stéréotaxiques, il est possible que des effets indésirables surviennent malgré notre vigilance et la mise en place de procédures adpatées. En effet, même si cela est relativement rare, il se peut que les sites d’injection (intra-péritonéale, sous-cutanée) ou les plaies chirurgicales s’infectent. De même dans les 2 jours suivant la chirurgie, il est possible que les animaux perdent du poids (~10/20g pour un rat de 400g au moment de la chirurgie). C’est pourquoi les animaux seront suivis quotidiennement au cours des 3 jours suivant ces actes afin de s’assurer de leur bien être. Au cours de ce suivi, l’expérimentateur en charge du projet remplit une fiche de suivi du bien-être animal avec une grille de score.

Devenir

Toutes les parties du projet nécessitent le prélèvement du cerveau des animaux afin de réaliser des analyses à l’échelle cellulaire. Les animaux seront de ce fait mis à mort à l’issue de chaque expérience pour réaliser ce prélèvement.

Remplacement

Dans ce projet, nous souhaitons étudier in vivo l’impact du vieillissement sur l’interaction entre astrocytes et nouveaux neurones de l'hippocampe, et ce en fonction du vieillissement des capacités de mémoire. Il s’agit d’une approche intégrée nécessitant les capacités cognitives de l’animal. Un tel travail ne pourrait être effectué par une approche in vitro, ou in sillico, et nous ne pouvons donc recourir à des techniques de remplacement.

Réduction

Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents de l’équipe, en tenant compte des divers problèmes que nous pourrions rencontrer au cours des différentes phases expérimentales, des problèmes de santé inhérents au vieillissement (les animaux développant arthrites, tumeurs, cécités, cataractes étant exclus de l’étude), ainsi que du nombre minimum d’animaux nécessaires à l’observation de différences inter-individuelles au niveau comportemental (test d’apprentissage spatial) qui constituent l’objet de notre étude. Les effectifs ont été déterminés de façon à pouvoir effectuer des tests statistiques sur un nombre de rats suffisant pour obtenir des résultats cohérents. De plus, notre schéma expérimental prévoit la possibilité de réduire le nombre de lots d’animaux générés en fonction des premiers résultats obtenus, les effectifs pourront ainsi être revus à la baisse si les objectifs sont atteints plus précocément que prévu

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés en cages collectives enrichies (nids de fibres de peupliers compressées) afin de réduire l’ennui et le stress. Les rats seront observés quotidiennement par le personnel zootechnique (motricité, réactivité, aspect du pelage) et manipulés hebdomadairement jusqu’à leur euthanasie. Ils seront stabulés dans une animalerie thermorégulée avec hygrométrie contrôlée et cycle lumière-obscurité de 12h. L’accès à la nourriture et à l’eau sera ad libitum et un changement de litière sera effectué chaque semaine. 10 à 30 min avant la chirurgie, un antalgique sera administré à l’animal afin de prévenir la douleur per-opératoire. Après chirurgie et durant 3 jours, les rats seront individuellement et quotidiennement manipulés afin de détecter tout problème post-opératoire (comportement, plaie, pesée). Si besoin, nous lui administrerons un analgésique par voie sous-cutanée. Nous utilisons des grilles d’évaluation permettant de scorer (0 à 15) de façon objective le bien-être de l’animal. Ces grilles sont remplies par l’expérimentateur jusqu’à l’euthanasie des animaux. Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en l’absence d’amélioration sous 48h, l’animal sera mis à mort par inhalation de gaz carbonique.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est le rat. La complexité du système nerveux des mammifères et des comportements qu’il sous-tend rend impossible leur reproduction in vitro ou chez des organismes d’une plus faible complexité neurophysiologique (invertébrés par exemple). Le rat est un modèle classiquement utilisé en neurosciences, notamment pour des études comportementales telles que celles réalisées auparavant au sein du laboratoire. De plus, la neurogenèse adulte est un phénomène conservé au sein des mammifères, chez le rat, chez le singe et chez l’homme. Enfin, cette étude vient compléter les investigations déjà menées sur cette espèce par notre équipe, permettant ainsi de s’appuyer sur une solide expertise et une base de données importante pour contrôler les résultats. Les rats seront réceptionnés à l’âge de 10 semaines afin d’être âgés de 12 semaines au moment des injections intra-cérébrales. Ensuite, les différentes études seront réalisées 1 à 15 mois après les chirurgies. Nous utiliserons ainsi des animaux adultes à différents stades de vieillissement : un groupe début de vie adulte (rats de 4 mois), deux groupes milieu de vie (rats de 8 et 12 mois) et un groupe fin de vie (rats de 18 mois). Ces âges ont été choisis car ils permettent une étude longitudinale de l’interaction entre astrocytes et néo-neurones en comparant les animaux âgés à des animaux plus jeunes.

432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intradermique de cellules tumorales sous anesthésie puis, trois fois par semaine pendant trois semaines, un traitement de l'oreille qui provoque une inflammation cutanée, développant une tumeur locale et des métastases dans les ganglions avant la mise à mort. Le porteur décrit cette dermatite induite, épaississement, rougeur et desquamation de l'oreille. Il indique que les cibles ont d'abord été identifiées in vitro et in silico, mais présente l'expérimentation in vivo comme "nécessaire" pour comprendre une réponse immunitaire impliquant plusieurs organes.

Objectifs

Le mélanome est une tumeur du système pigmentaire de la peau. Il apparait souvent sous la forme d’une tache pigmentée pour ensuite évoluer en métastases, en faisant un cancer très agressif. Normalement, notre système immunitaire nous protège des cancers en éliminant les cellules cancéreuses. Cependant, ces cellules tumorales peuvent bloquer notre système immunitaire, conduisant donc à la progression de la tumeur, ce qui impacte négativement le pronostic des patients atteints de mélanome. Les mécanismes mis en place par les cellules cancéreuses et qui stoppent notre système immunitaire sont à ce jour mal connus. Le projet vise donc à déterminer ces facteurs, dans le but d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour améliorer les traitements actuels qui restent peu efficaces dans le cadre du mélanome. Nous nous intéressons particulièrement à une molécule qui est connue pour moduler la réponse immunitaire, et qui est associée à un mauvais pronostic dans les cancers du pancréas et sein. Il a été suggéré que cette molécule pourrait aussi être associée au mélanome. L’objectif du projet est donc d’identifier le rôle de cette molécule dans la progression du mélanome, et de déterminer via quels mécanismes cette molécule induit la croissance tumorale. De plus, nous évaluerons l’effet de son blocage thérapeutique, en combinaison avec des thérapies déjà existantes mais peu efficaces pour voir si cela améliore le traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les signaux et cellules impliquées dans la réponse immunitaire et la croissance tumorale au cours du mélanome. Ceci permettra l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques, lesquelles seront testées pour déterminer si leur blocage pourrait être un traitement potentiel en clinique pour améliorer la qualité de vie et survie des patients atteints de mélanome.

Procédures

258 souris seront anesthésiées et injectées en intradermique avec des cellules tumorales (durée: 6min). Par la suite, ces animaux seront anesthésiés et traités 3 fois par semaine pendant 3 semaines avec un analogue de la vitamine D sur l’oreille (durée: 5min x 9 traitements = 45min). La durée totale de la procédure par souris est de 51minutes. Lors de la deuxième partie du projet, 48 souris seront injectées par voie intraveineuse avec des cellules immunitaires (durée: 12min). Par la suite, ces 48 souris seront anesthésiées puis injectées en intradermique avec des cellules tumorales (durée: 6min). Enfin, ces animaux seront anesthésiés et traités 3 fois par semaine pendant 3 semaines avec un analogue de la vitamine D sur l’oreille (durée : 5min x 9 traitements : 45min). La durée totale de la procédure est de 63 minutes. Lors de la troisième partie du projet, 126 souris seront anesthésiées puis injectées en intradermique avec des cellules tumorales (durée: 6min). Par la suite, ces animaux seront anesthésiés et traités 3 fois par semaine pendant 3 semaines avec un analogue de la vitamine D sur l’oreille (durée : 5min x 9 traitements : 45min). Ces souris seront ensuite injectées par voie intra-péritonéale 3 fois par semaine pendant 3 semaines (durée: 10 secondes x 9 injections = 1 minute 30). La durée totale de la procédure par souris est de 52 minutes 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux inoculés avec des cellules tumorales développeront une tumeur au niveau locale et des métastases au niveau des ganglions lymphatiques. Le traitement des oreilles des animaux par l'analogue de la vitamine D induira une légère inflammation de type dermatite atopique au fur et à mesure du traitement, se caractérisant par une épaisseur, rougeur et desquamation de l’oreille. Tous les animaux seront surveillés et traités selon les points limites énoncés.

Devenir

A l'issue de chaque procédure expérimentale, les animaux seront euthanasiés pour étudier la réponse immunitaire impliquée dans la croissance tumorale, à savoir 432 animaux.

Remplacement

Les cibles (cellules et récepteurs) étudiées dans ce projet ont été identifiées grâce à des travaux menés in vitro et in silico par notre équipe et par d'autres laboratoires. L'étude de la réponse immunitaires met en jeu plusieurs organes et réseaux complexes impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre le type d’interaction et les différentes voies de signalisation impliquées dans ces réponses immunitaires ainsi que le processus de progression tumorale.

Réduction

Ces souris seront utilisées afin d’étudier le rôle de la signalisation de la cytokines étudiée dans la progression du mélanome. Nous réaliserons une expérience pilote sur la réponse des différentes lignées cellulaires injectées en intradermique pour explorer de manière étendue les différentes interactions présentes au niveau du microenvironnement tumoral. La 1ère expérience pilote permettra de choisir la lignée qui fera l’objet des expérimentations du projet. La 2ème expérience pilote nous permettra de définir la dose d'anticorps bloquants à injecter. Dans un but de réduction du nombre de souris utilisées dans ce projet, l'oreille droite sera traitée avec l'analogue de la vitamine D alors que l'oreille gauche, servant de contrôle, sera traitée avec de l'éthanol. Les groupes comporteront 12 souris (paramètres étudiés : fréquence des cellules T et croissance tumorale), ce qui permettra d’avoir des résultats statistiquement interprétables selon les paramètres étudiés à l’aide d’un test statistique.

Raffinement

La greffe tumorale par le biais d’injection intradermique, le traitement topique avec du MC903 et la prise de photos nécessitent une anesthésie gazeuse légère (2.5% d’isoflurane) de courte durée. Les souris seront remises dans leur cage avec une courte exposition à la lampe chauffante. Les souris seront maintenues en groupe pour préserver les interactions sociales. Le nid sera retiré lors des traitements, mais sera remis dès la fin des traitements. En plus de la surveillance journalière, le suivi de la progression tumorale (prise de photos, mesure de la taille de la tumeur à l’aide d’un pied à coulisse) sera réalisé 3 fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). Les points limites, précis et gradés pour chacune des procédures expérimentales sont définis en fonction de la grille d’évaluation de la douleur que nous avons mis en place. Les observations faites lors des suivis permettront de situer l'état des animaux dans l'arbre décisionnel et d'appliquer ces points limites. L’arbre décisionnel mis en place pour ce projet tient compte de l’apparence physique ("Grimace Scaling"), du comportement (observation de la continuité des activités comportementales normales des animaux), de l’absence de signes d’infection aux lieux de piqures ou de traitements, du développement de tumeurs qui ne doivent pas être invalidantes pour nos animaux. Ces critères sont assortis de points limites ou points d’arrêt, définis pour éviter des douleurs entrainant un changement dans les comportements des animaux et des blessures qui impactent nos résultats : prostration, taille maximale des tumeurs de 5mm sur les oreilles, signe d’infection au point d’injection, nécrose, saignement ou peau percée au-dessus de la tumeur.

Choix des espèces

La réponse immunitaire dans le contexte tumoral met en jeu différents organes comme la peau et les ganglions lymphatiques, rendant nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réaction. Le modèle animal choisi pour étudier le mélanome est la souris car son système immunitaire est proche de celui de l'Homme avec une immunité innée et une immunité adaptative. De plus, la peau des souris présente des similitudes avec la peau humaine, rendant ce modèle pertinent pour l'étude du mélanome. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines de vie afin d'étudier le système immunitaire à l'âge adulte.