Rongeurs

104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour étudier leurs poumons, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des inhalations intranasales sous anesthésie, des particules virales et des injections abdominales répétées destinées à supprimer certaines cellules immunitaires. Le projet cherche à lever un frein immunitaire empêchant les cellules du poumon de se reprogrammer. Les applications en médecine régénérative, jusqu'au cœur ou au foie, sont annoncées à terme, quand les inhalations et les injections répétées, elles, sont immédiates.

Objectifs

Durant le développement, une cellule souche est capable de se spécialiser en n’importe quelle autre cellule différenciée et mature ayant une fonction définie. Cet état de différenciation est réversible et cela a été montré récemment notamment grâce à des travaux démontrant la possibilité de reprogrammer une cellule différenciée en une cellule souche en utilisant des gènes particuliers. Diverses études ont montré que cette reprogrammation cellulaire ne fonctionnait pas systématiquement dans tous les tissus à cause de la présence de certains freins. Parmi ces tissus, le poumon semble contenir un frein qui empêche ses cellules de se reprogrammer, même s’il est connu comme ayant la capacité de se régénérer. De ce fait, le but est d’identifier ce frein puis de le lever afin de comprendre le processus de reprogrammation cellulaire dans le poumon. Des études préliminaires nous ont permis d’identifier le système immunitaire comme frein potentiel à cette reprogrammation cellulaire dans le poumon. Dans ce contexte, nous souhaiterions étudier l’interaction entre la reprogrammation cellulaire du tissu pulmonaire avec le système immunitaire.

Bénéfices attendus

La reprogrammation cellulaire d’un tissu peut avoir lieu sous certaines conditions en levant certaines barrières responsables du blocage de la reprogrammation. Nous souhaiterions donc approfondir notre étude dans un modèle de souris où nous allons supprimer certaines cellules du système immunitaire et étudier le chemin des cellules en cours de reprogrammation dans le poumon. Les connaissances issues de ce travail pourraient, à terme, contribuer au développement de nouvelles approches en médecine régénérative, visant à favoriser la réparation des tissus endommagés. Ces avancées pourraient avoir des retombées plus larges, au-delà du poumon, pour améliorer les stratégies de régénération d’autres organes et soutenir la recherche de traitements innovants pour des maladies aujourd’hui difficiles à soigner telles que les insuffisances cardiaques ou hépatiques.

Procédures

Les animaux seront tout d’abord, au jour 0, soumis à une anesthésie et à une inhalation par voie intra-nasale d’un composé qui va permettre la déplétion de cellules immunitaires dans le poumon. Pour l’anesthésie et l’inhalation, la procédure totale dure environ 4 minutes (2 minutes d’anesthésie, 2 minutes d’administration par inhalation et réveil). Au jour 3, les animaux sous anesthésie inhalent des particules virales, et recevront une injection au niveau de l'abdomen d’un composé déplétant les cellules immunitaires qui se trouvent dans la circulation sanguine. Le geste dure environ 4 minutes (2 minutes d’anesthésie, 2 minutes inhalation). L’injection au niveau de l'abdomen se fera en 15 secondes en maintenant la souris, déjà anesthésiée, en contention sur le dos (geste maitrisé dans notre laboratoire). Pour la totalité de la procédure, l’inhalation intra-nasale sera réalisée 2 fois, au jour 0 et au jour 3. L’injection dans l'abdomen sera, quant à elle, réalisée trois fois : au jour 3 sur souris anesthésiées, au jour 6 et 9 sur souris vigiles.

Impact sur les animaux

Un saignement, une irritation et ou un grattage excessif de la région nasale peuvent apparaitre à la suite de l’administration intra-nasale. Pour effectuer l’injection intrapéritonéale, la souris sera maintenue sur le dos grâce à une contention. Ce geste causera un stress temporaire chez l’animal. Les effets indésirables liés à l’injection au niveau de l'abdomen sont limités au site d’injection. En effet, l’apparition de rougeur, d’une nécrose ou d’un saignement est possible.

Devenir

Les animaux seront mis à mort puisqu'il est nécessaire d'étudier leurs poumons.

Remplacement

Afin d’étudier l’impact du système immunitaire dans la reprogrammation des cellules du poumon, nous sommes dans l’obligation de recourir à un modèle animal. Des études in vitro faites dans notre laboratoire n’ont pas permis de valider notre hypothèse car il ne nous est pas possible de récapituler le système immunitaire in vitro. Dans un but de mener des études plus approfondies et pour se rapprocher de la médecine régénérative (discipline permettant de réparer ou remplacer les tissus abimés grâce à des cellules souches) il nous est indispensable de passer à des modèles in vivo.

Réduction

Les effectifs définis dans ce protocole ont été déterminés grâce à un logiciel tenant compte des exigences statistiques nécessaires à l’exploitation des résultats. Afin de limiter le nombre nécessaire de souris, nous avons réduit au maximum le nombre de souris utilisées (26 par lot et nous aurons 4 lots de souris) dans notre procédure sans en compromettre l’interprétation et la puissance statistique des analyses.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement sur les 4 jours suivant l’administration par voie intra-nasale et intrapéritonéale afin d’identifier toute complication liée au mode d’inoculation (gonflement de la trachée/région du cou). Les animaux seront par la suite observés 2 fois dans la semaine afin d’identifier tout signe potentiel de mal-être ou de souffrance. Nous avons défini une série de points limites (Grille de score) conduisant à l’arrêt de nos protocoles et à la mise à mort immédiate des souris concernées. Notre procédure implique l’ingestion d’un médicament dans de l’eau de boisson. Au vu du goût amer de ce médicament, du glucose est rajouté dans l’eau afin d’en augmenter l’appétence.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus pertinente du fait de l’existence de modèles génétiquement modifiés bien caractérisés qui permettent d’étudier la reprogrammation cellulaire à l’échelle de l’organisme. Nous utiliserons des souris entre l’âge de 6 et 8 semaines car c’est à cet âge que le geste de l’administration par voie intra-nasale fonctionne le mieux. Technique ayant été validée lors d’un projet antérieur.

Surveillées par une grille de score qui déclenche leur mise à mort si un seuil est atteint, 1 860 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent une à deux chirurgies de la peau sous anesthésie, des changements de pansement sous anesthésie une à deux fois par semaine pendant vingt jours, des gavages et une injection. Le projet cherche à savoir si une blessure cutanée laisse une mémoire inflammatoire modifiant la cicatrisation. Le porteur affirme que la dynamique du tissu cutané et des cellules immunitaires ne peut être reproduite sans un "organisme entier".

Objectifs

La mémoire immunologique permet au système immunitaire de réagir plus efficacement à des agents pathogènes spécifiques lors d'une seconde rencontre. Un autre type de mémoire existe dans certaines cellules immunitaires : la « mémoire inflammatoire », qui permet une réponse amplifiée lors d'une exposition ultérieure à un agent pathogène différent de l’agent pathogène initial. On ignore encore si ce type de mémoire se développe également suite à une inflammation provoquée par une blessure en l'absence de l’agent pathogène. Dans le cadre de ce projet, nous explorerons cette question au niveau cutané, à l'aide d'un modèle de plaie de la peau. Nous nous intéresserons plus particulièrement à l'impact potentiel de ce phénomène sur l'efficacité de la cicatrisation.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche permettra de mieux comprendre l'impact de cette « mémoire inflammatoire » sur les maladies de la peau. À plus long terme, les résultats de ce projet devraient également ouvrir de nouvelles perspectives pour le traitement des plaies chroniques et des lésions cutanées d'origine immunitaire.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie de la peau sous anesthésie une seule fois ou deux fois (durée 15 min). Pour les animaux qui seront suivis au cours du temps, le pansement sera changé sous anesthésie 1-2 fois par semaine pendant 20 jours (durée 3 min). Des gavages (2 jours consécutifs, 5 secondes) et des injections (1 fois, 2 secondes) seront réalisés sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une chirurgie de la peau, avec une douleur modérée. Les nuisances attendues sont : stress de l'anesthésie, risque d'hypothermie, douleur liée à une blessure cutanée et risque d'infection de la plaie. Le pansement sera changé sous anesthésie 1-2 fois par semaine pendant 2 semaines, les nuisances attendues sont : stress de l'anesthésie, risque d'hypothermie. Les animaux subiront un gavage. Les nuisances attendues sont : stress lié au gavage. Les animaux subiront également une injection. Les nuisances attendues sont : stress lié à la préhension et douleur légère liée à la piqure.

Devenir

Aucun animal ne sera maintenu en vie. Les animaux seront mis à mort à la fin du suivi ou pour des analyses post-mortem.

Remplacement

La dynamique du tissu cutané, des cellules immunitaires qu’il abrite ainsi que les interactions et le recrutement potentiel de cellules d’autres organes sont des conditions qui ne peuvent pas être adéquatement reproduites sans un organisme entier. De plus, le système immunitaire est un système dynamique dont les acteurs évoluent entre différentes localisations au sein de l’organisme selon des flux très précis. Enfin, certaines populations cellulaires du système immunitaire se spécialisent particulièrement en fonction de leur localisation, en particulier dans la peau. Ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes cellulaires ne permettent de reproduire cela, ceci nous oblige donc à utiliser des animaux afin de comprendre les interactions cellulaires régulant les réponses immunitaires et inflammatoires dans la peau. Des expériences sur organismes vivants sont donc nécessaires pour compléter les découvertes obtenues sur cellule. De plus, l’utilisation de modèle animal reste indispensable pour pouvoir aborder la phase d’application de nos découvertes en clinique.

Réduction

Le nombre de souris à utiliser a été calculé à l’aide d'un logiciel statistique, pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Dans le cadre du modèle de blessure cutanée, les animaux sont anesthésiés et un analgésique est administré lors de la chirurgie. Des pansements adaptés sont utilisés (compresse stérile, pansement semi-occlusif et bandage de contention). Les animaux seront surveillés et suivis avec la mise en place d’une grille de score et des points limites adaptés.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix car la physiologie de la souris est proche de celle de l’Homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les cellules immunitaires. La connaissance complète du génome de la souris permet d’utiliser de nombreux outils bien caractérisés, ce qui sera particulièrement pertinent dans le cadre de ce projet. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (de 8 à 12 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.

Greffées d'une tumeur sous anesthésie, mesurées au pied à coulisse une à deux fois par semaine, gavées jusqu'à quarante fois, suivies par imagerie: 730 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit des fragments de tumeurs humaines, ce qui suppose des animaux immunodéficients, et subit une chirurgie supplémentaire. Le projet teste des inhibiteurs du métabolisme des cellules cancéreuses de la peau, seuls ou combinés, pour freiner la croissance tumorale. Les traitements plus efficaces sont espérés à moyen et long terme, quand la greffe et les gavages répétés, eux, sont immédiats.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment se développent certains cancers de la peau appelés carcinomes épidermoïdes cutanés, afin d’identifier de nouvelles possibilités de traitement. Les cellules cancéreuses ont besoin de beaucoup d’énergie et de nutriments pour se multiplier rapidement. Pour y parvenir, elles modifient leur fonctionnement interne et utilisent différemment les ressources disponibles dans l’organisme. Cette capacité d’adaptation leur permet de continuer à croître et parfois de résister aux traitements existants. Notre travail vise à identifier ces mécanismes d’adaptation et à déterminer s’il est possible de les bloquer à l’aide de médicaments ciblant spécifiquement le métabolisme des cellules tumorales.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment certains cancers de la peau se développent et progressent. En particulier, il vise à étudier la manière dont les cellules cancéreuses produisent et recyclent les éléments indispensables à leur multiplication. Nous testerons différentes stratégies thérapeutiques, administrées seules ou en association, afin d’évaluer leur capacité à freiner la croissance tumorale. Ces essais seront réalisés dans des modèles reproduisant au mieux les conditions réelles d’une tumeur dans l’organisme, incluant son environnement, sa vascularisation et ses interactions avec les tissus voisins. Les résultats attendus permettront d’identifier des approches thérapeutiques potentiellement plus efficaces, en ciblant spécifiquement les mécanismes essentiels à la survie des cellules tumorales. À moyen et long terme, ce projet pourrait contribuer au développement de nouveaux traitements pour les cancers de la peau, avec l’objectif d’améliorer la prise en charge des patients tout en limitant les risques de résistance aux thérapies

Procédures

Les animaux anesthésiés subiront une greffe de cellules tumorales (1 fois, 5 min,sur 360 animaux), ou de fragments tumoraux humains (1 fois, 15 minutes, sur 370 animaux) . Croissance tumorale sur animaux vigiles par mesure au pied à coulisse , à raison de 1 à 2 fois par semaine en fonction de la croissance tumorale. 1 minute, 8 à 10 fois par animal, 730 animaux. Toutefois, le nombre de mesure ne peut être déterminée avec précision a priori, car elle dépend de variables tels que la prise de greffe, la cinétique de croissance tumorale, l’atteinte d’un volume tumoral suffisant pour la poursuite des expérimentations ou l’atteinte des critères d’arrêt. Suivie de la croissance par imagerie sous anesthesie ,20 minutes par animal, 3 fois sur 240 animaux, et 7 fois sur 120 animaux. Administration des traitements par gavage oral sur animaux vigiles, 40 fois par animal, 1 minute, sur 660 animaux. Avant chaque imagerie, une injection intrapéritonéale sur animal vigile (1 min, 3 fois sur 240 animaux, 7 fois sur 120 animaux. Intervention Chirurgical sur animaux anesthesiés (15 min, 1 fois, 120 animaux).

Impact sur les animaux

L’induction et la manipulation peuvent entraîner un stress léger transitoire. La croissance tumorale peut provoquer une gêne locale en fin d'experimentation. Les traitements administrés quotidiennement par voie oral peuvent induire un stress et comporte dans de trés rares cas un risque d’irritation œsophagienne, de fausse route ou de perte de poids en cas de complication. Les inhibiteurs métaboliques utilisés peuvent entraîner des effets généraux modérés tels qu’une perte de poids, une altération transitoire de l’état général ou des troubles digestifs. À l’issue du traitement, la chirurgie peut entraîner une douleur post-opératoire transitoire ainsi qu’un risque limité d’infection ou de retard de cicatrisation. Les injections peuvent induire une gêne transitoire.Dans de rares cas, la présence de micrométastases non détectées au moment du suivi tumoral ne peut être totalement exclue et pourrait conduire à l’apparition secondaire de foyers tumoraux

Devenir

Mise à mort pour analyse post mortem des tumeurs.

Remplacement

Des approches in vitro ont été utilisées en amont du projet afin d’identifier et de caractériser les cibles métaboliques étudiées, ainsi que pour évaluer l’efficacité des inhibiteurs seuls ou en combinaison sur la prolifération et la viabilité cellulaire. Cependant, ces modèles ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organisme entier, notamment les interactions avec le microenvironnement tumoral, la vascularisation, la biodistribution des molécules, la pharmacocinétique. À ce jour, aucun modèle alternatif in vitro ou ex vivo ne permet d’évaluer de manière intégrée l’efficacité antitumorale, la tolérance et la dynamique de progression tumorale ou métastatique. Le recours aux modèles de xénogreffes constitue donc une étape indispensable pour valider in vivo les stratégies thérapeutiques proposées.

Réduction

Le nombre d’animaux à été determiné en utilisant un test de puissance et des tests statistiques seront utilisés post expérimentation pour évaluer la significativité des résultats.L’approche expérimentale est séquentielle. Les premières études seront réalisées sur les lignées cellulaires avec un ou deux inhibiteurs. Le recours aux xénogreffes dérivées de patients et à l’ajout d’un troisième inhibiteur ne sera envisagé qu’en cas de résultats antitumoraux significatifs. Cette approche permet de limiter l’utilisation d’animaux supplémentaires si les premières combinaisons s’avèrent inefficaces. Le suivi longitudinal par mesures répétées et par imagerie bioluminescente permet de diminuer le nombre d 'animaux par groupe.

Raffinement

Toutes les manipulations invasives seront réalisées sous anesthésie générale à l’isoflurane. Les animaux seront installés sur tapis chauffant thermostatable pendant toute la durée des procédures et jusqu’au réveil complet afin de prévenir l’hypothermie. Une analgésie préventive sera administrée avant toute intervention chirurgicale. L'imagerie par bioluminescence seront réalisées sous anesthésie et espacées dans le temps afin de limiter le stress lié aux manipulations répétées. Des points limites prédéfinis seront appliqués afin d’éviter toute souffrance excessive. En cas d’atteinte d’un point limite, des mesures conservatoires seront immédiatement mises en place. Un arbre décisionnel interne sera appliqué par le personnel formé, permettant de décider de la poursuite, de l’adaptation du traitement ou de l’euthanasie en fonction de l’évaluation clinique quotidienne. L’ensemble des procédures est conçu conformément aux principes de raffinement et aux bonnes pratiques de bien-être animal, afin de limiter au maximum la douleur, le stress et l’inconfort.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est le modèle le plus approprié pour ce projet pour plusieurs raisons : La souris permet de recréer un environnement physiologique proche de celui des mammifères, notamment en termes d’absorption digestive, de métabolisme des médicaments, ainsi que de la manière dont les médicaments sont absorbés, circulent dans l’organisme, sont transformés puis éliminés. Elle permet également de reproduire le microenvironnement tumoral. De plus, la greffe de cellules tumorales humaines nécessite l'utilisation d'animaux immunodéficients. Les souris seront incluses dans les protocoles expérimentaux à l’âge de 8 à 10 semaines, soit l’équivalent de l’âge adulte chez la souris, afin que l’étude reflète au mieux le développement et le traitement du cancer chez l’adulte

2 366 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune soumise à quatre tests de mémoire, à des injections et parfois à l'ablation des glandes génitales. Nourries douze à quinze semaines d'un régime obésogène dès le sevrage, une partie subit une ou deux chirurgies sous anesthésie, puis une imagerie de la masse grasse en fin d'expérience. Le projet vise à comprendre le rôle des hormones sexuelles dans les troubles de mémoire liés à l'obésité, chez les mâles comme chez les femelles. Les stratégies thérapeutiques évoquées restent lointaines, quand la stérilisation et la mise à mort des 2 366 individus sont, elles, programmées.

Objectifs

L'obésité, en tant que défi de santé publique, réduit l'espérance de vie en raison des pathologies qu'elle favorise (hypertension, cancers, diabètes, etc.). Elle est également associée à des troubles de la mémoire, ce qui est particulièrement préoccupant durant l’enfance et l’adolescence, des périodes clés pour la maturation de structures cérébrales essentielles à la mémoire. Chez la souris, la consommation d'une nourriture riche en lipides pendant l'adolescence, en plus d'entrainer une prise de poids excessive, altère les capacités de mémoire en impliquant des mécanismes spécifiques dans certaines régions du cerveau. La majorité des travaux scientifiques ont été réalisés chez des mâles, alors que, chez l’humain, l’obésité touche de manière comparable les deux sexes. Afin de mieux transposer ces résultats, des études ont également été menées chez des femelles. Comme chez les mâles, la nourriture riche en lipides, à l’adolescence, a des effets négatifs sur la mémoire. Toutefois, les mécanismes impliqués semblent différer selon le sexe. L’objectif de ce projet est donc d’identifier le rôle des hormones sexuelles dans les altérations de la mémoire induites par un régime riche en lipides, chez les mâles comme chez les femelles.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet devrait produire des données expérimentales sur l'évaluation de la mémoire dans différentes conditions expérimentales (régime, age, sexe, traitement) chez la souris. Les résultats issus de ce projet devraient être accessibles à moyen terme, à l’issue de l’analyse complète des données et de leur diffusion via des publications scientifiques et des communications dans des congrès spécialisés. Et à plus long terme, ces expériences devraient permettre une meilleure compréhension des mécanismes à la base des effets délétères d'une nourriture hyperlipidique sur le cerveau et la mémoire en fonction du sexe et le rôle des hormones sexuelles, afin d'envisager potentiellement des stratégies thérapeutiques, puisque le surpoids concerne 47 % des français adultes et 17% des français souffrent d'obésité.

Procédures

Tous les animaux subiront, à au moins 48h d’intervalle, quatre tests comportementaux afin d'évaluer leur mémoire. Chaque étape de ces tests dure 10 minutes. Une partie des animaux subira lors de ces tests comportemantaux des injections périphériques ou locales. Une partie des animaux subira une fois un jeune de 5h préalablement aux mesures métaboliques (7 prélèvements sanguins sur une durée de 2 h). Une partie des animaux subira une ou deux interventions chirurgicales réalisées sous anesthésie gazeuse et en présence d'antalgique et d'anti-inflammatoire. Ces interventions durent entre 20 et 45 minutes avec une phase de réveil entre 5 et 20 minutes. Tous les animaux subiront en fin d’expérimentation, une seule analyse en imagerie d’une durée de 2 min afin d’évaluer la répartition de leur masse grasse/masse maigre et un seul prélèvement sanguin.

Impact sur les animaux

L’alimentation obésogène donnée pendant 12 à 15 semaines entraîne un surpoids qui reste non délétère chez des animaux jeunes comme ceux utilisés dans notre étude. Outre la sterilité induite par le retrait des glandes génitales, il n'y a que peu d’effets secondaires notables. Les tests de comportement, ainsi que les injections peuvent induire un stress qui sera limité par une habituation à la manipulation et à l'injection avant expérimentation et limitée par la maitrise des expérimentateurs. Les prélèvements durant le test de tolérance au glucose pourront engendrer une légère douleur aux animaux. Les chirurgies pourraient entraîner dans les 48h suivant l’opération une douleur et un stress se traduisant par une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en vue de récupérer leurs cerveaux pour des analyses post mortem.

Remplacement

L’étude intégrée des effets de la nutrition sur des aspects comportementaux et du fonctionnement cérébral est permise grâce à l’utilisation du modèle de rongeur soumis à de la nourriture obésogène et il n’est pas possible de le remplacer par des approches cellulaires sur des modèles in vitro ou in silico.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux en effectuant plusieurs tests comportementaux chez les mêmes individus plutôt que des groupes différents. De plus, le nombre d’animaux sera réduit au mieux pour obtenir des résultats concluants lors de nos comparaisons statistiques. Pour réduire le nombre d’animaux transgéniques produits, les besoins expérimentaux seront planifiés et les stratégies de croisement optimisées par l'utilisation de reproducteurs génotypés. Cela représente un total de 2366 animaux (1183 males et 1183 femelles) sur 5 ans.

Raffinement

Des critères objectifs d’arrêt des souffrances des animaux sont définis afin d’encadrer de manière objective et graduée les décisions visant à prévenir toute souffrance excessive. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec administration d’antalgiques en pré-, péri et post-opératoire pour limiter la douleur. Toutes les précautions d'asepsie et de confort seront prises pour limiter l'inconfort des animaux. Les jours suivant la chirurgie, les animaux sont surveillés attentivement une fois par jour pour s’assurer de leur bon rétablissement. Avec la mise en place de points limites, si un animal présente une anomalie il sera immédiatement isolé, surveillé et soigné pendant 3 jours jusqu’à amélioration. Si il n'y a pas d'amélioration et après avis de la cellule bien être et de l'avis du vétérinaire désigné, les animaux seront mis à mort. Si il y amélioration et durant les mois suivant la chirurgie, les animaux seront pesés 1 fois par semaine et un suivi avec des critères objectifs est mis en place. S’il n’y a aucun signe de mal-être chez l’animal, il passera en phase comportementale, qui sera optimisée pour durer le moins de temps possible. Une période d’habituation des souris à l'expérimentateur sera mise en place avant les taches comportementales afin de réduire le stress lié aux manipulations et aux procédures, contribuant ainsi à améliorer leur bien-être et la fiabilité des données recueillies. Les souris seront remises avec leurs congénères entre chaque phase de test. Les injections pharmacologiques seront réalisées de sorte à limiter les interventions sur l’animal.

Choix des espèces

L'espèce animale utilisée dans ce projet est la souris. Ce choix s’explique par la possibilité de modifier de façon précise le fonctionnement de certains éléments du cerveau chez cet animal. Ce sont des animaux sur lesquels les traitements nutritionnels et l'induction de l'obésité sont faciles à conduire et notre équipe dispose d’une expérience de longue date pour conduire des approches nutritionnelles chez cette espèce. Le modèle de rongeurs soumis à des régimes obésogènes permet l’étude intégrée de la nutrition sur des aspects comportementaux et de fonctionnement cérébral qu’il n’est pas possible de remplacer par des approches cellulaires. Les chirurgies et les tests comportementaux, maîtrisés sur cette espèce dans notre laboratoire, sont facilement mis en œuvre et permettent d’évaluer chez l’animal vigile les dimensions cognitives et émotionnelles, qui sont une nécessité expérimentale pour évaluer la réalité physiologique de nos résultats. Les souris seront exposées au régime hyperlipidique ou contrôle dès le sevrage (3 semaines) et pendant 12 semaines. Cette exposition commence dès le sevrage (jusqu’à l'âge adulte) afin de couvrir la période de l'adolescence. Certains animaux subiront une chirugie, une partie à l’âge de 4 semaines (pré adolescence) et une autre partie à l’âge adulte (8 semaines). Les taches comportementales seront réalisées à l'age adulte entre 15 et 18 semaines.

Exposés au fongicide in utero puis jusqu'au sevrage par l'alimentation de leur mère, à des doses dites réglementaires, 132 ratons subissent aussi six prélèvements sanguins hebdomadaires sous anesthésie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le projet cherche à savoir si ce pesticide, autorisé aux doses en vigueur, altère les barrières protectrices du cerveau en développement. Le porteur présente les nuisances des prélèvements comme légères, un stress court et une hypothermie transitoire. Tous les ratons sont tués en fin de protocole pour prélever leurs tissus.

Objectifs

Des études récentes montrent que certains pesticides, largement utilisés actuellement en agriculture pourraient poser un problème de santé publique important. Parmi les différents composés sur le marché, certains pourraient avoir une activité sur la consommation d'oxygène par les cellules. Dans le contexte du développement cérébral précoce, les barrières protectrices du cerveau nécessitent beaucoup d’énergie pour fonctionner correctement. Ainsi, l’altération de la respiration de ces barrières, provoquée par une exposition précoce au pesticide étudié est un facteur de risque méconnu de développement de pathologies cérébrales. L'objectif de cette étude est l’étude des altérations du fonctionnement des barrières protectrices du cerveau et du cerveau lui-même, provoquées par une exposition lors de la période périnatale (depuis le développement in utero jusqu'au sevrage) à un pesticides aux doses réglementaires.

Bénéfices attendus

Ce projet produira des données nouvelles et originales qui permettront aux agences réglementaires d’affiner leur analyse de risque sur la santé environnementale des populations exposées au pesticide étudié.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins hebdomadaires réalisés sous anesthésie générale. Nombre de prélèvements sanguins et durée : 6; 3 minutes chacun.

Impact sur les animaux

Les anesthésies gazeuses réalisées lors de prélèvement sanguins peuvent induire une légère hypothermie transitoire. La manipulation des animaux peut induire un stress léger de courte durée.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin du protocole afin de collecter les tissus pour analyse.

Remplacement

Le projet envisage l'étude des barrières protectrices du cerveau en lien avec une exposition expérimentale à un pesticide. Les modèles in vitro de barrières sang-cerveau ne permettent pas d’étudier l'influence globale des différentes cellules cérébrales sur la perméabilité de ces interfaces, et ne permettent pas de mimer des intoxications périnatales. Ceci implique donc le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Nous avons calculé, sur la base des effet attendus, le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet.

Raffinement

Conformément aux exigences de raffinement, les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie, et seront hébergés dans un environnement enrichi (bûchettes de bois, tunnel en plastique et éléments de nidification). Le suivi individuel consiste en une inspection visuelle du comportement et de l’apparence au quotidien. Des points limites spécifiques ont été définis et provoqueront la mise à mort des animaux si ils sont atteints. L'exposition au pesticide est réalisé par voie orale de façon naturelle via l'alimentation et sans manipulation des animaux. Les prélevement de sang sont réalisés sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Le projet sera réalisé sur des rats Sprague Dawley qui est une espèce de référence pour l'étude du neurodéveloppement. Cette lignée a des portées nombreuses. Le projet prévoit d’utiliser des ratons jusqu'au sevrage afin d’étudier l’impact d'un pesticide sur l’intégrité des barrières protectrices du cerveau au cours du développement précoce.

Toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, 1 280 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles portent des tumeurs et reçoivent jusqu'à dix injections, certaines sous anesthésie, pour tester des signaux immunogènes recombinants censés renforcer l'immunité antitumorale. Le porteur affirme qu'aucun système in vitro ou in silico ne reconstruit un système immunitaire fonctionnel. Les applications cliniques transposables sont annoncées comme une ambition, quand la mise à mort des 1 280 individus, elle, est certaine.

Objectifs

Dans le cadre de thérapies anti-tumorales telles que les chimiothérapies, il est possible d’observer une forme particulière de mort des cellules cancéreuses appelée mort cellulaire immunogène. Il a été démontré que ce type de mort cellulaire joue un rôle déterminant dans l’efficacité à long terme des traitements anticancéreux. Elle se caractérise par l’émission coordonnée de motifs moléculaires associés aux dommages cellulaires. Le système RUSH (Retention Using Selective Hooks) constitue une plateforme expérimentale particulièrement adaptée pour étudier la contribution spécifique de ces différents signaux immunogènes à l’activation de l’immunité antitumorale. L’étude de populations tumorales mixtes, offre ainsi un système original pour disséquer la manière dont la signalisation de danger indépendante de l’autophagie coopèrent, ou agissent en parallèle, dans la détection immunitaire de la tumeur. Les essais de coculture entre cellules tumorales et cellules dendritiques basés sur le modèle RUSH pourraient en outre permettre d’explorer la manière dont les cellules dendritiques intègrent ces signaux spatialement et fonctionnellement distincts afin d’induire leur activation, leur maturation, ainsi que la présentation croisée d’antigènes tumoraux. Une hypothèse vérifiable est que la déplétion sélective de certaines cellules dendritiques, abolirait les réponses immunitaires dirigées contre les tumeurs RUSH. Une autre hypothèse est que les tumeurs composées de cellules modifiées par le système RUSH soient intrinsèquement plus sensibles à l’inhibition des points de contrôle immunitaire, et que les souris guéries de telles tumeurs développent une mémoire immunologique durable. Ce projet a pour ambition de définir des stratégies combinatoires directement transposables, fondées sur l’administration de signaux immunogènes recombinants et d’agents immunomodulateurs, afin d’améliorer durablement l’efficacité des traitements anticancéreux.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider, dans des modèles précliniques, une nouvelle stratégie pharmacologique antitumorale efficace contre plusieurs types de cancer. À court terme, nous espérons aque les résultats obtenus grâce à ce projet permettront d'affiner les stratégies de traitement anticancéreux. À long terme, nous prévoyons de définir des conditions thérapeutiques optimales transposables en applications cliniques.

Procédures

Les souris seront manipulées régulièrement (

Impact sur les animaux

Diverses procédures (immobilisations, injections, gavages) peuvent provoquer du stress chez l'animal et une légère douleur transitoire au point d'injection. La croissance tumorale, la chimiothérapie et l'immunothérapie peuvent entraîner une perte d'appétit modérée, qui peut à son tour entraîner une perte de poids modérée.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de collecter divers organes pour des analyses immunologiques.

Remplacement

L'utilisation d'animaux vivants est essentielle car ce projet vise à tester l'efficacité des traitements anticancéreux et à confirmer l'activation du système immunitaire, et actuellement, il est impossible de reconstruire un système immunitaire fonctionnel in vitro/ex vivo ou in silico à cause de la limite des technologies actuelles.

Réduction

Une analyse statistique a été effectuée afin de calculer le nombre d'animaux nécessaires. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail. Les résultats seront analysés avec des outils statistiques.

Raffinement

Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (examen clinique quotidien, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). Des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout changement.

Choix des espèces

Plusieurs justifications d’ordre scientifique, pratique et éthique sont à la base du choix de la souris comme modèle préclinique. Tout d’abord, la souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. Ensuite, la souris est un animal très utilisé en oncologie, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Enfin, la méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire mature.

Pour étudier les mécanismes inflammatoires d'une arthrite provoquée dans deux modèles, 898 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Réparties sur trois établissements, elles subissent jusqu'à vingt et une injections, une irradiation de quatre minutes, des prélèvements sanguins et des séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur affirme que l'animal entier est "indispensable" car la réponse inflammatoire résulte d'interactions complexes entre organes. La majorité est tuée pour prélever sang, organes lymphoïdes et pattes, une partie conservée pour l'élevage des lignées.

Objectifs

Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs différents. La polyarthrite est une pathologie très fréquente et invalidante qui représente un enjeu de santé publique. Cette maladie auto-immune provoque une inflammation durable des articulations, ce qui peut endommager les os et le cartilage, entraînant des déformations irréversibles. Nous voulons étudier les mécanismes inflammatoires mis en jeu en modifiant leur expression dans deux modèles de souris d’arthrite induite.

Bénéfices attendus

Ce travail nous permettra de mieux comprendre les mécanismes pathogènes à l'origine de la maladie et pourrait ainsi contribuer au développement de thérapies efficaces.

Procédures

Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l'élévage dans l’établissement 1, le suivi clinique et traitement dans l’établissement 2, l’imagerie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à : 1) contention et 2 injections d'une durée de 10 secondes ou injections 3 fois par semaine pendant 1 semaine ou 7 semaines, soit au final: respectivement 3 ou 21 injections d’une durée de 10 secondes; 2) une irradiation d’une durée de 4 min, une injection unique d'une durée de 40 secondes, un prélèvement sanguin de 15 sec (5 au total). Les animaux anesthésiés seront soumis à 2 injections d'une durée de 10 secondes et à un acte d'imagerie (au total 6 actes d'imagerie de 15 minutes)

Impact sur les animaux

L’irradiation va induire un stress et une faible perte de poids temporaire. Les injections vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. Les prélèvements sanguins vont induire du stress. Le développement de l'arthrite va induire des douleurs au niveau des articulations, et une diminution de la mobilité. Les anesthésies gazeuses sont des actes stressants. Le transport des animaux entre les différents sites peut aussi être stressant pour les animaux.

Devenir

La majorité des souris seront mises à mort pour prélèvement de tissus spécifiques : sang, organes lymphoides et pattes afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte articulaire et inflammatoire par différentes techniques. Certains animaux de l'élevage avec le bon génotype seront conservés pour le maintien des lignées.

Remplacement

Bien que nous menions en parallèle des études de culture cellulaire pour tester nos hypothèses, le recours à l'animal est indispensable car la réponse inflammatoire et le développement de l’arthrite résultent d’interactions complexes entre plusieurs organes, qui ne peut être étudiée de façon complète que sur des animaux entiers.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. les animaux feront l’objet d’une surveillance continue, pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être et des anti-douleurs pourront être administrés si nécessaire. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale et permettra d’avoir un suivi longitudinal du développement inflammatoire et articulaire pour l'ensemble des animaux ainsi qu’une mise à mort de chaque animal au moment le plus informatif. Les souris seront transférées dans des cages de transport agrées, bords opaques, sans visibilité de l’extérieur.Tout au long de la procédure,

Choix des espèces

La souris développe des réactions immunitaires proches de celles observables chez l’homme. Les atteintes articulaires développées dans ces modèles induits sont similaires à celles observées chez l’homme. Les souris adultes seront âgées de 6 à 17 semaines pour évaluer l’efficacité thérapeutique des études.

Un AVC provoqué par chirurgie sous anesthésie d'environ 45 minutes, puis des tests de mémoire et de motricité répétés jusqu'à six fois par jour pendant douze à vingt jours: 540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. L'objectif déclaré est de comprendre comment l'inflammation se propage après un AVC et provoque des troubles cognitifs tardifs. Le porteur décrit un modèle induisant un dommage cérébral limité, sans symptômes majeurs, tout en cherchant à reproduire des déficits de mémoire. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune culture cellulaire ne reproduit la vascularisation cérébrale ni les tests de comportement.

Objectifs

L'accident vasculaire cérébral (AVC) résulte d'une interruption du flux sanguin dans une zone du cerveau, provoquant la mort cellulaire ainsi qu’une réaction inflammatoire dans cette région cérébrale. Les dommages induits chez les cellules produisent des symptômes qui se manifestent à court terme, tels que des déficits moteurs ou des difficultés à parler. Cependant, les dommages initialement induits par l’AVC dans une zone spécifique pourraient se propager dans d’autres aires cérébrales induisant ainsi de nouveaux symptômes. En fait, 70 % des survivants d'un AVC développent des troubles cognitifs tels que des déficits de mémoire, des difficultés à intégrer de nouvelles informations ou à s’adapter à de nouvelles situations. Ces symptômes se manifestent tardivement, de quelques semaines à quelques mois après l’AVC, ce qui offre la possibilité d’intervenir avec un traitement. Une bonne compréhension des mécanismes qui sous-tendent les troubles cognitifs se manifestant après l’AVC est donc nécessaire pour le développement de stratégies permettant d’éviter leur survenue. Nous émettons donc l’hypothèse que la propagation de l’inflammation de la zone initialement affectée par l’AVC aux autres régions du cerveau pourrait être à l’origine de troubles cognitifs. Dans cette étude, nous testons cette hypothèse en induisant un AVC limité à une région anatomique précise du cerveau d’un modèle de souris afin d’étudier l’évolution des conséquences à plusieurs niveaux, allant de l’expression du gène au comportement. Cette approche favorise une compréhension intégrative de comment des altérations précoces causées par l’AVC peuvent progressivement mener à des troubles tardifs à plus grande échelle, tels que la mémoire. Nous pourrons ainsi établir des liens entre les modifications observées dans le cerveau, notamment dans des régions qui ne sont pas touchées directement par la lésion, et les déficits de mémoire, afin d’identifier les mécanismes qui pourraient sous-tendre leur apparition.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à caractériser et comprendre les phénomènes après AVC au-delà de la zone initialement affectée. Cette compréhension est nécessaire afin d’établir de solides bases pour de futures recherches sur l’établissement de nouveaux traitements pour prévenir certains troubles cognitifs tardifs et pourrait avoir des répercussions positives et importantes pour la recherche préclinique. Les bénéfices attendus sont donc au profit de la santé humaine.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une chirurgie peu invasive pour induire l’AVC sous anesthésie générale (environ 45 minutes), et des tests comportementaux seront réalisés. Les souris seront soumises pendant 3 jours à des tests pour évaluer leur fonction motrice (duré max 5 minute par essai) et leur anxiété (durée max 5 minutes). Ensuite des autres tests seront utilisés pour évaluer la mémoire ainsi que la capacité à intégrer de nouvelles informations. Chaque test de la durée d’une minute est répété maximum six fois par jour pendant 12-20 jours selon le degré d'apprentissage des animaux. Les capacités de mémoire des souris pourraient également être étudiées avec un test plus court de reconnaissance d’objet nouveau.

Impact sur les animaux

La chirurgie d’induction de l’AVC induit un dommage cérébrale limité et ne s’accompagne typiquement pas des symptômes majeurs, rendant le modèle facilement utilisable tout en limitant la souffrance animale. Pendant la chirurgie des risques d’hypothermie et de déshydratation à cause de l’anesthésie peuvent survenir (nuisance modérée). Le seul symptôme observé post-chirurgie dans notre modèle et une légère perte de poids (usuellement inférieur à 10%) dès le lendemain de la chirurgie, et résolue dans la semaine suivante (nuisance légère). Les tests comportementaux peuvent engendrer une fatigue physique passagère (nuisance légère), ainsi qu’une légère hypothermie (nuisance légère).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort après les expériences pour récupérer les cerveaux et faire une étude de l’inflammation.

Remplacement

Il n’existe pas encore, à ce jour, de modèle alternatif (tel que les cultures cellulaires) à l’induction d’AVC chez la souris suffisant pour reproduire les mécanismes complexes présents dans la pathologie humaine, impliquant notamment des structures sophistiquées comme la vascularisation cérébrale. La méthode que nous utilisons est cependant la méthode actuelle connue la moins invasive, permettant l’induction contrôlée et reproductible d’un AVC limité à une zone d’intérêt. Il n’existe pas non plus actuellement de méthode alternative permettant de remplacer les animaux dans les expériences de comportement, impliquant l’interaction complexe de différentes structures et systèmes cérébraux

Réduction

Le déroulement des expériences est organisé afin de limiter au maximum le nombre d’animaux : certains tests seront effectués sur la base de résultats des expériences précédentes. Les tests comportementaux choisis permettent d’étudier plusieurs aspects de la mémoire sur le même lot d’animal et sans altérer les résultats. En plus, sur les mêmes animaux nous testerons des signes d’une inflammation. Cela permet une étude longitudinale, et donc une réduction des animaux. Le nombre de souris a été déterminé à l’aide de tests statistiques.

Raffinement

Des mesures de raffinement seront mises en place durant toute la durée du projet pour minimiser la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. La douleur est prévenue grâce à des mesures anesthésiantes et analgésiantes. Les animaux sont toujours surveillés quotidiennement par le personnel animalier, et une surveillance accrue est réalisée par l’expérimentateur pendant au moins deux jours après la chirurgie, puis une fois par semaine. Si l’animal présente des signes de douleur au cours de l’expérimentation, il sera pris en charge par l’expérimentateur et le vétérinaire responsable qui appliquerons des soins conservatoires et une surveillance prolongée. Si les critères d’arrêt des souffrances sont atteints (points limites établis), l’expérience sera arrêtée. Nous vérifions que les animaux sont en bonne santé tout au long des tests et si des souffrances sont observées, des soins conservatoires seront également appliqués avec avis du vétérinaire, ou les expériences arrêtées en cas d’atteinte des points limites. Les animaux sont habitués à l’utilisateur et aux dispositifs utilisés pendant le test pour réduire le stress. Par expérience, il est coutumier de voir après quelques jours d’apprentissage que l’animal monte directement dans votre main lorsque vous ouvrez la cage et effectue la tâche sans appréhension, ni signe d’angoisse particulier.

Choix des espèces

Le modèle envisagé a déjà été développé chez la souris. L’étude sur la souris permet de faire des corrélations entre les phénomènes à niveaux cellulaire et le comportement et donc de répondre à notre question scientifique. Nous utiliserons des souris âgées de 16-28 semaines. Cette tranche d’âge permet d’étudier les conséquences d’un AVC sur une tache de mémoire chez un animal adulte. Nous utilisons des animaux adultes puisque, pour étudier les conséquences d’un AVC, les circuits neuronaux et vasculaires doivent être complètement développés.