Rongeurs
Etude de l’effet d’expositions aux radiofréquences du téléphone portable sur la neurogenèse par la technique 5- bromo-2’-deoxyuridine
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
574 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Exposés aux radiofréquences de téléphonie dès le stade fœtal, ils reçoivent un marqueur des neurones en formation puis sont tués à des âges précis pour examen des organes. L'objectif est de savoir si ces expositions précoces nuisent à la formation des neurones du cerveau. Le porteur affirme que le rat vivant est la seule approche possible et que les expériences chez l'humain ne sont pas envisageables.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de comprendre si des expositions aux champs électromagnétiques radiofréquences (CEMRF) des télécommunications (comme le téléphone portable) reçues très tôt au cours de la vie (dès le stade du fœtus) sont dangereuses pour la formation des cellules du cerveau (les neurones) des rats nouveau-nés, juvéniles (équivalent enfant chez l’homme) et adolescents. Ce projet consistera à comparer des rats exposés aux CEM-RF avec des rats sans exposition aux CEM-RF.
Bénéfices attendus
Ce projet servira à comprendre si les expositions aux champs électromagnétiques radiofréquences (CEM-RF) des télécommunications (comme le téléphone portable) chez le très jeune bébé (avant la naissance) présentent un risque pour le développement de son cerveau. Pour répondre à cette question, nous réaliserons des expériences en comparant des groupes de rats contenant assez de rats pour conclure, sans dépasser ce nombre.
Procédures
Aucune intervention (de type opération chirurgicale) n’est prévue sur les animaux vivants. Dans la procédure 1, les rats adolescent et adulte recevront un marqueur des neurones en train de se former dans le cerveau. Pour savoir si les CEM-RF induisent une inflammation, nous comparerons leurs effets avec un cas provoqué d’inflammation chez le rat. Dans la procédure 2, les petits rats à l’âge de 9 jours et de 21 jours recevront un marqueur des neurones en train de se former dans le cerveau environ 2h00 avant leur mise à mort. Après la fin de l’exposition aux CEM-RF (entre 21 et 70 jours après les naissances), les mères recevront le marqueur des neurones en train de se former dans le cerveau et leurs petits rats le recevront à environ l’âge de 44 jours (stade de l’adolescence) ou de 60 jours (stade adulte) à la dose retenue dans la mise au point de la procédure 1. Avant sa mise à mort, toute souffrance ou douleur de l’animal sera supprimée par administration d’un médicament induisant une profonde anesthésie au bout de quelques minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances provoquées par les procédures n°1 et 2 sont des douleurs à l'injections des différents produits ainsi que la contention..
Devenir
Tous les rats seront mis à mort à des temps précis de leur croissance pour observer leurs organes et conclure à un risque ou non des CEM-RF pour leur état de santé.
Remplacement
Pour ce qui est du remplacement, le rat vivant (étude in vivo) est la seule approche à pouvoir répondre à la question sur le danger des expositions aux CEM-RF sur la formation des nouveaux neurones durant la croissance du cerveau. Le rat vivant est capable de se développer parce qu’il sait faire des actions complexes comme percevoir l’environnement avec ses sens, adapter (réguler) sa température en fonction de la température ambiante. Ces actions complexes ne sont pas réalisables par des cellules dans une boite de culture ou par les logiciels informatiques : leur réponse serait très loin de la réalité. Les expériences chez l’homme ne sont pas possibles.
Réduction
Au point de vue de la réduction, nous utiliserons le moins d’animaux possible. Chaque animal sera examiné au maximum (sur plusieurs organes). Le cerveau sera coupé et plusieurs observations seront faites sur chaque tranche (le nombre de neurones en train de se former, le nombre de neurones déjà formés, les facteurs de croissance (des signaux chimiques qui circulent et qui permettent le développement du cerveau), …). Nous comparerons les résultats des groupes de rats exposés aux CEM-RF avec les rats qui n’ont pas été exposés (groupe contrôle) en réalisant des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Concernant le raffinement, chaque animal sera observé tous les jours et pesé tous les 2 jours. Des feuilles d’observation permettront d’écrire les observations du rat sur son apparence générale (par exemple si le poil est normal ou ébouriffé) et sur son comportement (par exemple si ses déplacements sont normaux ou trop lents). Chez les rates qui attendent des petits, les observations seront encore plus attentives. Nous observerons leur bien-être, leurs petits après la naissance et le nid qu’elle construit pour ses petits. L’état de santé des animaux sera suivi. Nous aurons une liste des observations à réaliser avec des notes (grille de scores). Cette grille permettra de comprendre si l’animal est normal et ne souffre pas ou s’il souffre et comment il faut l’aider pour supprimer sa douleur (par exemple, lui faire une piqûre d’anti-douleur). De plus, des objets (par exemple des brindilles pour faire un nid, des bâtons en bois à ronger et éventuellement des cylindres) seront donnés aux rats dans leurs cages pour rendre leur environnement plus intéressant : pour faire leur nid, ronger, se cacher. Les rates qui attendent des petits seront seules dans leurs cages. Elles seront avec leurs petits après la naissance. Lorsque les rats ne seront plus nourris par le lait de leur mère (sevrage), ils seront mis dans des cages en groupes entre mâles ou entre femelles pour qu’ils ne soient pas seuls. Les rats auront une musique d’ambiance pour les habituer au bruit et diminuer leur stress. Avant leur mise à mort les animaux auront une administration d’un médicament contre la douleur, un sédatif.
Choix des espèces
Le rat est un animal de référence pour les études de toxicologie. Le fonctionnement de son cerveau et de son corps a été très étudié en laboratoire. Il existe beaucoup d’articles et de livres spécialisés sur ce sujet. Le laboratoire possède une grande expérience en recherche scientifique sur les dangers des substances ou des agents physiques. Presque toutes ces recherches ont été effectuées chez le rat. Pour pouvoir comparer nos résultats avec les résultats de ces études sur les effets des CEM sur le cerveau, nous avons choisi la même espèce. De plus, les personnes qui travaillent à l’animalerie savent très bien s’occuper des rats et les observer. Aucune intervention (de type opération chirurgicale) n’est prévue sur les animaux vivants. Dans la procédure 1, les rats adolescent et adulte recevront un marqueur des neurones en train de se former dans le cerveau. Pour savoir si les CEM-RF induisent une inflammation, nous comparerons leurs effets avec un cas provoqué d’inflammation chez le rat. Dans la procédure 2, les petits rats à l’âge de 9 jours et de 21 jours recevront un marqueur des neurones en train de se former dans le cerveau. Après la fin de l’exposition aux CEM-RF (entre 21 et 70 jours après les naissances), les mères recevront le marqueur des neurones en train de se former dans le cerveau et leurs petits rats le recevront à environ l’âge de 44 jours (stade de l’adolescence) ou de 60 jours (stade adulte) à la dose retenue dans la mise au point de la procédure 1. Ainsi, nous identifierons le stade de développement le plus sensible aux expositions aux CEM-RF, et les effets à court et à long terme, transitoires ou permanents, sur la neurogenèse tout au long de la maturation cérébrale.
Etude des mécanismes de passage du tPA vasculaire dans le compartiment cérébral et de son interaction avec les macrophages périvasculaires.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse puis, sous anesthésie, une injection chirurgicale dans le liquide céphalo-rachidien, avant que leur cerveau soit prélevé. Le projet vise à comprendre par quels mécanismes le tPA vasculaire, molécule utilisée contre l'AVC, passe vers le cerveau. Le porteur affirme que les méthodes sans animaux ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information et retient la souris comme le meilleur compromis.
Objectifs
L’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est une protéase sécrétée par l’endothélium vasculaire. Le tPA est surtout connu pour son rôle dans la fibrinolyse mais il est aussi présent dans le parenchyme cérébral. Il est sécrété par les neurones et par d’autres types cellulaires tels que les astrocytes, les microglies et les oligodendrocytes. Le tPA cérébral est impliqué dans de nombreuses fonctions non fibrinolytiques comme l’homéostasie de la barrière hémato-encéphalique (BHE). Le tPA est également un médicament, seul traitement pharmacologique à la phase aigüe de l’accident vasculaire cérébral ischémique (AVC). Cependant, l’injection intraveineuse de tPA recombinant chez des patients victimes d’AVC peut entrainer des effets secondaires sur les cellules nerveuses déjà compromises par l’AVC. Les vaisseaux sanguins du cerveau sont entourés d’un compartiment rempli de liquide céphalo-rachidien (LCR) nommé espace périvasculaire. Dans cet espace à l’interface entre le compartiment vasculaire et le cerveau, on retrouve une population cellulaire spécifique : les macrophages périvasculaires (PVM). Le rôle des PVM dans les maladies cérébrovasculaires reste à ce jour peu étudié. Il a été démontré qu’en condition physiologique, le tPA vasculaire est capable de passer du compartiment vasculaire vers le cerveau et que les PVM expriment des récepteurs LRP ("Low density lipoprotein receptor-related protein") . Le tPA possède un domaine de liaison à LRP : le domaine finger, et il a déjà été démontré que le tPA cérébral pouvait être endocyté par les astrocytes via un mécanisme LRP-Finger dépendant. Notre hypothèse est donc que le tPA vasculaire passe dans le compartiment cérébral via un mécanisme LRP-finger dépendant, qu’il peut être endocyté par les PVM également via ce mécanisme. Ce projet vise donc à déterminer les mécanismes par lesquels le tPA vasculaire passe dans le parenchyme cérébral et quels effets ce tPA peut avoir sur les différents types cellulaires et notamment sur les macrophages périvasculaires. Comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacent présente un intérêt à la fois pour une meilleure compréhension de la physiologie du système nerveux et de ces interactions avec le compartiment sanguin, mais également pour améliorer la prise en charge des patients victimes d’un AVC, et traités avec du tPA recombinant en injection intraveineuse.
Bénéfices attendus
Une meilleur compréhension des interractions sang cerveau, et une amélioration de la prise en charge des patients victimes d’un AVC ischémique, en limitant les effets secondaires délétères causés par la thrombolyse avec du tPA .
Procédures
Les animaux seront soumis à une anesthésie, analgésie puis à une seule injection intraveineuse (duréé : 40min). Les animaux seront soumis à une anesthésie, analgésie puis à une procédure chirurgicale permettant une injection dans le liquide céphalo rachidien (durée : 30min)
Impact sur les animaux
Stress lié à la contention, l'induction et le maintient de l'anesthésie. Douleurs eventuelles liées à la chirurgie (prises en charge par un traitement analgésique adéquat)
Devenir
La mise à mort est nécessaire pour le prélèvement du cerveau, afin de procéder à des analyses immunohistologiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. Le marquage des différentes protéines avec deux fluorochromes permet une co-injection des protéines recombinantes deux à deux et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce de référence de l’étude de la physiopathologie cérébrale dans la littérature. Les mécanismes d’action du tPA, l’anatomie, la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour notre étude Les souris utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude des mécanismes physiopathologique du tPA.
Analyse de l’impact d’une déficience en CD45 sur la réponse des lymphocytes T CD8 alloréactifs dans un modèle de greffe de peau chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certains sont tués comme donneurs de peau, les autres reçoivent une greffe cutanée sous anesthésie puis portent un pansement pendant sept jours qui réduit leur mobilité. Tous sont tués pour des prélèvements de tissus. Le projet étudie l'effet d'une déficience en CD45 sur le rejet de greffe, le porteur affirmant qu'aucune expérience in vitro ne rend compte des mécanismes immunitaires en jeu.
Objectifs
La transplantation représente un moyen thérapeutique efficace pour palier au dysfonctionnement de certains organes. Cependant, en l'absence de traitement du receveur, le greffon est rejeté par le système iimunitaire de l'hôte. Aujourd'hui le rejet de greffe est contrôlé par l'utilisation d'immunosuppresseurs pharmacologiques. Cependant, ces drogues ont des effets secondaires importants et ne sont pas toujours suffisantes pour prévenir le rejet. C'est pourquoi il est nécessaire de trouver des traitements alternatifs à ces immunosuppresseurs. Notre équipe a montré que l'utilisation d'un anticorps ciblant et déplétant la molécule CD45 normalement exprimée à la surface de sous populations de lymphocytes T, permettait d'induire une tolérance d'une greffe cardiaque chez le rat. L'objectif de ce projet est d'analyser plus profondément le rôle intrinsèque de la molécule CD45RC dans la fonction de ces sous-populations de lymphocytes T, dans le contexte de greffe de peau chez le rat. Pour cela, nous avons à disposition un modèle de rat déficient pour la molécule CD45RC qui a été généré par la plateforme Transgenèse rat du CR2TI.
Bénéfices attendus
Prolongation de la survie du greffon chez les rats déficients pour la molécule CD45RC
Procédures
- Prélevement de greffons sur animaux donneurs euthanasiés - Greffe de peau sur animaux receveurs anesthésiés (1/animal) - Retrait des pansements au bout de 7 jours sur animaux receveurs anesthésiés - Suivi du bien etre de l'animal et du greffon quotidiennement - Injection dose analgésique en post-opératoire - Prélevements post-mortem sur animaux receveurs euthanasiés
Impact sur les animaux
Douleur et stress engendré par la chirurgie. Mobilite réduite lié à la pause d'un pansement pendant 7jours.
Devenir
Euthanasie des animaux à la fin de l'expérimentation pour effectuer des prélevements de tissus post-mortem.
Remplacement
A ce jour, aucune expérience in vitro ou modélisation informatique ne permet de rendre compte de l'ensemble des mecanismes immunitaires qui rentrent en jeu dans un modèle complexe comme le modèle de greffe de peau. La nature de cette étude ne permet donc pas de s’affranchir de l’utilisation d’animaux et il n'ya pas d'alternatives non animales à la greffe de peau
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est réduit au nombre nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Concernant les donneurs de peau, 1 animal est suffisant pour greffer 5 receveurs. Nous estimons que 5 receveurs par groupe est le nombre minimal requis pour obtenir des résultats significatifs. L'approche statistique adoptée est la suivante : Deux expériences indépendantes seront menées comprenant 5 animaux receveurs par groupe. En cas de résultats significatifs, de nouvelles expériences pourront être menées pour confirmer les premieres observations (3 au maximum). Dans le cas contraire, le protocole sera arrêté.
Raffinement
Les animaux sont surveillés quotidiennement pour observer leur comportement général (mobilité, prise alimentaire, toilettage, posture, pilo-érection) suite à la chirurgie et pour surveiller le maintien du pansement avant son retrait à J7. Si un signe clinique sévère est observé (amaigrissement important, prostration, posture voutée), l’animal sera sacrifié pour des raisons éthiques. Pour réduire la douleur et la souffrance animale liées à la chirurgie, les animaux reçoivent au moment de la greffe de la kétamine, nécessaire à l'anesthésie des animaux et qui présente une action analgésique. De même une dose de buprénorphine (0.05mg/kg) pourra être administrée en post-opératoire (injection sous-cutanée) pour soulager la douleur. Afin de réduire le stress, différents types d'enrichissement (briquettes de bois, tunnel en carton) sont placés dans les cages et les rats seront à 2-3 par cage pour éviter leur isolement.
Choix des espèces
Le modèle rat a été choisi car nous disposons de cette lignée de rats déficients pour la molécule CD45RC. Les rats utilisés auront entre 12 et 16 semaines. Les animaux donneurs ne doivent pas etre trop jeunes pour disposer d'assez de greffons à partir d'un meme animal. Les animaux receveurs seront utilisés dans une tranche d'age relativement proche de celles des animaux donneurs.
Évaluation de l’effet d’un hydrogel fonctionnalisé avec un ion ayant des propriétés antibactérienne et ostéogénique dans un modèle de défaut critique de calvaria chez le rat.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
246 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie créant un défaut osseux dans le crâne, avec deux défauts par animal, pour y implanter un biomatériau. Ils sont ensuite tués pour prélever la voûte crânienne et évaluer la repousse osseuse. Le projet teste un hydrogel destiné à traiter la péri-implantite dentaire, le porteur affirmant qu'il n'existe pas de solution de remplacement pour l'étude du tissu osseux.
Objectifs
La pose d’implants dentaires est un traitement courant en dentisterie et se répand de plus en plus parmi les praticiens au fil des années. Cependant, en raison de l’exposition permanente aux agents infectieux, la péri-implantite touche aujourd’hui 20% des patients implantés. Si elle n’est pas traitée, elle peut conduire à la perte totale de l’implant et des complications systémiques. La péri-implantite se définit par la formation d’un biofilm bactérien à la surface de l’implant qui entraine une forte inflammation des tissus environnants conduisant à une perte osseuse massive. Les traitements utilisés aujourd’hui par les praticiens (antibiotiques à larges spectres, désinfection de l’implant) ne montrent pas d’efficacité à long terme et peuvent engendrer une résistance bactérienne. Pour pallier à l’utilisation des antibiotiques, un intérêt grandissant est porté aux agents antibactériens inorganiques tels que les nanoparticules, ions métalliques ou polyphénols. Ainsi, l’objectif de notre projet est de développer un matériau innovant en combinant deux hydrogels aux propriétés distinctes. Dans un premier temps, un mélange d’hydrogel, de granules de céramique biphasées (BCP) et de nanoparticules d’hydroxyapatite dopées avec un cation pourra adhérer à l’implant et présentera des propriétés antibactériennes, ostéoconductrices et pro-régénératives. Dans un second temps, une membrane composée d’un mélange d’hydrogel et de chitosan présentant une dégradation lente, sera positionnée afin d’empêcher la croissance des tissus épithéliaux autour de l’implant. L’hydrogel et la membrane ont déjà été étudiés au laboratoire. L’hydrogel a été montré comme cytocompatible in vitro et biocompatible in vivo dans un modèle d’injection en sous-cutané chez la souris. La membrane a quant à elle été montrée comme biocompatible et agissant comme une barrière à l’invasion des cellules du tissu gingival dans un modèle ex-vivo d’explants de cellules gingivales humaines dans le cadre de la parodontite. Cette étude in vivo sera menée chez le rat en deux contextes : une procédure en site orthotopique (implantation des composites dans des défauts osseux de calvaria) afin de juger l’effet du composite sur la repousse osseuse et une seconde procédure en site orthotopique (implantation des membranes dans des défauts osseux de calvaria) afin de juger l’effet de la membrane sur la croissance des tissus épithéliaux autour de l’implant.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de valider in vivo l’effet ostéogénique d’un composite d’HA-Si + BCP + cation dans le cadre de la péri-implantite. Cette étude pourrait participer à l’élaboration d’un nouveau traitement de la péri-implantite qui serait utilisable en une seule fois, pratique pour les cliniciens et efficace au long court, en terme de régénération osseuse et effet antibactérien. Ce traitement permettrait donc aux patients de retrouver une bonne qualité de vie d’éviter l’apparition de complications systémiques de la péri-implantite.
Procédures
Les animaux seront soumis à l’implantation d’un biomatériau chargé en cation au niveau d’un défaut osseux critique de calvaria de rats réalisé au préalable (temps opératoire max : 20 minutes). Cette procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale et une analgésie adaptée sera appliquée. Aucun prélèvement sur animaux vigiles ne sera réalisé.
Impact sur les animaux
Un des modèles les plus pertinents utilisés pour étudier la régénération osseuse est le défaut critique (5mm) de calvaria chez le rongeur. Par conséquent, ce modèle d’étude sur le rat consanguin Lewis a été étudié depuis plusieurs années, validé et publié. Les effets indésirables attendus peuvent être une difficulté de récupération de l’animal suite à l’anesthésie (stress, perte de poids, comportement anormal), l’apparition de douleurs au site d’implantation, une gêne fonctionnelle due à une réaction inflammatoire ou une mauvaise cicatrisation.
Devenir
En fin d’expérimentation, tous les animaux seront euthanasiés grâce au dispositif d’euthanasie qui respecte respecter une phase d’endormissement suivie de l’euthanasie (durée totale 8 minutes), permettant ainsi une phase progressive d’endormissement sans douleur pour les animaux. Les calvarias seront ensuite prélevés et préparées pour réaliser des analyses au laboratoire qui permettront l’évaluation la repousse osseuse.
Remplacement
L’utilisation de rongeurs reste nécessaire afin de valider les propriétés des biomatériaux fonctionnalisés en termes de biocompatibilité et d’ostéoconduction. Il n’existe malheureusement pas de solution de remplacement complet ou par des invertébrés en raison de l’étude menée sur le tissu osseux. Des études in vitro de cytocompatibilité des composites et d’étude de leur effet ostéogénique ont été réalisées et ont permis le choix de deux formulations, qu’il est maintenant nécessaire de tester in vivo sur le petit animal.
Réduction
Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, le biomatériau utilisé a été sélectionné en amont et déjà testé pour sa biocompatibilité et sa capacité d’ostéoconduction in vitro. et in vivo. Pour les deux procédures réalisées en site orthotopique, les défauts osseux seront réalisés sur chaque os pariétal qui compose la calvaria de rats, soit 2 défauts par animaux, réduisant de fait le nombre d’animaux tout en préservant la puissance statistique. Par ailleurs l’étude de la bibliographie nous a permis de déterminer le nombre d’implants nécessaires à l’obtention de résultats significatifs afin de constituer des groupes avec un nombre d’animaux nécessaires et suffisants à l’obtention de résultats significatifs et à la valorisation des résultats de cette étude. Pour la phase d’analyse, les tests statistiques utilisés dépendront de la distribution des données.
Raffinement
Afin de raffiner la méthodologie, les procédures de manipulation et de surveillance régulière sont élaborées avec l’objectif d’éliminer toute forme de souffrance animale. Chaque étape de l’étude tiendra compte du bien-être de l’animal, de son arrivée dans l’animalerie spécialisée à son sacrifice en fin d’étude. - Pour la chirurgie, une anesthésie générale et l’admission d’analgésiques sont prévus. -Aucune souffrance (ou très faible) n'est attendue lors des manipulations prévues. Une grille de score, des points critiques et un arbre décisionnel adaptés sont mis en place et les animaux seront observés tous les jours par les opérateurs et équipe d’animaliers. En cas d’apparition de symptômes, et si persistance malgré le traitement antalgique adapté, l’animal sera sorti de l’expérimentation et mis à mort dans les plus brefs délais.
Choix des espèces
Le modèle de défaut osseux critique de calvaria chez le rongeur est couramment utilisé dans la littérature pour l’étude de la régénération osseuse et est parfaitement validé. Les animaux inclus dans cette étude seront des rats mâles âgées de 12 semaines au début de la procédure. Ceci permet d’avoir des animaux matures sans pathologies associées au vieillissement tout en limitant les biais liés à la croissance osseuse physiologique.
Effet de la manipulation de l’activité Locus coeruleus sur la progression de la migraine
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
688 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent deux craniotomies pour injecter un virus et implanter une canule, puis des injections de molécules inflammatoires sur les méninges qui reproduisent une douleur de type migraineux pendant environ deux heures, et des stimulations mécaniques par filaments. Ils sont isolés deux semaines pour éviter l'arrachage des canules, puis tués pour prélever le cerveau. Le projet étudie le rôle d'une région du tronc cérébral dans la migraine, le porteur affirmant qu'aucune méthode alternative ne peut remplacer ce protocole.
Objectifs
L’objectif du projet est d’étudier le rôle des neurones qui libèrent la noradrénaline, situés dans une région du tronc cérébral appelé Locus Coeruleus (LC) dans la migraine. En effet, des études antérieures utilisant un modèle animal de migraine, ont montré que l’activité des neurones du LC est importante dans l’intégration des messages douloureux issus des méninges (seule région intracranienne qui est sensible à la douleur). Dans ce projet, pour aller plus loin dans l’étude du rôle de ces neurones, nous allons les activer ou les inhiber directement et spécifiquement afin d’étudier le retentissement de ces activations/inhibitions sur l’intégration d’un message douloureux venant des méninges. Pour réaliser ce projet, nous utiliserons un modèle animal mimant l'inflammation qui semble avoir lieu au niveau des méninges pendant les crises de migraine et qui provoque la douleur ressentie. En effet l’hypothèse actuelle est que cette douleur est la conséquence d’une inflammation provoquée par des molécules (histamine, bradykinine, sérotonine, prostaglandines…) libérées par les fibres nerveuses au niveau des méninges.
Bénéfices attendus
A moyen terme, ce projet nous permettra de mieux comprendre le rôle du LC dans la physiopathologie des migraines. L’origine des migraines est encore inconnue. Ainsi identifier les acteurs ainsi que leurs rôles dans cette pathologie nous permettra de mieux comprendre cette pathologie. A plus long terme, mieux comprendre la pathologie peut nous aider à développer de nouveaux traitements qui pourraient mieux soulager les patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à 2 interventions chirurgicales qui consistent en une craniotomie : la première pour pouvoir injecter les molécules permettant l’activation/inhibition des neurones) ; la deuxième pour pouvoir implanter une canule pour appliquer à la surface des méninges une inflammation, mimant ce qui se passe pendant les crises de migraines. Les chirurgies sont réalisées chez les animaux anesthésiés. Chaque chirurgie dure environ 30 à 45 min. Injection des molécules sur les méninges afin de mimer les crises de migraine: 4 injections tous les 2 ou 3 jours ; l'injection se fait sous anesthésie brève et dure moins de 2 min ; réveil des animaux en 5 min. Mesure de la sensibilité cutanée: tous les jours pendant 7 jours ; cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal toutes les 15 min pendant 4 h après l'injection des molécules sur la dure-mère (chaque application dure quelques secondes).
Impact sur les animaux
Nous réalisons des procédures chirurgicales (injections de virus dans le LC et implantation de la canule). La douleur est prise en charge en post-opératoire. Nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée de l’animal. Cette douleur est ressentie pendant 2 h après l’injection, mais n’empêche pas les mouvements de l’animal. Par ailleurs, les stimulations mécaniques avec les filaments de Von Frey induisent un retrait de la face signe d’une douleur modérée. L’animal peut échapper à cette stimulation puisqu’il n’est pas en contention. Cette stimulation dure moins d’une seconde. Un autre effet indésirable est l’obligation de séparer les animaux (un par cage) après la chirurgie pour la mise en place de la canule. En effet, si les animaux restent ensemble, ils arrachent les canules. Ils sont donc seuls dans une cage pendant 2 semaines.
Devenir
Les 3 procédures sont 3 expériences différentes ne permettant pas de réutiliser les animaux. A la fin de ces procédures, les animaux sont mis à mort. En effet, le comportement se termine par des études immunohistochimiques qui nécessitent de prélever le cerveau, l’électrophysiologie se fait chez des animaux anesthésiés, sans réveil par la suite. Le rotarod ne permet la réutilisation des animaux puisque les molécules permettant l’activation/inhibition des neurones ont été injectées.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Le nombre d'animaux est défini à partir de notre expérience et des tests statistiques donnant le nombre nécessaire pour la discrimination des effets. Ainsi dans chaque lot, nous aurons 20 animaux (10 mâles et 10 femelles). Ce nombre tient compte des échecs qui peuvent être rencontrés lors d'une chirurgie (mauvais placement de la pipette d’injection de virus, taux d’infection faible, animal mort à cause de la chirurgie de préparation/neurone non trouvé, site d'injection mal placé, problème de migration du virus, canule bouchée). D’après les données du laboratoire, nous avons environ 20 % de rats qui doivent être écartés de l'étude. Par ailleurs pour rendre compte des mécanismes sans doute différents chez l'homme et la femme (hormones différentes), nous avons besoin de réaliser l'étude à la fois chez les mâles et les femelles. Enfin pour améliorer le confort des animaux et donc prévenir la perte d'animaux, les animaux (rats adultes de la souche Long Evans) sont placés dans des cages enrichies (rouleaux permettant de se cacher) ce qui permet de réduire le stress des animaux tout le temps précédant la mise en place de la canule. Pendant six jours, ils seront acclimatés à l’animalerie. Par ailleurs la chirurgie est réalisée par une personne expérimentée.
Raffinement
Les nuisances identifiées sur le bien-être des animaux sont : la douleur engendrée par les chirurgies, la douleur engendrée dans le cadre du modèle, et la séparation des animaux après la mise en place de la canule sur les méninges. Afin de réduire la douleur de la chirurgie, un traitement antalgique pendant 3 jours. Pour éviter le dessèchement de la cornée pendant la chirurgie, la cornée est protégée par de la vaseline pendant toute cette étape. Concernant la douleur générée par l’application des filaments de Von Frey, nous respectons les recommandations de l'International Association for the Study of Pain (IASP). Nous limitons les stimulations en durée et en intensité au minimum et l’animal a la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Pour améliorer le bien-être des animaux après la chirurgie, les cages sont enrichies à l'aide de rouleaux permettant aux animaux de se cacher avant la chirurgie. Après l’implantation de la canule, les animaux seront seuls dans une cage pour éviter de s’arracher les canules. Les rouleaux seront remplacés (risque d’arracher la canule) par des feuilles de sopalin blanc pour permettre aux animaux de faire un nid.
Choix des espèces
La souche Long Evans utilisée dans ce projet est génétiquement modifiée : le gène Cre a été introduit immédiatement avant la séquence du gène de la protéine tyrosine hydroxylase (TH, rats Long Evans TH-Cre hétérozygotes). Cela permettra d’activer cette enzyme ce qui entrainera la synthèse de noradrénaline dans les neurones du LC. Cette souche est couramment utilisée pour ce type des études. Les animaux seront âgés de 6-8 semaines pour les mâles et 12-13 semaines pour les femelles afin d’avoir le meilleur poids pour la chirurgie stéréotaxique d’injection de virus.
Rôle du métabolisme glucidique sur la fonction testiculaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
96 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections quotidiennes sous la peau pendant quinze jours, un test de tolérance au glucose après une période de jeûne, et deux prélèvements sanguins. Elles sont ensuite tuées et autopsiées pour analyser le testicule et d'autres organes. Le projet étudie l'effet de deux molécules régulant le glucose sur la fertilité masculine, le porteur indiquant qu'aucune méthode de remplacement ne permet d'intégrer les effets sur l'organisme entier.
Objectifs
Dans le monde nous estimons que 2 à 12% des hommes sont infertiles. Des facteurs génétiques mais aussi des changements de mode de vie (peu de sport, alimentation riche) peuvent conduire à une baisse de la fertilité à l'âge adulte. Ainsi, dans le cas d’un apport riche en glucides ou dans le cas de diabète sucré chez l’adulte, la qualité du sperme et de son patrimoine génétique sont altérés. Toutefois, après l'arrêt de la consommation de haute teneur en fructose, le nombre de spermatozoïdes retourne à une valeur normale. Dans cette étude, nous allons essayer de mieux comprendre comment le métabolisme glucidique peut affecter la fertilité masculine en utilisant deux classes de molécules (médicaments) utilisées pour réguler la voie des glucides. Nous utiliserons une molécule qui va favoriser l’entrée des glucides dans la cellule (molécule anti-diabetique) ; et la seconde molécule est une hormone produite par le foie . Cette hormone est actuellement étudié pour le traitement de maladies métaboliques (obésité, diabète), mais nous ne connaissons pas ses effets sur la reproduction. L’objectif du projet est d’identifier les effets de ces modulateurs des glucides sur la fonction testiculaire. Ainsi, au cours de cette étude, nous exposerons 2 groupes de souris mâles adultes (saines ou en surpoids suite à un régime riche en lipides) avec soit 1/ l'hormone et 2/ soit avec une molécule qui agit comme sensibilisateur aux glucides (anti-diabetique).
Bénéfices attendus
L’obésité peut conduire à l’apparition de pathologies telles que les maladies cardiovasculaires, ou l’infertilité. Ainsi, dans le cas d’un apport riche en fructose ou dans le cas de diabète sucré chez l’adulte, la qualité du sperme et de l’ADN des spermatozoïdes est détériorée. Les mécanismes d’actions des glucides sur le testicule ne sont pas clairement connus et posent des questions sur les nouveaux traitements thérapeutiques régulant le métabolisme glucidique et leur innocuité sur la fertilité masculine. Le fait que récemment, il a été mis en évidence des taux plasmatiques d'une hormone négativement corrélés aux taux sériques en testostérone chez les patients atteints d’obésité, suggère qu'elle peut agir directement ou indirectement sur plusieurs cellules du testicule et modifier leurs activités . Est ce que ces molécules agissent sur la fonction testiculaire et quels effets peuvent elles avoir ? Les données permettront de mieux comprendre l'importance 1/ du métabolisme glucidique et de sa dérégulation dans la fonction testiculaire et 2/ d'identifier les effets sur le testicule de ces médicaments.
Procédures
La moitié des males auront pendant 15 jours des injections journalières en sous-cutanée avec soit l’hormone, soit du sérum physiologique, l'autre moitié des males auront une administration dans l'eau de boisson. L'ensemble des males auront un test de tolérance au glucose qui nécessite une période à jeûn de 4 à 6h suivi d'une injection de glucose puis de mesures répétées du glucose dans une goutte de sang sur une période de 2h. Enfin les animaux auront 2 prises de sang au cours de l'expérimentation pour vérifier les effets des traitements sur le métabolisme du glucose et sur des marqueurs de la fonction testiculaire.
Impact sur les animaux
Les molécules utilisées ont déjà été etudiées aux concentrations que nous souhaitons utiliser. Elles sont en cours d'essais chez l'Homme. Elles ont montré avoir un effet benefique sur le métabolisme glucidique en cas d’hyperglycemie. Les tests decrivent une "innocuité et tolérance bonnes, similaires au placebo" . Les autres nuisances potentielles sont les injections sous-cutanée qui peuvent potentiellement conduire à une infection, mais les solutions seront preparées sous hotte stérile ainsi que l'apparition d'hematome lors des prises de sang.
Devenir
A la fin de l'experimentation, l'ensemble des males seront euthanasiés et autopsiés pour analyser les effets des molécules (analyse histologique et analyse fonctionnelle moléculaire du testicule, hypophyse, foie, tissu adipeux).
Remplacement
A l'heure actuelle, il n’y a aucune méthode de remplacement, puisque les essais in vitro ont été réalisés. L'analyse proposée, nécessite d'intégrer les effets sur l’organisme en entier (notamment en prenant en compte le métabolisme glucidique par le foie, le tissu adipeux et les muscles) sur la fonction testiculaire. Les effets des molécules ont déjà été caractérisés in vitro sur 2 lignées de cellules et aucun effet toxique (mortalité cellulaire) n’a été observé.
Réduction
Des conditions sont mises en place afin de réduire le nombre d’animaux utilisés ainsi nous utilisons qu’une seule dose des médicaments qui est la dose efficace en se basant sur les données de la littérature et du developpeur. Nous optimisons également les analyses au niveau moléculaire, afin d'utiliser peu d'echantillon.Toutefois, pour faire face à la variabilité individuelle, nous avons besoin d'un nombre minimal d'animaux par groupe (12) pour avoir une analyse statistique fiable. Les tests statistiques seront menés pour tester les différences entre le groupe contrôle et le groupe traité de 12 animaux.
Raffinement
Afin de reduire au minimum les effets sur le bien-être animal, les animaux seront élevés dans les meilleures conditions d’élevage avec la présence d’un enrichissement (une cabane en carton pour se cacher et des morceaux de cartons "crinklets" pour faire leur nid), une surveillance accrue sera réalisée les jours suivants la prise de sang ou le test de tolerance au glucose. Si toutefois, un animal présentait un des points limites sur l'apparence, poids, ou le comportement, ou une combinaison de signes cliniques inquiétant, le vétérinaire référent ou un responsable bien-être local serait consulté et/ou les animaux euthanasiés. Dans le cadre des procedures, pour limiter la douleur, nous utiliserons un anesthesique pour les prises de sang et et un analgesique pour le test de tolerance au glucose et pour limiter la possibilité d'hematome nous effectuerons un point de compression. Pour limiter le stress, les animaux resteront au maximum dans leur cage d'hebergement habituelle.
Choix des espèces
Les souris sont des petits mammifères qui ont une vitesse de reproduction rapide (il ne faut que 30 jours pour produire un spermatozoïde à partir d’une cellule souche, contre 80 jours chez l’homme), et la durée de gestation est de 21 jours. De plus les marqueurs et paramètres du métabolisme glucidique ont été très bien caractérisés et facilement mesurables. Cette espèce est donc un très bon modèle pour étudier les effets des composés agissant sur le métabolisme sur la fonction testiculaire, chez les mammiferes. A l’heure actuelle, aucune donnée sur la reproduction n’est connue pour ces molécules. à partir de 6 semaines, les souris peuvent être considérées comme jeune adulte (fin de la puberté), et peuvent se reproduire. Nous utiliserons des animaux avec un âge supérieur à 6 semaines (8 semaines ).
Le rôle de PRL2 dans les métastases lymphatiques et les lymphoedèmes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent six injections de tamoxifène, une greffe de cellules tumorales, et pour une partie une chirurgie d'ablation des ganglions lymphatiques, avec un suivi par imagerie sous anesthésie deux fois par semaine. Elles sont ensuite tuées pour prélever plusieurs organes. Le projet étudie le rôle d'une protéine dans les métastases et le lymphœdème, le porteur affirmant que l'étude d'un "organisme entier" ne peut être reproduite in vitro.
Objectifs
Le projet vise à déterminer le rôle de notre protéine d’intérêt, une phosphatase, dans les vaisseaux lymphatiques dans deux contextes liés au cancer : (1) les métastases d’origine lymphatique et (2) les lymphoedèmes post-résection des ganglions lymphatiques. Les métastases représentent la dissémination d’une tumeur dans le corps. Les lymphoedèmes sont des accumulations de fluide dû à un défaut des vaisseaux lymphatiques pour évacuer le surplus de fluide. Dans certains cancers, la résection des ganglions, soit l’opération de retirer les ganglions lymphatiques proches de la tumeur, est souvent nécessaire pour prévenir la formation des métastases. Malheureusement, cela peut avoir des effets négatifs tels que le lymphoedème. Par cette étude, nous voudrions répondre aux questions suivantes : (1) est-ce que l’expression de cette protéine dans les cellules lymphatiques joue un rôle majeur dans le développement de métastases, notamment dans la lymphangiogenèse associée ? (2) Cette protéine est-elle impliqué dans la formation de lymphoedème suite à une résection de ganglions lymphatiques ?
Bénéfices attendus
Les résultats préliminaires in vitro montrent que notre protéine d’intérêt, une phosphatase, a un effet sur la prolifération, la migration et le bourgeonnement des cellules endothéliales lymphatiques. Ceci suggère que cette protéine pourrait donc avoir un rôle dans la régulation de la formation des vaisseaux lymphatiques (lymphangiogenèse). Si cela est aussi observé in vivo, ce projet nous permettra d’ajouter un nouveau régulateur dans le processus et également une meilleure compréhension du rôle des phosphatases dans la lymphangiogenèse. La formation des vaisseaux lymphatiques est un processus important pour le bon fonctionnement de l’organisme et un dérèglement de ce processus entraîne souvent le développement ou l’aggravation d’une pathologie comme par exemple les lymphoedèmes (accumulation de fluide dans une partie du corps) ou les métastases (dissémination de cellules tumorales). Ainsi, tout régulateur de la lymphangiogenèse peut devenir une cible thérapeutique pour activer ou inhiber la formation des vaisseaux lymphatiques afin de prévenir ou de guérir les pathologies. Par exemple, dans le cas des cancers avec un risque de métastase, les deux voies les plus probables pour les cellules tumorales sont les vaisseaux sanguins et lymphatiques. Donc, en inhibant la formation de ces vaisseaux à la périphérie de la tumeur, le risque de métastase diminue. Ainsi, l’utilisation d’un inhibiteur de lymphangiogenèse comme traitement additionnel pourrait améliorer le traitement des cancers. On observe déjà ce type de traitement pour inhiber la formation de vaisseaux sanguins autour de la tumeur. Cependant, pour inhiber la lymphangiogenèse, il est nécessaire de mieux comprendre le mécanisme de formation des vaisseaux pour pouvoir cibler les régulateurs. Dans notre cas, notre protéine d’intérêt pourrait devenir une cible pour inhiber la formation des vaisseaux lymphatiques dans les tumeurs. Cela pourrait également devenir une cible thérapeutique contre la formation de lymphoedème qui a aussi pour origine un dysfonctionnement des vaisseaux lymphatiques.
Procédures
Avant chaque procédure, tous les animaux (soit 320 max) recevront 6 injections de tamoxifen réparties sur 2 semaines. Chaque injection dure moins d’une minute par souris. Pour chaque procédure, les animaux sont anesthésiés sous isoflurane (un gaz) ou par injection d’anesthésiants. Pour l'injection de cellules tumorales en sous-cutanée, les animaux recevront une application d'analgésique local avant l'injection de cellules. Les animaux subissant une chirurgie plus importante recevront une injection d’analgésique avant chirurgie. 160 souris auront une injection de cellules tumorales (mélanome ou cancer du poumon) en sous-cutané, 80 souris auront une injection de cellules du cancer du sein au niveau des glandes mammaires et 80 souris subiront une chirurgie pour retirer les ganglions lymphatiques de la patte. Chaque chirurgie n’excède pas 5 minutes par souris. Après chirurgie, tous les animaux seront gardés en observation pendant le développement de la maladie jusqu’à la mise à mort. Si nécessaire, les souris recevront 1 ou 2 injections supplémentaires d’analgésique contre la douleur ou l’application d’un désinfectant cutané contre le risque d’infection. Les souris ayant reçu une injection de cellules tumorales auront un suivi du développement de la tumeur par imagerie 2 fois par semaine. Pour cela, les souris seront anesthésiées par isoflurane et recevront une injection d’un composé permettant la localisation des cellules tumorales avant d'être placé dans un imageur adapté pour une acquisition d’image sur animal vivant. L'acquisition d'image prend 6 à 25 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront suivis quotidiennement avec une fiche de suivi hebdomadaire et une pesée 3 fois par semaine. L’apparence et le comportement des animaux seront marqués sur la fiche de suivi. Pour chaque expérience, les animaux pourront présenter une perte de poids, des signes de douleur ou de gêne avec possible prostration, cachexie, tremblement ou isolement (voir chaque procédure pour plus de détails). Tous ces critères sont considérés comme des points limites lorsqu’ils dépassent un certain seuil. Le seuil est déterminé par le personnel de l’animalerie qui a une longue expérience de ce type de procédure. Lorsqu’un point limite est atteint, l’animal est immédiatement euthanasié pour éviter toute souffrance inutile.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus nécessaires aux analyses visant à déterminer s’il y a une différence au niveau de la formation des métastases et de lymphoedème. Ainsi plusieurs tissus et/ou organes seront prélevés sur chaque animal.
Remplacement
Le projet vise à caractériser le rôle d’une protéine spécifique au niveau des vaisseaux lymphatiques lors de métastases (dissémination de cellules tumorales) et de lymphoedème (accumulation de fluide dans une partie du corps). Ceci nécessite donc l’utilisation d’un modèle in vivo car il n’est pas possible de reproduire ces conditions in vitro. L’étude des métastases demande un organisme entier puisque les cellules tumorales circulent d’un organe à un autre en utilisant le système circulatoire de l’organisme. Le lymphoedème est également une pathologie qui s’étudie à l'échelle d'un corps entier. Il est également important de noter que des interactions complexes entre différents types cellulaires est nécessaire pour l’observation de ces phénomènes.
Réduction
Pour être statistiquement significatif et scientifiquement irréprochables, un nombre de 10 souris par génotype sera nécessaire pour chaque expérience et les expériences seront répétées 4 fois (1 expérience pour ajuster les protocoles et 3 expériences pour prouver la reproductibilité des résultats) pour chaque procédure. La variabilité entre les expériences et entre les animaux pouvant être importante, un nombre d’animaux suffisant et plusieurs expériences permet d’avoir des résultats scientifiquement robustes. Nos 2 génotypes d’intérêt sont les souris avec une délétion inductible de notre protéine et les souris sans délétion inductible. Nous avons optimisé nos croisements pour n’obtenir que les génotypes d’intérêt à chaque portée pour limiter le nombre d’animaux. Donc 2 x 10 souris = 20 souris/expérience. Donc pour la procédure 1, où nous avons 2 lignées cellulaires différentes : 20 souris x 4 expériences x 2 lignées cellulaires = 160 souris. Pour la procédure 2 : 20 souris x 4 expériences = 80 souris. De même pour la procédure 3. Donc, nous estimons le nombre maximal d’animaux à 320. Pour la procédure 2, nous n’utiliserons que des souris femelles pour l’étude sur le cancer du sein. Afin de ne pas perdre les mâles des mêmes portées, nous les utiliserons pour les autres procédures en essayant de garder quand même une certaine mixité. Le ratio femelle/mâle des procédures 1 et 3 sera donc plus de l’ordre du 1 pour 3 que du 1 pour 1 dans certaines expériences en parallèles avec celles de la procédure 2. Les études statistiques seront réalisées avec les tests statistiques adaptés aux résultats.
Raffinement
Une surveillance d’une grande attention sera faite après chaque geste expérimental. Pour les injections de tamoxifen de chaque procédure, 10 minutes d’observation et une vérification 1h après. En cas d’inconfort ou de souffrance, l’animal sera tout de suite pris en charge par les soigneurs et sacrifié si son état est trop grave. En cas de saignement grave au niveau du site d'injection, l’animal sera immédiatement sacrifié. Pour chaque acte chirurgical, les souris seront anesthésiées et placées sur un tapis chauffant (37°C) avec une application de gel ophtalmique sur les yeux pour prévenir le dessèchement oculaire. Lors de l’injection des cellules tumorales en sous-cutané (procédure 1), un analgésique local sera utilisé pour prévenir la douleur dû à l’injection. Lors de l’injection des cellules tumorales dans la glande mammaire (procédure 2) et l'opération de retrait des ganglions lymphatiques (procédure 3), un analgésique et un désinfectant cutané seront utilisés pour réduire la douleur et prévenir les infections. Après chirurgie/implantation, les souris sont remis dans leurs cages avec leurs congénères (5 souris/cage) et observées jusqu’à leur réveil avec une vérification 1h après. Les cages seront enrichies en accord avec la procédure expérimentale. Des tunnels seront présents dans chaque cage. De la nourriture humide sera mise à disposition dans les cages si nécessaire, par exemple pour aider à l’alimentation suite à la chirurgie. Pour toutes les procédures expérimentales, il y aura un suivi quotidien des animaux et chaque changement physique ou comportemental sera noté sur une fiche de suivi quotidienne. Tout comportement anormal grave comme la prostration ou des tremblements entraînera l’euthanasie immédiate de l’animal. Pour des changements plus légers, l’avis d’un vétérinaire sera demandé et une décision sera prise en concertation avec le vétérinaire, les soigneurs et le responsable du projet pour définir la meilleure prise en charge de l’animal. Les soins seront toujours effectués par les mêmes expérimentateurs pour réduire le stress des animaux et tout le personnel de l’animalerie impliqué dans ce projet a les compétences et l’expérience nécessaire pour la partie expérimentale. Au cours du projet, nous nous maintiendrons informer des possibles améliorations de raffinement adaptables à nos procédures.
Choix des espèces
Le projet vise à caractériser le rôle de notre protéine d’intérêt au niveau des vaisseaux lymphatiques lors de métastases (dissémination de cellules tumorales) et de lymphoedème (accumulation de fluide dans une partie du corps). Ceci nécessite donc l’utilisation d’un modèle in vivo car il n’est pas possible de reproduire ces conditions in vitro puisque cela demande une conformation 3D à l’échelle d’un organisme entier, mais également des interactions complexes entre différents types cellulaires. L’implantation de tumeur chez la souris est par ailleurs une expérience couramment utilisée pour l’étude de la formation des métastases. La lignée de souris de notre projet, déjà existantes, permettra de déléter spécifiquement notre protéine au niveau des vaisseaux lymphatiques. Ce modèle nous permettra d’étudier l’implication de l’expression de notre protéine d’intérêt au niveau des vaisseaux lymphatiques dans les cas de métastases et de lymphoedème. Les souris sont également immunocompétentes car les cellules immunitaires peuvent avoir une grande influence sur les vaisseaux lymphatiques, notamment dans les cas de cancers où le microenvironnement est important. Nous commencerons les expériences sur des souris âgées entre 6 et 8 semaines afin d’avoir une bonne induction de la délétion de la protéine. L’utilisation de jeunes animaux permet également une croissance tumorale optimale et un système immunitaire performant. En effet, dans notre étude, il se peut que le système immunitaire ait un rôle important en lien avec les vaisseaux lymphatiques que nous étudions. Ces expériences d’implantation de tumeur peuvent prendre plusieurs semaines à plusieurs mois, particulièrement pour l’observation de métastases, donc il est mieux de commencer le plus tôt possible.
Etude du rôle des vésicules de membrane externe bactériennes dans l’induction et l’aggravation de sepsis.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
1 760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections de vésicules bactériennes qui provoquent un sepsis, un dysfonctionnement d'organe potentiellement mortel suivi par un score clinique jusqu'à une perte de 20 % du poids. Une moitié est tuée à un stade précoce, l'autre gardée pour l'étude des séquelles avant d'être tuée à son tour. Le projet étudie le rôle de ces vésicules dans la gravité du sepsis, le porteur indiquant que les modèles animaux restent "essentiels" pour tester les traitements à l'échelle de l'"organisme entier".
Objectifs
Le sepsis est un problème majeur de santé publique, défini comme un dysfonctionnement d'organe potentiellement mortel causé par une réponse dérégulée de l'hôte face à une infection. Les sepsis dus à une infection par des bactéries Gram-négatif sont associés à une mortalité plus élevée que ceux associés à une infection par des bactéries Gram-positif. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent la pathogénicité des souches septiques ne sont pas encore totalement compris. Nous avons montré que les bactéries Gram-négatives Escherichia coli (E.coli) pathogènes et responsables de sepsis produisent des vésicules à partir de leur membrane externe, appelées OMV pour outer membrane vesicle en anglais, ayant des propriétés particulières qui contribuent à la virulence de ces souches. En effet, ces OMV spécifiques ont la capacité d'induire seules un sepsis particulièrement grave. Nous postulons donc que ces OMV jouent un rôle majeur dans la sévérité des infections bactériennes et notamment du sepsis. Notre objectif est de comprendre comment ces OMV contribuent à la physiopathologie des infections par des infections à Gram négatif et au sepsis en particulier (mise en place et aggravation / séquelles à court et moyen terme).
Bénéfices attendus
Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle et l’impact des OMV d’E. coli dans l’induction et l’aggravation du sepsis et ses conséquences néfastes à court et moyen terme. Ces résultats apporteront donc des informations à la fois fondamentales dans la connaissance de la physiopathologie des sepsis mais aussi donneront des pistes pour adapter les traitements de supports à utiliser chez les patients septiques admis en unité de soin intensif.
Procédures
Les animaux se subiront aucune intervention vigile autres que des injection intra-péritonéales, intra-veineuse ou sous-cutanées, à une fréquence faible (2 fois sur toute la procédure). Les animaux qui se verront administrer les OMV par voie intra-vésicale seront au préalablement anesthésiés par anesthésie injectable (Ketamine-100mg/kg/Xylazine- 10mg/kg, i.p., 10ml/kg) ou anesthésie gazeuse (4% isoflurane) durant toute la durée de l'intervention, qui durera environ 5 minutes. Ces animaux seront privés d’eau 2h avant cette instillation et jusqu’à 2h après cette procédure. Sur tous les animaux, nous procéderons à une anesthésie terminale par injection de 100μl d’un mélange de rompun/ketamine 1000 (2 ml de ketamine, 500μl de Rompun QSP10ml NaCl 0,9%) avant une prise de sang à la veine cave d’un volume de 700µL à 1mL en environ 15 secondes et qui sera suivie par l'euthanasie de l'animal par dislocation cervicale.
Impact sur les animaux
Certaines procédures expérimentales prévues chez la souris peuvent entraîner une souffrance chez l'animal avec des effets systémiques (sepsis). Ainsi, les paramètres cliniques (aspect du poil [score 1], posture courbée [score 2], défaut de mobilité [score 3]) et la mesure du poids (perte de poids 20% [score 3]) seront observés et quantifiés toutes les heures pendant 8 heures le jour de l’administration des OMV puis quotidiennement à partir du deuxième jour et jusqu’à la fin des expériences (sauf les pesées qui seront réalisées seulement 2 fois par semaine) et serviront d’une part comme paramètres expérimentaux validant impact des OMV et d’autre part comme critères d’évaluation objectifs de la souffrance de l’animal. Ceci nous permettra de déterminer un point limite : score≥ 3 et/ou perte de poids > 20%.
Devenir
A l'issue des procédures 1 et 2, la moitié des animaux sera euthanasiée pour évaluer l'impact des OMV sur les temps précoces après induction d'un sepsis afin d'établir leur rôle dans la phase aigüe. L'autre moitié des animaux sera gardée en vie et utilisée pour la procédure 3 qui vise à évaluer le rôle des OMV dans l'apparition de séquelles à court et moyen terme après apparition du sepsis. A l'issue de la procédure 3, tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser un score lésionnel macroscopique et microscopique.
Remplacement
Des expérimentations alternatives in vitro ont été préalablement réalisées pour démontrer l'effet des OMV sur les cellules impliquées dans l’induction du choc septique (plaquettes sanguines, neutrophiles, macrophages, cellules endothéliales) et valider ainsi la preuve de concept du projet. Cependant, les modèles animaux sont des éléments essentiels de la recherche sur le sepsis pour étudier de manière exhaustive les différentes étapes de l’induction d’un sepsis et pour tester l’effet des traitements habituellement prescrits à l’échelle d’un organisme entier.
Réduction
Le modèle d’injection des OMV par voie systémique, par voie intrapéritonéale et par voie intra-vésicale ainsi que les infections par des E. coli ont été validés dans l’équipe, ce qui facilite les étapes d'optimisation réduisant ainsi le nombre d'animaux requis pour ce projet. Nous utiliserons 10 animaux par groupes (et 5 animaux pour le groupe contrôle). Ce nombre a été estimé en fonction des tests statistiques qui seront utilisés.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans des cages à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés (dans des cages d’une superficie de 500cm2 avec un nombre de 5 animaux par cage), avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 1 fois par semaine. Du coton ou du sopalin sont ajoutés pour leur permettre de faire un nid. Les animaux ont deux semaines d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Pour les procédures d’injection des OMV par voie systémique, les animaux seront surveillés de manière permanente jusqu’au sacrifice (qui aura lieu entre 2 à 12h après l’injection des OMV). Pour les autres procédures, les paramètres cliniques (aspect du poil [score 1], posture courbée [score 2], défaut de mobilité [score 3]) et la mesure du poids (perte de poids 20% [score 3]) observés et quantifiés quotidiennement (sauf les pesées qui seront réalisées seulement 2 fois par semaine) et serviront d’une part comme paramètres expérimentaux validant l’efficacité du traitement et d’autre part comme critères d’évaluation objectifs de la souffrance de l’animal. Ceci nous permettra de déterminer un point limite : score≥ 3 et/ou perte de poids > 20%. Le dépassement de ces points limites conduira à l’euthanasie de l’animal concerné selon le décret N°2013-18 du 1er février 2013 relatif à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques.
Choix des espèces
La souris est le mammifère le plus facilement manipulable et le modèle plus décrit pour l’étude du sepsis. Les doses d’OMV à utiliser sont déjà validées dans cette espèce. Souris de 7 à 8 semaines pour toutes les procédures sauf la procédure 3. Dans la littérature, les souris utilisées pour l’étude du sepsis sont classiquement âgées de 5 à 6 semaines, âge auquel elles sont considérées comme adultes. Nous prenons une marge de deux semaines pour permettre l’acclimatation.
Evaluation de l’efficacité d’un traitement anti-cancéreux à base de cellules NK produites ex vivo dans un modèle murin xénogénique
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
314 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe d'un lymphome que le porteur décrit comme envahissant les tissus et aboutissant à la mort de l'animal, puis des injections de cellules et jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie. Toutes sont tuées par dislocation cervicale pour prélever leurs tissus. Le projet évalue des cellules NK humaines produites selon un procédé breveté comme immunothérapie anticancéreuse, en vue d'un dossier réglementaire pour un essai clinique.
Objectifs
Nous produisons des lymphocytes « Natural Killer » humains à partir de cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon, en passant par un stade de précurseur lymphoïde, selon une technique brevetée, qui permet d’obtenir en 2 à 3 semaines de très grandes quantités de lymphocytes NK immatures, présentant un degré de pureté supérieur à 90. Nous avons également montré que nous pouvions combiner la culture à une modification génétique par transduction lentivirale, qui permet d’apporter des propriétés antitumorales supplémentaires (par exemple un récepteur antigénique chimérique appelé CAR, dirigé contre un antigène tumoral). Les lymphocytes produits sont fonctionnels in vitro. Notre objectif est de caractériser in vivo la biodisponibilité et la fonction de ces cellules lymphocytaires, non modifiées ou modifiées génétiquement pour exprimer un CAR, et à les comparer à des lymphocytes matures du sang et des lymphocytes dérivées de cellules souches hématopoïétiques selon un protocole qui ne passe pas par l’étape précurseur lymphoïde. Ces deux sources de lymphocytes sont utilisées dans le cadre d’essais cliniques, mais présentent un certain nombre des défauts (résistance à la transduction, expansion limitée, apparition précoce de marqueurs d’épuisement). Nous utiliserons comme modèle une souris immunodéficiente humanisée et suivrons des schémas expérimentaux publiés. Nous répondrons à la question de la biodisponibilité in vivo des lymphocytes après greffe chez la souris. Nous validerons dans une étape pilote le modèle tumoral. Enfin, nous explorerons la capacité des lymphocytes armées avec un CAR à détruire des cellules tumorales par imagerie sur souris anesthésiée. Ce projet nous apportera les réponses scientifiques et les preuves précliniques du potentiel de ces cellules en immunothérapie anti-cancéreuse.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider la capacité des cellules NK produites dans nos conditions (brevetées) à persister après greffe. Il permettra également de valider la fonctionnalité des cellules NK. Au terme du projet, s’ils sont positifs, les résultats seront utilisés pour documenter le dossier exigé qui sera soumis aux autorités réglementaires pour la mise en place d’un essai clinique de phase I/II pour le traitement des lymphomes B. Les schémas expérimentaux et les résultats serviront de base à l’exploration de l’efficacité des cellules NK pour traiter des tumeurs solides.
Procédures
Aucun prélèvement sur animaux vigiles, ni procédures chirurgicales n'est prévu dans l'étude. Les interventions se limiteront à : 1) Injection d'agent de conditionnement. Durée de l’intervention : 30 secondes/souris. L’ensemble des souris (314) sont injectées 1 fois avec cet agent. Durée de l’intervention : 30 secondes/souris. 2) 3 jours après l’injection de l'agent de conditionnement, injection(s) de l'agent théeapeutique NK et/ou des cellules cancéreuses après anesthésie générale : 172 souris injectées 1 fois; Durée de l’intervention 5 minutes/ souris. 142 souris injectées 2 fois. Durée de l’intervention : 15 min/souris. 3) Injection de molécule pour permettre le suivi par bioluminescence après anesthésie générale. Maintien de l’anesthésie gaseuze durant l’aquisition au lecteur de bioluminescence. 164 souris injectées et anesthésiées 8 fois maximum pendant 1 mois. Durée de l’intervention : 15 min/souris. 4) Prélèvement de sang après anesthésie générale : 150 souris, 1 prélèvement par souris juste avant la mise à mort. Durée de l’intervention : 10 min/souris. 5) Mise à mort par dislocation cervicale immédiatement après le prélèvement de sang. Toutes les souris (314) sont concernées. Durée de l’intervention : 1 minute/souris. Au total, 150 souris subiront 4 injections et 1 prélèvement de sang. Les 22 aurtes souris subiront 12 injections et 8 séances d’imagerie. Les 142 souris restantes subiront 13 injections, 8 séances d’imagerie et 1 prélèvement de sang.
Impact sur les animaux
Le modèle tumoral est un modèle d’un lymphome de Burkitt, une tumeur liquide qui envahit les tissus hématopoïétiques (moelle osseuse, rate) et aboutit à la mort de l’animal. Les cellules NK ne provoquent pas d'effets indésirables. Les injections intrapéritonéales et intraveineuses par voie caudale provoquent une douleur localisée légère. Les injections intraveineuses par voie rétro-orbitaire provoquent une douleur localisée et un stress.
Devenir
Tous les animaux du projet (314) seront mis à mort pour prélèvement de tissus et leurs analyses (à J4 ou J7). Ces dernières nous permetteront d'étudier la biodisponibilté.
Remplacement
Notre protocole de production de cellules NK est, en soit, une méthode de Remplacement partiel, puisque nous partons de cellules souches humaines isolées de sang de cordon ou ou de donneurs adultes pour produire et expandre des cellules NK ex vivo avec un système complètement in vitro, sans nécessité de faire maturer les cellules humaines chez la souris. Les expériences chez l’animal interviennent au terme d’un long développement et s’inscrivent dans le cadre d’une validation in vivo de l’effet thérapeutique de ces cellules avant un développement clinique. Les cellules NK produites selon le nouveau procédé ont été complètement caractérisées phénotypiquement et fonctionnellement. Toutefois, les expériences in vitro ne permettent pas d’évaluer la biodisponibilité, des cellules NK dans les différents organes immunitaires, ou leur capacité à migrer dans les tumeurs, et à les détruire. L’efficacité des approches de thérapie cellulaires ne peut être évaluée in fine que in vivo dans un modèle mimant la maladie humaine. Les expériences sur l’animal sont donc justifiées avant leur application chez l’homme.
Réduction
Pour répondre à des questions de biologie cellulaire et moléculaire, nous utiliserons des cultures primaires, ce qui réduit fortement l’utilisation d’animaux. Cependant, les cultures cellulaires ne peuvent pas remplacer les études in vivo pour les réponses physiopathologiques liées à une manipulation génétique ou traitement pharmacologique. Le nombre total de souris impliquées dans les expériences a été réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisantes tout en s’assurant d’une interprétation statistique fiable des résultats pour évaluer l’effet thérapeutique des produits testés. Afin de réduire le nombre d’animaux, les scores d’évaluation clinique les plus objectifs, prédictifs et robustes seront privilégiés.
Raffinement
Afin de limiter la souffrance et le stress infligés aux animaux, une surveillance rapprochée et l’utilisation d’antalgiques sont prévues. Des points limites ont été établis afin d’anticiper la mise à mort de l’animal si nécessaire. Dans le modèle tumoral en particulier, dans le cas où l’induction de la tumeur est à l'origine de douleurs visibles, de détresse ou de signes de toxicité (diminution des mouvements, perte d'appétit, perte d'intérêt de l'exploration, perte de poids, comportement stéréotypique lié au stress), l’expérience sera interrompue et l'animal mis à mort. Pour réduire le stress éventuel engendré par la procédure, les animaux seront hébergés dans un environnement exempt d’organisme pathogène, enrichi à l’aide de coton (pour la nidification), de tunnels de polycarbonate (pour les activités journalières) et de bâtons en bois (pour développer leurs exigences naturelles comme ronger, grimper et se cacher). D’autres outils seront disponibles à la demande pour éviter l’ennui si des animaux se retrouvent seuls dans les cages. Si une souffrance est avérée avec un score supérieur à 6 défini dans les procédures, les NSG-IL15 seront mises à mort pour une étude macroscopique des organes et/ou de l’immunohistochimie et/ou une analyse du statut sanitaire.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus utilisé car sa génétique est proche de celle de l’homme et elle permet d’avoir des nombres d’animaux suffisants pour faire des tests statistiques. Par ailleurs, il existe de nombreux outils (ex : anticorps) qui sont développés parfois exclusivement chez la souris. Les essais précliniques sur animaux sont exigés par les autorités réglementaires dans tout dossier préalable à la demande d’un essai clinique chez l’homme. Il est à noter que seuls les protocoles mis au point et validés in vitro seront testés chez l’animal. Les animaux utilisés seront au stade adulte, entre 10 et 12 semaines de vie. Ce choix se base sur l’âge auquel les lymphomes B se déclarent chez l’Homme et sur un protocole ayant montré des résultats encourageants.
Étude de l’efficacité de dendrimères anti-inflammatoires pour traiter la polyarthrite rhumatoïde dans le modèle murin d’arthrite spontanée IL-1ra -/- (Interleukin-1 Receptor antagonist Knock-Out)
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie porte une mutation qui provoque une arthrite spontanée avec inflammation et douleurs articulaires dès l'âge de quatre semaines et jusqu'à la fin du protocole à vingt semaines, pendant lequel elles reçoivent les molécules testées durant douze semaines. Elles sont ensuite tuées pour des prélèvements. Le projet évalue des dendrimères contre la polyarthrite rhumatoïde, le porteur invoquant le "besoin" de nouveaux traitements et le caractère difficilement modélisable in vitro de la maladie.
Objectifs
La polyarthrite rhumatoïde est une maladie chronique, inflammatoire qui affecte principalement les articulations, induisant de forte douleur et une réduction de la mobilité articulaire. Dans la polyarthrite rhumatoïde, un réseau de médiateurs inflammatoires favorise l’inflammation chronique et la destruction osseuse. L’objectif de ce projet est d’utiliser le modèle animal basé sur la délétion d’un gène impliqué dans la résolution de l’inflammation, IL-1ra, pour étudier l’efficacité thérapeutique de nouveaux candidats médicaments dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde. Ce modèle animal conduit à un développement spontané et rapide d’une arthrite inflammatoire dont les caractéristiques tissulaires sont fortement similaires à la polyarthrite rhumatoïde humaine. Ce modèle animal a déjà été utilisé pour évaluer l’efficacité d’une molécule anti-inflammatoire pour le traitement de la polyarthrite rheumatoïde. Notre équipe étudie ces nouvelles molécules ayant une activité modulatrice du système immunitaire en ciblant plusieurs cellules inflammatoires. Nous avons validé ces propriétés anti-inflammatoires sur des cellules humaines et, pour certains, dans des modèles animaux en prouvant l’efficacité thérapeutique de ces nouvelles molécules dans d’autres modèles de maladies inflammatoires chroniques et aigües. Dans ce projet, ayant recours à 370 animaux, notre objectif est d’évaluer leur potentiel thérapeutique pour traiter la polyarthrite rhumatoïde dans le modèle IL1ra -/-, seuls ou en combinaison avec un traitement de référence pour cette maladie, le méthotrexate.
Bénéfices attendus
Dans la polyarthrite rhumatoïde, le système immunitaire attaque les tissus de l'organisme affectant principalement les articulations, ce qui peut entraîner de graves lésions articulaires, de fortes douleurs et un véritable handicap pour les patients. Cette maladie affecte près de 150 000 personnes en France et 10 % des patients montrent une invalidité grave en moins de 2 ans. Les traitements, dits de fond, pour cette maladie tels que le méthotrexate présentent une efficacité limitée et présentent de conséquents effets secondaires. Plus récemment, les biothérapies ciblées mises au point permettent l’obtention d’une réponse favorable dans près de 75% des cas, mais ces traitements sont très couteux et n’entrainent une rémission prolongée que chez 25% des patients. Ainsi, ces données, bien qu’encourageantes, montrent la nécessité du développement de nouveaux traitements ayant peu d’effets secondaires, peu couteux et entrainant des réponses durables. Des résultats préliminaires laissent à penser que les dendrimères PPH que nous avons développés pourraient répondre à ce besoin. Ainsi, les bénéfices attendus de ce projet sont de démontrer l’activité anti-inflammatoire et l’efficacité thérapeutique des dendrimères PPH sur un nouveau modèle de polyarthrite rhumatoïde. Cette étude - en combinaison avec nos datas confirmant l’activité immuno-modulatrice de nos composés obtenus dans d’autres modèles (in vitro et in vivo) et des études de toxicologie menées chez le rongeur et chez des primates non humains montrant que notre molécule candidate principale ne présente pas de toxicité - permettra d’avancer considérablement notre étude pré-clinique dans le but de mener par la suite des études cliniques chez l’Homme.
Procédures
Les animaux recevront des injections ou des administrations par voie orale des molécules à tester pendant 12 semaines (S8 à S19). Ces gestes, rapides et indolores pour les souris, seront réalisés sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les souris IL-1ra -/- peuvent subir une inflammation et des douleurs articulaires dès l’apparition des symptômes à l’âge de 4 semaines jusqu’à la fin du protocole expérimental (âge de 20 semaines). Si les animaux présentent des signes de douleur, nous administrons une analgésique. Si cela n’améliore pas leur état ou si une perte de poids trop importante est observée, l’expérimentation sera immédiatement arrêtée et les souris concernées seront euthanasiées. De plus, pour limiter le stress des animaux, les souris seront hébergées avec d’autres animaux tout au long du protocole (5 souris par cage) et des objets enrichissants (du coton et des tubes en cartion) seront disposés dans les cages.
Devenir
À l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et des pélèvements seront effectués pour les dosages biochimiques et les analyses histologiques.
Remplacement
Le travail de notre équipe s’inscrit dans la recherche et le développement de nouveaux médicaments pour combattre les maladies inflammatoires. Le processus de développement d’un nouveau médicament comporte plusieurs étapes. L’étude préclinique est la seconde étape fondamentale de ce processus. Elle fait généralement appel à l’expérimentation animale. C’est un pré-requis obligatoire pour justifier l’investigation et la première administration chez l’Homme. Ces expériences in vivo ont une valeur prédictive supérieure à celles réalisées in vitro. En outre, la polyarthrite rhumatoïde est une pathologie complexe qui résulte de l’action concertée de plusieurs acteurs cellulaires et, de fait, est difficilement modélisable in vitro ou ex vivo.
Réduction
Nous avons planifié les expériences dans l’optique de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Nous réaliserons à l’issue des traitements des analyses anatomiques (histologie des articulations), cellulaires (analyses des cellules immunitaires dans les articulations et circulantes) et moléculaires (dosage de cytokines) à partir d’échantillons prélevés sur un même animal. Le nombre d'animaux à inclure sera déterminé, et nos résultats analysés, avec des analyses statistiques appropriées. Enfin, le modèle d’arthrite choisi est robuste (incidence élevée) et reproductible, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaires par groupe.
Raffinement
Nous avons conçu nos expériences dans l’optique de réduire le stress et la douleur pour les animaux. Pour limiter le stress, les souris seront hébergées avec d’autres animaux tout au long du protocole (5 souris par cage). Du coton et des tubes en carton seront disposés dans les cages comme objets enrichissants. Si les animaux présentent des altérations physiques signes de douleur (flan creusé/dos voûté, yeux enfoncés/vitreux, anomalie respiratoire sévère, comportement anormal extrême tel qu’une aphasie ou un grattage excessif) un analgésique sera administré. Si cela n’améliore pas leur état ou si une perte de poids de plus de 20% est observée, l’expérimentation sera immédiatement arrêtée et les souris concernées seront euthanasiées.
Choix des espèces
Les souris sont fréquemment utilisées pour modéliser la polyarthrite rhumatoïde et, en particulier, avec le modèle expérimental (IL-1ra -/-), que nous avons sélectionnées. Le choix d’utiliser des souris a aussi été conforté par le fait qu’il existe un plus grand nombre d’outils d’analyse disponibles (dont les réactifs immunologiques), par rapport aux autres espèces comme le rat. Nous avons choisi la souris IL-1ra -/-. Cette souche mutée pour l’antagoniste au récepteur à l’IL-1, est adaptée pour étudier l’efficacité de nouveaux candidats médicaments pendant une longue durée. La souris BALB/cA sera utilisée comme contrôle non arthritique. Les souris seront âgées de 8 semaines ce qui est en conformité avec les précédentes études.
Approche translationnelle de l’étude du rôle des ganglions de la base dans l’anorexie mentale : modélisation préclinique de la stimulation cérébrale profonde dans l’anorexie mentale
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
1 536 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent l'implantation chirurgicale d'électrodes cérébrales et, pour la moitié, une restriction d'accès à la nourriture qui provoque une perte de 20 à 25 % du poids en une à deux semaines, au-delà de laquelle le porteur indique que l'animal meurt en quelques jours. Ils sont isolés après chirurgie et tués en fin de protocole pour vérifier la position des électrodes. Le projet teste la stimulation cérébrale profonde comme modèle d'anorexie mentale, le porteur la jugeant "indispensable" et urgente pour les patients déjà implantés.
Objectifs
L’anorexie mentale (AM) est une maladie sévère affectant principalement les femmes jeunes et pour laquelle aucun traitement biologique, en dehors des soins nutritionnels, n’a pu démontrer son efficacité. Plusieurs protocoles dans le monde proposent l’implantation d’électrodes dans les Noyaux Accumbens (NAcc), alors même que peu d’études précliniques testent ces techniques pour mieux en comprendre les déterminants et les limites. L’AM associe troubles de la motivation et comportements compulsifs. Le substrat neurobiologique de ces différents processus implique le système cortico-striatal qui est composé de différents territoires corticaux moteur ou préfrontal (i.e. cortex cingulaire antérieur, le cortex préfrontal ventromédial et le cortex orbitofrontal) et différents territoires du striatum : dorsal (caudé et putamen) et ventral (NAcc). Le noyau sous-thalamique (NST), une structure des ganglions de la base classiquement associée aux fonctions motrices, est utilisé comme cible chirurgicale dans le traitement de la maladie de Parkinson par la technique de stimulation cérébrale profonde. Des travaux chez le rat ont souligné l’importance de cette région cérébrale dans les fonctions cognitives et motivationnelles et dans les mécanismes de prise de décision et de contrôle des impulsions et compulsions. Ces implications fonctionnelles du NST ont conduit à le proposer comme cible chirurgicale potentielle pour traiter les troubles obsessionnels compulsifs et les addictions. Il est indispensable et urgent de développer des modèles précliniques dans cette indication. D'abord pour tester les effets de la neuromodulation de structures déjà utilisées pour la stimulation cérébrale profonde dans l’AM et, ensuite, pour tester les effets sur d’autres structures associées aux même processus mentaux mais jamais évoqués dans l’AM (NST). Le but de ce projet est de valider un modèle préclinique chez le rat de stimulation cérébrale profonde dans les troubles alimentaires par l’étude de deux cibles : le NAcc et le NST.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait de répondre à de nombreuses questions concernant la stimulation cérébrale profonde pour les patients déjà implantés et les suivants. Quelle est la cible la plus appropriée ? Quel mécanisme explique l’effet thérapeutique observé ? Quels paramètres sont à privilégier et quels sont leurs effets (stimulation continue ou intermittente, haute ou basse fréquence, durées d’impulsion, intensité) ? Il existe un bénéfice translationnel direct et immédiat (même équipe en charge de ce projet préclinique et du projet clinique) de ce protocole. Il faut souligner le caractère urgent sur le plan déontologique de pouvoir apporter des réponses pour les patients déjà implantés.
Procédures
L'ensemble des animaux de ce projet sera soumis une fois à un acte chirurgical , réalisé sous anesthésie générale et analgésie adaptée. L’ensemble des animaux sera soumis à l’implantation d’électrodes de stimulation cérébrale profonde. L’intervention dure environ 90 minutes. Tous les animaux auront deux prélèvements de sang au niveau de la queue après application d’une anesthésiant local (avant et après la procédure comportementale de restriction et d’accès à une roue d’activité). Chaque prélévement dure moins de 15 secondes. La moitié des rats du protocole sera exposée à une période de restriction d’accès à l’alimentation (1h30 par jour d’accès à volonté) d'une durée maximale de 14 jours.
Impact sur les animaux
Il s’agit des conséquences de l'anesthésie, de la chirurgie, de la restriction calorique, de l’isolement et des prélèvements sanguins. Lors de l'induction anesthésique l'injection intrapéritonéale peut entrainer une gène modérée au point d'injection puis sur le site de diffusion du produit anesthésique. Dans les jours suivant l’opération une perte légère de poids et une activité réduite peuvent être constatées. Les animaux peuvent ressentir une gêne due au poids de l’implant fait en ciment dentaire. Rarement, les animaux peuvent présenter un saignement au niveau des cicatrices. Ces nuisances s’estompent en 2-3 jours. Les animaux sont isolés pendant la période de récupération après chirurgie. La restriction calorique par restriction du temps d’accès à la nourriture, indispensable dans ce modèle d’anorexie mentale, entraine une perte de poids de 20-25% en 7 à 14 jours en moyenne. La perte de poids jusque 20% n’entraine la plupart du temps aucune modification de l’état général en dehors d’une augmentation du niveau d’activité physique (constitutif du modèle Activity-Based-Anorexia). Au-delà de 25% de perte de poids il est constaté une altération de l’état général qui conduit en quelques jours à la mort de l’animal. L’isolement est rendu nécessaire par le port du stimulateur sur le haut du crâne, stimulateur qui pourrait être endommagé par les partenaires de cage. Mais aussi afin d’empêcher les phénomènes de coprophagie des fèces du partenaire de cage. Les découvertes récentes sur la place du microbiote sur le métabolisme énergétique et l’effet des transferts de microbiote d’un animal à l’autre rendent nécessaire de contrôler ce paramètre via l’isolement. Le rat étant un animal social l’isolement peut entrainer des comportements répétitifs, une apathie. Cela peut entrainer en situation de perte de poids et des difficultés à réguler la température corporelle venant aggraver la perte de poids. Cette dimension fait cependant partie du modèle ABA. Le prélèvement sanguin à la queue peut être à l’origine d’un hématome sous-cutané du premier tiers de la queue. Le prélèvement est considéré comme indolore, une gêne modérée peut être ressentie lors de la ponction.
Devenir
Afin de permettre de vérifier la localisation exacte de l’électrode implantée et afin de réaliser des mesures de l’activité électrique de certaines populations de neurones (effet de la stimulation) les rats sont mis à mort à la fin du protocole expérimental.
Remplacement
La modélisation comportementale préclinique d’une pathologie comme l’anorexie mentale nécessite l'étude de comportements chez l’animal vigile et libre de ses mouvements et choix. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, ne pouvant être remplacé pour ce type d’objectif.
Réduction
Les paramètres de stimulation optimaux étant inconnus pour l’anorexie mentale et aucune donnée n’étant disponible chez le rongeur, il est nécessaire de tester sur 4 groupes, 2 cibles (NAcc/STN), 2 conditions de stimulation (ON/OFF), 3 types de fréquence, 3 intensités, 2 largeurs d’impulsion. La mesure de l’effet préventif de la stimulation cérébrale profonde sur le développement du phénotype ABA sera réalisée par l’application d’une restriction alimentaire secondaire pour les rats des groupes contrôles (AL/ALW). Cela permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires. S’agissant d’une étude utilisant une chirurgie stéréotaxique, 12 animaux par condition testée sont nécessaires afin d’anticiper les erreurs de placement d’électrodes de stimulation. Le taux d’échec est d’environ 40 % et ne peut être formellement démontré que post-mortem. Soit (12*4*3*2)+(12*4*2)+(12*4*3*3*2)+(12*4*2)= 1344 rattes. Ce à quoi il faut ajouter un groupe de rats mâles pour estimer l’effet du sexe sur les variables mesurées. Le nombre de rat mâle sera minimisé au maximum pour n’être utilisé que dans la combinaison de conditions (STN/NAcc) optimale chez les femelles soit 12*4*2*2*1*1*1 = 192 rats. Soit 1536 animaux maximum sur 5 ans. Plusieurs approches combinées permettront de réduire au cours de l’étude le nombre d’animaux nécessaires. La taille de l’effet de la stimulation cérébrale profonde sur l’activité compulsive en roue en situation de restriction calorique n’étant pas connue à ce jour, les analyses statistiques intermédiaires permettront principalement de réduire le nombre d’animaux finalement nécessaires. L’obtention d’un effet robuste pour une condition expérimentale entrainera l’arrêt du test dans cette condition et l’absence d’effet entrainera l’arrêt pour futilité. Un taux d’échec d’implantation bas entrainera la réduction de la taille du groupe. La limitation matérielle induit des protocoles comportementaux par bloc de 4 animaux par condition et permet de facto les analyses intermédiaires et induisent une réduction optimale du nombre d’animaux. Les groupes contrôles stimulation OFF pourront s’avérer futiles plus ou moins rapidement selon la taille d’effet mesuré. Les groupes contrôles sans roue d’activité et sans restriction pourront aussi s’avérer inutiles en cas de résultat robuste dans une modalité de stimulation. Cette modalité pourra devenir le standard à laquelle sera comparé un autre paramètre.
Raffinement
Les cages sont enrichies grâce à la présence d'objets divers et variés (bâtonnets en bois, rouleau en carton… changés régulièrement afin de diversifier au maximum l'environnement des animaux). Les cages translucides permettent aux rats isolés après chirurgies de se voir. Les animaux bénéficient d'une habituation aux salles d'experimentation avant le début du protocole. Les animaux bénéficient d'une anesthésie générale pour l'ensemble de la chirurgie d'implantation. Lors de la procédure chirurgicale une injection en sous cutanée de 3 mL de NaCl 0,9% est réalisée afin de limiter la déshydratation et améliorer la récupération post chirurgie. La gestion de la douleur pendant et après les procédures douloureuses et les expérimentations est toujours prise en compte par des personnels compétents et sera améliorée si besoin par injection d'analgésiques ou antibiotiques spécifiques. L'état de santé général de tous les animaux de l'étude est suivi quotidiennement, ce qui nous permet de réagir immédiatement et de manière appropriée en cas de besoin. En cas de souffrance (prostration, poils hérissés, absence de toilettage, dos courbé...) l’animal sera isolé et aura accès ad libitum à une nourriture enrichie. Un traitement antalgique pourra être administré si besoin (méloxicam 0,5mg/kg, 0,25ml, sc) ou une injection intrapéritonéale de glucose. Le protocole prévoit un retour à une alimentation ad libitum continue si la perte de poids est supérieure à 25%. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie appropriée.
Choix des espèces
Le rat est un modèle animal de choix pour l'étude des comportements compulsifs. Les rats ont été les premiers et sont encore prioritairement utilisés dans la modélisation préclinique de l’anorexie mentale, via l’Activity-Based-Anorexia ou ses variantes. L’étude de comportements en situation cherchant à modéliser un trouble mental requiert que l'animal soit vigile, libre de ses mouvements et que les structures cérébrales clefs soient présentes. L’équipe a une longue expérience des chirurgies dans le NST du rat, ce qui permet un meilleur taux de succès des chirurgies. Cette structure cérébrale étant très petite, la souris rendrait les chirurgies plus difficiles. Afin d’étudier les animaux à un stade proche de l’équivalent de l’adolescence (réduire) tout en limitant les risque de la chirurgie (raffinement) nous réaliserons nos expériences chez de jeunes adultes femelles 6-9 semaines (environ 150-200 g). Une expérience avec des rats mâles est prévue afin d’estimer l’effet du sexe.
Evaluation des effets secondaires d’une molécule après administration intra cérébrale chez la souris
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie est génétiquement modifiée pour développer des symptômes de maladies neurodégénératives, comme une démarche altérée et des tremblements, et toutes subissent une chirurgie d'injection dans le cerveau puis sont isolées pendant toute l'expérience. Elles sont tuées soit par prélèvement d'organes incompatible avec leur survie, soit à cause des effets indésirables des produits testés. Ce projet réglementaire évalue la tolérance de candidats médicaments injectés dans le cerveau, le porteur affirmant qu'il n'existe pas de méthode de substitution suffisante.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'évaluer si les futurs candidats médicaments sont bien tolérés après leur injection dans le cerveau. Les souris utilisées pourront être soit des animaux non génétiquement modifiés, soit des animaux génétiquement modifiés pour rentrer dans le cadre de certaines pathologies. Dans ce dernier cas, on évaluera la tolérabilité des molécules visant à atténuer l'expression d'une protéine humaine liée à un gène inséré dans le génotype de la souris. 3 souches de souris transgéniques pourront être utilisées permettant d’étudier des symptômes apparaissant dans les pathologies suivantes : maladie de Machado-Joseph, ataxie cérébelleuse de type 2 ou bien maladie de Parkinson. Ces modèles animaux reproduisent de façon plus fidèle la physiopathologie humaine. Pour ces 3 pathologies, l'accumulation anormale de la protéine va entrainer la mort des neurones dans des zones du cerveau contrôlant la motricité.
Bénéfices attendus
A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments qui seront bien tolérés par l'homme et permettant de traiter de nombreuses maladies neurodégénératives comme la maladie de Machado-Joseph, une pathologie humaine ayant une incidence de 1-2 personnes sur 100 000 et qui peut être plus élevé chez certaines ethnies, l'ataxie cérébelleuse de type 2 A qui a une prévalence de 1 à 2 sur 100 000 personnes, ou la maladie de Parkinson qui touche jusqu'à 8.5 millions de personnes dans le monde. Les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est toléré (avec l'utilisation d'animaux non génétiquement modifiés et génétiquement modifiés).
Procédures
Les animaux seront soumis à une anesthésie et une chirurgie sous anesthésie (45 minutes) pour réaliser l'administration du produit dans le cerveau, des administrations d'anti-douleur (jusqu'à 5 administrations, moins de 30 secondes pour chaque administration), des prélèvements de sang sur animaux vigiles (2 minutes) ou anesthésiés (pas de réveil après le prélèvement).
Impact sur les animaux
Les animaux seront anesthésiés pour réaliser l'injection des candidats médicaments dans le cerveau et ils recevront jusqu'à 5 injections d'anti-douleur. Pour les animaux génétiquement modifiés, des symptomes liés à l'expression de la proteine humaine se développeront (par exemple une démarche altérée, des tremblements, une baisse de l'activité, une éventuelle perte de neurones dans des structures précises). Les animaux seront isolés pendant toute la durée de l'expérience.
Devenir
Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal, ou euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le(s) produit(s)/ modèle chez les animaux.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule après son injection dans le cerveau. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences. Une analyse statistique pourra éventuellement être envisagée et sera adaptée au modèle. Aucune analyse statistique ne sera réalisée sur la grille d'observation.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire. Un raffinement spécifique à cette étude sera réalisé par la mise en application d'une grille d'observation spécifique à l'espèce permettant d'objectiver la contrainte subie par l'animal.
Choix des espèces
La souris est l'une des espèces les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d'un produit sur une pathologie précise dont certains symptomes sont induits après modification génétique de l'expression d'une proteine, qui peut être par exemple impliquée dans la maladie; ou bien pour évaluer la tolérabilté d'un candidat médicament. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement .