Rongeurs

Pendant les quatre semaines du test TouchScreen, des souris mutantes reçoivent une eau acidifiée progressivement jusqu'à un pH de 2,3, et pour un autre test elles sont enfermées environ 45 minutes dans un cylindre, exposées à des sons allant jusqu'à 110 dB. 60 souris issues de trois lignées mutantes et de deux groupes témoins vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort en fin de projet pour des analyses histologiques et moléculaires. Elles subissent aussi l'implantation d'une puce sous la peau, puis, sous anesthésie, une tomographie par cohérence optique et une électromyographie par aiguilles avec stimulation électrique de 8 mA, ainsi qu'un suivi dans l'arène du Live Mouse Tracker. Les mutations étudiées sont celles du syndrome BBSOA, une maladie génétique rare de l'enfant, et le porteur renvoie les pistes thérapeutiques "à long terme". Il écrit avoir défini "des points limites éthiques", sans dire lesquels.

Objectifs

Les troubles neurodéveloppementaux (NDD) sont des maladies complexes et hétérogènes présentant des symptômes associés à un développement anormal du cerveau pouvant entraîner plusieurs déficits comportementaux, tels des troubles de l'attention/hyperactivité, les troubles du spectre autistique, une déficience intellectuelle, l'épilepsie ou encore les troubles d'apprentissage. Les NDD englobent plusieurs dysfonctionnements cérébraux développementaux, qui se manifesteront par des troubles neuropsychiatriques ou une altération de la fonction motrice, de l'apprentissage, du langage ou de la communication non verbale avec une grande variabilité et différents degrés de gravité. Des études récentes ont révélé un rôle essentiel du développement cortical embryonnaire dans la physiopathologie des NDD, mais la génétique et les mécanismes sous-jacents sont encore méconnus. En particulier, un gène joue un rôle crucial dans le développement du cerveau. Des mutations sur ce gène entraine l’apparition du syndrome Bosch-Boonstra-Schaaf optic atrophy (BBSOA), qui est une maladie génétique rare, décrite pour la première fois en 2014. Les patients présentent une multitude de symptômes neuronaux et comportementaux, y compris, un retard développemental, une déficience intellectuelle, un trouble du spectre autistique, un trouble déficitaire de l'attention avec hyperactivité, des convulsions, une déficience visuelle et auditive. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre comment les mutations de ce gène peuvent causer le syndrome BBSOA. Certains des symptômes observés chez les patients BBSOA fournissent déjà des indices importants sur le rôle de ce gène dans le développement du cerveau. En outre, des corrélations entre la génétique et le comportement commencent à être caractérisées chez les patients atteints de BBSOA. Néanmoins il est nécessaire d’étudier de façon approfondie des modèles animaux qui permettront de reproduire les mutations génétiques décrites chez l’Homme. Au cours de ce projet nous caractériserons le comportement de 3 lignées de souris présentant des différentes mutations sur ce gène. Cela nous permettra de mieux comprendre comment les mutations contribuent aux différentes anomalies du développement neurologique chez les patients atteints du syndrome BBSOA.

Bénéfices attendus

Les troubles neurologiques du développement sont des maladies neuro-développementales qui impliquent un dysfonctionnement de l’apprentissage, la mémoire, la perception, le langage, la résolution de problèmes et/ou l’interaction sociale. Ces troubles sont principalement d’origine génétique et se manifestent au cours de la petite enfance. Ce projet de recherche expérimentale se focalise sur un gène dont le rôle clé pendant le développement cortical est bien connu et dont plusieurs mutations conduisent au syndrome appelé BBSOA. Les enfants atteints de cette maladie présentent des déficits cognitifs et comportementaux, des crises d’épilepsie au jeune âge et montrent des retards dans l’apprentissage et dans le langage. La majorité des patients (>80%) diagnostiquée présente des troubles du spectre autistique (TSA). Les études récentes à ce sujet ont permis de mettre en évidence des anomalies cérébrales, notamment dans les régions du cerveau impliquées dans le langage et l’abstraction. Pour approfondir la compréhension de l’impact fonctionnel des mutations de ce gène, le projet global vise à mieux caractériser les mécanismes dans le cerveau qui sous-tendent les déficits cognitifs des enfants malades. En particulier, cette étude comportementale qui sera comparée avec celle clinique permettra d’étudier l’impact fonctionnel des mutations du gène dans le contexte des TSA avec le but à long terme de déboucher sur des pistes thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Implantation sous-cutanée d'une puce sera faite sur les animaux. Elle se fera sous anesthésie et avec une couverture antalgique (durée = 30 minutes) - Injection intra-péritonéale d'anesthésique (durée = 5 secondes) (deux fois)*. -Tomographie par Cohérence Optique (durée = 10 minutes). - Electromyographie permettant la mesure neurophysiologique de la fonction motrice et sensorielle (durée = 10 minutes), insertion d'électrodes à aiguille + stimulation électrique (0,1 ms, 8mA). Les aiguilles sont insérées à travers la peau de l'animal à une profondeur de 1 à 2 mm. - Injection sous-cutanée d'antidote de l'anesthésique (durée = 5 secondes). -Consommation d'eau acidifiée lors du test TouchScreen (4 semaines). - Contention des animaux dans un cylindre fermé lors du test d'altérations des capacités de filtrage de l'information. Dans ce test des sons de 110 dB pour une durée de 40 msec et d'autres plus faibles (65-70-75-85-90 dB ; durant 10 msec) sont présentés à l'animal. Chaque type de stimulus est présenté 10 fois aléatoirement durant le test. Un intervalle de 20 sec sépare 2 stimuli. Avec 11 types de stimuli présentés 10 fois, une session dure environ 45 min.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une implantation d'une puce d'identification par radiofréquence en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse. Lors des périodes d'analyse du test Live Mouse Tracker, ils seront simplement transférés dans une arène de 50 cm de côté qui disposera de sciure, boisson et aliment qu'ils pourront explorer. Lors de la Tomographie par Cohérence Optique et de l'électromyographie ils auront une anesthésie chimique avec une injection intrapéritonéale. Pour le test du Touchscreen, l'eau des biberons des cages d'élevage sera acidifiée pendant les jours de test. . Il y une acidification progressive de l’eau (acide citrique 1,5%) de pH 7 à pH 2,3. Lors de la période précédant le test l’animal subit une habituation au lait fraise (12% de sucre) dans biberon pendant 15 min par jour ainsi qu’une variation du pH de 7 à 3 (semaine 1). Puis lors du test le pH varie de 2,8 à 2,3 (semaines 2 à 4). Pour le test d'altérations des capacités de filtrage de l’information, l’animal est placé dans un cylindre fermé.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet afin de réaliser des analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Cette étude comportementale sera complémentaire d'études in vitro sur des cellules de patients BBSOA porteurs des différentes mutations. Ceci permettra de décrypter les anomalies cellulaires et moléculaires à la base du trouble du développement BBSOA. Néanmoins, la présence d’anomalies comportementales des patients ne pourra pas être reproduite in vitro et nécessite donc l’utilisation d’animaux pour mieux comprendre l’impact/ le lien des mutations sur le phénotype neurodéveloppementale.

Réduction

Dans un souci de réduction, le nombre d'animaux pour chaque expérience sera limité à celui nécessaire à la validation d'un effet significatif. Nous utilisons une stratégie de croisement qui permet d'utiliser tous les animaux générés, et les mêmes animaux seront utilisés dans les différents tests comportementaux. Nos études antérieures nous montrent qu’un nombre minimal de 12 animaux par groupe est nécessaire pour obtenir une réponse significative. Enfin, pour réduire le nombre d’animaux seulement 2 groupes contrôles seront utilisés pour 3 groupes expérimentaux présentant des mutations.

Raffinement

Afin de réduire l'inconfort des animaux, la durée minimale sera appliquée pour chaque test, afin de réduire le stress auquel seront exposés les animaux. Des phases de récupérations entre les différents tests seront prévues. De plus, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et auront un accès illimité à l'eau et à la nourriture. Ils subiront la pose d'une puce sous-cutanée sous anesthésie et avec une couverture antalgique suite à laquelle une attention particulière sera effectuée afin de vérifier la bonne cicatrisation. Nous utiliserons du gel ophtalmique hydratant durant les implantations pour éviter un dessèchement oculaire. Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C), qui permettra un retour progressif de la température corporelle de l'animal. Nous avons défini des points limites éthiques dans le cadre de la procédure expérimentale. Un antiseptique local par spray pourra être administré si besoin. De la même manière lors de l'Electromyographie et de la Tomographie par Cohérence Optique une anesthésie sera faite pour éviter tout stress. Les animaux seront injectés en sous-cutané avec un antagoniste de l'anesthésique après les tests et placés sur une couverture chauffante (37°C) jusqu’à leur réveil. Les animaux seront ensuite replacés dans leur cage d’hébergement et surveillés quotidiennement.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris en raison de ses similarités génétiques avec l'Homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Grâce aux progrès des technologies de manipulation génétique, il est aujourd’hui possible d’introduire des mutations génétiques chez la souris et modéliser donc une maladie génétique humaine chez la souris. Les manipulations génétiques nous permettent de simuler in vivo des altérations de l’expression de gènes ou de la physiologie cellulaire, caractéristiques de pathologies humaines. La génération et l’analyse de ces modèles pourront nous être utiles dans la compréhension des mécanismes à la base de la maladie génétique et au développement de nouvelles thérapies. Les animaux utilisés seront des jeunes adultes et âgés de 6 à 9 semaines. Cet âge a été choisi car le développement du cortex est terminé, mais ce dernier est encore plastique. De plus les systèmes visuels et auditifs sont aussi matures.

960 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, et une partie d'entre elles reçoit un gavage chaque jour pendant un mois, précédé pour certaines de trois semaines de nourriture au tamoxifène et de cinq jours d'injections dans l'abdomen. Les glucocorticoïdes administrés, dexaméthasone pendant trois jours ou prednisone pendant un mois, doivent provoquer une fonte musculaire qui peut atteindre 20 % du poids du muscle, pour étudier le rôle de deux co-régulateurs du récepteur de ces hormones, supprimés dans le muscle d'une partie des souris. Le gavage peut provoquer des fausses routes, les injections des infections, et le porteur écrit : "Nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques." Un test d'agrippement clôt les traitements, et l'espoir de réduire les effets indésirables des corticoïdes chez les patients reste au conditionnel, cette modulation "ouvrirait de nouvelles perspectives thérapeutiques" selon lui.

Objectifs

Les glucocorticoïdes (cortisol chez l'homme et corticostérone chez la souris) sont des hormones exerçant différents effets chez les mammifères. Elles contribuent en particulier au métabolisme, à la réaction immunitaire et à la réponse au stress. En raison de leurs propriétés anti-inflammatoires, les glucocorticoïdes sont des traitements largement prescrits qui ont révolutionné le domaine de la médecine. En effet, les composés comme la prednisone et la dexaméthasone sont couramment utilisés pour traiter les maladies inflammatoires chroniques telles que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques, l'asthme et certaines myopathies. Néanmoins, leur utilisation prolongée peut entrainer d'importants effets secondaires, comme le diabète de type 2, l'ostéoporose ou l’atrophie musculaire. Les effets des glucocorticoïdes sont relayés par le récepteur des glucocorticoïdes appelé GR. Il est communément admis que GR une fois lié à son hormone est convoyé dans le noyau de la cellule, où il se lie à l’ADN pour activer ses gènes cibles. Il effectue cette tache en coopération avec d’autres protéines qui sont appelées des « corégulateurs ». L'objectif de ce projet est d'identifier le rôle de deux de ces corégulateurs dans l'atrophie musculaire dépendante des glucocorticoïdes en utilisant des souris dans lesquelles ils sont sélectivement supprimés dans le muscle squelettique.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ces études nous permettra d'identifier le rôle de deux corégulateurs du récepteur des glucocorticoïdes dans le muscle au cours de l'atrophie musculaire provoquée par les glucocorticoïdes. Contrôler l'activité du récepteur des glucocorticoïdes en modulant celle des co-régulateurs ouvrirait de nouvelles perspectives thérapeutiques pour réduire les effets indésirables causés par les traitements prolongés avec ces hormones.

Procédures

Les animaux pour lesquels la mutation doit être induite (groupe 1 et 2) seront traités au Tamoxifène par le biais d’une nourriture spécifique pendant 3 semaines, puis par voie intra-péritonéale pendant 5 jours (30 sec/ souris). Le groupe 1 qui nous permettra de comprendre le rôle des deux corégulateurs dans l'atrophie musculaire induite par un traitement aigü aux glucocorticoïdes sera injecté une seule fois par jour pendant 3 jours à la dexaméthasone ou avec un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 2 qui nous permettra de comprendre le rôle des deux corégulateurs dans l'atrophie musculaire induite par un traitement prolongé aux glucocorticoïdes sera traité à la prednisone ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Le groupe 3 sera injecté une seule fois par jour pendant 3 jours à la dexaméthasone ou avec un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 4 sera traité à la prednisone ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Un test d'agrippement sera réalisé une seule fois en tripicat sur l'ensemble des cohortes à la fin des traitements (30 sec/ souris) .

Impact sur les animaux

L’injection de tamoxifène et de dexaméthasone peut causer des infections. Le site d'injection sera surveillé chaque jour, et désinfecté si besoin. Le gavage peut conduire à des fausses routes. Les traitements aux glucocorticoïdes peuvent entrainer une fonte musculaire allant jusqu'à une perte de 20% du poids du muscle.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale pour des études moléculaires et histologiques.

Remplacement

Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes synthétiques (Dex et Prednisone) sur l'atrophie musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, même si des myotubes en culture peuvent être utilisés pour modéliser le muscle squelettique et connaitre les effets directs des glucocorticoïdes au niveau moléculaire, ils ne permettent pas de récapituler le microenvironnement musculaire ainsi que les nombreux facteurs et hormones intervenant dans l’homéostasie tissulaire. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant contribuer à ce processus soient pris en compte. A ce titre, la souris est un modèle de référence.

Réduction

De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance du modèle de mutation et de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. Pour réaliser le type d’analyses envisagées, un faible nombre d’animaux est requis par groupe, à savoir 10 animaux par condition. En effet, les études montrent qu’il faut 10 animaux par condition pour détecter la différence escomptée à l’aide d’un test statistique. De plus, pour une même souris une patte sera utilisée pour l'analyse d'expression des gènes et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux.

Raffinement

Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection du tamoxifène et des glucocorticoïdes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés quotidiennement. L’état de chaque souris sera référencé dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité. Par exemple, si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, ces observations seront référencées dans le tableau. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, l'animal sera sorti du lot et une euthanasie sera réalisée. L'injection de dexaméthasone n'est en général pas problématique pour l'animal. Néanmoins, si l'injection est mal effectuée et entraine des souffrances pour l'animal pouvant éventuellement causer sa mort, celui-ci sera euthanasié afin d'éviter toute douleur inutile. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur l'animal vigile. Nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques.

Choix des espèces

Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Le projet s’intéresse au rôle de GR et deux de ses co-régulateur dans l'atrophie musculaire de l’organisme adulte. Les animaux inductibles seront donc traités au tamoxifène entre 5 et 7 semaines d'âge et étudiés dans les semaines suivant l'injection.

200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie créant un défaut osseux dans la boîte crânienne, où sont implantés des biomatériaux, puis des scanners répétés sous anesthésie avant une mise à mort au CO2 pour analyses histologiques. Le projet teste des biomatériaux à base de verre bioactif censés favoriser la réparation osseuse et visibles par imagerie. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour ce modèle de défaut osseux du crâne chez le rat.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de confirmer la biocompatibilité, l’ostéoinduction/conduction et le potentiel de réparation de ces nouveaux biomatériaux in-vivo, et d'établir l’impact de la minéralisation sur les particules à luminescence persistante. Ce projet nous permettra d’établir le temps de survie des particules, mais aussi d’en analyser la potentielle migration.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de développer des biomatériaux qui présenteront des compétences ostéogéniques par la présence de verre bioactif et qui pourront être visualisables directement par imagerie.

Procédures

Procédure chirurgicale : 10 min, tous les animaux. Scanner Haute résolution sous anesthésie Isoflurane (Induction 3%, maintien 1.5%) : 15 min, J0 (200 animaux), J15 (160 animaux), J30 (120 animaux), J60 (80 animaux), J90 (40 animaux). Mise à mort par inhalation progressive au CO2 dans un système dédié : 10 min, tous les animaux, 40 animaux à chaque temps histologiques.

Impact sur les animaux

L'estimation de la souffrance de cette procédure est estimée "modérée" mais brève et bien tolérée. Au sein de cette procédure, seul l'acte chirurgicale peut mener à des suites douloureuses avec la présence d'hématome, oedeme ou désunions des sutures. Le CT-scan et la mise à mort n'ayant pas d'actions iatrogènes douloureuses. Le nombre d'animaux par groupe et par temps (10) est justifié en fonction des effets observés et permet d'envisager une étude adéquate sur le plan statistique.

Devenir

Mise à mort pour analyses histologiques

Remplacement

La régénération osseuse présente une biologie complexe impliquant la participation et l’intéraction de différents types cellulaires. Ces processus complexes ne peuvent être mimés en utilisant uniquement des cultures in vitro ou des modèles informatiques. Ces biomatériaux ont été préalablement étudiés in vitro et in vivo et ne présente aucune toxicité. Le modèle de défaut osseux de calvaria chez le rat est un modèle in vivo classiquement utilisé et il n’existe à ce jour aucune méthode alternative. A terme, ces travaux permettront de mettre au point des matériaux utilisables en clinique pour la réparation de défauts osseux de la sphère cranio-faciale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit par l’utilisation de tests statistiques déterminant la taille minimale des groupes expérimentaux (ici 10 animaux par groupe et par temps dû à l'implantation bilatérale des matériaux). Sur 3 ans un nombre maximum de 200 rats seront utilisés, des études par imagerie longitudinale seront effectuées à différents temps afin de réduire au maximum le nombre d’animaux par temps d’analyse. Tous les matériaux sont préalablement sélectionnés sur leurs propriétés ostéogéniques démontrées in vitro et une veille bibliographique sera systématiquement effectuée pour éviter toute expérience redondante. Si nous n’observons pas de différence entre les groupes à la moitié du nombre requis d’animaux, l’expérience sera arrêtée et les matériaux repensés.

Raffinement

La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment l'utilisation d’anesthésie et d’analgésique adaptée durant les procédures avec une médication anti-douleur systématique en per et également post-opératoire, et l’établissement de points limites adéquats. Une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée. Les conditions d’élevage sont présentes pour le bien-être animal de façon à réduire le stress et l’anxiété dans un environnent enrichi au sein de groupes sociaux de plusieurs individus, avant et après les procédures.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de laboratoire appropriée et classiquement utilisée pour l’étude de l’inflammation et du tissu osseux. Elle permet une faisabilité technique et la biologie du tissu est proche de celle de l’homme. Notre laboratoire possède une expertise sur cette procédure. Les animaux seront âgés de 8 semaines, les animaux étant alors des jeunes adultes. Les adultes jeunes supportant mieux les chirurgies et ayant un potentiel de cicatrisation/régénération plus important. A 8 semaines, ils ont la taille minimale requise pour pouvoir créer chez le rat des défauts critique de 5mm bilatéral dans la calvaria.

1000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules cancéreuses humaines, puis pour une partie d'entre elles une injection intra-tumorale de particules d'oxyde d'hafnium et une à trois expositions aux rayonnements ionisants, la croissance tumorale ne permettant pas de les maintenir en vie dans des conditions confortables. Le projet vise à démontrer l'efficacité antitumorale de ces particules contre les cancers de la tête et du cou, bénéfice pour l'humain formulé au conditionnel. Le porteur affirme que le recours à l'animal est "incontournable" et "nécessaire" pour disposer d'un système immunitaire complet et se conformer aux standards réglementaires.

Objectifs

Notre objectif général est d’étendre les modalités du traitement des sarcomes des tissus mous (STS) par des particules d’oxyde d’hafnium aux cancers de la tête et du cou (Head &Neck abrégé en H & N). Plus précisément, l’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet antitumoral de particules administrées par injection intra-tumorale (IT) unique et activées par les rayonnements ionisants, par comparaison avec la radiothérapie seule, en termes de retard de croissance tumorale et de survie, associés à une très bonne tolérance chez les animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de démontrer l’efficacité d’un traitement par des particules d’oxyde d’hafnium activées par radiothérapie (retard de croissance tumoral, tolérance chez l’animal) sur un modèle de cancer supplémentaire (cancers de la tête et du cou). Plusieurs modèles de lignées cellulaires humaines sont prévus afin de couvrir un panel de situation dans lesquelles les particules d’oxyde d’hafnium activées pourront avoir un bénéfice concernant l’efficacité antitumorale et la tolérance par rapport à la radiothérapie seule : une efficacité tumorale plus forte associée à des effets indésirables plus faibles. Le bénéfice final du projet étant de prouver l’augmentation du temps et de la qualité de vie sur des souris porteuses de tumeur par rapport à un traitement par radiothérapie seul. Ce projet permet alors de mettre en exergue les bénéfices attendus pour un traitement chez l'homme sur des modèles similaires.

Procédures

Geste pratiqué n°1 : Contention manuelle et injection sous-cutanée de cellules cancéreuses sur animal vigile (une dizaine de seconde). Utilisation de lidocaïne localement sur la zone d'injection. Injection unique pour chaque animal. Tous les animaux de cette étude sont concernés par ce geste. Contention manuelle sur animal vigile pour mesure de la croissance tumorale (une dizaine de seconde par mesure) 2 à 3 fois par semaine, pendant une à deux semaines avant le geste pratiqué n°2. Geste pratiqué n°2 : Uniquement sur les souris dont les tumeurs se sont développées (taille environ 100mm3). Anesthésie gazeuse (isoflurane) et utilisation de lidocaïne localement sur la zone d'injection (tumeur). Injection intra-tumorale d'un contrôle (véhicule - glucose) ou de particules d'oxyde d'hafnium (10-15 secondes par injection). Injection unique pour les animaux sélectionnés. D’après les groupes établis, deux tiers des animaux de cette étude sont concernés par ce geste. Geste pratiqué n°3 : Contention de l'animal vigile dans un système de protection adapté (environ 1 minute). Exposition à des radiations ionisantes sur la zone tumorale (le reste de l’animal est protégé dans un système de contention). Chaque animal est exposé une à trois fois (une exposition par jour) selon la lignée cellulaire d’étude. Dans le cas de plusieurs expositions, elles se font sur des jours consécutifs. Chaque exposition dure en moyenne 5 minutes. Un suivi clinique est effectué sur l’animal afin de surveiller sa nutrition et son hydratation. D’après les groupes établis, près de la moitié des animaux de cette étude sont concernées par ce geste.

Impact sur les animaux

Angoisse et douleur peuvent être associées aux injections (injections sous-cutanées de cellules tumorales et injections intra-tumorale de particules d’oxyde d’hafnium). L’injection intra-tumorale de particules peut également entrainer une gêne liée à la pression intratumorale. L’anesthésie effectuée afin de limiter ces nuisances et de permettre les injections peut entrainer des conditions d’hypothermie chez l’animal. Une perte de poids peut être attendue à la suite de l’exposition aux rayonnements ionisants. Cette perte de poids peut être associée à une dégradation de l’état général (prostration, refus de s’alimenter ou de boire). La croissance tumorale peut aboutir à des volumes de tumeur important pouvant être une nuisance pour l’animal. Le risque de nécrose de la tumeur est à prendre en compte également. Enfin, la contention des souris (identification, suivi et mesures des tumeurs) peut également engendrer un stress.

Devenir

Les animaux dont les points limites sont atteints seront euthanasiés. Durant cette étude, les souris sont injectées avec des cellules tumorales et la croissance tumorale ne permet pas un maintien en vie dans des conditions confortables. De plus, des prélèvements et analyses post-mortem impliquent une euthanasie de l'ensemble des animaux.

Remplacement

Le recours à l’animal pour ce projet est incontournable. Les interactions avec un système immunitaire complet est nécessaire pour étudier les effets des particules d’oxyde d’hafnium dans le cancer de la tête et du cou, tout en déterminant et en évaluant les risques à prendre en compte pour un développement en thérapeutique humaine. De plus, le recours à l’animal est actuellement nécessaire pour être en conformité avec les standards internationaux exigés par les instances réglementaires.

Réduction

La première partie du projet permet d'optimiser les conditions d'étude (paramètres d'injection, croissance tumorale, état de la tumeur) avec deux lignées cellulaires de cancer de la tête et du cou actuellement non-renseignées dans la littérature et dans les projets précédents. Si cette première partie du projet ne permet pas d'isoler des conditions d'étude adéquates avec l'une de ces lignées cellulaires, celles-ci ne seront pas inclus dans la seconde partie du projet qui se fera sur 3 lignées cellulaires au lieu de 4, réduisant le nombre total de souris de 25% dans l'étude (passant de 1000 à 720 souris pour cette étude). La robustesse de l'étude en diminuant au maximum le nombre de souris inclus dans ces procédures a été assurée par un calcul de puissance (test statistique). Les résultats de cette étude seront interprétés par des tests statistiques.

Raffinement

Après leur réception à l’animalerie, les animaux ne seront pas utilisés pendant une semaine (période d’acclimatation). Les animaux seront hébergés en groupe de 5 animaux/cage maximum, dans des conditions sanitaires et environnementales contrôlées (nourriture stérilisée et eau disponible à volonté). De l’enrichissement sera prévu : du coton ou des lanières de Kraft (E-Kube) sera mis à disposition dans la cage afin que les souris puissent faire un nid ainsi que des maisons ou qui leur servent d’abri. L’inconfort, la douleur ou l’angoisse ressentie par les animaux seront pris en compte. Une anesthésie locale à la lidocaïne sera pratiquée systématiquement avant un geste pouvant occasionner une angoisse ou de la douleur (injection des cellules tumorales en sous cutané ou injection de particules par voie intratumorale). Une anesthésie gazeuse à l’isoflurane sera mise en place pour l’injection des particules par voie intratumorale afin de faciliter le geste et la rapidité d’exécution, et diminuer le stress et l’inconfort de l’animal. L’anesthésie gazeuse est privilégiée afin d’avoir un réveil rapide (1 à 2 minutes) de l’animal et de s’émanciper des risques d’hypothermie associés à une plus longue anesthésie générale. Néanmoins, l’animal sera placé sur un tapis chauffant afin de s’affranchir totalement de ce risque. La surveillance clinique quotidienne (examen de santé) lors des jours ouvrés permettra de détecter précocement tout signe clinique et de le traiter. Une mesure de l’évolution de la taille de la tumeur et du poids sera réalisée deux à trois fois par semaine. Pour les périodes de week-end, l’état de l’animal et son évolution seront évalués les jours précédents et il sera alors décidé si 1/ les points limites sont atteints ou sur le point de l’être 2/ si aucun risque n’est estimé pour le week-end ou 3/ si le doute nécessite un suivi au cours du week-end. Les points limites seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Dans la recherche en oncologie, le modèle de tumeurs humaines xenogreffées chez la souris nude est le modèle de référence pour l’étude des traitements anti-cancéreux. En ce sens, cette espèce de rongeur a été choisi pour l’évaluation de l’efficacité antitumorale d’oxyde d’hafnium activé par la radiothérapie. Souris de 7 semaines, jeunes adultes. Pour des raisons techniques, le poids des animaux doit être au minimum de 20 grammes afin d’assurer de bonnes conditions de traitement par radiothérapie. Pour les irradiations localisées, les animaux sont disposés dans des systèmes de contention exposant uniquement la zone d’intérêt. Ces systèmes sont adaptés à des souris de taille adulte.

225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une irradiation cérébrale sous anesthésie, des administrations intra-nasales, une perfusion intracardiaque et des prélèvements sanguins, puis passent des tests comportementaux répétés (labyrinthe en Y, labyrinthe en croix surélevé, rotarod) avant d'être euthanasiées pour prélever leurs structures cérébrales. Le projet teste des vésicules extracellulaires censées limiter les troubles cognitifs provoqués par la radiothérapie chez les patients, retombées renvoyées au conditionnel. Le porteur affirme que les modèles in vitro ne permettent d'évaluer ni le réseau vasculaire ni les troubles cognitifs et conclut que le recours à la souris est "indispensable".

Objectifs

La radiothérapie dans le traitement des tumeurs cérébrales peut conduire à la mort de cellules non tumorales comme les cellules constituant les vaisseaux sanguins et les neurones. En effet, chez 50-90% des patients suite au traitement de tumeurs du cerveau par radiothérapie il est observé dans les 6 mois des troubles neurologiques avec des troubles de l’attention, de la mémoire ou de la résolution de problèmes. Il est donc indispensable de proposer de nouveaux traitements afin d’améliorer la qualité de vie des patients. Dans ce projet, nous allons évaluer l’efficacité thérapeutique des vésicules extracellulaires issues de cellules souches mésenchymateuses (CSM) pour limiter les impacts de la radiothérapie. Les CSM sont un type de cellules souches adultes très utilisées en médecine dite régénérative. Elles ont la capacité de se renouveler pour créer des cellules spécialisées capable de réparer la fonction d’un organe. Elles sont prélevées chez une personne à partir de la moelle osseuse ou de la graisse corporelle. Elles sont mises en culture puis administrées à l’homme. Cependant, cette stratégie thérapeutique cellulaire a ses limites telles que la transplantation autologue des CSM (prélèvement et administration chez la même personne). Cette technique limite le nombre de patients pris en charge en raison du temps nécessaire à la mise en culture. On note surtout une efficacité des cellules diminuées en fonction de l’âge et de facteurs de risques associés (hypertension, cholestérol). Les cellules peuvent être aussi inutilisables si elles ont été irradiées lors du traitement par radiothérapie. Des études ont démontré que l’effet thérapeutique des CSM serait majoritairement lié à la sécrétion de vésicules extracellulaires (VE). Elles sont produites en grand nombre par les CSM suite à leur activation par des facteurs stimulants. Une production de VE in vitro permet de s’affranchir des limites liées à l’utilisation des CSM via le patient. Les VE sont stockées et conservées sous forme lyophilisée simplifiant leur administration. Les VE permettent de limiter la destruction des vaisseaux sanguins (qui est observée après exposition aux rayonnements ionisants) et donc pourraient permettre de limiter le développement des troubles cognitifs. Dans le cadre de ce projet, la mesure du flux sanguin cérébral sera réalisée dans un autre établissement possédant expertise et équipement pour le réaliser de façon non invasive.

Bénéfices attendus

Les bénéfices que ce projet apportera sont multiples tel que - une nouvelle thérapie non-invasive - une réduction des troubles cognitifs (troubles de l’attention, de la mémoire ou de la résolution de problèmes) - une amélioration de la qualité de vie

Procédures

Prélèvement sanguin (80 microL) 1 fois sous anesthésie gazeuse isoflurane avant euthanasie, durée du prélèvement sanguin 15 secondes Perfusion intracardiaque sous anesthésique, durée 15 minutes Irradiation cérébrale sous anesthésie gazeuse : 10 min sous anesthésie gazeuse isoflurane Administration intra-nasale sous anesthésie gazeuse : environ 5 min par administration Les animaux subiront plusieurs fois les procédures qui suivent à différents temps. Tests comportementaux réalisés 4 fois (1, 2, 4 et 6 mois): - Labyrinthe en Y : 10 min, - Labyrinthe en croix surélevé : 5 min, réalisé 4 fois (1, 2, 4 et 6 mois) - Rotarod : 3 fois 3 min par séance (1h entre chacun des 3 passages) Analyse échodoppler sous anesthésie gazeuse : 10 min sous légère anesthésie gazeuse Ils seront transportés dans un autre établissement, anesthésiés et rasés entre la base de la nuque et les oreilles avec une tondeuse afin de pouvoir appliquer un gel et la sonde échographique pour évaluer la vasoréactivité cérébrale : mesure de la demande en sang du cerveau. Une diminution de ce flux sanguin nous renseigne sur une diminution du nombre de vaisseau et donc la mise en place des complications aux rayonnements ionisants et le développement des troubles cognitifs.

Impact sur les animaux

Pour les irradiations, les animaux étant anesthésiés pour limiter les mouvements, il peut y avoir un effet des anesthésies répétées et les effets potentiels de l’anesthésie sur les variables physiologiques. Pour les administrations, même si les animaux sont légèrement anesthésiés, il est possible de noter un inconfort transitoire après l’administration. Pour les transports, il peut être noté un stress chez les animaux suite aux changements des conditions environnantes. Après irradiation, un animal peut développer des difficultés à se déplacer et/ou une apparence extérieure piloérection, dos rond ou amaigri Après administration nasale, les effets indésirables peuvent être un écoulement nasal important et/ou une tête penchée, difficultés à se déplacer, amaigrissement

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser les prélèvements des structures cérébrales.

Remplacement

Le nouveau développement de stratégie thérapeutique doit être validé sur des modèles pré-cliniques (modèles animaux). De plus, les modèles in vitro (culture isolée de cellule en boîte de pétri) ne permettent d’évaluer le réseau vasculaire ni les troubles cognitifs. Par conséquent l’utilisation d’un modèle murin est indispensable pour valider notre approche thérapeutique.

Réduction

Les modèles d’expérimentation animal présentent une certaine variabilité de réponse. De plus le retour d’expérience des médecins, chercheurs et biostatisticien déterminent qu’un nombre de 12 ou 15 animaux comptabilisés dans chaque groupe expérimental est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement robustes (Anova, Ttest) afin de valider notre nouvelle thérapie.

Raffinement

Les conditions de soins et d’hébergement des animaux sont adaptées aux procédures réalisées afin de limiter au minimum la souffrance animale (suivi des animaux, anesthésie pour les irradiations, administrations intra-nasales et imageries, hébergement en groupe avec enrichissement).

Choix des espèces

Afin de développer et proposer des thérapies, nous sommes dans l’obligation d’utiliser un modèle in vivo. Le modèle murin sélectionné pour ce travail est le plus pertinent puisqu’il est le plus utilisé dans les études précliniques. Également, nous avons déjà démontré dans différents modèles murins soumis aux rayonnements ionisants l’efficacité thérapeutique des VE-CSM dans les processus de néovascularisation et la réparation tissulaire. Enfin, nous maîtrisons les techniques indispensables afin d’évaluer les paramètres vasculaires, inflammatoires et cognitifs pour démontrer l’efficacité de notre traitement.