Rongeurs

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur humaine leur est inoculée, avec des injections de traitement deux fois par semaine pendant quatre semaines, puis mise à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que la tumeur peut nécroser ou s'ulcérer, l'animal étant tué si elle dépasse 2 000 mm³. Il affirme que la validation de ces anticorps ne peut s'effectuer que chez l'animal vivant, l'entrée en essai clinique restant une perspective.

Objectifs

L’immunothérapie constitue un véritable espoir dans le traitement de nombreux cancers, notamment dans ceux sans prise en charge efficace actuellement. Ce traitement consiste principalement en l’administration d’anticorps monoclonaux dirigés contre les cellules tumorales ou leur microenvironnement afin de limiter la croissance tumorale. Plusieurs types d’anticorps monoclonaux peuvent être utilisés dans ce but, sous réserve que le patient présente bien la protéine ciblée au sein de sa tumeur. D’autres anticorps monoclonaux ont une action immunomodulatrice en levant le mécanisme d’inhibition du système immunitaire induit par la tumeur. Ces mécanismes sont communs à plusieurs cancers et ces traitements récents ont des indications dans déjà sept types de cancers : poumon, rein, vessie, tête et cou, mélanome , maladie de Hodgkin et maladie de Merkel et sont actuellement évalués dans de nombreux autres cancers. Bien que des réponses remarquables et prolongées aient pu être observées chez des patients atteints de cancers avancés métastatiques, un nombre important de patients (80 à 60% selon les cancers) restent réfractaires au traitement.

Bénéfices attendus

La première partie de ce projet permettra de compléter la caractérisation de notre produit par confirmation des marqueurs tumoraux identifiés et permettra de de débuter un essai clinique chez l’homme , dans des cancers ou le besoin médical est très important. Dans le cadre du lymphome cette étude permettra de confirmer l’intérêt thérapeutique de notre candidat médicament et ainsi d’offrir une vrai alternative thérapeutique aux patients atteints de lymphomes T périphériques et ne bénéficiant d’aucune prise en charge actuellement

Procédures

Les animaux seront soumis à une inoculation de tumeur humaine via injection en sous-cutanée sous anesthésie ou via injection en intra-péritonéale sur animal vigile. Pour le suivi de chaque modèle, les animaux seront également soumis à des injections en intrapéritonéal pour les traitements (2 fois par semaine pendant 4 semaines) sur animaux vigiles. L'anesthésie pour l'injection en sous-cutanée sera de courte durée :< à 5 min par souris. Pour les injections en intrapéritonéale la manipulation des souris n'excédera pas 1 min.

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux sous-cutanées peuvent provoquer de la douleur si la tumeur nécrose ou s’ulcère (points-limites). La tumeur ne devant pas provoquer de gêne pour la mobilité de l’animal, celui-ci sera mis à mort si la tumeur atteint 2000mm3 (soit moins de 10% de la masse corporelle). Aucun autre effet indésirable n’a été remarqué sur ce type de modèle au laboratoire. Les modèles tumoraux sous-cutanés sont considérés comme des procédures modérées. Les modèles de lymphomes T périphériques peuvent induire une splénomegalie, mais aucune autre altération majeure n’est attendue. L’état clinique et le poids des souris seront suivies 3 fois par semaine. Ces modèles sont également considérés comme des procédures modérées.Une contention légère sera fait sur les souris pour l'administration intrapéritonéale par du personnel qualifié afin de ne pas engendrer de stress sur les souris. Cette manipulation ainsi que la piqure ne durera que quelques secondes et la souris sera rapidement remise avec ses congénères. La manipulation des souris pour mesurer la masse tumorale n’excédera pas 1 min. elle se fera 3 fois par semaine dont 2 fois en même temps que l’injection des traitements afin d’éviter les manipulations intempestives.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêts pourront être récupérés pour compléter les analyses.

Remplacement

Du fait du contexte physiologique et de la complexité du système immunitaire, la validation d’un traitement par anticorps polyclonaux ne peut s’effectuer que dans un modèle in vivo. Il est nécessaire d’utiliser des animaux pour atteindre les objectifs du projet car cette étude a pour objet l'évaluation de l’efficacité thérapeutique d’un ou plusieurs traitements en préclinique. Les animaux sont indispensables à cette étape d’évaluation thérapeutique du traitement car ils permettent de tester in vivo l’efficacité ou la non-efficacité du (des) traitement(s), de caractériser le fonctionnement du (des) traitement(s), ainsi que les effets secondaires possiblement liés avant de le tester en clinique chez l’Homme si celui (ceux)-ci est efficace.

Réduction

Dans le but d'utiliser un nombre d'animaux cohérent avec une pertinence statistique, nous avons défini le nombre d'animaux par groupe de 10 -15 animaux selon les étapes pour l’ensemble des groupes. Les tests statistiques utilisés reposent sur l’analyse de données non paramétriques, calculée quand le nombre de sujet est inférieur à 30. Ces tests nous permettent d’analyser nos données en combinant un test statistique fiable et un nombre d’animaux réduit.

Raffinement

Une étape d’acclimatation de 4 jours minimum sera systématiquement réalisée à l’arrivée des animaux pour éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. La douleur sera dans la mesure du possible évitée en euthanasiant les animaux si leur score clinique global atteint 8 sur deux jours consécutifs tel que décrit dans le tableau de score clinique général ou par injection d’analgésique dans le cas de morsure par exemple. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 5 pour limiter le stress de la surpopulation. Des brindilles de papier sont placées dans la cage pour permettre aux souris de s’enfouir et se cacher. L’analgésie quant à elle dépendra de la cause. Pour les animaux en souffrance tels que les animaux ayant un score clinique > à 7 sur deux jours consécutifs, l’animal se verra administrer en sous-cutané une injection de buprénorphine à 0.1mg/kg deux fois par jour jusqu’à diminution du score ou exclusion de l’étude. Pour les plaies de surface comme les morsures, après désinfection, les animaux pourront recevoir directement sur la plaie de la tétracaïne.

Choix des espèces

La souris NMRI nude est très largement utilisée pour la mise en place de modèle xénogreffe. De plus elle présente une activité résiduelle du complément murin, ce qui la rend pertinente pour l’évaluer l’activité biologique de nos traitements à base de d’anticorps polyclonaux. Tous les modèles xénogreffe décrit dans ce projet ont été validé et caractérisé dans des publications. Adulte-8-10 semaines, car la prise tumorale est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse anti-tumorale, et donc un stade tumoral différent.

1 200 souris et 300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur mammaire leur est greffée, avec jusqu'à deux chirurgies, radiothérapie, imagerie et prélèvements sanguins, puis mise à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que la tumeur peut réduire la mobilité, se nécroser ou métastaser jusqu'aux poumons. Il affirme que l'animal est un passage obligatoire avant l'humain, les bénéfices étant renvoyés au long terme.

Objectifs

Les cancers du sein sont les cancers les plus fréquents chez la femme. Ils représentent une pathologie très hétérogène. Ainsi, deux patients ayant le même diagnostic initial pourront présenter des réponses aux traitements conventionnels très différentes. Un seul type de modèle ne peut donc représenter l’ensemble de ces pathologies. Ce projet vise à évaluer les propriétés anti-tumorales de différentes approches thérapeutiques incluant notamment des candidats médicaments, la radiothérapie ou encore l'utilisation de dispositifs médicaux dans des modèles de tumeurs mammaires obtenues par greffe de cellules cancéreuses.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter les cancers du sein. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé ou le dispositif médical testé est actif dans un modèle expérimental de tumeurs mammaires ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques.

Procédures

En fonction de l'étude, les animaux pourront subir au maximum 2 chirurgies de 5 à 15 min chacune, sous anesthésie générale, pour l'implantation d'un dispositif médical et l'exérèse chirurgicale de la tumeur mammaire. Ils seront également anesthésiés au moins une fois, généralement par anesthésie gazeuse, pour l'implantation des cellules tumorales. Ils pourront également être anesthésiés plusieurs autres fois au cours de l'étude pendant quelques minutes, généralement par anesthésie gazeuse, afin de procéder à des traitements comme la radiothérapie et/ou à des suivis par imagerie. Dans le cas de radiothérapie, les animaux seront traités généralement pendant 5 jours consécutifs. Les suivis par imagerie se feront eux généralement 1 fois tous les 7 à 15 jours pendant environ 2 mois. Les animaux pourront également subir plusieurs prélèvements de sang dans le respect des recommandations éthiques (volumes prélevés, fréquences et temps de récupération).

Impact sur les animaux

Le développement de la tumeur mammaire peut entrainer un inconfort voire une réduction de la mobilité des animaux. Les tumeurs peuvent également développer une nécrose. Des métastases, en particulier au niveau des poumons, peuvent entrainer des difficultés respiratoires. Par ailleurs, les effets potentiellement indésirables du/des produits testé(s) font l’objet d’échange avec nos promoteurs et les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d’observations des animaux afin d'anticiper au mieux de potentiels signes cliniques.

Devenir

Mise à mort de l'ensemble des animaux à la fin de l'étude pour réaliser des prélèvements d'organes et/ou des observations macroscopiques.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les tumeurs mammaires. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris et le rat sont les espèces qui sont les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 6-10 animaux/groupe.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • le suivi d’éventuel signes cliniques, • la détermination des points limites, • le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire. • un protocole analgésique adapté pour les chirurgies et la période post-opératoire ainsi qu'un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • la réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse.

Choix des espèces

La souris et le rat sont les espèces animales les plus adaptées et les plus couramment utilisées dans les modèles animaux de tumeurs mammaires obtenues par greffe de matériel biologique d’origine tumorale. Les animaux utilisés sont des animaux adultes âgés de 6 à 10 semaines au moment de l’implantation des cellules tumorales. La prise tumorale est connue pour être moins bonne chez des individus plus âgés.

260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections intramusculaires répétées de deux candidats myorelaxants, avec prélèvements sanguins, puis sont tués pour analyse du muscle. Le porteur n'attend aucun signe clinique et situe les nuisances dans le stress de contention et la douleur des injections. Il affirme que les modèles cellulaires sont débattus et ne reproduisent pas le système immunitaire, l'étude vérifiant l'absence de réaction immunitaire à ces molécules d'un développeur privé.

Objectifs

Après avoir démontré le bénéfice d’efficacité des produits (FTP-501 et FTP-101) face aux produits de référence utilisés en clinique lors de projets précédents, ce projet expérimental s’intéresse au potentiel immunogène de ces candidats. Cette étude a pour objectif de confirmer la non-présence d’Anticorps Anti-Drug (ADA) suite aux injections des différents composés. Ces molécules pourraient a priori provoquer une réaction immunitaire suite aux injections, diminuant ainsi l’efficacité du traitement et sa tolérance. Il est donc important de vérifier qu’une telle réaction est limitée ou inexistante.

Bénéfices attendus

Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont un impact sociétal important. La dystonie est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entrainer des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques comportent tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. L’objectif de notre projet est de mettre en évidence les effets bénéfiques de l’utilisation locale de différents produits myorelaxants novateurs à effet rapide et durable, sur la contraction musculaire pour les patients souffrant de troubles du mouvement comme la dystonie et la spasticité. Au cours d’une étude princeps, nous avons pu identifier au moins 5 produits présentant une activité myorelaxante d’intérêt ; ensuite, grâce aux différents projets déposés, nous avons avancé nos 2 premiers Lead (FTP-501 et FTP-101) quasiment au terme de leur développement préclinique. Chacun des produits identifiés au cours de l’étude princeps semble avoir des caractéristiques pharmacologiques différentes : certains induisent une myorelaxation très rapide (FTP-101), et d’autres offrent un effet durable par exemple (FTP-501). Or, selon la maladie neuromusculaire, le besoin clinique est différent, et donc chaque caractéristique est plus ou moins critique. Ce projet permettra de vérifier qu’aucune réaction immunitaire ne se manifeste suite aux injections et que les produits sont bien tolérés quelle que soit la dose injectée, et bien tolérés après des injections répétées.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - Injection intramusculaire = 3 injections, durée 30 secondes/injection/animal = 1 min 30 sec - Pesée des animaux = 7 pesées / animal => 30 secondes / pesée = 3 minutes 30 sec / animal - Prélèvements de sang = 7 maximum par animal, durée 2 minutes = 14 minutes / animal.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, aucun signe clinique ni effets secondaires n’est attendu ici suite à l’injection des composés, d’après nos résultats obtenus dans nos études précédentes et la littérature. En effet lors de nos précédents projets, aucun signe clinique de type infection ou inflammation suite à une seule injection n’a été observé. Nous n’attendons pas ici de réactions suite aux multiples injections. Dans le cadre de nos procédures, les nuisances attendus sont : le stress des animaux dû à la contention pour l’injection, une douleur liée aux injections i.m. et les multiples prélèvements de sang (6 maximum).

Devenir

Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés. Un prélèvement pour analyse histologique du muscle injecté sera réalisé.

Remplacement

Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). De plus, nous recherchons ici des réactions immunitaires suite aux injections de nos composés. Le système immunitaire d’un hôte est extrêmement complexe (impossible à reproduire dans sa globalité in vitro) et nécessite des expérimentations in vivo.

Réduction

Pour la réduction, la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs a été déterminé avec le logiciel G-Power. Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 10 animaux par groupe (5 mâles et 5 femelles). Cependant, si les résultats sont dépendants du sexe, les groupes d’analyse seront de 5 animaux. Cette taille de groupe nous permet néanmoins d’obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les animaux seront stabulés dans des cages en plastique transparent de 1800cm2 au sol et comportant une plateforme. Les cages seront ventilées individuellement, placés dans une pièce sous air conditionné, avec un cycle jour/nuit de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. Ils seront maintenus en groupe de 2 ou 3 rats par cage. Ils disposeront de matériel de nidification (litière en chips de cellulose) puis d’enrichissement : les rats ont un tunnel rouge ainsi qu’un bâton de bois à ronger. Les animaux seont surveillés quotidiennement permettant un suivi clinique de chaque animal. Ainsi, des points limites sont mis en place durant tout ce projet permettant de définir des critères d’arrêt si nécessaire. Les prélèvements sanguins seront réalisés par un expérimentateur entraîné, et via une approche limitant le stress et la douleur, tout en ne dépassant pas les limites de volume prélevables chez un rat.

Choix des espèces

La comparaison de la rapidité d’action entre notre molécule et les traitements sur le marché ne pourra se faire que sur un modèle : i) exprimant les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire, et ii) dans lequel il existe une limite de diffusion dans les tissus. En effet, la cinétique des molécules après injection intra-musculaire est fortement dépendante de la capacité à diffuser dans le muscle, un tissu très compartimenté comportant plusieurs membranes interne. Nous recherchons ici des réactions immunitaires suite aux injections de nos composés. Le système immunitaire d’un hôte est extrêmement complexe et nécessite des expérimentations in vivo. De plus, nous avons choisi le rat d’une part, par continuité avec nos études précédentes et notre expérience sur ce modèle et d’autre part, car il s’agit d’un modèle de choix pour des études de toxicité de composé. Nous utiliserons des rats Sprague Dawley âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (200g) et 18 semaines maximum en fin d’expérimentation (600g pour les mâles). Des jeunes adultes sont choisis ici pour le bon fonctionnement de leur système immunitaire.

768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On provoque une inflammation chez des femelles gestantes porteuses d'une mutation, pour observer les effets sur le développement nerveux des embryons, avec suivi par échographie. Le porteur indique que l'injection peut induire un développement anormal in utero et une mise bas prématurée. Il affirme qu'il est impossible de remplacer ce modèle muté, les retombées cliniques étant renvoyées à une meilleure compréhension des pathologies.

Objectifs

Lorsque des infections sont contractées durant la grossesse, il en résulte l’apparition de davantage de pathologies du neuro-développement (PND), autisme, paralysie cérébrale, schizophrénie etc. Ces pathologies sont dues en particulier à un développement anormal du système nerveux. De plus, les naissances prématurées qui peuvent s’y ajouter sont un facteur également aggravant. Il a récemment été montré que des anomalies de motricité apparaissent précocement, avant que les anomalies cognitives ne puissent être diagnostiquées. Des travaux récents ont mis en évidence des mutations dans certains gènes, qui jouent un rôle crucial dans le développement du système nerveux central, et qui sont impliqués dans de telles pathologies neuro-développementales. L’existence simultanée d’une inflammation placentaire accentuerait les conséquences de ces modifications génétiques. Lors d’infections au cours de la grossesse, une inflammation du placenta peut être décelée et impacter le développement des embryons. En cas de fragilités génétiques dues à des mutations chez certains embryons, le développement normal du système nerveux est perturbé, ce qui peut conduire à différentes pathologies neurodéveloppementales. Nous provoquerons une situation d’inflammation chez la souris gestante, et nous analyserons l’effet de mutations dans les embryons sur : (i) des marqueurs inflammatoires présents dans les fluides amniotiques des portées, (ii) le développement neuro-anatomique du système nerveux, (iii) de l’appareil neuro-moteur dont les masses musculaires, ainsi que (iv) le développement du placenta.

Bénéfices attendus

Le gène étudié permet la transmission de signaux de l’environnement en permettant notamment le développement embryonnaire du cerveau. Son étude dans des modèles de souris nous permettra d'obtenir une meilleure compréhension des signaux moléculaires et cellulaires et des facteurs multiples conduisant aux pathologies neuro- développementales dans le contexte inflammatoire de la grossesse. Elle devrait également conduire à une amelioration du pronostic des troubles précoces du développement neuro-moteur.

Procédures

Les souris seront accouplées pour déclencher une gestation. Les accouplements seront réalisés jusqu’à l’obtention de 6 souris gestantes par groupe. Les souris suivies subiront 4 examens d'imagerie non invasive pour le suivi des gestations sous anesthésie générale ne dépassant pas 20 minutes. Au cours de cette gestation, une réponse inflammatoire suite à une seule injection (durée maximale : 30 sec) sous-cutanée d’une molecule déclanchant l’inflammation sera générée pouvant entraîner des défauts de développement in utero.

Impact sur les animaux

Impact de l’agent inflammatoire sur l’état général des souris : une vigilance sera portée sur l’inflammation provoquée, même si des conséquences telles que l’hypothermie sont peu probables aux doses faibles utilisées ici (jusqu’à 40 fois moins que les doses rapportées). Il est attendu que les injections d’un composant bactérien, qui provoque de l’inflammation, induisent un développement anormal des embryons in utero et une possible mise bas prématurée.

Devenir

Mort pour utilisation des tissus : analyses anatomiques et dosages immunologiques.

Remplacement

Il est impossible de remplacer ce modèle murin porteur d’une mutation constitutionnelle pour le gène d’intérêt, mais des études en culture ont permis de montrer son rôle sur le développement de certaines structures du système nerveux. Par ailleurs, nous avons déjà identifié des toxines utilisables en culture cellulaire pour renforcer certains des résultats que nous aurons obtenus dans les souris.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe sera de 6 pour atteindre une robustesse statistique. L'échographie non invasive permettra de déterminer in utero l'apparition d'une létalité dans les portées et de préciser à quel stade elle apparaît, évitant une mise à mort séquentielle des femelles gestantes au cours de la gestation, comme cela est habituellement le cas pour les études de mortalité in utero. Ce suivi nous permettra également d’éviter d’engager une inflammation dans des femelles n’ayant pas ou trop peu de petits.

Raffinement

L'échographie non invasive permettra de caractériser in utero plusieurs paramètres fonctionnels (fréquence cardiaque, flux sanguin et résistance hémodynamique) en plus des informations anatomiques (rapport périmètre cranial / périmètre abdominal). A partir des expériences préliminaires, nous établirons rapidement le timing auquel l’injection sera réalisée (précoce ou tardive) pour n’effectuer dans un premier temps l’étude que sur le stade d’injection qui donne les résultats les plus évidents. Les échographies seront faites sous anesthesie, et nous avons établi une grille qui nous permet d’évaluer l’éventuelle détresse et souffrance des animaux et de les supprimer ou soulager et ainsi d’améliorer leur bien-être. Les conditions d’hébergement seront optimisées en évitant l’isolement des animaux et leur maintien en groups sociaux dans des cages enrichies de cylindres en carton.

Choix des espèces

Choix du modèle murin : le modèle de souris a été choisi car il permet d’étudier les conséquences durant le développement embryonnaire de l’absence d’expression d’une protéine. Modèle mammifère, adapté pour les études à visée clinique : études sur la reproduction/gestation, rôle du placenta. Reproduction rapide, fond génétique homogène, nombre important d’animaux dans une même portée, avec des génotypes différents, permettant une comparaison interne fiable. Nombre de publications ont récemment rapporté que les mutations murines introduites miment la pathologie humaine. Les animaux seront utilisés à pour les études anatomiques du système nerveux, la mise en place des motoneurones qui a lieu précocement et le développement des masses musculaires.

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée à la patte, avec injections cinq jours sur sept pendant quatre semaines et suivi par imagerie, pour tester des molécules contre un cancer pédiatrique, le rhabdomyosarcome. Le porteur précise n'utiliser que des femelles, notamment pour limiter les bagarres entre mâles. Il affirme que le modèle animal est le seul à intégrer les facteurs physiologiques en jeu, les retombées cliniques étant renvoyées à un transfert ultérieur.

Objectifs

Dans les cancers pédiatriques, le rhabdomyosarcome (RMS) représente 5% des tumeurs pédiatriques solides. Ces tumeurs malignes d’origine musculaire se développent dans diverses localisations, principalement dans la tête et le cou (40%), la vessie et les organes reproducteurs (20%), les membres (20%) et le tronc (10%). La survie à cinq ans des patients est d'environ 75 %, alors qu'elle est inférieure à 30 % chez les patients dont la maladie s'est propagée à d'autres parties du corps (maladie métastatique). Malgré les avancées de la médecine personnalisée, il n’y a eu que de faibles progrès dans le traitement de cette maladie. Une famille de nouvelles molécules ciblant la production d'énergie a été identifiée dont il faut démontrer qu’elles possèdent les caractéristiques de candidats médicaments anti-tumoraux et anti-métastatiques. Ceci permettrait d’améliorer la prise en charge médicale des RMS chez l’enfant et l’adolescent. L’objectif de ce projet est de confirmer chez la souris l’efficacité anti-tumorale de ces molécules, c’est-à-dire que le traitement induit une diminution du volume des tumeurs primaires et de l’étendue des métastases.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules candidats médicaments dans le traitement d’un type de cancers pédiatriques (rhabdomyosarcomes) et de confirmer les résultats déjà obtenus en vue d’un transfert technologique vers la clinique.

Procédures

Analgésique pré implantation : 1x lors de la greffe au niveau de la patte avant l'anesthésie. Anesthésie : 1x au moment de la greffe au niveau de la patte (Durée : 5 min maxi) et au niveau de la queue en intra-artérielle (Durée : 20 min maxi) ; 2x avant l’imagerie par l'échographie pour la préparation des animaux (Durée : 5 min maxi par point d’acquisition) ; 2x (lors du constat de la prise de greffe et en point final) pour l'imagerie par échographie (Durée : 10-20 min maxi par point d’acquisition) ; 13x max pour l'imagerie lumineuse (Durée : 8 min maxi par point d’acquisition soit 1x/semaine). Traitement : 5 jours/7 injection des molécules pendant 4 semaines maximum. Évaluation de l’efficacité des composés et prise de greffe par imagerie lumineuse sous anesthésie (1x/semaine) et par mesure au pied à coulisse de l’épaisseur des pattes (1x/semaine) pendant 91 jours maximum.

Impact sur les animaux

Implantation intra-musculaire (IM) : Avant l’implantation IM, l’injection en sous-cutanée d’un anti-douleur engendre une douleur légère. Puis, l’implantation IM sous anesthésie entraine une douleur légère. Le suivi de l'évolution du volume tumo va engendrer un stress léger lors de la mesure au pied à coulisse de l’épaisseur de la patte greffée et de la patte car ces mesures sont réalisées sur animaux vigiles. Implantation intra-veineuse ou intra-artérielle : L’implantation va entrainer une douleur légère. Développement des tumeurs/dissémination et imagerie : Le suivi dudéveloppement de tumeurs et/ou leur dissémination (métastases) peut engendrer une douleur modérée. Uniquement pour l’imagerie par bioluminescence, les animaux vont devoir recevoir en vigile une injection de luciférine en intra-péritonéale qui va engendrer une douleur légère. Traitements : Les animaux des procédures (3 et 4) reçoivent une injection en intra-péritonéale du traitement standard (Doxorubicine) ou des composés d’intérêt (MS-C2 et MS-C3) qui génèrent une douleur légère au début qui peut évoluer vers une douleur modérée suite à la répétition des injections (5J/7 des composés à tester ou 2J/7 le traitement standard) pendant les 4 semaines de traitement. Les effets secondaires pour le traitement standard et l’administration des composés d’intérêt sont connus et n’entrainent pas de douleur. La toxicité des molécules a été évaluée précédemment in vivo chez la souris et n’a pas montré de souffrance des animaux aux doses que nous allons utiliser. Les molécules MS-C2 et MS-C3 sont resuspendus dans du DMSO (= véhicule) et lors des traitements, seront injectées en présence d’un excipient lipidique (huile raffinée) dédiée et certifiée pour l’usage vétérinaire en injection. La concentration finale de DMSO dans l’excipient est ~1% et aucun signe particulier de souffrance ou d’irritation n’a été relevé chez les souris ayant reçu ce traitement lors des expériences réalisées selon le même protocole. Elles ont permis de déterminer la Dose Maximale Tolérée (DMT) utilisable pour un protocole de traitement incluant une injection intra-péritonéale 5J/7 pendant 4 semaines. Avec le traitement standard, nous allons observer une diminution de la taille des tumeurs donc une diminution potentielle de la douleur mais nous ne savons pas avec les composés d’intérêts.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure.

Remplacement

Des études précédentes sur des cellules cancéreuses et sur des embryons de poulet ont montré qu'une nouvelle famille de molécules était efficace sur la tumeur et les métastases. Le modèle animal est le seul permettant de prendre en compte de nombreux facteurs physiologiques susceptibles d’intervenir dans les effets de la molécule testée. Aucune donnée bibliographique n’est disponible sur ces molécules à l'heure actuelle.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des études précédentes ont permis de sélectionner les composés d'intérêts et de déterminer les doses maximales tolérées. Dans le but de réduire le nombre d’animaux, deux lignées cellulaires humaines, qui émettent de la lumière seront utilisées afin de pouvoir suivre la progression tumorale et/ou la dissémination métastatique au cours du temps sur le même animal sans avoir à le mettre à mort. D’après les données de la littérature, on estime que le taux de prise de greffe sera de 90%. Cette donnée a été prise en compte afin d’utiliser le nombre minimum d’animaux permettant de s’assurer de la reproductibilité et de réaliser une analyse statistique des résultats. De plus, les procédures prévues dans ce projet sont séquentielles, ce qui permettra de réduire au maximum le nombre de souris impliquées dans le projet.

Raffinement

Deux lignées cellulaires humaines qui émettent de la lumière seront utilisées afin de pouvoir suivre la progression tumorale et/ou la dissémination métastatique au cours du temps sur le même animal sans avoir recours à sa mise à mort dans un but de raffinement. Au cours de ce projet, les précautions seront prises pour stresser au minimum l’animal. Dès leur arrivée, les souris seront hébergées par groupe de 5 animaux par cage. Une période d’acclimatation de 7 jours sera respectée avant l’entrée des animaux dans l’une des procédures présentées ci-après. L'administration d'analgésique/anesthésique, un suivi adapté des animaux et la définition précise des points limites précoces et prédictifs d'un mal être, permettent de limiter au maximum la souffrance animale. Post greffe, de la nourriture humidifiée sera ajoutée au fond de la cage au cas où les animaux présenteraient des difficultés à se déplacer. De plus, post-mortem différents organes seront prélevés pour des analyses complémentaires.

Choix des espèces

L’utilisation de souris dont le système immunitaire est altéré est nécessaire pour étudier l’efficacité du nouveau traitement sur des cellules de cancers pédiatriques humaines sans rejet de greffe par le système immunitaire. Les rhabdomyosarcomes sont des tumeurs pédiatriques rares, pour lesquelles un sexe-ratio Mâle/Femelle légèrement supérieur à 1 a été rapporté, toutefois très variable selon les études, l’âge et la localisation des tumeurs primaires. Les premières expériences de greffes en intra-musculaire au niveau de la patte ont été menées avec des femelles et ont permis l’obtention de tumeurs dans 90% des cas. Uniquement des femelles sera utilisée afin d’être dans les mêmes conditions que le projet précédent et aussi de limiter le risque d’agressivité/bagarre inter-individu par rapport aux mâles dans les cages et être obligé d’écarter des individus ou les mettre à mort suite à des blessures. Les essais chez le mâle seront ultérieurement envisagés en fonction d’effets endocriniens potentiels car actuellement aucune information n'est disponible. Les greffes seront réalisées sur des souris de 6 semaines pour une réalisation optimale de l’expérience. En effet à cet âge, d'après la littérature, la prise de greffe est plus fiable et donne des résultats clairs pour évaluer l’efficacité de nouveaux traitements.

Des souris sont rendues malades par une injection intradermique cinq jours par semaine pendant quatre à six semaines, soit 20 à 30 injections de bléomycine ou d'acide hypochloreux, qui provoquent une fibrose de la peau et des poumons censée reproduire la sclérodermie systémique. 134 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi une injection unique de cellules souches issues du tissu adipeux dans la veine de la queue, et le porteur décrit des démangeaisons, de petites plaies au point d'injection et une fibrose pulmonaire qui, selon lui, "n'entraine pas de signes de difficulté ou de souffrance respiratoires". Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leur sang, leurs poumons, leur rate et leur peau.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer la possibilité d’utiliser des cellules stromales mésenchymateuses d'origine adipocytaire (ASCs) en clinique (traiter des patients atteints de sclérodermie systémique). Ainsi, nous évaluerons leurs effets thérapeutiques (réduction de l’inflammation et de la fibrose cutanée et /ou pulmonaire), leurs interactions avec différents types de cellules immunitaires et le(s) mécanisme(s) impliqué(s) dans leurs effets thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet sera de valider si la thérapie cellulaire de cellules stromales et en particulier d'origine adipocytaire (ASCs) est efficace pour contrer les troubles majeurs de la sclérodermie systémique que sont la fibrose cutanée et pulmonaire et, dans une moindre mesure, la production d’anticorps et d’apporter de nouvelles connaissances sur leurs effets thérapeutiques.

Procédures

Les souris seront soumises à une injection intra-dermique (5 jours/semaine) pendant 4 semaines (procédure N°1 et N°2 ) ou pendant 6 semaines (procédure N°3) et à une seule injection intraveineuse dans la veine caudale de cellules souches stromales d'origine adipocytaire (ASCs).

Impact sur les animaux

L'injection intra-dermique de Bléomycine ou d'acide hypochloreux peut entrainer une gène (démangeaisons) dans les 2-3 minutes post-injection et aussi parfois des petites plaies ou des irritations cutanées au point d'injection. Ces souris développent une fibrose cutanée au point d'injection et une fibrose pulmonaire modérée, limitée à la région sous-pleurale qui n'entraine pas de signes de difficulté ou de souffrance respiratoires.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements de tissus et d'organes (sang, poumons, rate et peau)

Remplacement

Il est important de voir les effets thérapeutiques des cellules mésenchymateuses stromales au niveau de l’animal entier portant une maladie surtout quand celle-ci touche plusieurs tissus ou organes et qu’elle est caractérisée par une autoimmunité (présence d’auto-anticorps dans la circulation sanguine), impossible à reproduire in vitro. La souris possède de nombreuses caractéristiques physiopathologiques communes avec l’homme, indispensables à l’extrapolation des résultats.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux pour ce projet, nous testerons la tolérance des souris à l'injection des cellules souches stromales adipocytaires (ASCs) uniquement dans la procédure N°1 et sur un nombre réduit de souris c'est à dire 5 souris/groupe au lieu de 10 pour les groupes de souris malades.

Raffinement

Les procédures ont été travaillées pour limiter le stress et la souffrance des animaux. Les souris seront au maximum 5 dans des cages enrichies. Une observation quotidienne des souris sera réalisée (apparence physique, comportement), une pesée sera réalisée une fois par semaine et, si des signes de souffrance sont détectés chez les animaux, des sédatifs ou anti-douleurs adaptés (après avis du vétérinaire) pourront être leur être administré.

Choix des espèces

Parmi les rongeurs, il n'existe pas d'autres modèles de sclérodermie systémique que le modèle murin. Par ailleurs, le modèle murin est indispensable pour suivre l'apparition des effets systémiques et en particulier l'autoimmunité caractérisée par la production d'autoanticorps. Les souris seront adultes car la sclérodermie systémique est une pathologie qui affecte les adultes