Rongeurs

804 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur cérébrale leur est implantée, suivie d'une irradiation cérébrale fractionnée de 20 Gy, de gavages, d'injections et de prélèvements sanguins répétés, puis d'imageries sous anesthésie avant la mise à mort par perfusion intracardiaque. Le projet compare protonthérapie et rayons X combinés à l'immunothérapie, l'adaptation clinique restant annoncée au conditionnel. Le porteur affirme que ces expériences sont "absolument nécessaires" et qu'"on ne peut pas utiliser d'espèces moins évoluées que la souris".

Objectifs

La radiothérapie (RT) fait partie des traitements les plus utilisés chez les patients atteints de cancer. A l’heure actuelle, en France, 60% des patients diagnostiqués pour un cancer sont traités par RT. Pour les tumeurs cérébrales, tels que les gliomes, la RT fait partie du traitement standardisé. Nous avons précédement montré que l’irradiation aux RX pouvait modifier l’inflammation des tumeurs cérébrales, notamment en augmentant la proportion de macrophages pro-tumoraux. D’autres études ont montré l’impact de l’irradiation cérébrale sur la lymphopénie (diminution des lymphocytes sanguins). Contrairement à la RT conventionnelle qui utilise des photons de basse énergie (rayons X et γ), la protonthérapie utilise des particules chargées plus lourdes et de haute énergie. Parce qu’elle peut déposer de façon précise des doses d’irradiation dans le tissu, la protonthérapie peut être utilisée pour : i) limiter les risques de radiotoxicité en réduisant l’exposition du tissu sain, et ii) augmenter la dose déposée à la cible pour accroître la probabilité du contrôle tumoral tout en maintenant les doses pour le tissu sain environnant sous la limite du seuil de tolérance. Le premier objectif est d’appréhender si au-delà des avantages balistique/dosimétrique/radiobiologique, la protonthérapie pourrait présenter des avantages par rapport aux RX en termes d’inflammation anti-tumorale dans le cas d’une irradiation cérébrale. Le second objectif est de déterminer si la combinaison de la protonthérapie et de l’immunothérapie serait bénéfique pour le traitement des tumeurs cérébrales.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront d’améliorer les connaissances scientifiques sur les effets de la protonthérapie sur l’inflammation. De plus, cela permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques combinant la protonthérapie et l’immunothérapie (dont les tumeurs cérébrales sont très résistantes). Le projet scientifique global présente également une partie clinique dont le CPP a été accepté en décembre 2021. Les résultats du projet ci présent pourront ainsi être comparés aux données cliniques. Ainsi, l’ensemble de ces résultats pourra rapidement être adapté à la clinique dans le but d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de tumeurs cérébrales. Plus généralement, ce projet permettra d’appréhender en détail les relations entre la protonthérapie et les immunothérapies.

Procédures

Les animaux subiront plusieurs types d’interventions (irradiations, prélèvements sanguins, …). -Implantation de cellules tumorales : Les souris sont induites à l’anesthésie et vont subir cette procédure une seule fois qui dure environ 15min. - L'irradiation cérébrale est réalisée après anesthésie des animaux. Les animaux sont anesthésiés et lors de l’irradiation cérébrale par RX ou protons, une dose totale de 20Gy sera délivrée de manière fractionnée comme en clinique : 2.5Gy/séance avec deux séances par jour (espacées de 6h) sur 4 jours consécutifs. Les souris vont subir cette procédure une fois qui dure environ 5 min. - Prélèvements sanguins sous-mandibulaires seront réalisés sur souris vigiles. Les souris vont subir cette procédure 6 fois, une fois par semaine qui dure environ 20 sec. -Administration par gavage sera réalisée sur souris vigiles. Les souris vont subir cette procédure tous les jours pendant deux semaines qui dure 10 secondes. -L’administration par injection ip sera réalisée sur souris vigile. Les souris vont subir cette procédure tous les 2-3 jours pendant un mois maximum qui dure environ 10sec. - Imagerie par IRM/TEP, les animaux sont anesthésiés et vont subir des IRM qui dure environ 15 min et les souris vont subir des TEP Fludarabine qui dure environ 20 min. -Mise à mort par perfusion intracardiaque. Après une injection de buprénorphine 15 min avant la procédure, les animaux seront profondément anésthésiés et maintenus pendant la chirurgie.

Impact sur les animaux

-Li'rradiation par elle-même n’induit pas de douleurs, les points limites pendant la procédure d’irradiation vont correspondre à une diminution de la fréquence respiratoire en dessous de 30 respirations/min. - Les répétitions bijournalières et ce sur 4 jours consécutifs peuvent induire une perte de poids des animaux jusqu’à 10 jours après irradiation. Le poids de chaque animal sera mesuré avant, pendant et 15 jours après irradiation et si une perte de poids >10% est observée, la procédure sera arrêtée. Le prélèvement sanguin ou l’injection de traitements journalier et hebdomadaire en eux-même ne provoquent pas de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal. - Les séances d’imageries (TEP et IRM) en elles-même n’induisent pas de douleurs, les points limites vont correspondre à une diminution de la fréquence respiratoire en dessous de 30 respirations/min. Si tel est le cas, le pourcentage d’isoflurane sera légèrement diminué et si cette fréquence de réaugmente pas, la procédure sera arrêtée. Les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil et ensuite replacés dans leur cage et rentrés à l’animalerie tous les soirs. Ils sont ensuite surveillés quotidiennement. La procédure chirurgicale pour l’établissement du modèle de tumeur cérébrale peut induire des douleurs.

Devenir

En fin de protocole, les animaux seront mis à mort. Les organes seron ensuite prélevés pour réaliser à postériori des marquages immunohistologiques sur coupes de 20µm d'épaisseur. Les marquages permettront de suivre la quantité de macrophages et leur état d'activation ainsi que la quantité de cellules lymphocytaires et myéloides. Concernant la cytométrie en flux, elle nous permet de quantifier l'ensemble des cellules circulantes lymphoides (LT / LB / NK + les sous populations LT H; LT M; LT Reg ) et myéloides (Cellules dendritiques / monocytes / Myeloid derived Suppressor cells)

Remplacement

L’évolution du système immunitaire et ce en lien avec la circulation sanguine cérébrale après un traitement ainsi que la formation et l’évolution de l’inflammation tumorale ne peuvent pas être évaluées in vitro. Les expériences in vivo sont absolument nécessaires pour étudier l’impact d’un traitement et tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Pour tester de nouvelles stratégies thérapeutiques qui pourraient être transposées à la clinique, on ne peut pas utiliser d’espèces moins évoluées que la souris. La souris présente un système immunitaire similaire à l’homme et nous disposons d’un modèle in vivo de tumeur cérébrale bien maitrisé dans le laboratoire qui récapitule plusieurs caractéristiques retrouvées chez les patients.

Réduction

Afin d’assurer une puissance statistique suffisante pour les analyses de cytométrie en flux, il sera nécessaire d’utiliser 10 animaux par groupes et ceci en prenant en compte la variabilité inter-individuelle basée sur notre expérience antérieure et de nos expériences antérieures. Afin de réduire le nombre d’animaux au maximum, à chaque fin de protocole, les tissus (cerveaux, rates et ganglions lymphatiques) seront prélevés pour des études histologiques. Pour les analyses d’imagerie et d’histologie à court terme, basé sur notre expérience antérieure, 6 animaux par groupe sera suffisant. L’imagerie nous permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux en évitant des euthanasies à tous temps. Des tests statistiques adéquats seront utilisés.

Raffinement

Si chute de la respiration pendant l'irradiation : Si tel est le cas, le pourcentage d’isoflurane sera légèrement diminué et si cette fréquence ne réaugmente pas, la procédure sera arrêtée. Les animaux sont surveillés tous les jours pendant toute la durée du protocole, week-end compris. Le poids des souris est suivi tous les 2-3 jours avant, pendant et deux semaines après l’irradiation. Si perte de poids dues aux protocoles d'irradiation: Les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil et ensuite replacés dans leur cage et rentrés à l’animalerie tous les soirs. Ils sont ensuite surveillés quotidiennement. Pour limiter cela, les souris disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de la cage ainsi que du complément alimentaire (DietGel Recovery) Pour le modèle de tumeur cérébrale, la procédure chirurgicale est détaillée en 4.2. Après la chirurgie, les animaux sont surveillés tous les jours pendant le protocol, week-end compris. Les souris sont hébergées dans des cages avec 5 souris/cage dans un environnement enrichi (roues/cartons). L'état général des animaux est utilisé comme reflet de son bien-être et des points spécifiques comme le poids ou une respiration anormale sont utilisés comme point limite. Pour toutes les procédures le nécessitant, une anesthésie générale volatile et une analgésie locale et générale sont appliquées.

Choix des espèces

Les modèles tumoraux in vivo sont indispensables pour récapituler au mieux l’environnement inflammatoire des tumeurs qui se développent chez les patients. Nous utiliserons des souris immunocompétantes C57/Bl6 car ces souris présentent toutes les populations de cellules immunitaires et parce que le modèle de tumeur cérébral utilisé repose sur l’implantation de cellules de gliome GL261, cellules issues de souris femelles C57/Bl6, afin d’éviter toute inflammation abérante due au rejet de « greffe » par la souche de souris utilisée. De plus, pour cette espèce et pour les cellules étudiées, tous les outils de caractérisation en cytométrie en flux sont déjà validés dans la littérature et dans notre laboratoire. Animaux agés de 7 semaines. Ce stade correspond à de jeunes adultes et est parfaitement adapté en termes de physiologie aux pathologies ciblées. Cet âge leur confère également une résistance aux protocoles expériementaux utilisés.

80 souris juvéniles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumises à un régime pauvre en protéines qui restreint leur croissance, elles subissent une calorimétrie avec 72 heures d'isolement, un test de tolérance à l'insuline avec sept prélèvements sanguins à la queue, puis une laparotomie sous anesthésie pour prélèvement en veine porte avant la mise à mort. Le projet évalue les effets d'un probiotique dans un contexte de malnutrition, cibles thérapeutiques annoncées au conditionnel et à long terme. Le remplacement tient en une phrase, le porteur affirmant que la réponse "intégrée" de l'organisme "nécessite une étude chez l'animal".

Objectifs

La malnutrition infantile est un problème majeur dans les pays en développement, touchant environ 150 millions d'enfants dans le monde. Des études ont montré que le microbiote des individus mal nourris était sévèrement impacté. De plus, une intervention probiotique (micro-organisme vivant qui, lorsqu’il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets positifs sur la santé, au-delà des effets nutritionnels traditionnels) permet de compenser partiellement le retard de croissance observé dans le contexte de malnutrition chez un modèle préclinique de rongeur. En plus des retards de croissance classiquement décrits, un déficit en protéines pendant l'enfance entraîne des perturbations métaboliques qui persistent à l'âge adulte. Cependant, les altérations exactes se produisant en contexte de malnutrition protéique juvénile, ainsi que les éventuels bénéfices d’une intervention probiotique sont encore mal connus. De précédentes études portant sur les hormones de l'intestin ont permis d’identifier une population de cellules productrices d'hormones impactée par la malnutrition protéique juvénile. Dans ces conditions, une diminution du nombre de cellules produisant du Glucagon-Like Peptide 1 (GLP-1), une hormone contrôlant la sécrétion d’insuline par le pancréas et donc le métabolisme énergétique, a été observée. De plus, les fonctions du GLP-1 étaient également impactées. Il est donc intéressant d'explorer de façon détailléé le métabolisme énergétique dans ces conditions. En utilisant un modèle murin de malnutrition protéique juvénile, permettant une approche de physiologie intégrée, l'objectif de ce projet est de caractériser finement les altérations métaboliques induites par une carence protéique ainsi que le potentiels effets bénéfiques d'une bactérie probiotique.

Bénéfices attendus

Les altérations métaboliques induites pas la malnutrition protéique dans un contexte juvénile sont encore mal connues. Ce projet permettra d’identifier les modifications précises du métabolisme qui surviennent en condition de malnutrition et d’évaluer les potentiels effets positifs d’un traitement avec une bactérie probiotique (micro-organisme vivant qui, lorsqu’il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets bénéfiques pour la santé au-delà des effets nutritionnels classiques). De futures cibles thérapeutiques permettant d’optimiser à long terme la prise en charge des enfants soufrant de malnutrition protéique chronique au travers d’un traitement nutritionnel et probiotique adapté pourront ainsi être identifiées.

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime nutritionnel faible en protéine (qui entraîne un retard de croissance modélisant la malnutrition protéique juvénile) ou à un régime contrôle pendant la durée de la procédure, ainsi qu’à un traitement avec une bactérie probiotique ou un placebo dans le creux de la joue 5 jours sur 7. Les animaux seront soumis une fois à une mesure de composition corporelle par Résonance Magnétique Nucléaire. La mesure s’effectue sous contention et dure quelques minutes. Les animaux seront soumis à une expérience de calorimétrie indirecte impliquant un isolement des animaux pendant 72h. Un test de tolérance à l’insuline sera réalisé sur les animaux vigiles (injection intra-péritonéale) et 7 prélèvements sanguins (2-3 μL) seront réalisés au bout de la queue afin de mesurer la glycémie au cours du temps. Enfin, un prélèvement de sang dans la veine porte sera réalisé 15 minutes après un gavage au glucose. Pour cela, après une injection de buprénorphine, les animaux seront anesthésiés avec de la kétamine et de la lidocaïne et une laparotomie sera réalisée. L’ensemble des interventions seront réalisées sur 80 animaux appartenant à 4 groupes expérimentaux (10 mâles et 10 femelles par groupe).

Impact sur les animaux

Cette procédure devrait entraîner des nuisances modérées sur les animaux. Le régime pauvre en protéine utilisé dans le cadre de cette procédure a déjà été utilisé et il n’engendre pas de sensation de faim, ni d’aggressivité chez les animaux juvéniles. Ce régime vise à modéliser le retard de croissance induit par la malnutrition protéique chronique, il entraîne donc une plus faible croissance en taille et en poids par rapport au régime contrôle pendant la durée de la procédure. Aucune modification de l’activité, ni de stress anormal n’a cependant été détecté chez les animaux nourris avec le régime pauvre en protéine. Pour limiter les effets délétères du régime pauvre en protéine sur les animaux, leur poid et leur taille seront mesurés chaque semaine et les animaux seront mis à mort si un des points limites est atteint. Leur comportement sera également surveillé de manière régulière. Les expériences de Résonnance Magnétique Nucléaire (RMN) et de calorimétrie indirecte peuvent induire un stress chez les animaux en raison du bruit environnant et de l’isolement. La mesure de RMN s'effectue sous contention dans un tube adapté et dure 2 minutes maximum. Pour limiter ce stress, les expériences de calorimétrie indriecte sont réduites en temps au minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables. De plus, une période d’acclimatation est prévue avant l’expérience pour limiter le stress lors de l’expérience et l’enrichissement sera accru dans les cages suite à la période d’isolement pour limiter le stress post-expérience. Le test de tolérance à l’insuline implique une injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins au bout de la queue pouvant induire une douleur et un stress. L’injection intrapéritonéale peut entraîner un gonflement ou un œdème, dont l’apparition sera surveillée quotidiennement après la procédure. La cicatrisation du bout de la queue sera également surveillée.

Devenir

L'ensemble de animaux mis en procédure seront mis à mort après le prélèvement en veine porte en vue du prélèvement des organes d'intérêt. Les mères, qui n'auront pas subi de procédure expérimentale, seront réformées dans l'animalerie.

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires, ce qui nécessite une étude chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus, tout en contournant le problème de la variabilité inter-individuelle des paramètres étudiés. Le nombre de 10 animaux par groupe a été évalué en prenant en compte la puissance du test statistique souhaité, la différence de moyenne attendue entre les groupes ainsi l’écart-type attendu des données au vu de nos résultats précédents. Le test statistique réalisé sera une analyse de variance à trois voies. Dans une optique de réduction, nous allons prélever en fin de procédure l’ensemble des organes qui pourraient nous intéresser (muscle, tissu adipeux par exemple) mais sur lesquels nous n’avons pas prévu de travailler pour le moment et les conserver au congélateur pour d’éventuelles analyses ultérieures. Notre protocole expérimental utilisera des souris issues d’une reproduction chez un fournisseur agrée. Le choix d’utiliser des souris issues d’un fournisseur nous permettra de mieux contrôler certains paramètres liés à l’âge et à la croissance juvénile afin d’assurer une analyse pertinente et un résultat statistiquement significatif.

Raffinement

Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de cette procédure expérimentale, les animaux seront surveillés de manière quotidienne. La croissance en taille et en poids sera mesurée individuellement chaque semaine afin d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. Les animaux seront identifiés par tatouage (au début de la procédure, sous anesthésie légère à l'isoflurane 3%) afin de permettre un suivi individuel de ces paramètres. La prise alimentaire sera également mesurée pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement, et la nourriture sera mise directement dans la litière au début de la procédure expérimentale afin de faciliter l’accès aux souriceaux qui viendront d’être sevrés. Les animaux seront ensuite progressivement habitués à la nourriture en mangeoire en vue de la procédure de calorimétrie indirecte. Afin de limiter le stress lié au transport, une période d’acclimatation est prévue après le transport et avant le début des procédures expérimentales. Pour la procédure de calorimétrie indirecte, pendant laquelle les souris seront isolées pour une période de 72h, les animaux conserveront une partie de leur litière afin de limiter le stress. Lors du test de tolérance à l'insuline, l'état général des animaux sera surveillé et l'expérience sera stoppée s'il vient à se dégrader. De plus, si la glycémie des animaux descend sous un certain seuil au-delà duquel ils risquent une hypoglycémie, ils recevront une injection intrapéritonéale de glucose. A la suite du test de tolérance à l’insuline, l’apparition d’un oedème ou d’un gonflement au point d’injection intrapéritonéale ainsi que la bonne cicatrisation du bout de la queue suite aux prélèvements sanguins seront surveillés quotidiennement et pourront donner lieu à l’application locale d’antispetiques le cas échéant. Des points limites suffisament prédictifs pour pallier à tout stress et toute souffrance animale seront établis. L’atteinte des points limites entraînerait alors la mise à mort des individus concernés. Le protocole du régime expérimental et l’administration de probiotique, ainsi que le prélèvement en veine porte avant mise à mort ont déjà été employés au laboratoire et ne devraient pas apporter de souffrance animale.

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin de comparer l'effet d'un probiotique dans un contexte malnutrition. Les animaux seront suivis à partir du 21ème jour post-natal (âge du sevrage et de l'identification par tatouage de la patte), et pendant les 35 jours de traitement post-sevrage (traitement commencé à jour 21 (P21) en fonction du poids du juvénile (poids non inférieur à 8g) jusqu’à jour 56 (P56). Ce stade est choisi car l'objectif du projet est de connaître les effets d'une malnutrition juvénile sur le métabolisme.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chirurgies stéréotaxiques cérébrales, la pose de pompes osmotiques, des régimes hyperlipidiques provoquant obésité et résistance à l'insuline, et des tests métaboliques répétés avec prélèvements sanguins sur animaux vigiles. Le projet vise à comprendre le rôle des céramides dans le diabète de type 2, retombées thérapeutiques renvoyées au conditionnel et au long terme. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'il est "très difficile" de reproduire ces interactions entre organes in vitro et conclut que le modèle animal reste "nécessaire".

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche sur le diabète, pathologie définie par une élévation anormale du taux de glucose dans le sang, et qui touche plus de 300 millions de personnes dans le monde. Le diabète de type 2 concerne plus de 90% des patients diabétiques et se caractérise par une résistance des tissus cibles à l'insuline, hormone clef dans la régulation de la glycémie, associée à un défaut de sécrétion de cette hormone par les cellules beta du pancréas. Il est maintenant bien établi qu'un régime riche en graisses peut induire la survenue d'un diabète de type 2, via un phénomène appelé la lipotoxicité. Ce dernier est défini par une accumulation délétère de lipides dans différents tissus. Parmi les différents lipides, les céramides apparaissent comme particulièrement délétères. Ainsi, il a été décrit qu'un excès de céramides perturbe la voie de signalisation insuline dans les tissus cibles de cette hormone. Les céramides peuvent également être à l'origine de l'inflammation des cellules B pancréatique, conduisant à une diminution de la sécrétion à l'insuline. Tous les mécanismes d'actions des céramides (qui diffère selon les types de tissus) ne sont cependant pas élucidés et davantage d'études doivent être menées afin d'évaluer la pertinence de l'inhibition de la synthèse des céramides comme cible thérapeutique dans le traitement du diabète. L'objectif de ce projet est donc de mieux comprendre, par des études in vivo, le rôle du métabolisme des céramides sur l'homéostasie glucidique et l'inflammation dans différents tissus cibles de l'insuline (foie et cerveau) ou dans les cellules beta chez la souris. Dans ce projet, nous allons particulièrement cibler la sérine palmitoyltransférase 2 (SPT2), une sous-unité de la SPT, enzyme clef de la voie de synthèse des céramides.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux comprendre l'implication du métabolisme des céramides dans l'homéostasie glucidique, dans différents types cellulaires. Ces études permettront également d'élucider les mécanismes d'actions des céramides dans production hépatique de glucose, l'insulino-résistance ou dans la sécrétion de l'insuline. Ce projet vise aussi à comprendre l'implication des céramides dans l'inflammation et la mort des cellules beta. Enfin, une approche utilisant un inhibiteur d'une enzyme qui produit des céramides, la sphingomyélinase neutre 2, nous aidera à investiguer les mécanismes de régulation de la synthèse des céramides dans les cellules du foie. Les résultats attendus pourraient ouvrir de nouvelles perspectives pour la prévention et le traitement du diabète de type 2, à plus long terme.

Procédures

Prélèvements sur animaux vigiles : 312 souris; chirurgie stéréotaxique pour injection de la protéine Tat-Cre : 72 souris; chirurgie stéréotaxique pour injection de la protéine Tat-Cre + pose d'une canule et pompe Alzet pour perfusion icv de résistine : 96 souris. Détail par procédures : -Proc 1 : injection intrapéritonéale quotidienne pendant 15j puis réalisation de trois tests fin d 'évaluer l'homéostasie glucidique. Ces tests consistent à un suivi de la glycémie (prélèvements sur animaux vigiles) après soit une administration orale de glucose, soit une injection intrapéritonéale de pyruvate ou de glycérol, ces différents tests seront réalisés avec au minimum deux jours d'intervalles. - Procédure 2 : régime hyperlipidique puis tests de mesure de l'homéostasie glucidique espacés de 2 jours minimum avec prélèvements sur animaux vigiles, identiques à ceux de la procédure 1. - procédure 3 : injections stéréotaxiques et insertion d'une pompe osmotique, puis réalisation de tests espacés de 2 jours avec prélèvements sur animaux vigiles (idem procédure 1). - procédure 4 : injections stéréotaxiques et insertion d'une pompe osmotique, puis réalisation d'enregistrements nerveux sur animal anesthésié. - ¨Procédure 5 : injections stéréotaxiques, régime hyperlipidiques puis réalisation de tests espacés de 2 jours minimum avec prélèvements sur animaux vigiles (idem Procédure 1).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à des régimes provoquant l'obésité et/ou des désordres métaboliques de type réistance à l'insuline. Le protocole sera arrêté si les animaux présentent différents signes de souffrance (infections suite aux chirurgies,œdème, absence de mobilité dans la cage, poils ébouriffés, mauvaise prise alimentaire, perte de poids). Ces paramètres seront évalués par le chercheur chaque jour dans la semaine suivant la mise sous régime, injections, tests métaboliques ou chirurgies.

Devenir

A l'issue des procédures les animaux seront mis à mort afin de collecter des tissus et du plasma en vue de mesures biochimiques.

Remplacement

Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôles les flux d'énergie en fonction des besoins. Il est très difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux est encore nécessaire. Cependant, nous avons entamé une réflexion sur le développement d'approches in vitro du type organ on chips qui permettent de mimer quelques interactions entre organe. Certains des travaux réalisés in vitro auront pour but de remplacer, au moins en partie, les approches in vivo

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons effectué un travail en amont qui nous a permis d'identifier un gène cible particulièrement intéressant (SPT2). L'inhibition de son expression dans différents tissus a déjà montré des résultats très prometteurs. Le nombre d'animaux utilisé a été calculé pour que les tests statistiques puissent être fiable et robuste, évitant ainsi de réitérer les expériences, tout en utilisant le nombre d'animaux le plus faible possible.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans des milieux enrichis ce qui permettra d'améliorer leur bien-être. Ils seront également observés quotidiennement et un suivi du poids et de la prise alimentaire seront réalisés 2 fois par semaine. Cela nous permettra d'identifier rapidement les animaux en souffrance.

Choix des espèces

Les modèles précliniques de rats et de souris sont des outils complémentaires et essentiels, partageant avec l’humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contrôle de l’homéostasie glucidique. De plus, la souris est un modèle de choix pour les études génétiques car de nombreuses lignées de souris transgéniques sont disponibles. Ces souris seront utilisées à l'âge adulte, à partir de deux mois. Dans le cadre de l'utilisation du régime cétogène, une partie des souris seront mises sous régime cétogène dès le sevrage pour qu'elles n'aient pas accès à une alimentation riche en glucide.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale de thioglycolate qui provoque une inflammation du péritoine, puis sont tuées quatre jours plus tard pour un lavage péritonéal et un prélèvement d'organes. L'objectif relève de l'enseignement, fournir des cellules immunitaires à des travaux pratiques d'étudiants. Le porteur invoque la "stricte nécessité" réglementaire et affirme que ces objectifs ne peuvent être atteints sans recours à un "animal modèle de l'Homme".

Objectifs

Le projet s’inscrit dans une démarche pédagogique visant à former des étudiants sur les approches en biologie. Ce projet a pour but de récolter des cellules immunitaires pour mettre en culture primaire. Donc pour améliorer la production il est indispensable d'augmenter le nombre de cellules immunitaires prélevables par animal suite à une injection intrapéritonéale d'un activateur de la production de cellules immunitaires. Les cellules prélevées permettront de réaliser des cultures primaires afin de montrer aux étudiants les différentes approches de biologie cellulaire réalisables pour étudier les réponses immunitaires. Il n'existe à ce jour pas de bon modèle de cellules issues de lignées pour étudier les réponses immunitaires sans avoir recours aux prélèvements chez les animaux. Le but de ces travaux pratiques est également de le démontrer en comparant les réponses immunitaires obtenues sur lignées et sur les cellules issues des animaux.

Bénéfices attendus

Le bénéfice premier de cette expérimentation est de de former les étudiants en leurs présentant des techniques qui permettent de limiter le nombre d'animaux mais également que les lignées cellulaires peuvent ne pas suffire pour étudier certains domaines de la biologie Cette technique d'induction nous permettra d 'utiliser moins de souris et d'avoir suffisement de cellules circulantes de la réponse immunitaire (macrophages) pour mettre à la disposition des travaux pratiques. En effet, les prélèvements sanguins chez la souris ne permettent pas d'obtenir suffisamment de cellules pour réaliser des expériences ex vivo sur cellules isolées, et surtout, les cellules visées ne sont pas des cellules circulantes (macrophages). Selon les données de la littérature et nos observations depuis que nous utilisons ce protocole pour les travaux pratiques l'injection intrapéritonéale de milieu thioglycolate à 3% stérile permet d'augmenter le rendement des cellules collectées.

Procédures

les souris seront soumiess à une seule injection (une minute environ) et euthanasiées 4 jours plus tard.

Impact sur les animaux

La procédure a été classée en "modérée" car l'injection de milieu au thioglycolate vise à induire un recrutement de macrophages en provoquant une inflammation péritonéale modérée, qui est cependant à différencier d’une péritonite aigüe en raison de l’absence d'agent infectieux et d’un profil d'activation des cellules recrutées différent (selon les données de la littérature).Les effets indésirables potentiels décrits dans la littérature sont les suivants: léthargie, perte de poids, perforation intestin ou vessie, péritonite, dommages aux organes internes. Ces 3 derniers points étant dus à une mauvaise injection , l'injection ne se fera que par un manipulateur chevronné et expert dans ce geste.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés afin de réaliser un lavage intrapéritonéal pour collecter les cellules recrutées suite à l'injection et prélever les organes nécessaires aux expériences réalisées en TP sur 2 jours.

Remplacement

En conformité avec l’article R214-104 du code rural et de la pêche maritime, « les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information ». Le projet s’inscrit en effet dans le cadre d'activités d'enseignement visant à démontrer l'intérêt des études pré-cliniques dans un contexte de prévention de pathologies humaines et nécessite pour cela, l'utilisation de cellules immunitaires non isolables sans technique invasive. Les objectifs du projet ne peuvent donc être atteints sans recours à un animal modèle de l’Homme, en particulier pour des analyses sur des organes et cellules cibles.

Réduction

L'injection intrapéritonéale de milieu thioglycolate permet d'augmenter la quantité de cellules d'intérêt collectées et ainsi de réduire le nombre de souris utlisées. La procédure expérimentale est conçue pour être favorable sur le plan statistique en mettant en commun les suspensions cellulaires de cellules intrapéritonéales obtenues par séance de TP, ce qui permet de réaliser des triplicats avec un même nombre de cellules à partir d'un nombre limité d'animaux (6 par séance de TP soit 1 animal par étudiant pour l'intérêt pédagogique de la procédure).

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions favorables à leur bien être en cage collective répondant aux normes en vigueur ( 6 animaux par cage ) . L'enrichissement sera réalisé avec des cachettes en plexiglass rouges (nid et tunnel) et des bâtons en cellulose à ronger.

Choix des espèces

La souris est un modèle universellement reconnu en immunologie. De nombreux outils et réactifs permettant d'étudier les réponses immunitaires spécifiques et fonctionnelles ainsi que pour caractériser les cellules sont disponibles pour la souris. Nous avons une bonne connaissance pratique de ces animaux et particulièrement de la souche de souris utilisée (C57/BL6) compte-tenu de leur utilisation fréquente au laboratoire pour nos études nutritionnelles. Age jeune adulte : 6 semaines (5 semaines à reception). Fenêtre d’âge de référence utilisée dans la plupart des études où la réalisation d'isolement de cellules immunitaires est effectuée.

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime gras et sucré pendant 28 semaines induisant obésité et maladie du foie, une injection d'un virus AAV dans la veine de la queue, des prélèvements sanguins à la joue et à la veine porte, avant mise à mort par dislocation cervicale. Le projet étudie le rôle d'une protéine hépatique dans la stéato-hépatite non alcoolique, avec des stratégies thérapeutiques annoncées pour l'humain. Le porteur affirme que l'étude de l'axe intestin-foie nécessite un "organisme entier" et des souris génétiquement modifiées.

Objectifs

Le syndrome métabolique touche actuellement 18% des habitants en France. Au niveau du foie, les complications de ce syndrome se caractérisent par une accumulation de graisses dans l'organe, puis peuvent évoluer vers des stades plus avancés d'inflammation, de fibrose et de dysfonction du foie. Ces maladies représentent maintenant la deuxième cause de transplantation de foie et il n'existe pas de traitement de référence contre ces maladies. Dans ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur le rôle d'une protéine (le récepteur nucléaire CAR (Constitutive Androstane Receptor)) dans le développement de ces maladies chroniques du foie. Ce recepteur est impliqué dans le maintien des fonctions de détoxification et de métabolisme lipidique du foie et des études préliminaires montrent que son expression est très diminuée dans les maladies métaboliques du foie. Cependant, son rôle dans l'avancée de la maladie est inconnu. Ainsi pour cette étude nous utiliserons des souris dont le gène CAR a été supprimé et nous les nourrirons avec un régime induisant une obésité et une maladie hépatique mimant celle observée chez l'Homme. Nous étudierons le rôle de la protéine CAR dans le dialogue entre l’intestin et le foie lors de ce régime. Les institutions internationales recommandent de prendre en compte l’effet du sexe dans le métabolisme énergétique puisqu’il existe chez l’Homme une grande différence entre les hommes et les femmes. Nous étudierons donc le rôle de CAR dans les 2 sexes.

Bénéfices attendus

Avec ce projet nous souhaitons approfondir les connaissances sur le rôle hépatique de CAR dans le développement des maladies chroniques métaboliques du foie, pour pouvoir par la suite proposer des stratégies thérapeutiques chez l'Homme. En effet, il n'existe à ce jour aucun traitement de référence pour les patients atteints de ces maladies, qui représentent actuellement la 2e cause de transplantation de foie dans le monde. Ainsi, nos études permettront de mieux cibler les médicaments nécessaires à chaque sous-catégorie de patients, notamment en fonction de leur sexe.

Procédures

Après les 2 semaines d'acclimatation, les animaux seront placés sous régime (WD). Dans la même semaine, nous injecterons un volume 100 microlitres de solution contenant les AAV à chaque animal au niveau de la veine de la queue. L'AAV est un virus qui va véhiculer une séquence d'ADN qui code pour une protéine d'intérêt et qui permet de restaurer l'expression de cette protéine d'intérêt dans un organe cible chez des individus où la protéine a été supprimée par génie génétique dans tout l'organisme. Après 14 semaines de régime, nous exposerons aussi les animaux à 1 prélèvement de sang à la joue (représentant moins de 5% de leur volume de sang total), le geste durera moins de 1 minute par animal. Après les 28 semaines de régime nous procèderons à 1 prélèvement de sang à la veine porte et la veine cave sous analgésie et anesthésie générale. Ainsi, les animaux transgéniques seront exposés à un régime riche en graisse pendant 28 semaines.

Impact sur les animaux

Le régime WD, qui est un régime enrichi en graisse, en sucre et en cholestérol, mime le régime consommé par les populations occidentales dans lesquelles l'incidence de l'obésité atteint 30% de la population, ce régime induit donc une obésité chez les animaux, ainsi que les perturbations métaboliques généralement associées à l'obésité: intolérance au glucose (diabète), accumulation de triglycérides dans le foie, augmentation de la perméabilité intestinale, sans souffrance visible des animaux, ni changement drastique de leur comportement. L'AAV quant à lui est un virus qui va véhiculer une séquence d'ADN qui code pour une protéine d'intérêt et qui permet de restaurer l'expression de cette protéine d'intérêt dans un organe cible chez des individus où la protéine a été supprimée par génie génétique dans tout l'organisme. L'injection de l'AAV au niveau de la veine de la queue demandera une contention de l’animal qui peut entraîner un stress. Enfin, le prélèvement sanguin à la joue demandera une contention et peut entrainer un épanchement au niveau de la joue.

Devenir

A l'issu de la procédure tous les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale.

Remplacement

L’utilisation d’animaux de laboratoire est nécessaire car le projet implique le dialogue entre organes, en particulier entre le foie et l'intestin. Pour étudier l'interaction entre l'alimentation et le microbiote intestinal, ainsi que les voies moléculaires impliquées dans l'axe intestin-foie, l'utilisation de souris de laboratoire est appropriée avec la possibilité d'utiliser des animaux génétiquement modifiés. L'étude spécifique de l'axe intestin-foie justifie l'utilisation d'expériences in vivo car l'étude in vitro de lignées cellulaires clonales ne permet pas d'examiner les interactions complexes entre les différents compartiments et organes qui composent l'axe intestin-foie intact.

Réduction

Nous avons soigneusement conçu les expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Un nombre suffisant de souris sera utilisé dans toutes les expériences afin d'observer des effets biologiquement pertinents et statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux a été déterminé par un calcul de puissance et basé sur les résultats antérieurs d'études similaires.

Raffinement

Le milieu d’élevage des souris est enrichi d’un abri en inox permettant aux souris de s'isoler de leurs congénères si besoin. Pour limiter le stress, les animaux sont manipulés régulièrement et habitués à la contention. Nous procèderons également à une surveillance accrue des souris (toutes les heures le premier jour puis 2 fois par jours pendant 1 semaine) après le prélèvement de sang à la joue et après l'injection au niveau de la queue. Concernant la gestion de la douleur nous appliquerons un analgésique local la queue avant l'injection au niveau de la veine de la queue. Pour le prélèvement à la veine porte et à la veine cave on réalise une pré-médication par voie intra-péritonéale afin d’induire l’analgésie des animaux. Ensuite après 2 minutes, l'anesthésie débute dans une cage à induction volatile. Le contrôle de l’efficacité de l’anesthésie est fait par vérification du réflexe de retrait à la patte. Pour l'évaluation de la souffrance, de la détresse et de l'inconfort des animaux, des points limites gradés seront mis en place basés sur l'évaluation de cinq aspects de l'état de l’animal: variation du poids de l'animal; apparence physique externe; signes cliniques mesurables; changement dans les comportements non provoqués; et, réponses comportementales aux stimuli externes. Pour chaque catégorie, un système d'évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) est proposé. L'indice cumulatif obtenu en ajoutant les valeurs de chacune des catégories indique supérieur ou égal à 3, le critère d’arrêt sera atteint et l’animal sera retiré de l’expérimentation.

Choix des espèces

Nous souhaitons étudier le rôle du récepteur CAR dans la stéato-hépatite non alcoolique, pathologie qui met en jeu le dialogue entre plusieurs organes (tissus adipeux, intestin et foie notamment) ainsi il est impossible d'étudier cette pathologie via l'utilisation de modèles cellulaires. C'est la raison pour laquelle nos études nécessitent un organisme entier. De plus, afin d’étudier spécifiquement le rôle de la protéine CAR dans cette pathologie systémique, la souris est actuellement le meilleur modèle expérimental car il existe des modèles transgéniques dans lesquels cette protéine a été supprimée au niveau de tout l’organisme (modèle knock-out KO). Enfin, nous utilisons uniquement des souris adultes car il est nécessaire que la fonction hepatique ait pleinement atteint sa maturité physiologique (souris âgées de 7 semaines minimum)

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sevrées, elles reçoivent un régime pauvre en protéines modélisant la malnutrition, un probiotique ou un placebo dans la joue, subissent une calorimétrie avec isolement de 72 heures et un test de tolérance à l'insuline avec prélèvements au bout de la queue, puis une laparotomie pour prélever le sang de la veine porte avant mise à mort. Le projet évalue l'effet d'un probiotique sur les troubles métaboliques de la malnutrition infantile, cibles thérapeutiques annoncées à long terme. Le porteur affirme que la réponse intégrée de l'organisme à l'alimentation impose l'étude chez l'animal.

Objectifs

La malnutrition infantile est un problème majeur dans les pays en développement, touchant environ 150 millions d'enfants dans le monde. Des études ont montré que le microbiote des individus mal nourris était sévèrement impacté. De plus, une intervention probiotique (micro-organisme vivant qui, lorsqu’il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets positifs sur la santé, au-delà des effets nutritionnels traditionnels) permet de compenser partiellement le retard de croissance observé dans le contexte de malnutrition chez un modèle préclinique de rongeur. En plus des retards de croissance classiquement décrits, un déficit en protéines pendant l'enfance entraîne des perturbations métaboliques qui persistent à l'âge adulte. Cependant, les altérations exactes se produisant en contexte de malnutrition protéique juvénile, ainsi que les éventuels bénéfices d’une intervention probiotique sont encore mal connus. De précédentes études portant sur les hormones de l'intestin ont permis d’identifier une population de cellules productrices d'hormones impactée par la malnutrition protéique juvénile. Dans ces conditions, une diminution du nombre de cellules produisant du Glucagon-Like Peptide 1 (GLP-1), une hormone contrôlant la sécrétion d’insuline par le pancréas et donc le métabolisme énergétique, a été observée. De plus, les fonctions du GLP-1 étaient également impactées. Il est donc intéressant d'explorer de façon détailléé le métabolisme énergétique dans ces conditions. En utilisant un modèle murin de malnutrition protéique juvénile, permettant une approche de physiologie intégrée, l'objectif de ce projet est de caractériser finement les altérations métaboliques induites par une carence protéique ainsi que le potentiels effets bénéfiques d'une bactérie probiotique.

Bénéfices attendus

Les altérations métaboliques induites pas la malnutrition protéique dans un contexte juvénile sont encore mal connues. Ce projet permettra d’identifier les modifications précises du métabolisme qui surviennent en condition de malnutrition et d’évaluer les potentiels effets positifs d’un traitement avec une bactérie probiotique. De futures cibles thérapeutiques permettant d’optimiser à long terme la prise en charge des enfants souffrant de malnutrition protéique chronique au travers d’un traitement nutritionnel et probiotique adapté pourront ainsi être identifiées.

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime nutritionnel faible en protéine (qui entraîne un retard de croissance modélisant la malnutrition protéique juvénile) ou à un régime contrôle pendant la durée de la procédure, ainsi qu’à un traitement avec une bactérie probiotique ou un placebo dans le creux de la joue 5 jours sur 7. Les animaux seront soumis une fois à une mesure de composition corporelle par Résonance Magnétique Nucléaire. La mesure s’effectue sous contention et dure quelques minutes. Les animaux seront soumis à une expérience de calorimétrie indirecte impliquant un isolement des animaux pendant 72h. Un test de tolérance à l’insuline sera réalisé sur les animaux vigiles (injection intra-péritonéale) et 7 prélèvements sanguins (2-3 μL) seront réalisés au bout de la queue afin de mesurer la glycémie au cours du temps. Enfin, un prélèvement de sang dans la veine porte sera réalisé 15 minutes après un gavage au glucose. Pour cela, après une injection de buprénorphine, les animaux seront anesthésiés avec de la kétamine et de la lidocaïne et une laparotomie sera réalisée. L’ensemble des interventions seront réalisées sur 80 animaux appartenant à 4 groupes expérimentaux (10 mâles et 10 femelles par groupe).

Impact sur les animaux

Cette procédure devrait entraîner des nuisances modérées sur les animaux. Le régime pauvre en protéine utilisé dans le cadre de cette procédure a déjà été utilisé et il n’engendre pas de sensation de faim, ni d’aggressivité chez les animaux juvéniles. Ce régime vise à modéliser le retard de croissance induit par la malnutrition protéique chronique, il entraîne donc une plus faible croissance en taille et en poids par rapport au régime contrôle pendant la durée de la procédure. Aucune modification de l’activité, ni de stress anormal n’a cependant été détecté chez les animaux nourris avec le régime pauvre en protéine. Pour limiter les effets délétères du régime pauvre en protéine sur les animaux, leur poid et leur taille seront mesurés chaque semaine et les animaux seront mis à mort si un des points limites est atteint. Leur comportement sera également surveillé de manière régulière. Les expériences de Résonnance Magnétique Nucléaire (RMN) et de calorimétrie indirecte peuvent induire un stress chez les animaux en raison du bruit environnant et de l’isolement. La mesure de RMN s'effectue sous contention dans un tube adapté et dure 2 minutes maximum. Pour limiter ce stress, les expériences de calorimétrie indriecte sont réduites en temps au minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables. De plus, une période d’acclimatation est prévue avant l’expérience pour limiter le stress lors de l’expérience et l’enrichissement sera accru dans les cages suite à la période d’isolement pour limiter le stress post-expérience. Le test de tolérance à l’insuline implique une injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins au bout de la queue pouvant induire une douleur et un stress. L’injection intrapéritonéale peut entraîner un gonflement ou un œdème, dont l’apparition sera surveillée quotidiennement après la procédure. La cicatrisation du bout de la queue sera également surveillée.

Devenir

L'ensemble de animaux mis en procédure seront mis à mort après le prélèvement en veine porte en vue du prélèvement des organes d'intérêt. Les mères, qui n'auront pas subi de procédure expérimentale, seront réformées dans l'animalerie.

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires, ce qui nécessite une étude chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus, tout en contournant le problème de la variabilité inter-individuelle des paramètres étudiés. Le nombre de 10 animaux par groupe a été évalué en prenant en compte la puissance du test statistique souhaité, la différence de moyenne attendue entre les groupes ainsi l’écart-type attendu des données au vu de nos résultats précédents. Le test statistique réalisé sera une analyse de variance à trois voies. Dans une optique de réduction, nous allons prélever en fin de procédure l’ensemble des organes qui pourraient nous intéresser (muscle, tissu adipeux par exemple) mais sur lesquels nous n’avons pas prévu de travailler pour le moment et les conserver au congélateur pour d’éventuelles analyses ultérieures. Notre protocole expérimental utilisera des souris issues d’une reproduction chez un fournisseur agrée. Le choix d’utiliser des souris issues d’un fournisseur nous permettra de mieux contrôler certains paramètres liés à l’âge et à la croissance juvénile afin d’assurer une analyse pertinente et un résultat statistiquement significatif.

Raffinement

Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de cette procédure expérimentale, les animaux seront surveillés de manière quotidienne. La croissance en taille et en poids sera mesurée individuellement chaque semaine afin d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. Les animaux seront identifiés par tatouage (au début de la procédure, sous anesthésie légère à l'isoflurane 3%) afin de permettre un suivi individuel de ces paramètres. La prise alimentaire sera également mesurée pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement, et la nourriture sera mise directement dans la litière au début de la procédure expérimentale afin de faciliter l’accès aux souriceaux qui viendront d’être sevrés. Les animaux seront ensuite progressivement habitués à la nourriture en mangeoire en vue de la procédure de calorimétrie indirecte. Afin de limiter le stress lié au transport, une période d’acclimatation est prévue après le transport et avant le début des procédures expérimentales. Pour la procédure de calorimétrie indirecte, pendant laquelle les souris seront isolées pour une période de 72h, les animaux conserveront une partie de leur litière afin de limiter le stress. Lors du test de tolérance à l'insuline, l'état général des animaux sera surveillé et l'expérience sera stoppée s'il vient à se dégrader. De plus, si la glycémie des animaux descend sous un certain seuil au-delà duquel ils risquent une hypoglycémie, ils recevront une injection intrapéritonéale de glucose. A la suite du test de tolérance à l’insuline, l’apparition d’un œdème ou d’un gonflement au point d’injection intrapéritonéale ainsi que la bonne cicatrisation du bout de la queue suite aux prélèvements sanguins seront surveillés quotidiennement et pourront donner lieu à l’application locale d’antispetiques le cas échéant. Des points limites suffisament prédictifs pour pallier à tout stress et toute souffrance animale seront établis. L’atteinte des points limites entraînerait alors la mise à mort des individus concernés. Le protocole du régime expérimental et l’administration de probiotique, ainsi que le prélèvement en veine porte avant mise à mort ont déjà été employés au laboratoire et ne devraient pas apporter de souffrance animale.

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin de comparer l'effet d'un probiotique dans un contexte malnutrition. Les animaux seront suivis à partir du 21ème jour post-natal (âge du sevrage et de l'identification par tatouage de la patte), et pendant les 35 jours de traitement post-sevrage (traitement commencé à jour 21 (P21) en fonction du poids du juvénile (poids non inférieur à 8g) jusqu’à jour 56 (P56). Ce stade est choisi car l'objectif du projet est de connaître les effets d'une malnutrition juvénile sur le métabolisme.

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à un régime hyperlipidique ou contrôle pendant cinq à quinze semaines, à des tests de tolérance au glucose et à l'insuline pouvant provoquer des signes d'hypoglycémie, puis à une échocardiographie avant euthanasie et collecte d'organes. Le projet vise surtout à tester la reproductibilité entre laboratoires européens de données sur le cœur des souris obèses. Le porteur affirme que les systèmes cellulaires ne reproduisent pas les régulations neuro-hormonales et conclut qu'un modèle animal est "indispensable".

Objectifs

Le projet consiste en une analyse de modèles murins avec études histologiques de divers tissus d'intérêt (cœur, rein, foie, tissu adipeux) visant à : 1/ Comparer la reproductibilité entre différents laboratoires européens des données à l'aide d'un protocole standardisé et unique sur des modèles murins de diabète de type 2 induit par l'obésité, et 2/ Mettre en place une biobanque d'échantillons sanguins et tissulaires pour réaliser des analyses multi-omiques

Bénéfices attendus

Ce projet vise à tester la reproductibilité de ces données en comparant dans différents laboratoires en Europe l'impact d'un régime hyperlipidique chez les souris mâles et femelles sauvages sur la structure et la fonction cardiaques, ainsi que l'évaluation métabolique et l'impact sur d'autres organes (foie, rein, tissu adipeux).

Procédures

La moitié des animaux du projet sera soumise à un régime contrôle de 5 semaines ou de 15 semaines. L'autre moitié des animaux sera soumise à un régime hyperlipidique de 5 semaines ou de 15 semaines. A la fin du protocole expérimental, tous les animaux seront soumis à des tests métaboliques (tests de tolérance au glucose et à l'insuline) ainsi qu'à des analyses échocardiographiques, avant euthanasie et collecte de sang et d'organes. Les tests métaboliques seront réalisés une fois au début du régime et une fois à la fin du protocole. Les mesures seront réalisées à différents temps post-injection : t0, 15, 30, 60, 90, 120 minutes pour une durée de quelques secondes chacune. Les échocardiographies seront réalisées une fois à la fin du protocole expérimental (environ 15 min par animal).

Impact sur les animaux

Certains animaux sont susceptibles de présenter des signes cliniques d’hypoglycémie durant les tests métaboliques (ex. inactivité, yeux fermés, posture prostrée, tremblements, froid au toucher) ou encore une glycémie ≤ 3 mmol/l.

Devenir

A la fin du protocole expérimental, les animaux seront euthanasiés afin de procéder à une collecte multi-organes.

Remplacement

Pour ce type de projet visant à étudier l'impact de troubles métaboliques sur le remodelage et la dysfonction cardiaque, l'utilisation de modèles animaux est indispensable. Des modèles cellulaires seront utilisés en complément (cardiomyocytes de rats nouveau-nés, lignée cellulaire H9C2) afin de valider certaines cibles/voies métaboliques. En revanche, ces systèmes simplifiés ne récapitulent pas toutes les régulations neuro-hormonales d'un organisme complet, dont le rôle dans les régulations métaboliques est bien connu. En ce sens, un modèle animal est indispensable.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au maximum en prenant en compte de l’apparition d'altérations et de la mortalité liée au vieillissement des animaux et suite à la mise sous régime HFD selon les données de la littérature. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous réaliserons toute une série de collecte de données sur une même souris (sang, urine, fécès, organes). Avant sacrifice, des méthodes non invasives seront réalisées (tests cognitifs, échocardiographies, mise en cage métabolique) pour obtenir des informations sur plusieurs thématiques et disciplines (cardiaque, métabolique, physiologique, etc.). Après sacrifice, le sang sera prélevé à la veine cave et un grand nombre d’organes seront récupérés. Ce protocole permettra ainsi d’extraire un maximum de données sur le même animal et d’en réduire leur nombre.

Raffinement

Les animaux seront hébergés et pris en charge selon la règlementation en vigueur. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 4 fois par mois. Du coton ou du sopalin sont ajoutés pour leur permettre de faire un nid. Les animaux ont une semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Les conditions d’expérimentations font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Les souris seront au nombre de 5 par cage, et suivies quotidiennement afin d'identifier le plus précocement possible tout signe de souffrance ou de stress : apathie, prostration, perte de poids >20% (les souris seront pesées à leur arrivée puis toutes les semaines), agressivité, difficultés de déplacements. Pour améliorer le quotidien des souris, des matériaux de litière ou des structures de repos adaptés seront installés dans les cages (mouchoirs en papier, rouleaux en cartons, …).

Choix des espèces

Le développement de pathologies est un processus complexe et intégré qui est mieux reproduit dans un modèle animal. Par exemple, la mise en place de pathologies cardiaques fait intervenir des systèmes hormonaux, neuro-hormonaux, des adaptations circulatoires, centrales, métaboliques, etc., si bien que seul un système intégré in vivo permet de reproduire toutes les composantes. En outre, l'obésité étant un facteur de risque connu de dysfonction cardiaque chez l'Homme, il est intéressant de mettre en place des conditions expérimentales (facilement réalisables chez l’animal) pour étudier ces processus chez l’animal. Le modèle "souris" permet d’étudier ce phénomène dans un laps de temps court (quelques mois) et il permet l’utilisation de conditions expérimentales simples à mettre en place (régime HFD) afin d'induire ce processus, permettant des analyses précises. Les souris auront 5 mois au début de l'étude, âge auquel le développement cardiaque est terminé.