Rongeurs

940 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection intramusculaire d'un composé myotoxique sous anesthésie pour léser le muscle, certaines des injections de tamoxifène et un suivi par imagerie, avant mise à mort par surdose d'anesthésique et perfusion d'un fixateur. Le porteur étudie la régénération musculaire et les dépôts fibro-adipeux des myopathies, avec des retombées thérapeutiques présentées comme potentielles. Il décrit des méthodes in vitro de réduction, cellules immortalisées et mini-muscles humains, mais conclut qu'une validation in vivo reste "indispensable".

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier les mécanismes impliqués dans le processus de régénération du muscle squeletique sain ou pathologique chez la souris. Le muscle adulte est capable de régénérer suite à des lésions, grâce aux cellules souches musculaires (cellules satellites), ainsi qu’à l’action coordonnée des plusieurs autres cellules, parmi lesquels les macrophages, les vaisseaux sanguins, et des cellules que nous appelons « progéniteurs fibro-adipogéniques » (ou FAPs), composants clés du tissus-conjonctif musculaire. Chez un individu adulte sain, ce processus permet de maintenir la masse musculaire en réparant les microlésions liées à l’activité musculaire normale ou les lésions aigues induites par des blessures physiques. Le processus de régénération est dysfonctionnel dans divers pathologies du muscle, conduisant à une fonte musculaire accompagnée d'infiltrations de tissus fibreux et adipeux. Ces infiltrations résultent d’un comportement anormal des FAPs, qui prolifèrent en exces et se transforment en fibrose ou en adipocytes. Cette multiplication des FAPs et la transformation fibroadipeuse sont normalement inhibées dans un muscle sain, et cette protection est perdue dans certaines myopathies (comme la dystrophie Duchenne, ou la dystrophie facioscapulohumérale (FSHD)). Nous cherchons à identifier les molécules participant à cette protection naturelle. Partie 1 : Nous explorerons la contribution à ce processus du gène FAT1, dont nous avons précédemment identifié l’influence clé sur la croissance et la forme de sous-groupes de muscles pendant l’embryogénèse, et dont nous avons montré que le dysfonctionnement se produisait dans la FSHD. Nous examinerons comment l’inactivation du gène FAT1 dans les FAPs chez la souris perturbe la régénération musculaire induite par une lésion, et evaluerons si elle conduit à l’apparition de dépots fibro-adipeux. Partie 2 : Grace à une recherche de candidats basée sur des données publiées issues de modèles humains et murins de dystrophies musculaires, nous avons identifié des molécules caractéristiques des FAPs, produites en quantité augmentées ou réduites dans les pathologies musculaires avec infiltrations fibro-graisseuse. La liste de candidats sera complétée avec les résultats de la partie 1. Nous testerons l’implication de ces candidats dans les formations fibro-adipeuses, en etudiant leurs fonctions a) in vitro dans des cultures primaires de FAPs de souris ; puis b) in vivo chez la souris.

Bénéfices attendus

L’apparition de dépots fibro-adipeux dans les myopathies marque un stade de non-réversibilité des symptomes. Ces dépots changent les propriétés physiques du muscle, et compromettent l’efficacité du processus régénératif, non seulement spontanné, mais aussi thérapeutique, en empêchant de nouvelles fibres de s’intégrer ou même de se contracter. Ainsi, il est essentiel d’identifier les moyens de bloquer l’apparition ou la progression des dépots fibro-adipeux, afin de retarder l’évolution des symptomes chez les patients, et leur permettre de bénéficier de thérapies inovantes. Partie 1 : L’identification d’un gène tel que FAT1, régulant le développement et la régénération des muscles, et dont nous suspectons que le dysfonctionnement participe à l’apparition des symptomes de la FSHD, a fourni une nouvelle cible thérapeutique potentielle. Divers éléments permettent d’anticiper que l’inhibition de FAT1 dans les FAPs sera détrimentaire au fonctionnement normal des FAPs, pourrait empecher une bonne régénération et favoriser l’apparition de dépots fibro-adipeux dans les muscles lésés. En confirmant cette hypothèse et clarifiant les mecanismes, nos résultats feront émerger de nouvelles options thérapeutiques qui pourraient à terme, bénéficier aux patients. Partie 2 : Le projet permettra d’identifier, parmi les protéines présentes dans les FAPs et produites en quantités anormales dans les pathologies avec dépots fibro-adipeux, ceux qui sont responsables de la formation de tels dépots. Nous obtiendrons dans un premier temps la preuve de principe que reproduire un changement observé dans les pathologies est suffisant pour induire ces dépots. Dans un deuxieme temps, nous déterminerons si corriger une ou plusieurs anomalies dans les modèles de pathologies (in vitro, puis in vivo) est suffisant pour empêcher, retarder ou ralentir la formation des dépots fibro-adipeux. Pour toute molécule remplissant ces deux critères, la correction (deuxième étape) est susceptible d’améliorer les symptomes musculaires chez les patients, et de maintenir les muscles dans un état leur perméttant de bénéficier de thérapies innovantes favorisant la formation de nouvelles fibres saines et fonctionnelles.

Procédures

Le projet comporte 3 procédures, impliquant de 2 à 4 étapes. La procédure de lésion par injection intramusculaire (concerne toutes les souris) est une chirurgie faite sous anésthésie générale, et permettant une injection intramusculaire ciblée d'un composé myotoxique. Elle dure environ une heure, et ne sera effectuée qu'une seule fois pour chaque animal, sur tous les animaux impliqués dans le projet. Etapes ne concernent que des sous-groupes d'animaux. - injection en IP de Tamoxifen (modèles inductibles), une à 5 injection par animal, une fois tous les 2 jours (ou une seule injection lorsque pratiquée à P1). - suivi longitudinal par imagerie non invasive (étape sous anesthésie, procédure 3, répétée 3 à 5 fois pour chaque animal), - Mise à mort par surdose d’anesthésique suivi d’une perfusion intracardiaque de PFA : procédure sans réveil faite sous anesthésie profonde, une seule fois par animal. Gestes visant à réduire la souffrance : Anesthésie (injection IP), injection sous-cutanée d’antalgiques ou d’anesthésie locale. Ces gestes sont pratiqués en préparation de la chirurgie/Lésion, ainsi qu’avant la procédure de mise à mort par perfusion.

Impact sur les animaux

L’injection dans le muscle de composés myotoxiques induit une blessure limitée dans le temps et restreinte au seul muscle injecté. Pendant 3-4 jours, une inflammation (nécessaire pour la cicatrisation) se produit au niveau du site d’injection, puis s'estompe d'elle même. L'expérience a un impact limité sur les conditions de vie de la souris, même lorsque les modifications génétiques étudiées compromettent l'efficacité de la réparation. Dès le lendemain, les souris ont récupéré une activité/locomotion normales. Le fait d'utiliser des modèles génétiques dits « inductibles » (déclenchement par le Tamoxifen) evite que les effets des modifications étudiées commencent avant le demarrage de la procédure expérimentale. Toutes les lignées nécessaires au projet sont élevées dans notre animalerie, et les cohortes expérimentales sont produites par croisements. Les lignées utilisées ne présentent aucun phénotype dommageable lorsque maintenues séparément. Lorsque ces lignées sont combinées : 1) les lignées utilisées pour visualiser les cellules mutantes (grace à un marquage par une protéine fluorescente) ou pour rendre les cellules modifiables par les adenovirus, n’ont pas d’effets dommageables car les protéines introduites n’ont pas de cibles naturelles chez la souris. 2) L’utilisation des systemes inductibles par le Tamoxiden permet que la modification génétique désirée ne commence qu’au démarrage de l’expérience. Il n'y a donc ni douleur ni souffrance avant la procédure expérimentale. L’expérience est terminée en maximum 3 semaines (les douleurs locales étant limitées aux 3 premiers jours), et est écourtée en cas de problemes inattendus. Nous n’attendons pas d’anomalies majeures ailleurs que dans le muscle. 3) Certaines souris utilisées présentent de légères anomalies de forme de certains muscles, non-dommageables car les muscles affectés ne sont pas vitaux (le diaphragme n’est pas touché). Ces souris ont une durée de vie normale, et ne présentent aucun signe de souffrance. 4) Le modèle de souris FSHD a été choisi pour son caractère inductible, limitant la toxicité de la proteine DUX4 (agent causal de la FSHD), à la durée de l’expérience. Même le Tamoxifen devait déclencher dans ces souris des anomalies en dehors du muscle, cela se produira dans le temps de l’expérience, et nous veillerons à écouter le suivi longitudinal si nécessaire, et les expériences effectuées pourraient (de par leur objectif) identifier un moyen de diminuer ces anomalies.

Devenir

La procédure se termine par une mise à mort des animaux visant à prélever les tissus (muscle lésé, ainsi que certains organes supplémentaires). Ces tissus sont soit fixés pour de l'histologie, soit dissociés afin de mettre les cellules en culture. En conséquence tous les animaux utilisés pour ce projet sont mis à mort à l'issue de la procédure.

Remplacement

1) Afin d'éviter des expériences inutiles chez l'animal, nous commençons par exploiter des données publiques déjà disponibles (analyses déjà publiées de biopsies de patients ou de modèles « souris ») pour identifier des mecanismes potentiellement responsables du remplacement de la masse musculaire par des dépots fibro-adipeux dans les pathologies musculaires. 2) Le projet implique une étape basée sur des cultures de cellules isolées à partir de souris. Afin de limiter au maximum l’étape d’isolement à partir de souris, nous développons une méthode alternative utilisant des cellules « souches » humaines (lignées déja établies par d'autres laboratoires), dont le caractère « souche » permet une utilisation répétée/prolongée. En mimant in vitro les étapes du développement du muscle, nous induirons la formation de « mini-mucles » reproduisant autant que possible le contexte physiologique. Une fois optimisée, cette approche sera une alternative efficace pour remplacer les cellules de souris et pour toutes les études-pilotes concernants la compréhension des mécanismes en jeu. 3) Une fois que nous aurons identifié in vitro des molécules susceptibles d’être responsables de l’apparition des dépots fibro-adipeux dans les muscles malades, et que nous aurons montré avec succès que contrer leur action a un effet thérapeutique, il sera néanmoins nécessaire de valider ces résultats in vivo, en passant par un modèle animal. En effet, les modèles in vitro (cellules de souris ou mini-muscles humains), aussi puissants soient ils, ne reproduisent pas l’ensemble des événements mis en jeu dans la réparation musculaire normale ou pathologique. Il est difficile par exemple de reproduire le contexte de la blessure, de l’inflammation, de l’irrigation sanguine, et l’influence du métabolisme des individus malades. Ainsi, un mécanisme efficace in vitro pourrait s’avérer inefficace chez l’animal ou chez l’homme. Il est donc indispensable de déterminer, parmi les approches validées in vitro, lesquelles sont les plus susceptibles d’être efficaces chez l’homme en passant par une étape en modèle animal. Cette validation ne portera cependant que sur des cas pour lesquels nous aurons obtenu une preuve de principe in vitro, limitant largement l’ordre de grandeur des tests in vivo.

Réduction

1) La manière dont nous procédons pour l’histologie (partie 1) permet qu’un même échantillon soit réutilisé pour plusieurs analyses, réduisant ainsi le nombre d'animaux. En effet les tissus prélevés (muscles) sont divisés en plusieurs fragments congelés/stockés séparéments. Sur chaque fragment de tissus, nous réalisons des coupes alternées sur plusieurs séries de lames histologiques. Nous réalisons une base de données permettant l’optimisation de l’utilisation de ces échantillons/lames. Ainsi, un seul muscle d’un seul animal peut servir à des dizaines de tests différents. Une seule cohorte d’animaux (comprenants les souris étudiées et les controles adequats) suffit pour réaliser l’ensemble de l’étude pour un stade donné d’analyse. Les nombres d’animaux dans chaque cohorte (5-10 souris par lot (incluant males et femelles)) sont nécessaires pour l’obtention de résultats statistiquement robustes (tests statistiques considérés significatifs si p

Raffinement

1) Les souris sont hébergées en cages ventilées, avec enrichissement (dôme ou rouleau de carton + baton de papier ou carré de coton pour nidification). Elles sont suivies quotidiennement pour vérifier la nouriture et l'eau, ainsi que leur état de santé et leur bien être. 2) Pour la chirurgie, les souris sont anesthésiées par injection intra-péritonéale. Au préalable, elles recoivent des prémédications visant un effet antalgique (30 minutes avant l'anesthésie) at une anesthésie locale. La peau au niveau de la zone à opérer est rasée et aseptisée par application de solution antiseptique. 3) Nous avons défini des points limites nécessitant interruption anticipée d'une procédure: Une perte de poids dépassant 20% par rapport au poids de reference (poids à l'entrée dans la procédure) est considérée comme limite au dela de laquelle l'expérience est interrompue et l'animal est euthanasié. Par ailleurs, comme un des produits utilisés peut, dans de rares cas, liés au lot ou à la préparation, s’avérer toxique et déclencher une inflammation dans le foie, nous surveillerons le poid des animaux après injection, et fixons à 15% de perte par rapport au poids initiale la limite au dela de laquelle ces effets secondaires sont susceptibles d’interférer avec l’expérience. Dans ce cas, les animaux seront exclus de la cohorte et mis à mort. D'autres parametres d'exclusion sont: pelage hérissé; infection de la cicatrice; immobilité et indifférence à l'environnement, tremblements. 4) Nous utiliserons des tests statistiques adequats pour les comparaisons entre cohortes d’animaux (cohortes test et controles appropriés, males/femelles, differentes approches) avec 5 à 10 souris par cohorte et par stade d’analyse.

Choix des espèces

La souris est un modèle particulièrement adapté à l'étude de la regeneration du muscle. La dynamique du processus est bien connue suite à différents modèles de lésions (cardiotoxine, brulure au froid, glycerol, barium, ces modèles différant légèrement les uns des autres). La regeneration est rapide, et complete en 3 semaines, sans séquelles dans des souris sauvages. La souris permet l'utilisation de modèles génétiquement modifiés élaborés de telle sorte qu'il soit possible de definir précisément le type cellulaire dans lequel un gène est modifié et le moment à partir duquel cette modification est déclenchée. Ceci permet de limiter le dommage au seul organe/tissus considéré. L'utilisation des modèles génétiquements modifiés ainsi que des vecteurs adénoviraux permet d'explorer les mécanismes génétiques et de tester l'effet de nouvelles modifications génétiques, et d'evaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Aucun modèle cellulaire/ex-vivo humain ne reconstitue l’environnement du muscle suffisamment pour valider la pertinence in vivo d'un mécanisme ou d'une option thérapeutique. Stades d’utilisation : 1) L’Induction par le Tamoxifen (modèles inductibles) est faite soit 1 jour après la naissance (P1), soit au stade adulte, un peu avant et juste après la lésion. Pour obtenir une meilleure efficacité de recombinaison, il est justifié d'acriver la CRE au moment coincidant à un pic d'expression (nombre de cellules et intensité) de la lignée CRE utilisée, basée sur le territoire d’expression du gène PDGFRA. PDGFRA est fortement exprimé pendant la première semaine après la naissance. Chez l’adulte, PDGFRA est produit par les FAPs, mais ces derniers sont « dormants », et en faible nombre. La lésion provoque une augmentation de l’intensité d’expression, et active fortement la multiplication des FAPs. En conséquence, le meilleur moment pour activer la lignée avec le Tamoxifen est juste au moment de la lésion. 2) injection intra-musculaire (lésion/Adenovirus) : Souris Adultes (3 à 6 mois). 3) Suivi longitudinal de la lésion (par imagerie bioluminescence), à 3, 5, 7, 14 et 21 jours après lésions, pour suivre l'évolution de la régénération musculaire dans une fenetre correspondant aux résultats de la litérature, et pour évaluer l'impact des conditions expérimentales sur l'apparition d'infiltrations fibro-adipeuses. 4) mise à mort (à l’issue du suivi longitudinal ou à un stage post-lésion donné (à 3, 5, 7, 14 et 21 jours après lésions

1 056 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mères reçoivent des prébiotiques pendant la gestation, subissent des traites de lait sous anesthésie et des prélèvements, tandis que la descendance femelle est sensibilisée par injections d'allergène puis soumise à un gavage déclenchant une réaction allergique, avec prise de température rectale. Le porteur relie l'étude à un essai clinique en cours chez des femmes enceintes allergiques et cherche des biomarqueurs de tolérance. Il affirme qu'il est "impossible" de reproduire in vitro le microbiote et le système immunitaire intestinaux.

Objectifs

Les maladies allergiques affectent 30 à 40% de la population mondiale, et l’augmentation globale de leur prévalence en font à ce jour un enjeu de santé public. Les allergies alimentaires (AA) représentent environ 6% de la population industrialisée et elles sont souvent associées à des allergies cutanées comme la dermatite atopique (DA). Les réactions dues aux AA peuvent être systémiques et engendrer des chocs anaphylactiques. Elles sont détectables dès les premiers mois de vie et peuvent perdurer chez l’adulte. Le rôle précoce d’une anomalie de diversité du microbiote a été récemment mis en évidence ainsi qu’un dysfonctionnement au niveau des barrières épithéliales intestinales et du système immunitaire. L’origine du développement des AA est multifactorielle (facteurs génétiques, mode de vie, environnement extérieur, etc…) et dépend notamment du régime alimentaire. Aujourd’hui, il n’existe aucune stratégie thérapeutique préventive du développement de l’AA chez l’enfant. Or, la grossesse représente une fenêtre d’intervention optimale dans la régulation du processus allergique à travers une modulation des systèmes immunitaire et microbien du fœtus, ce qui en fait une piste prometteuse pour la prévention de l’AA. En effet, notre étude préclinique a montré chez la souris une diminution de l’AA après une exposition aux prébiotiques durant la gestation et l’allaitement. L’objectif de ce projet sur 5 ans est de comprendre les mécanismes physiologiques, cellulaires et moléculaires de l’effet préventif des prébiotiques sur l’AA dans un modèle murin pour identifier des biomarqueurs précoces de la mise en place de la tolérance induits par les prébiotiques administrés pendant la gestation, qui pourrons être alors investigués chez l’homme dans notre étude clinique PREGRALL. PREGRALL évalue l’effet préventif de la supplémentation en prébiotique chez la femme allergique pendant la grossesse sur l'apparition de l’allergie alimentaire et la dermatite atopique chez des enfants à 1 an. (L’étude PREGRALL est financée par le PHRC-I 2015 et a démarré en février 2018).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet préclinique sont d’identifier chez la souris des biomarqueurs associés à la supplémentation en prébiotiques pendant la gestation chez la mère et d’identifier les biomarqueurs associés à la protection de la survenue de l’allergie alimentaire chez la descendance. Ces biomarqueurs pourraient ainsi être investigués chez l’homme dans notre étude clinique PREGRALL. En effet en 2018, nous avons lancé le premier essai clinique au monde évaluant la supplémentation en prébiotique chez la femme allergique pendant la grossesse sur l’apparition de l’allergie alimentaire et la dermatite atopique chez les enfants à haut risque d’allergie. PREGRALL, financé par le ministère de la Santé, recrute 376 femmes enceintes allergiques. Les participantes sont randomisées pour recevoir une supplémentation en prébiotiques ou en placebo, à partir de 20 semaines d’aménorrhée jusqu’à l’accouchement. Le critère principal est l’apparition de la dermatite atopique associée ou non à l’allergie alimentaire chez les nourrissons à un an. PREGRALL nous permet de mettre en place une étude mécanistique ancillaire grâce à une bio-collection d’échantillons réalisée au cours du protocole clinique (sang, selle, lait, placenta, écouvillons jugaux), CIMMAP. CIMMAP vise à améliorer la compréhension de la physiopathologie de l’allergie, les mécanismes d’action des prébiotiques et à identifier les biomarqueurs précoces de la pathologie ou de mise en place de la tolérance induits par les prébiotiques.

Procédures

Les souris reproductrices femelles et mâles seront mises en reproduction sur 1 semaine. Deux prélèvements de lait seront réalisés sur les souris reproductrices femelles à 10 jours d’intervalle.Un prélèvement de sang sera réalisé sur les souris reproductrices femelles en fin de protocole. Six prélèvements de fèces seront réalisés sur les souris reproductrices femelles à 10 jours d’intervalle en moyenne entre chaque prélèvement. La descendance femelle sera soumise à 2 injections intrapéritonéales espacées de 10 jours et d’un gavage oral en fin de protocole. Un prélèvement de sang sera réalisé sur la descendance femelle en fin de protocole. Quatre prélèvements de fèces seront réalisés sur la descendance femelle à 10 jours d’intervalle en moyenne entre chaque prélèvement.

Impact sur les animaux

Lors du prélèvement de lait chez les souris reproductrices femelles, la traite au niveau des tétines pourrait induire une irritation. De plus, pour le prélèvement de lait, les souris seront anesthésiées. Lors de l’injection intrapéritonéale de l’allergène, une petite lésion au niveau de l’introduction de l’aiguille peut avoir lieu. Lors du gavage oral (challenge avec l’allergène pour déclencher les symptômes de l’allergie alimentaire), une irritation de la gorge et/ou de l’œsophage peut avoir lieu rendant la déglutition difficile. Lors de la prise de température rectale pour mesurer la chute de température induite par la réaction allergique, une irritation du colon peut avoir lieu.

Devenir

Mise à mort des animaux afin de récupérer les différents tissus nécessaires à l’étude physiologique, immunologique et du microbiote suite à la supplémentation en prébiotique et à l’induction de l’allergie alimentaire.

Remplacement

Impossible de prendre des mesures de remplacement. Il est impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes que sont le microbiote et le système immunitaire intestinaux in vitro ou in silico et ce notamment dans le cadre d’interactions complexes comme ici avec des prébiotiques et leur influence au cours de la période prénatale.

Réduction

Le modèle animal utilisé a été conçu pour permettre de réduire un maximum le nombre d’animaux du fait de la connaissance et de la précision des paramètres observés. Pour évaluer l’impact des prébiotiques sur les nouveaux nés, le projet étudiera 3 conditions, les mères avec une alimentation standard (160) et avec une alimentation supplémentée en prébiotique HMO (160) ou GOS/Inuline (160). A l’issu de la reproduction nous obtiendrons 96 souriceaux femelles issus de mères sous régime contrôle, 96 souriceaux femelles issus de mères sous régime HMO et 96 souriceaux femelles issus de mères sous régime GOS/Inuline. Les 96 souriceaux femelles de chaque groupe seront divisés en 2 : 48 souris sensibilisées par voie intrapéritonéale et 48 souris non sensibilisées considérées comme le contrôle négatif intrapéritonéale. Le nombre de reproducteurs a été sélectionné en fonction de l’efficacité de reproduction, du nombre de petits issus de chaque portée, du rapport mâle/femelle obtenu à l’issu de la gestation. Ces nombres permettront d’être statistiquement significatif pour réaliser des tests quantitatifs de comparaison : Anova, Kriskal-Wallis, Mann & Whitney ou t de Student.

Raffinement

Hébergement adéquate, ajout d’au moins 2 enrichissements (dôme, tuyau, coton), utilisateurs expérimentés et qualifiés, utilisation d'anesthésique et tapis chauffant pour les prélèvements de lait. L’observation quotidienne des souris permet de détecter un changement de comportement. Si une souffrance de l’animal est détectée et jugée trop importante, alors la souris sera euthanasiée sans délais. Si un seul signe clinique sévère ou 2 signes notables sont détectés, alors le responsable de la SBEA et le responsable de l’étude seront prévenus et la souris sera sacrifiée sans délais. Les signes spécifiques et notables sont les suivants : -Notables : aspects extérieurs : pelage sale, pâleur (yeux, oreille, peau), position recroquevillée, faciès contracté, yeux larmoyants. A la manipulation : réticence à se déplacer, zone urogénitale souillée. Evolution pondérale : perte de poids à 10%.

Choix des espèces

D’après la bibliographie, les modèles murins d'allergie alimentaire (Bouchaud & al. 2016 ; Gourbeyre & al. 2011) sont ceux se rapprochant le plus de la pathologie humaine. Ce modèle est bien établi dans la littérature et dans notre laboratoire. Nous avons débuté notre modèle sur les femelles Balb/cj et afin de rester cohérent dans nos études, nous souhaitons continuer à utiliser ce modèle. Les souris reproductrices femelles seront âgées de 4 semaines à leur arrivée à l’animalerie. Après 2 semaines d’acclimatation, donc à 6 semaines de vie, elles seront mises en reproduction pendant 1 semaine car c'est à 6 semaines que les souris femelles atteignent leur maturité sexuelle. Les souris reproductrices mâles seront âgées de 6 semaines à leur arrivée à l’animalerie. Après 2 semaines d’acclimatation, donc à 8 semaines, elles seront mises en reproduction pendant 1 semaine car c’est à 8 semaines que les mâles atteignent leur maturité sexuelle. Les souriceaux seront séparés des mères à 3 semaines de vie correspondant au sevrage. Les souriceaux femelles seront acclimatés 1 semaine et le début du protocole de sensibilisation aura lieu à 4 semaines de vie pour la première injection intrapéritonéale puis à 5 semaines de vie pour la 2ème injection intrapéritonéale. Une semaine après, donc à 6 semaines de vie, nous réaliserons le gavage oral pour déclencher les symptômes de l’allergie. Le protocole d'induction d'allergie commence à 4 semaines de vie car c'est l'âge le plus pertinent pour l'induction de l'allergie et ce modèle d'induction à 4 semaines de vie a été décrit comme un bon modèle d'induction d'allergie dans l'article de Selle et al., 2022 : Prebiotic Supplementation During Gestation Induces a Tolerogenic Environment and a Protective Microbiota in Offspring Mitigating Food Allergy. Les souriceaux mâles seront acclimatés 1 semaine et les études comportementales seront réalisées durant les 2 semaines suivantes car c’est à partir de 4 semaines de vie que la mémoire de la souris peut être étudiée.

160 souris d'une lignée génétiquement modifiée vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié reçoit des antibiotiques dans l'eau de boisson pendant huit semaines pour supprimer leur microbiote, toutes subissent des jeûnes de six heures, des prélèvements sanguins répétés à la queue et des gavages, avant mise à mort pour trier les cellules intestinales. Le porteur étudie l'effet des bactéries intestinales sur les hormones digestives, avec une application humaine dans l'obésité et les maladies inflammatoires présentée comme lointaine. Il indique que la déplétion du microbiote produit "a priori peu d'effets indésirables" et affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'interaction entre bactéries et intestin.

Objectifs

Les intestins sont un organe majeur pour la santé car ils sont à l’interface entre alimentation, les bacteries intestinales et l’organisme. L’intestin permet notamment la digestion et l’absorption des aliments, tout en faisant barrière aux microbes et aux toxines. L’intestin produit également des produits (hormones) qui régulent les fonctions de différents organes, modulant ainsi par exemple le comportement alimentaire, la régulation énergétique ou les fonctions intestinales (transit intestinal, digestion…) elles-mêmes. Ces hormones sont produites par des cellules intestinales spécifiques, appelées cellules entéroendocrines. Ces cellules jouent le rôle de senseurs, libérant les hormones en réponse à des modifications de leur environnement Des modifications des fonctions intestinales et notamment des hormones intestinales sont associées à différentes maladies telles l’obésité ou des maladies digestives. Ces maladies sont également associées à une modification des bactéries intestinales. Notre travail de recherche vise à mieux caractériser comment les bactéries de l’intestin influent sur les hormones intestinales et les cellules qui les produisent. Dans ce projet, nous éliminerons les bactéries intestinales par l’action d’antibiotiques, mesurerons le niveau des hormones et analyserons précisément ces cellules grâce à l’utilisation de souris exprimant une fluorescence associée à ces cellules et permettant de les isoler.

Bénéfices attendus

Le rôle de l’intestin et en particulier des hormones intestinales pour la santé de l’homme apparait comme étant très important, en particulier dans l’obésité ou les maladies inflammatoires l’intestin, qui touchent plus de 650 millions d’individus à travers le monde. Un lien entre microbes et les cellules produisant les hormones intestinales a déjà été établi. Cette étude nous permettra d’identifier plus précisément comment les cellules produisant les hormones intestinales sont impactées lors de la suppression du microbiote intestinal. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris permettant de trier cette population cellulaire rare, et mesurerons les niveaux d’hormones après différentes stimulations. Cela nous permettra d’identifier comment ces cellules sont régulées. Compte tenu du rôle important de ces hormones, ce projet permettra de proposer de nouvelles voies modulant leurs niveaux lorsque les fonctions de ces hormones sont altérées, dans le but à terme de prévenir et/ou guérir des maladies.

Procédures

La moitié des animaux recevra un mélange d’antibiotiques dans leur eau de boisson pendant toute la durée de la procédure, soit 8 semaines, conduisant à la déplétion de leur microbiote intestinal. Pour mesurer les niveaux des hormones et les activités des cellules produisant ces hormones, trois tests métaboliques seront réalisés, espacés de 15 jours, sur tous les animaux. Un test métabolique permet de mesurer l’effet d’un stimulus particulier sur l’animal, notamment au niveau intestinal en comparant l’animal avant et après ajout du stimulus. Chaque test comporte une phase de jeun (6h), trois prélèvements sanguins, un avant l’administration du stimulus, et deux après, à 5 et 15 minutes respectivement après l’administration pour un volume total de 150µLet un gavage par voie orale ou une injection en intrapéritonéal, permettant de mesure la libération des hormones en réponse au stimulus. La durée d’un test métabolique n’excède pas une heure entre la première prise de sang et la dernière. Des mesures de transit intestinal par gavage (au maximum trois par animal, deux au cours de l’expérience (avec un suivi pendant 48h) et un au moment de la mise à mort (gavage une heure avant) seront également réalisées pour mesurer les fonctions intestinales, ainsi que des prélèvements de sang avant la mise à mort et la récupération des tissus intestinaux.

Impact sur les animaux

Ce protocole produit a priori peu d’effets indésirables sur les animaux : la consommation des antibiotiques dans l’eau de boisson a déjà été pratiquée à de nombreuses reprises sans impact sur la santé et le comportement des animaux, les antibiotiques étant introduits séquentiellement pour éviter tout rejet par néophobie. Les animaux seront conservés en groupe et manipulés régulièrement. Le gavage oral et la prise de sang à la queue seront réalisés par des personnes compétentes, avec des temps de manipulations réduits. Les prises de sang séquentielles se faisant de manière rapprochées, une seule incision à la queue est nécessaire pour réaliser le prélèvement. Les jeûnes seront limités dans le temps, induisant une perte de poids réduite qui est en général rattrapée les jours suivants. Les souris seront suivies pendant l’heure qui suit l’administration des stimuli puis pendant le reste de l’expérimentation pour s’assurer qu’aucun n’induit d’effets indésirables, aucun n’effet étant attendu sur le type de stimuli testés.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de récolter leurs tissus pour l’isolement des cellules produisant les hormones intestinales par tri cellulaire. Les fonctions des cellules pourront alors être analysées par différentes techniques

Remplacement

L’utilisation de souris pour cette expérimentation est nécessaire par l’impossibilité d’étudier in vitro ou de modéliser l’interaction entre les bactéries et l’intestin. La lignée de souris utilisée permettra d’étudier spécifiquement les fonctions des cellules entéroendocrines, ce qui n’est pas possible dans un autre modèle. Les intestins récupérés dans ces expérimentations serviront à la production de culture de cellules intestinales (organoïdes intestinaux) qui seront utilisés dans des projets ensuite pour étudier (1) le développement de l’épithélium intestinal issu de souris déplétées en microbiote et (2) la réponse des cellules entéroendocrines à des produits spécifiques, notamment produits par les bactéries.

Réduction

160 animaux au total répartis en 20 lots seront utilisés dans ce projet, répartis en 10 procédures. Chaque procédure incluera un lot de 8 souris traitées par antibiotiques et un lot contrôle de 8 souris non traitées et sera effectuée sur des animaux de même sexe pour tester l’effet de trois stimuli et récupérer les tissus pour un usage spécifique. 5 procédures différentes permettront de tester au total 15 stimuli de cellules entéroendocrines (par exemple, glucose, mélange d’acides aminés et protéines, acides gras, produits microbiens..), ainsi que pour récupérer les tissus intestinaux des souris pour différents usages, un seul tissu ne pouvant être utilisé que pour un seul usage lors du tri cellulaire (transcriptomique, peptidomique, génération d’organoides, histologie…). Les procédures seront reproduites sur les femelles et les mâles.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en propylène rouge et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum et seront hébergés à plusieurs par cage. L’hydratation, notamment lors de l’introduction des antibiotiques, sera surveillée et si nécessaire, l’ajout d’antibiotiques sera modifié pour permettre une meilleure tolérance. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés (ainsi que leur ingéré alimentaire) 2 fois par semaine. Une grille de décision (points limites) est établie et permet d’agir de façon appropriée en cas d’apparition de signes de souffrance chez un animal, Les volumes de gavage seront adaptés aux poids des animaux, avec un maximum de 10µL/g et celui-ci sera pratiqué par des expérimentateurs entrainés à la contention et au gavage. Les animaux seront habitués à être manipulés avant et pendant toute la durée de l’expérimentation afin de diminuer leur stress lors de la contention et les prélèvements. Les souris seront au moins 2 par cage pour éviter l'isolement. Une grille de score de bien être permettra de suivre régulièrement chaque animal individuellement en prenant en compte son aspect général, son poids et son comportement. En cas de hausse modérée du score, un suivi plus attentionné sera réalisé avec l’ajout de nourriture plus facilement accessible. Dans le cas d’une forte dégradation du score les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Les souris utilisées sont issues d’une lignée génétiquement modifiée pour exprimer une protéine fluorescente dans toutes les cellules entéroendocrines. Cette lignée est un modèle particulièrement utile pour l’étude des cellules entéroendocrines, permettant de les trier ou de les distinguer facilement lors de l’analyse des tissus. Les procédures seront appliquées sur les femelles et les mâles avec un lot de souris traitées aux antibiotiques et un lot contrôle. Les procédures seront reproduites 5 fois pour tester différents stimuli et pour différents usages des tissus, chaque tissu ne pouvant être utilisé que pour un seul usage. L’étude portant sur les cellules entéroendocrines matures, des souris adultes (8 à 12 semaines au démarrage du protocole) seront utilisées.

3 322 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules ou de peau tumorale, puis des injections d'anticorps deux à trois fois par semaine pendant quatre semaines, les tumeurs pouvant croître jusqu'à un point limite fixé à 1 500 mm³. Le porteur teste de nouveaux anticorps anticancéreux et renvoie l'application clinique chez l'homme à un objectif lointain. Il affirme qu'il n'existe aucun système alternatif et que l'expérimentation in vivo a une valeur prédictive supérieure aux essais in vitro.

Objectifs

Avec l’objectif de développer de nouveaux médicaments anti-cancéreux, notre laboratoire s’attache à découvrir et valider des anticorps innovants dirigés contre des cibles impliquées dans différents types de cancer. Ces anticorps peuvent être sélectionnés pour leur capacité à s’attaquer aux cellules tumorales mais aussi à affecter simultanément les cellules se trouvant dans l’environnement de la tumeur et connues pour jouer un rôle crucial dans son développement. Notre projet va permettre de sélectionner et valider chez la souris de futurs candidats-médicaments en étudiant leur efficacité anti-tumorale ainsi que leur distribution dans l’organisme. Nos anticorps candidats seront systématiquement comparés aux traitements de référence déjà disponibles sur le marché ou en développement clinique avancé. En effet, il n'existe pas à ce jour d'autres moyens que l'expérimentation animale pour caractériser de façon fiable l'efficacité des anticorps. Dans le but d'appliquer strictement la règle des 3R et donc de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, seuls les anticorps ayant été validés au terme d’essais in vitro très exigeants en laboratoire, seront administrés aux souris. Ainsi, pour chaque cible identifiée et validée par notre Comité Médical, de 1 à 3 anticorps issus des pré-sélections in vitro seront testés ce qui représente au total, sur les 5 années du projet, un nombre maximal de 3232 souris.

Bénéfices attendus

L’objectif est de tester l'efficacité thérapeutique de nouveaux anticorps dans différents modèles murins porteurs de tumeurs cancéreuses. Les résultats de ces travaux permettront in fine de sélectionner des candidats-médicaments en vue de leur développement pour une utilisation en clinique humaine.

Procédures

Les souris seront soumises à une greffe de cellules par injection sous cutanée (20 secondes /souris y compris contention) ou à une greffe de peau sous cutanée avec chirurgie (20min/ souris y compris anesthésie). Elles seront traitées 2 à 3 fois par semaine pendant 4 semaines par injection intrapéritonéale (5 secondes /souris y compris contention) ou par voie intraveineuse (2 minutes /souris y compris contention) avec le traitement.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont : - Signes de douleur, souffrance, angoisse, changement de comportement ou d’aspect physique liés à la cytotoxicité des anticorps ; - Douleur légère et immédiatement réversible au moment de l’injection/prélèvement.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés soit parce qu'ils ont atteint un des points limites définis pour chaque procédure, soit car l'expérimentation prend fin. En cours d'étude, tout animal démontrant une souffrance irréversible ou inacceptable sera immédiatement euthanasié.

Remplacement

Dans le processus de développement des médicaments, les études précliniques jouent un rôle fondamental. Elles font principalement appel à des expérimentations dans des modèles animaux, murins notamment. C’est un prérequis obligatoire pour justifier l’investigation clinique et la première administration chez l’Homme. Ces expériences in vivo ont une valeur prédictive supérieure à celles réalisées in vitro. Les processus tumoraux ainsi que les interactions des composants du système immunitaire avec les médicaments à base d’anticorps sont des processus complexes qui résultent de l’action concertée de plusieurs acteurs cellulaires. De fait, ils sont difficilement modélisables in vitro ou ex vivo. Il n’existe pas à l’heure actuelle de systèmes alternatifs. L’objectif de notre projet étant de caractériser de façon fiable l'efficacité et la toxicité de nouveaux anticorps, notamment en étudiant leur impact sur le stroma tumoral et sur la modulation de l’activité anti-tumorale du système immunitaire, seule l’expérimentation animale peut répondre à notre objectif.

Réduction

Afin de réduire à son minimum le nombre de souris utilisées pour l’ensemble des études, les anticorps testés auront au préalable, été validés par une série de tests complets en laboratoire. De plus, 3 études de mise au point permettront de réduire au minimum le nombre d'animaux utilisé tout en disposant d'un nombre statistiquement suffisant. Dans le but de confirmer le nombre de souris nécessaires pour les études d’efficacité thérapeutique et de biodistribution, nous avons calculé via un logiciel de statistique un nombre de 10 animaux par groupe afin d'obtenir des résultats robustes. Les études pilotes n'utiliseront que 3 animaux / groupe, permettant d’optimiser les meilleures conditions à retenir pour les procédures expérimentales.

Raffinement

Pour la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats obtenus dans le strict respect du bien-être animal. Les points limites ont été établis dans chaque procédure expérimentale et le suivi clinique des animaux se fera sur la base de la fiche de scoring établie par la SBEA de notre Institut. Les souris seront surveillées quotidiennement y compris les week-ends et jours fériés : suivi du développement de la tumeur (point limite volume >1500 mm3 ou nécrose tumorale précoce), pesée (toute perte de poids ne devra pas excéder 20% du poids normal attendu de l’animal) et détection du moindre signe de souffrance et/ou de détresse de l’animal. En fonction des observations, des décisions allant de l’adaptation des conditions d’hébergement à l’injection d’analgésique jusqu’à une décision d’euthanasie, seront prises. D’autre part, une fiche de soins validée par la SBEA de notre Institut est utilisée pour la prise en charge des animaux.

Choix des espèces

L’espèce choisie pour cette étude est la souris car elle est l’espèce qui est le mieux défini génétiquement et pour laquelle les données scientifiques de référence sont nombreuses, s’agissant notamment des études en immunothérapie. Dans le cas où les anticorps candidats médicaments testés ne reconnaîtraient pas la cible murine, nous pourrons être amenés à utiliser des lignées de souris transgéniques exprimant la forme humaine de la cible. Les souris seront âgées de 4 à 7 semaines à la réception (souris adultes). Après 1 semaine d’acclimatation en zone d’hébergement, les souris âgées 5 à 8 semaines subiront la greffe.

78 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Comme dans le volet complémentaire du même projet, des composants de bioprothèse cardiaque sont implantés sous la peau de leur dos sous anesthésie, avec deux séances d'imagerie TEP, avant euthanasie à J29 pour prélever le sang et les tissus. Le porteur teste un revêtement censé réduire l'inflammation déclenchée par les valves biologiques, un bénéfice pour les patients qu'il formule au conditionnel. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe aucune méthode fiable sans animaux et que la souris reproduit fidèlement la réaction humaine aux biomatériaux.

Objectifs

Les valves cardiaques artificielles sont utilisées pour remplacer des valves malades chez l'Homme. Certaines valves dites biologiques sont composées de tissus biologiques d’origine animale (porc ou bovin). Elles présentent de nombreux avantages par rapport à des prothèses complétement synthétiques (valves dites mécaniques), notamment en termes de fonction et risque de formation de caillots (thrombose). En revanche, la composition des valves biologiques reste « étrangère » au système immunitaire du receveur les rendent susceptibles d’être rejetées par le tissu receveur. En effet, malgré toutes les mesures mises en place pour rendre le tissu biologiquement inactif, les cellules qui assurent la défense de notre organisme reconnaissent inéluctablement la différence d’origine du tissu implanté et déclenchent une réaction inflammatoire qui réduit sensiblement la durée de vie des bioprothèses par rapports aux solutions mécaniques. Ainsi, bien que plus performantes, les bioprothèses sont rarement implantées chez les sujets jeunes en raison de ce risque de vieillissement prématuré. L’objectif de cette étude est de tester le potentiel d'un traitement de surface sur les valves biologiques capable de diminuer cette réaction inflammatoire.

Bénéfices attendus

Les effets attendus sont une diminution de l'inflammation des tissus environnants lorsque les bioprothèses sont recouvertes avec le traitement de surface à l'étude avant implantation par rapport aux bioprothèses standard non traitées. L'évaluation pré-clinique du bénéfice apporté par le revetement proposé peut considérablèment accélérer le transfert de l'innovation chez l'homme (application aux bioprothèses cardiovasculaires qui sont utilisées en pratique clinique).

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule procédure d'implantation des composants des bioprothèses (traitées avec le traitement de surface ou non) sous la peau du dos sous anesthésie générale et à deux séances d'imagerie dans les suites (TEPscanner, 7 jours et 28 jours après implantation, toujours sous anesthésie générale) pour visualiser et mesurer la réaction inflammatoire au niveau de la zone d'implantation. Ces procédures d'imagerie comportent une injection d'un traceur par voie intraveineuse. Les procédures de chirurgie dureront 20 minutes et les séances d'imagerie 40 minutes.

Impact sur les animaux

Concernant l'intervention chirurgicale, les effets indésirables potentiels après l'intervention comportent des douleurs au site d'implantation sur la peau du haut du dos, des démangeaisons et des troubles de la cicatrisation. Concernant les scanners, ces examens sont peu invasifs et ne comportent pas d'effets indésirables attendus.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés le lendemain de la dernière imagerie (soit J29) afin de prélever du sang et d'étudier les biomarqueurs de l'inflammation. Les composants des bioprothèses implantés 29 jours plus tot seront également prélevés pour etre analysés en microscopie.

Remplacement

Dans ce projet, il n'existe pas de moyens alternatifs à l'expérimentation animale. En effet, à ce jour il n'existe pas de méthode fiable permettant d'estimer de facon fiable l'efficacité du traitement de surface à l'étude. Toutefois, des manipulations préliminaires sur des cellules endothéliales aortiques humaines (expériences "in vitro") ont permis d'affiner le protocole du traitement de surface et d'utiliser le nombre minimal d'animaux.

Réduction

Afin de diminuer au maximum le nombre d'animaux, un calcul statistique a été réalisé en amont. De la meme facon, une mutualisation des résultats expérimentaux au sein de l’unité de recherche pourrait permettre l'exploitation des résultats par d'autres chercheurs et de limiter l'utilisation ultérieure d'animaux.

Raffinement

Le confort, la douleur et le stress des animaux seront scrupuleusement recherchés à l'aide de grille de surveillance journalière. Un recours à l’anesthésie générale sera systématique pour toutes les procédures et des soins spécifiques pourront etre conduits en fonction de l'examen (désinfectant, anti-douleurs). L'administration d'anti-douleurs sera réalisée en cas d'inconfort ou de douleurs et une euthanasie sera pratiquée dans les plus brefs délais en cas de non-amélioration. La surveillance de points limites (devant faire stopper l'expérimentation) sera systématique et faite quotidiennement. Les conditions d’hébergement seront également optimisées au maximum avec respect du rythme veille/sommeil. Afin de minimiser le stress post-chirurgie, des éléments d’enrichissement des cages comme des bâtons à ronger et du coton, ainsi que de la nourriture en gélée, seront placés. Enfin, nous priviliégerons des procédures d’imagerie non invasive (TEPscanner) pour visualiser l'inflammation des tissus.

Choix des espèces

Le modèle animal (souris) a été soigneusement choisi d’après les publications internationales les plus pertinentes sur le sujet. Des souris adultes C57Bl6/J de 6 à 9 semaines d'âge seront utilisées. Bien qu'il n'existe pas d'impact de genre attendu, des sujets femelles seront utilisés pour une meilleure cohabitation. La reaction aux biomatériaux chez cette espèce reproduit de façon très fidèle les réponses observées chez l'homme (mammifère). Les tests précliniques sont communemment effectués dans cette espèce et sont abondamment documentés dans la littérature scientifique.

78 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des composants de bioprothèse cardiaque sont implantés sous la peau de leur dos sous anesthésie, suivis de deux séances d'imagerie TEP avec injection d'un traceur, avant euthanasie à J29 pour prélever le sang et les tissus. Le porteur teste un traitement de surface censé réduire l'inflammation, un bénéfice pour les patients humains qu'il renvoie au conditionnel et à un transfert futur. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe pas de moyens alternatifs et que la réaction aux biomatériaux chez la souris reproduit celle de l'homme.

Objectifs

Les valves cardiaques artificielles sont utilisées pour remplacer des valves malades chez l'Homme. Certaines valves dites biologiques sont composées de tissus biologiques d’origine animale (porc ou bovin). Elles présentent de nombreux avantages par rapport à des prothèses complétement synthétiques (valves dites mécaniques), notamment en termes de fonction et risque de formation de caillots (thrombose). En revanche, la composition des valves biologiques reste « étrangère » au système immunitaire du receveur les rendent susceptibles d’être rejetées par le tissu receveur. En effet, malgré toutes les mesures mises en place pour rendre le tissu biologiquement inactif, les cellules qui assurent la défense de notre organisme reconnaissent inéluctablement la différence d’origine du tissu implanté et déclenchent une réaction inflammatoire qui réduit sensiblement la durée de vie des bioprothèses par rapports aux solutions mécaniques. Ainsi, bien que plus performantes, les bioprothèses sont rarement implantées chez les sujets jeunes en raison de ce risque de vieillissement prématuré. L’objectif de cette étude est de tester le potentiel d'un traitement de surface sur les valves biologiques capable de diminuer cette réaction inflammatoire.

Bénéfices attendus

Les effets attendus sont une diminution de l'inflammation des tissus environnants lorsque les bioprothèses sont recouvertes avec le traitement de surface à l'étude avant implantation par rapport aux bioprothèses standard non traitées. L'évaluation pré-clinique du bénéfice apporté par le revetement proposé peut considérablèment accélérer le transfert de l'innovation chez l'homme (application aux bioprothèses cardiovasculaires qui sont utilisées en pratique clinique).

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule procédure d'implantation des composants des bioprothèses (traitées avec le traitement de surface ou non) sous la peau du dos sous anesthésie générale et à deux séances d'imagerie dans les suites (TEPscanner, 7 jours et 28 jours après implantation, toujours sous anesthésie générale) pour visualiser et mesurer la réaction inflammatoire au niveau de la zone d'implantation. Ces procédures d'imagerie comportent une injection d'un traceur par voie intraveineuse. Les procédures de chirurgie dureront 20 minutes et les séances d'imagerie 40 minutes.

Impact sur les animaux

Concernant l'intervention chirurgicale, les effets indésirables potentiels après l'intervention comportent des douleurs au site d'implantation sur la peau du haut du dos, des démangeaisons et des troubles de la cicatrisation. Concernant les scanners, ces examens sont peu invasifs et ne comportent pas d'effets indésirables attendus.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés le lendemain de la dernière imagerie (soit J29) afin de prélever du sang et d'étudier les biomarqueurs de l'inflammation. Les composants des bioprothèses implantés 29 jours plus tot seront également prélevés pour etre analysés en microscopie.

Remplacement

Dans ce projet, il n'existe pas de moyens alternatifs à l'expérimentation animale. En effet, à ce jour il n'existe pas de méthode fiable permettant d'estimer de facon fiable l'efficacité du traitement de surface à l'étude. Toutefois, des manipulations préliminaires sur des cellules endothéliales aortiques humaines (expériences "in vitro") ont permis d'affiner le protocole du traitement de surface et d'utiliser le nombre minimal d'animaux.

Réduction

Afin de diminuer au maximum le nombre d'animaux, un calcul statistique a été réalisé en amont. De la meme facon, une mutualisation des résultats expérimentaux au sein de l’unité de recherche pourrait permettre l'exploitation des résultats par d'autres chercheurs et de limiter l'utilisation ultérieure d'animaux.

Raffinement

Le confort, la douleur et le stress des animaux seront scrupuleusement recherchés à l'aide de grille de surveillance journalière. Un recours à l’anesthésie générale sera systématique pour toutes les procédures et des soins spécifiques pourront etre conduits en fonction de l'examen (désinfectant, anti-douleurs). L'administration d'anti-douleurs sera réalisée en cas d'inconfort ou de douleurs et une euthanasie sera pratiquée dans les plus brefs délais en cas de non-amélioration. La surveillance de points limites (devant faire stopper l'expérimentation) sera systématique et faite quotidiennement. Les conditions d’hébergement seront également optimisées au maximum avec respect du rythme veille/sommeil. Afin de minimiser le stress post-chirurgie, des éléments d’enrichissement des cages comme des bâtons à ronger et du coton, ainsi que de la nourriture en gélée, seront placés. Enfin, nous priviliégerons des procédures d’imagerie non invasive (TEPscanner) pour visualiser l'inflammation des tissus.

Choix des espèces

Le modèle animal (souris) a été soigneusement choisi d’après les publications internationales les plus pertinentes sur le sujet. Des souris adultes C57Bl6/J de 6 à 9 semaines d'âge seront utilisées. Bien qu'il n'existe pas d'impact de genre attendu, des sujets femelles seront utilisés pour une meilleure cohabitation. La reaction aux biomatériaux chez cette espèce reproduit de façon très fidèle les réponses observées chez l'homme (mammifère). Les tests précliniques sont communemment effectués dans cette espèce et sont abondamment documentés dans la littérature scientifique.

2 100 souris et 2 100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur est implantée dans leur cerveau, un geste que le porteur décrit comme sévèrement douloureux, avec irradiation, traitements répétés et exsanguination terminale. L'établissement réalise une douzaine d'études par an selon les commandes de clients. Il affirme que les méthodes alternatives ne permettent pas de prévoir l'efficacité in vivo, les retombées cliniques étant renvoyées aux essais ultérieurs.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de tumeur intracrâniennes (tumeur implantée dans le cerveau des animaux, = tumeur stéréotaxique), déjà mis en place dans nos laboratoires ou bien d’en développer de nouveaux (dans nos laboratoires) chez les rongeurs (rats ou souris) afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter le cancer. L’évaluation des traitements potentiels chez l’animal permettra d’étudier ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte physiologique le plus proche possible de la pathologie humaine et d’arriver, avant les essais cliniques, à réaliser une réelle évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles précliniques de cancer, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques ou diagnostiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, représentant un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent la première évaluation de l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés. Au cours des expériences, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur ou mimer l’apparition de sites métastatiques dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance/échappement après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme des moyens de défense.

Procédures

- Identification des animaux (implantation d’un transpondeur ou clips aux oreilles ou tatouage), sous anesthésie - Transport vers le site ou est réalisé l’irradiation (durée totale moins de 30 minutes, les animaux restant dans leur cage de stabulation). - Irradiation - Greffe des cellules tumorale dans le cerveau, sous anesthésie et antalgie. - Traitements par voies intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée sous anesthésie, mais pouvant être réalisés sur animaux vigiles - Traitements par voies intradermique ou intramusculaire, sous anesthésie et analgésie - Traitements par voie orale, sur animaux vigiles sous contention. - Suivi des animaux (poids) - Suivi des animaux par imagerie (sous anesthésie) - Prélèvements de sang, sur animaux anesthésiés, par ponction dans : la veine jugulaire. - Prélèvements de sang, sur animaux vigiles sous contention, par piqure dans la veine saphène (possibilité de déposer de la poudre hémostatique pour limiter le saignement s’il se produit après le prélèvement). - Prélèvements de sang, sur animaux vigiles sous contention, par piqure dans la veine caudale (animal placé dans 1 boite thermorégulée à +37°C). - Prélèvement d’un grand volume de sang lors de l’euthanasie (« exsanguination terminale ») par ponction intracardiaque ou via l’aorte abdominale, sous anesthésie profonde, suivi d’une confirmation de la mort par une deuxième méthode physique - Mise à mort en fin de procédure (overdose d’anesthésique confirmée par une deuxième méthode physique, CO2 suivi d’une deuxième méthode physique - Prélèvements de tissus après euthanasie (post-mortem)

Impact sur les animaux

Une douleur sévère sera induite par la procédure de greffe, l’analgésie mise en place permettra de l’atténuer très significativement. Un stress sera ressenti par les animaux, pendant 1 ou 2 jours, lors de la randomisation et/ou le début des traitements. De même un stress léger sera ressenti lors de la réalisation des gestes techniques pour identification des animaux (tatouage par exemple), lors d’un transport de courte durée, ainsi que pour les traitements (par voie intraveineuse, orale, sous-cutanée ou intrapéritonéale) et le suivi des animaux (mesures des poids et par imagerie). Une douleur légère sera également ressentie lors de la piqure pour traitement par voies intraveineuse et intrapéritonéale. Un stress et une douleur légère liée à la piqure seront ressentis par les animaux lors des prélèvements de sang (en cours d’étude). Une douleur forte sera ressentie dans le cas d’injections intramusculaires et intradermiques, celle-ci sera fortement atténuée par une analgésie adaptée. Les animaux pourront perdre du poids à la suite des traitements avec de nouveaux composés. Une douleur forte sera ressentie par l’animal lors de prélèvements de sang à l’euthanasie par ponction intracardiaque, elle sera fortement réduite par une analgésie adaptée.

Devenir

A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort (la méthode utilisée étant l’une de celles autorisées par la Directive 2010/63). Les animaux étant porteur de tumeur dans le cerveau et ayant fait l’objets de gestes techniques, aucune autre utilisation ne peut être envisagée.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments En effet, les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D peuvent être utilisées mais reste toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes sera ajusté à la question scientifique posée et aux paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la survie des animaux entre les différents groupes de l’étude seront comparées pour évaluer l’efficacité des composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter individuelles. L’analyse statistique sera effectuée au moyen d’un test d'analyse de la variance (ANOVA). Près de 12 études seront réalisées chaque année, mais le nombre pourra varier en fonction des commandes des clients. Une étude peut être composée de 3 à 10 groupes [un groupe contrôle (= véhicule), un groupe recevant un médicament de référence, 1 à 8 groupes recevant des nouvelles molécules]. Le nombre d’animaux par groupe varie généralement entre 7 et 20. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser, si possible, des biomarqueurs (cytokine plasmatique par exemple) et des techniques faiblement invasives d’imagerie (IRM par exemple) chez le petit animal. Ces techniques permettent de suivre les biomarqueurs sur le même animal tout au long de l’étude, ceci réduisant la taille de la cohorte nécessaire pour la réalisation de l’expérience. Ces techniques peuvent également constituer un moyen d’atteindre les objectifs de l’étude avant l’apparition des signes cliniques, et donc limiter la souffrance des animaux.

Raffinement

Toutes les procédures sur les animaux seront réalisées par des techniciens formés et qualifiés, selon des modes opératoires validés. La greffe des tumeurs sera réalisée sous anesthésie et analgésie pour atténuer fortement la douleur que ce geste technique engendre. Les animaux bénéficieront également de soins adaptés après la greffe. Les animaux ressentiront un stress léger lorsque ceux-ci seront attribués aux groupes de traitement, stress toutefois limité par l’enrichissement de leur environnement. Un stress léger sera également perçu lors des manipulations pour suivre le poids des animaux ou bien lors des séances d’imagerie (pour suivi de l’évolution de la tumeur). La fréquence des mesures de poids sera adaptée, elle pourra être quotidienne et ce afin de prodiguer des soins adaptés aux animaux dès que nécessaire et éviter toute souffrance. Les traitements avec des nouveaux produits à tester induiront un stress léger. C’est pourquoi, la plupart seront réalisés sous anesthésie. Si jamais des traitements engendre une douleur quelconque, les animaux bénéficieront d’une analgésie adaptée pour la supprimer. Des prélèvements de sang pourront être réalisés. Ils induiront un stress léger de l’animal. C’est pourquoi, ils seront réalisés sous anesthésie. Une douleur légère liée à la piqure sera également ressentie. La perte de poids des animaux sera suivie. Un animal montrant une perte de poids égale ou supérieure à 15% de son poids initial sera euthanasié. Toute intervention sur un animal qui pourrait engendrer une douleur sera réalisée avec une analgésie adaptée afin de l’atténuer fortement.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. Diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. Enfin, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvements et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 semaines minimum à la date d’induction tumorale). L’utilisation d’animaux adultes garantit la reproductibilité l’injection des cellules tumorales, c’est-à-dire que cette injection est toujours réalisée au niveau des coordonnées souhaités. Cela garantit également que la vitesse de croissance des tumeurs sera similaire d’une expérience à l’autre. L’utilisation d’animaux plus jeunes ne permet pas de garantir que l’injection des cellules est réalisée au niveau des coordonnées souhaitées (une injection au niveau de coordonnées non connues peut induire des effets neurologiques néfastes).

5 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un fragment de tumeur humaine leur est greffé pour développer des modèles dits PDX, avec traitements et prélèvements sanguins, y compris par ponction intracardiaque terminale. L'établissement, prestataire, développe ces modèles pour des partenaires afin de cribler des molécules. Le porteur affirme que les PDX sont les seuls à reconstituer la complexité des tumeurs humaines, une perte de poids déclenchant supplémentation ou arrêt du traitement.

Objectifs

En Europe, les cancers pédiatriques sont la 1ère cause de mortalité infantile non accidentelle. 20% des enfants et adolescents diagnostiqués meurent chaque année et bien que 80% survivent, les 2/3 d’entre eux souffrent au long terme d’effets secondaires associés à un traitement souvent inadapté. Le développement de thérapies efficaces en oncologie pédiatrique est aujourd'hui devenu un enjeu majeur. Ces dernières années, grâce à l’avancée des thérapies ciblées, une augmentation très importante de nouvelles molécules approuvées pour le traitement des cancers chez l’adulte a été enregistrée. Or, il existe encore peu d’options thérapeutiques accessibles aux enfants et adolescents atteints de cancers. Pour pallier à ce retard, ce projet a été mis en place pour permettre le développement de systèmes de criblages performants dans le but de tester de nouvelles molécules développées chez l'enfant et des molécules développées ou en cours de développement chez l'adulte qui pourraient aussi être efficaces chez l'enfant. Dans le cadre de ce projet, notre société est chargée de finaliser le développement de modèles de tumeurs humaines xénogreffées sur souris ou Patient Derived Xenografts (PDX) représentants au mieux l'hétérogénéité et la variété des cancers pédiatriques solides. Ces modèles seront utilisés pour réaliser des études précliniques avec un nombre d'animaux réduit afin d'identifier les meilleures thérapies potentielles dont pourraient bénéficier les enfants et les adolescents malades. Le développement de modèles PDX est indispensable car ces modèles sont les seuls permettant de reconstituer la complexité des tumeurs humaines et bien que l'environnement cellulaire qui entoure les greffons est constitué de tissus de souris, ce sont sans doute les modèles qui s'approchent le plus de la maladie humaine. Ces PDX sont donc, à l'heure actuelle, les outils les plus performants pour mimer les réponses observées chez les patients en clinique et établir une liste des meilleurs traitements potentiels pour lutter contre les cancers pédiatriques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de développer les modèles nécessaires pour déterminer l’efficacité de nouvelles molécules développées chez l'enfant ou de molécules développées ou en cours de développement chez l’adulte afin d’améliorer et d'identifer des thérapies efficaces pour le traitement des différents types de cancers pédiatriques solides. Dans le cadre de développement de médicaments pour des populations bien définies (médecine personnalisée), il est indispensable de développer de nouveaux modèles sur un organisme complexe (souris) avec une activité du métabolisme pouvant changer la distribution et l’efficacité thérapeutique. Parmi un très grand nombre de molécules à tester, incluant de nouvelles molécules ou des molécules développées ou en cours de développement chez l’adulte, et dont l’efficacité doit être démontrée chez l’enfant, les études précliniques avec un nombre d'animaux réduit sont une première étape vers l’identification des traitements les plus efficaces pour l’ensemble des cancers pédiatriques.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une greffe correspondant à l'implantation d'un fragment de tissus tumoral. Avant la greffe, les souris sont anesthésiées (anesthésie générale). La peau est incisée au niveau du dos de l'animal après désinfection préalable. La greffe est réalisée par l'implantation d'un fragment tumoral. Afin d'identifier avec précision le modèle implanté, les souris seront marquées au niveau des oreilles ou avec une puce insérée en sous cutané. L'incision est alors refermée par 2-3 agrafes préalablement aseptisées. La procédure a une durée globale de 30 minutes maximum par souris. Le réveil des animaux sera surveillé au maximum 24h après l'anesthésie. Les animaux seront observés quotidiennement pour s'assurer de leur bien-être et de leur comportement (isolement du groupe, prostration, aspect du poil...). Les animaux seront manipulés une à trois fois par semaine si leur état général ne nécessite pas une surveillance renforcée: les souris seront pesées 1 fois par semaine et les tumeurs seront mesurées jusqu'à 3 fois par semaine en fonction de la croissance tumorale. Selon les molécules, l’administration sera réalisée par voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutané en fonction du schéma de traitement associé. Dans le cadre d'une meilleure connaissance des modèles des prélèvements de sangs pourront être effectués au niveau du sinus retro-orbital (sous anesthésie gazeuse) ou de la veine caudale, dans le respect des directives européennes. Des ponctions intracardiaques pourront être pratiquées lors de prélèvements terminaux, sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Certains modèles de PDX sont susceptibles d’induire une perte de poids chez la souris. L'administration de molécules est susceptible d’induire une perte de poids chez la souris. En cas d'une perte de poids supérieure à 15% du poids en début d'expérimentation pour les souris porteuses de modèles en développement ou une perte de poids supérieure à 10% pour les souris porteuses de modèles en traitement, une supplémentation sous forme de gel sera ajoutée dans la cage. Dans ce cas, la mesure du poids corporel est effectuée tous les jours jusqu'au retour à une perte de poids

Devenir

L'ensemble des animaux de ce projet étant porteur d'un fragment tumoral, à l'issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés. La réutilisation ne peut pas être possible car les effets des procédures précédentes que les animaux ont subies (greffe de fragment tumoral, traitement par des molécules) pourraient introduire une variabilité indésirable dans les résultats de toute étude ultérieure.

Remplacement

Ce projet a pour objectif de développer les modèles nécessaires pour déterminer l’efficacité de nouvelles molécules développées chez l'enfant ou de molécules développées ou en cours de développement chez l’adulte afin d’améliorer et d’identifier des thérapies efficaces pour le traitement des différents types de cancers pédiatriques solides. Dans le cadre de développement de médicaments pour des populations bien définies (médecine personnalisée), il est indispensable de développer de nouveaux modèles sur un organisme complexe (souris) avec une activité du métabolisme pouvant changer la distribution et l’efficacité thérapeutique. Il n'existe pas de méthode alternative autre qu’in vivo dans le modèle murin permettant de valider les résultats avant un transfert chez l'homme.

Réduction

Le développement de PDX est standardisé et la parfaite connaissance de ce type de modèles permet de mettre en place une stratégie expérimentale n’utilisant que le nombre strictement nécessaire d’animaux. Nous estimons développer 100% des modèles transférés par les partenaires du projet. L'approche sélectionnée pour la réalisation d'études précliniques permet d'évaluer, sur un nombre réduit de souris, l'efficacité et la toxicité de molécules sur une large cohorte de modèles. Ce format d'étude permet de réduire le champ d’investigation en diminuant le nombre important de molécules à tester dans des études précliniques plus approfondies et donc de réduire le nombre global d'animaux utilisés. La taille des groupes des études précliniques sur un nombre d'animaux réduit se base également sur la valeur classiquement utilisée du taux d'inhibition présentant un intérêt qui permet de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tous en garantissant la puissance de l'expérimentation. A partir de nos données, nous avons pu déterminer les variables liées à la croissance tumorale de ce type de modèles et définir le nombre d’animaux minimum et nécessaire à l’observation significative d’un effet >58%.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement pour monitorer leur bien-être général et leur comportement (isolement du groupe, prostration, aspect du poil...). Pour chaque animal, tout signe clinique observé susceptible de causer une douleur, une souffrance ou une angoisse, sera immédiatement enregistré. En cas d’apparition de signes cliniques importants, l’observation pourra être portée à 4 fois par jour au lieu d'une. Lors de l’acte chirurgical, la greffe se fera sous anesthésie générale par une injection par voie intrapéritonéale. Le réveil des animaux sera surveillé au maximum 24h après l'anesthésie. En cas d’une perte de poids supérieur à 15% du poids en début d'expérimentation, une supplémentation sous forme de gel alimentaire sera ajoutée dans la cage et/ou les traitements seront arrêtés jusqu'à ce que la perte de poids soit inférieure à 10% du poids en début d'expérimentation. En cas de diarrhée causant une perte de poids, les dispositions associées à la perte de poids seront prises. L'ensemble de ces mesures permet d'anticiper et de réduire une éventuelle souffrance de l'animal.

Choix des espèces

L'objectif du projet est le développement de modèles nécessaires pour la détermination de l’efficacité de nouvelles thérapies pour le traitement des différents types de cancers pédiatriques solides. Dans le cadre de développement de médicaments pour des populations définies (médecine personnalisée), il est indispensable de développer de nouveaux modèles sur un organisme complexe (souris) avec une activité du métabolisme pouvant changer la distribution et l’efficacité thérapeutique. Il n'existe pas de méthode alternative autre qu’in vivo permettant de valider les résultats avant un transfert chez l'homme. Nous utilisons des souches murines immunodéprimés qui sont classiquement utilisées pour des greffes de tumeurs humaines et dans le cadre d'évaluations pharmacologiques et qui ont été utilisées lors du pré-développement des modèles par les partenaire du projet. Les souris présentant un système immunitaire résiduel qui se développe avec l'âge et qui peut réduire le taux de prise de greffe, nous utiliserons des animaux, en fin de période d'acclimatation, de plus de 18g, âgés entre 6 et 10 semaines pour augmenter nos chances de succès.