Rongeurs
Effets de différents traitements sur les crises fébriles et le développement d’état de mal épileptique chez le jeune animal
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
224 souris juvéniles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des crises fébriles leur sont provoquées sur animal vigile pendant une heure au maximum, avec prise de température par sonde rectale et injection intrapéritonéale, pour tester des traitements antiépileptiques transposables aux enfants de moins de deux ans. Le porteur indique que les nuisances attendues sont des crises myocloniques et convulsives, un stress lié à l'isolement des jeunes animaux et à la sonde, et une douleur liée à l'injection, un état de mal dépassant quinze minutes constituant un point limite. Il affirme que la culture cellulaire ne reproduit pas les crises d'un cerveau entier et que l'étude chez l'enfant ne serait pas éthiquement acceptable.
Objectifs
Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de traitements sur les crises fébriles, un type de crise présente chez les patients Dravet. Le syndrome de Dravet est une épilepsie grave de l’enfant, qui débute avant l’âge d’un an par des crises convulsives, souvent déclenchées par de la fièvre. Ces crises fébriles sont les premières manifestations de cette maladie orpheline et les traitements actuels ne permettent pas de soulager tous les patients. De plus, les crises fébriles reproduisent un état de mal épileptique (status epilepticus) qui touche de nombreux patients. Nous proposons ici de tester des traitements aigus sur un modèle murin de crises fébriles, afin de pouvoir diminuer ces crises précoces, prédisant le développement d’une épilepsie.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d’évaluer l’efficacité de traitements anti-épileptiques sur les crises fébriles, dès le plus jeune âge et ainsi conforter l’utilisation de ces traitements chez les patients de moins de 2 ans. L’inhibition des crises fébriles aidera à contrôler le phénomène d’état de mal épileptique (status epilepticus) et ainsi à limiter ses conséquences délétères sur le développement des patients.
Procédures
Induction de crises fébriles sur animal vigile: protocole d’induction durant au maximum 1h avec prise de température par sonde rectale, tous les animaux : 224 souris Injection i.p. pour la 2ème partie : une seule injection (max 30s), 168 souris. Ces procédures seront effectuées par du personnel expérimenté pour limiter le stress de l’animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : 1) Une survenue de crises myocloniques et convulsives 2) un stress dû à l’isolement des jeunes animaux et à la prise de température par sonde rectale (pendant une heure au maximum) 3) un stress et une douleur dus à l’administration intrapéritonéale.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’effectuer des prélèvements d’organes, pour compléter cette étude.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est justifiée car: (1) Les modifications cérébrales induites par les crises ne peuvent être étudiées chez l’humain de façon éthiquement acceptable. (2) La culture cellulaire ne reproduit pas l’ensemble des propriétés des crises d'épilepsie survenant dans un cerveau entier. (3) La modélisation in silico nécessite des données expérimentales encore manquantes.
Réduction
Nous ferons une planification rigoureuse des expériences, en testant d’abord des animaux de différents âges pour sélectionner l’âge avec le plus de crises fébriles et une latence d’induction la plus faible. Selon le Guidelines for the Design and Statistical Analysis of Experiments Using Laboratory Animals, il nous faut au minimum 10 animaux par groupe. Cependant, les animaux étant livrés avec leur mère, leur nombre peut varier selon les portées. Nous envisageons ainsi d’utiliser au maximum 14 souris par groupe (et au minimum 10) pour utiliser tous les animaux d’une portée. Ainsi, avec 3 mères gestantes, nous attendons d’avoir entre 10 et 14 petits à utiliser.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages ventilées (une mère et sa portée par cage), enrichies avec du sizzle dry. La température et l’hygrométrie sont contrôlés. Le cycle jour nuit est de 12h, changeant à 7h et 19h. Lors de l’induction de crises fébriles, les animaux seront observés de façon continue afin de caractériser ces crises et définir l’apparition d’un état de mal épileptique (status epilepticus). Si cet état de mal dure plus de 15 minutes, cela constituera un point limite. Les administrations i.p. seront effectuées sur des animaux vigiles par du personnel expérimenté.
Choix des espèces
L’espèce que nous avons choisie (souris) est le modèle animal décrit dans la littérature comme reproduisant au mieux l'épilepsie induite par la fièvre. Les rongeurs ont un cerveau suffisamment élaboré pour générer des activités épileptiques dont les mécanismes pathologiques aux niveaux cellulaire et moléculaire sont similaires à l'humain. Les crises fébriles apparaissent chez les nouveaux nés humains, ainsi nous utiliserons des souris juvéniles entre P8 et P20 (stade de développement correspondant à la période péri-natale chez l’humain): dans un premier temps pour définir l’âge optimal pour la survie de crises fébriles; puis à cet âge optimal, afin de tester des traitements dans le but de réduire ou éliminer le nombre de crises. La souris C57Bl6 présente des crises fébriles à partir de P8 jusqu’à P20, ce qui justifie son emploi.
Etudes précliniques non-réglementaires de candidats médicaments combinés ou non à des nanotechnologies après administrations intraveineuses, intracérébrales ou sous-cutanées chez des souris adultes saines ou porteuses de glioblastome.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
4 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une implantation de tumeur cérébrale par stéréotaxie, un suivi par IRM répété, des injections intraveineuses, sous-cutanées ou intracérébrales sur plusieurs cycles et des gavages, pour tester un peptide et des nanotechnologies portés par une société de biotechnologies. Le porteur décrit des effets possibles d'hyperpression intracrânienne, d'œdème et de perte de poids, et justifie l'effectif élevé par les 17 procédures prévues. Il qualifie le passage par un modèle animal d'"indispensable" et conclut que le glioblastome ne peut être reproduit in vitro, les bénéfices pour les patients restant conditionnés à des étapes réglementaires ultérieures.
Objectifs
Le glioblastome (GBM) est le cancer cérébral le plus fréquent et le plus agressif, avec 200 000 décès par an dans le monde, une survie médiane de 14 mois et aucun traitement curatif. Le traitement actuel consiste en une extraction chirurgicale de la tumeur suivie par le protocole de Stupp (radiothérapie et chimiothérapie avec le témozolomide). Des travaux ont montré l’activité anticancéreuse du peptide NFL sur des cellules de GBM (rats, souris, humain) cultivées en laboratoire et sur des rats porteurs d'un GBM (après une simple administration directement dans la tumeur). Ce peptide tue également les cellules responsables de l'apparition du GBM. De plus, lorsque le peptide se trouve à la surface de nanotechnologies, ce peptide augmente leur entrée dans des cellules de GBM de souris comparativement aux nanotechnologies seules. Chez l'animal (souris), une seule injection des nanotechnologies couplées au peptide et chargées en un anticancéreux, directement dans la tumeur, diminue de manière plus efficace le volume de la tumeur comparativement aux nanotechnologies chargées en anticancéreux mais sans peptide à leur surface. Une société de biotechnologies en santé travaille sur les formulations de ce peptide seul et combiné à des nanotechnologies pour en faire de futurs candidats-médicaments pour le traitement du GBM. Leur développement pharmaceutique a permis de les formuler pour une utilisation clinique. Le but de ce projet de recherche pré-clinique non réglementaire est d’étudier la tolérance et l’efficacité de ce peptide seul ou combiné à des nanotechnologies après administrations chez des souris saines ou porteuses de GBM humain en déterminant la voie d’administration la plus adaptée afin de développer un traitement contre le GBM et prévenir les rechutes chez les patients.
Bénéfices attendus
La société de biotechnologies en santé qui travaille sur les formulations du peptide NFL seul et combiné à des nanotechnologies visent à en faire de futurs candidats-médicaments dans le traitement du GBM. Ces travaux avancés de recherche pré-clinique non réglementaire ont pour but de valider l’innocuité des traitements et leur efficacité et ainsi, confirmer leur intérêt thérapeutique. Si l’intérêt thérapeutique est attesté et la posologie déterminée, ces travaux pourront servir de base pour la mise en place d’essais pré-cliniques règlementaires avant la mise en place d’essais cliniques chez l'Homme. Le but de ce projet est de développer un traitement contre le GBM et prévenir les rechutes chez les patients opérables ou non.
Procédures
Dans la mise au point du modèle, les animaux subiront 3 types d'intervention : l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure plusieurs minutes, le suivi de la croissante tumorale par IRM (4 IRM de suivi qui dureront environ une heure chacune et qui seront espacées de plusieurs jours) et une injection intraveineuse. Dans l'étude de toxicité, les animaux subiront un type d'intervention : des injections intraveineuses ou sous-cutanées (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours suivies de 2 jours de repos, sur 5 cycles) ou une injection intracérébrale. Dans l’étude de biodistribution et pharmacocinétique tissulaire, les animaux subiront jusqu'à 5 types d’intervention : l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure plusieurs minutes, le suivi de la croissante tumorale par IRM (3 IRM de suivi qui dureront environ une heure chacune et qui seront espacées de plusieurs jours), des injections intraveineuses ou sous-cutanées sur une période de 5 semaines (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours suivies de 2 jours de repos, sur 5 cycles) ou une injection intracérébrale qui durera plusieurs minutes et une perfusion cardiaque. Dans l’étude de pharmacocinétique, les animaux subiront deux types d’intervention, une injection unique intraveineuse ou sous-cutanée ou intracérébrale qui durera plusieurs minutes et des prélèvements répétés de sang au niveau de la veine caudal, de la veine jugulaire ou du sinus retro-orbital (3 prélèvements maximum, qui dureront quelques minutes chacun et qui seront espacés de plusieurs minutes à plusieurs heures). Dans l’étude d'efficacité, les animaux subiront quatre types d’intervention : l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure plusieurs minutes, le suivi de la croissante tumorale par IRM (1 à 6 IRM de suivi qui dureront environ une heure chacune et qui seront espacées de plusieurs jours), des injections intraveineuses ou sous-cutanées (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours) ou une injection intracérébrale qui durera plusieurs minutes et des gavages répétés (1 gavage par jour pendant 5 jours suivi de 2 jours de repos, sur 5 cycles maximum).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables des candidats médicaments seront évalués lors de chaque phase du projet. Les nanotechnologies pouvant être chargés d’anticancéreux (paclitaxel, etc.), des effets indésirables communément retrouvés après injection de ce type de composé pourraient être observés (modification de la formulation sanguine, perte de poids, faiblesse, etc.). Les effets indésirables peuvent être également liés à l’acte chirurgical et la croissance tumorale (hyperpression intracrânienne, oedème, etc.) ainsi qu’à l’injection des traitements (rougeur, inflammation, etc.).
Devenir
A l’issue de toutes les procédures, les animaux seront tous mis à mort pour prélèvements de sang et/ou d’organes.
Remplacement
L’utilisation des candidats médicaments étant à visée humaine, dans le domaine de la neuro-oncologie, il est nécessaire de réaliser des études précliniques pharmacologiques non-réglementaires, comme ici des études toxicologiques et d’efficacité pour démontrer et valider sans aucune ambiguïté leur innocuité et efficacité avant les études précliniques réglementaires et les essais cliniques chez l’Homme. Des travaux menés sur des cultures de cellules tumorales et saines ont déjà été réalisées ou sont en cours pour valider les molécules et formulations testées. Pour compléter l’étude, il est indispensable de passer sur un modèle animal mimant les conditions de développement du GBM humain avant de pouvoir tester les molécules sur des patients atteints de ce cancer. Le développement de ce type de modèle (modèle CDX) dans ce projet ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur s'accompagne de modifications physiopathologiques dans un microenvironnement particulier, notamment dans le cas du glioblastome, ne pouvant actuellement pas être reproduites in vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux.
Réduction
L'étude de toxicité permettra de raffiner la dose administrée, et ainsi de réduire le nombre de lot d’animaux à tester dans les études suivantes (études 2, 3 et 4). Une seule dose à la fois sera testée. Ainsi, si la plus haute dose n’est pas toxique, les doses plus basses ne seront pas systématiquement testées. Le nombre de souris immunodéprimées pourra également être réduit au strict minimum en fonction des résultats obtenus chez les souris immunocompétentes. Pour finir, lors de l’étude d’efficacité, seuls les traitements ayant montré la meilleure biodistribution et pharmacocinétique tissulaires seront testés pour réduire le nombre d’animaux. Enfin, ce traitement étant destiné aux hommes et aux femmes, ces études seront d'abord effectuées sur un premier sexe, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux pour le deuxième sexe. Ce nombre n'est pas inclu dans cette saisine mais est estimé à 1526 comparativement à 4640 pour le premier sexe. Le nombre d’animaux choisi par groupe est suffisant pour garantir des données précises, représentatives de l’espèce, et statistiquement exploitables. Il n’est pas utile d’avoir plus d’animaux, mais il est préférable de ne pas en utiliser moins, au risque d’être confronté à des variations entre des animaux d’un même groupe. L’effectif des souris utilisées (4640) est très important, toutefois il est justifié par le nombre de procédures (17) dont la logique de déroulement est clairement établie. Si certaines de ces procédures étaient un échec complet (peu probable et non souhaitable), cela pourrait entraîner un arrêt du projet tel qu’il est établi aujourd’hui et diminuerait le nombre de vies animales utilisées, afin d’éviter de recourir inutilement à des vies animales.
Raffinement
La douleur et l’angoisse de chaque animal seront évaluées par un suivi quotidien. Afin d’évaluer de façon raffiner la souffrance/douleur des animaux tout au long de l’expérimentation, un système de score sera mis en place pour chaque animal et pour chaque paramètre contrôlé. Dans le cas où un animal présenterait un ou des signes de souffrance, un médicament contre la douleur serait administrée jusqu’à ce que ces signes disparaissent. L'atteinte d'un des points limites par un animal impliquera sa mise à mort. Plusieurs personnes seront impliquées dans ce suivi, mais la décision finale sera prise dans les 24h par le porteur de projet. Au fur et à mesure des études précédentes, nous avons pu affiner cette grille et la prise en compte de la douleur animale.
Choix des espèces
Des recherches bibliographiques montrent que la souris est l'espèce la plus utilisée et adaptée pour l’implantation de cellules de GBM, qu’elles soient issues de lignées immortalisés ou de patients. Il s'agit de l'espèce la mieux décrite dans la littérature. Les souris seront utilisées entre 6 et 8 semaines d’âge. Cet âge est majoritairement retrouvé dans les études bibliographiques in vivo sur modèle orthotopique de GBM chez la souris.
Maintien et suivi d’une lignée murine avec phénotype dommageable (lignée P301S-PS19, modèle de maladie d’Alzheimer)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
275 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 92 tuées à l'issue et 183 réorientées vers d'autres projets. Cette lignée transgénique développe vers 7-8 mois des lésions cérébrales entraînant faiblesse musculaire, paralysie partielle des membres postérieurs et amaigrissement, que le projet se limite à surveiller par pesée et observation hebdomadaires. Le porteur présente ce suivi comme un progrès de "bien-être animal", alors que la souffrance provient du phénotype dommageable entretenu par l'élevage de la lignée. Il affirme que l'étude de la maladie d'Alzheimer "nécessite" ces souris et qu'aucune alternative non animale ne peut les remplacer.
Objectifs
Le présent projet a pour but de mettre en place une stratégie pour la production et l’élevage, dans le respect strict du bien-être animal, de souris nécessaires à des travaux expérimentaux sur la maladie d’Alzheimer (MA). Ces souris transgéniques miment les lésions cérébrales de la MA et seront utilisées dans différents projets de recherche qui ont été examinés par les comités d’éthique pour l’expérimentation animale et qui sont déjà validés par les instances du ministère de l’enseignement supérieur, de la recherche et de l’innovation (MESRI). Les souris utilisées développent au cours du vieillissement des symptômes neurologiques invalidants nécessitant un suivi rapproché et constituant l’objectif de ce projet.
Bénéfices attendus
Le projet concerne le maintien dans notre animalerie d’une lignée murine modèle de MA. Ce modèle reproduit de façon unique les dégénérescences de la MA. L’implantation de la lignée sur site permettra aux équipes de chercheurs de mieux comprendre les mécanismes de la MA et de développer des thérapies innovantes pour cette affection. Le présent projet a pour unique but d’assurer les meilleures conditions d’élevage et de préservation des souris produites, dans le strict respect des règles du bien-être animal. On veillera en particulier à détecter de façon précoce l’apparition de symptômes neurologiques (problème moteurs) et à mettre en place des procédures pour limiter le caractère dommageable de ces manifestations cliniques.
Procédures
Le suivi des animaux implique des gestes zootechniques mineurs (toutes les semaines, à partir de l’âge de 6 mois : observation de l’état général, prise de poids). Aucune intervention invasive ne sera réalisée au cours de ces visites de suivi.
Impact sur les animaux
Les souris étudiées peuvent développer vers l’âge de 7-8 mois (parfois plus tôt) des lésions cérébrales entraînant une faiblesse musculaire et parfois une paralysie partielle des membres postérieurs. Ce tableau clinique s’accompagne d’un amaigrissement lié aux difficultés d’accès à la nourriture et à la boisson. La procédure expérimentale associée à ce projet consiste en un suivi rapproché de la colonie de souris afin de minimiser l’apparition des signes cliniques et, le cas échéant, d’appliquer une réponse adaptée lorsque que les symptômes sont détectés.
Devenir
Les animaux de 6 mois et plus qui feront l’objet de la procédure de suivi de lignée et qui n’atteindront pas les points limites, seront réutilisés. Ils seront alloués à 3 projets expérimentaux en cours et validés par le ministère, ou utilisés en procédure hors champ (prélèvement d’organe).
Remplacement
L’étude préclinique, fondamentale ou appliquée de la maladie d’Alzheimer, nécessite le recours aux modèles animaux, seuls à même de reproduire le contexte physiologique de cette pathologie neurodégénérative complexe. Il n’est donc pas possible de substituer aux souris transgéniques une alternative non-animale.
Réduction
Le nombre d’animaux produits et maintenus sur site est réduit au maximum. La taille des groupes d’animaux produits pour les études expérimentales est définie en fonction de nos expériences antérieures et des données de la littérature afin de permettre de générer des données reproductibles et donc solides. Les lots produits tiennent compte de la variabilité de la lignée (par exemple la densité des lésions cérébrales peut varier d’un animal à l’autre) et des mesures biologiques effectuées (par exemple les performances comportementales des souris dans des tests de mémoire peuvent montrer un degré important d’hétérogénéité d’un animal à l’autre). Ce projet de suivi de lignée concernera 275 souris.
Raffinement
L'animalerie où sont hébergés les animaux est agréée, avec des conditions de température et d'hygrométrie contrôlées, un abreuvage automatique et de la nourriture à volonté. Les animaux sont hébergés par groupes de 4-5 souris et bénéficient également d’un enrichissement matériel (coton ou kraft pour faire un nid, maisons en cellulose). Le maintien de la lignée de souris s’articulera sur un ensemble d’actions : surveillance accrue des animaux âgés afin de détecter le plus précocement possible l’apparition de troubles neurologiques invalidants, mise en place de mesures pour limiter l’impact des symptômes moteurs et faciliter l’alimentation des animaux, euthanasie des souris dès l’atteinte de points limites. La mise en place du présent projet de maintien de lignée renforcera le bien-être animal et constitue donc une étape supplémentaire dans l’application et le respect du principe de Raffinement.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris transgéniques qui surexpriment une mutation et développent des lésions cérébrales similaires à celles des patients atteints de maladie d’Alzheimer. Il n’existe pas à notre connaissance de modèles autres que ces souris transgéniques permettant d’atteindre les objectifs des différents projets nécessitant la mise en place d’une procédure de suivi de lignée globale (objectif du présent projet). Le présent projet sera réalisé sur des animaux adultes.
Exploration de l’implication des récepteurs cholinergiques dans les processus nociceptifs associés aux neuropathies périphériques chimio-induites – Explorations biologiques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'anticancéreux (oxaliplatine, paclitaxel, bortézomib, vincristine) pour induire une neuropathie douloureuse, puis subissent chaque semaine des tests comportementaux de douleur (test du von Frey électronique, test d'immersion de la patte), avant un prélèvement terminal du système nerveux. Le porteur reconnaît que l'induction de la neuropathie est une nuisance qu'il qualifie d'"indispensable", et que les anticancéreux réduisent le gain de poids des animaux. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne remplace encore l'animal vivant pour explorer la douleur, la retombée pour les patients restant renvoyée au conditionnel.
Objectifs
La neuropathie périphérique chimio-induite (CIPN) est un effet indésirable classique et dose limitant des anticancéreux neurotoxiques (sels de platine, taxanes, vinca alcaloïdes, bortézomib), qui altère profondément la qualité de vie des patients et dont la prise en charge thérapeutique reste très limité. Aucun traitement préventif ne peut être recommandé et seule la duloxétine est modérément recommandée sur les douleurs associées. En conséquence, les oncologues sont fréquemment contraints de diminuer voire d’arrêter les anticancéreux neurotoxiques lors de l’apparition des premiers symptômes de CIPN. Des travaux récents au sein de notre équipe de recherche ont démontré l’efficacité analgésique du donépézil sur des modèles animaux de CIPN. L’effet analgésique du donépézil (inhibiteur de cholinestérase) implique l’activation des récepteurs muscariniques M2 (m2AChRs) au niveau spinal. Cependant, l’action anticholinestérasique du donépézil pourrait être responsable de l’activation d’autres récepteurs cholinergiques et le mécanisme analgésique des m2AChRs n’est pas totalement connu (à priori inhibition des cellules excitatrices et pronociceptives glutamatergiques). Ainsi, l’objectif de ce projet sera d’évaluer l’implication du système cholinergique (m2AChRs) au niveau spinal et du système nerveux périphérique (ganglions spinaux - DRG) dans des modèles animaux de CIPN : mesure de l’expression génique et de la localisation des récepteurs cholinergiques au niveau spinal et des DRG, et exploration de l’effet analgésique d’agonistes spécifiques des m2AChRs.
Bénéfices attendus
Ce projet propose d’étudier de nouvelles cibles thérapeutiques des CIPN. Rappelons qu’à ce jour la prise en charge des CIPN est très limitée (aucun traitement préventif et seule la duloxétine modérément recommandée sur les douleurs). Nos précédents travaux ont démontré l’intérêt analgésiques du donépézil sur ces modèles animaux de CIPN, et ont permis la mise en place d’une étude clinique évaluant l’effet analgésique du donépézil chez des patients souffrant de neuropathie induite par l’oxaliplatine. Le projet proposé vise à préciser l’implication des m2AChRs comme nouvelle cible thérapeutique, et dont l’objectif à terme sera de développer des agonistes de ces m2AChRs pour le traitement des CIPN, et qui pourront être testé chez l’homme à moyen terme.
Procédures
Tous les animaux recevront des injections d'anticancéreux ou du véhicule. Le nombre d’injection et leur voie d’administration sera fonction du modèle animal : - Oxaliplatine : 2 injections par semaine (lundi et vendredi) pendant 4 semaines, voie intraveineuse, durée injection de 20 secondes (max) - Paclitaxel : 4 injections (J0, J2, J4, et J7), voie intrapéritonéale, durée injection de 10 secondes (max) - Bortézomib : 5 injections (J0, J1, J3, J4 et J7), voie intrapéritonéale, durée injection de 10 secondes (max) - Vincristine : 5 Injections (J0, J2, J4, J7 et J9), voie intraveineuse, durée injection de 20 secondes (max) Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaire et jusqu’à une semaine après la fin des injections : - Test du von Frey électronique : durée du test pour un animal de 60 minutes (max). Le test en lui-même est beaucoup plus court, mais cette durée correspond à la durée maximale de mobilisation d’un animal (stabulation dans des portoirs (box) individuel pour 24 rats) - Test d’immersion de la patte : durée du test pour un animal 5 minutes (max)
Impact sur les animaux
L’induction de la CIPN chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. La CIPN sera associée à des désordres nociceptifs qui seront évalués dans le cadre du projet (allodynie tactile et thermique). Les administrations répétées d’anticancéreux seront responsables d’une diminution du gain de poids des animaux. A noter que le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux (dose en mg/kg), et permettra de contrôler la tolérance des animaux au traitement anticancéreux. A noter que ce type d’étude ayant recours à des tests comportementaux nécessitent un bon état général des animaux.
Devenir
L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue des expérimentations, après une sédation profonde et rapide. Car l’objectif sera, in fine, de prélever des échantillons tissulaires du système nerveux central et périphérique afin d’étudier des anomalies d’expression des récepteurs à l’acétylcholine dans une perspective thérapeutique.
Remplacement
Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Des travaux sont en cours sur cellules souches humaines de neurones. Mais pour le moment ces modèles in vitro ne permettent pas encore d'appréhender la complexicité de la physiopathologie des CIPN, qui n'est elle même pas encore élucidée. Enfin, s'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer et évaluer de nouvelles stratégies pharmacologiques et par le biais de tests comportementaux.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au maximum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux. Mais le plus souvent, nosu devons fractionner les études en nombre d'animaux plus petits et avec une approche par bloc de traitement. Cette méthodologie peut permettre de réduire les effectifs d'animaux si par exemple avec n=6 ou 8, les résultats attendus sont significatifs.
Raffinement
Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont eux aussi bien maitrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles nociceptifs seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant les seuils d’allodynie tactile ou thermique (stimulus non douloureux perçu comme douloureux), plutôt que des seuils d’hyperalgésie (stimulus douloureux). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire.
Choix des espèces
Le rat Sprague-Dawley est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les CIPN. D’autres travaux de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche (Ferrier et al. J Neurosci 2015 ; Selvy et al. Biomed Pharmacother. 2022), ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures. Enfin, le rat Sprague-Dawley possède une activité et un comportement tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de test comportementaux. Les animaux auront 5 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 6 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6 semaines est communément choisi pour ce type de projet. A noter que des animaux plus âgés (voire « âgés ») pourraient être pertinents car mieux corrélés à la clinique humaine (cancer = maladie du sénior), mais ces animaux âgés ont un coût important et sont rarement utilisés dans la littérature scientifique.
Validation de nouveaux modèles de tumeur du tronc cérébral chez l’enfant
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont implantées dans le tronc cérébral, l'injection étant réalisée au deuxième jour après la naissance, pour valider des modèles de tumeur pédiatrique aujourd'hui incurable. Le porteur ne décrit qu'"un stress physique léger" lié à la manipulation avant anesthésie, et prévoit la mise à mort de tous les animaux pour prélever leurs cerveaux. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reconstitue la complexité tumorale in vivo et juge cette souche de souris "impossible" à remplacer.
Objectifs
Avec un taux de survie proche de zéro, les tumeurs du tronc cérébral ou DIPG sont les cancers les plus mortels chez l’enfant. L’étude de cette tumeur, toujours fatale en 2022, nécessite la validation de nouveaux modèles tumoraux et l’analyse des mécanismes responsables de son apparition.
Bénéfices attendus
Démontrer qu’une ou plusieurs des trois nouvelles lignées de tumeur du tronc cérébral forment des tumeurs chez la souris et que ces lignées constituent de bons modèles pour étudier le développement de la tumeur et ultérieurement, pour tester des médicaments.
Procédures
Implantation de cellules tumorales en intracrânien dans le tronc cérébral.
Impact sur les animaux
Les nuisances prévues pour les animaux sont un stress physique léger dû à la manipulation de la cage et des animaux avant anesthésie générale.
Devenir
Les 90 souris de ce projet seront euthanasiées afin de procéder au prélèvement des cerveaux et leur analyse pas des approches moléculaires et histologiques.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris (souris immunodéficience). Sources bibliographiques consultées (PubMed, CEVMA). Les conclusions recherchées ne peuvent pas encore être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiment stromales et tumorales en action in vivo chez la souris. Malgré tout, ces modèles pourraient ouvrir la voie au développement ultérieur de nouvelles approches ex vivo, notamment à l’aide d’organoïdes.
Réduction
Les effectifs des animaux utilisés sont déterminés et nos résultats sont analysés selon des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, de la douleur et/ou de l’angoisse infligées aux animaux, les souris seront hébergées et suivies quotidiennement par du personnel qualifié pour détecter d’éventuels signes cliniques ou de mal-être. Les animaux sont hébergés en cages à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées aux animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Le score limite est de 12. Au-delà, l’animal sera euthanasié sans attendre. Les critères prépondérants ainsi que les mesures conservatoires en fonction du score de cette grille sont détaillés dans les procédures. En ce qui concerne la manipulation des souris, celle-ci se fera en conditions stériles, sur tapis chauffant et sur des animaux sous anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
1. La souche de souris est appliquée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. La capacité d’extrapoler les résultats. 3. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. 4. L’existence des équipements nécessaires à l’étude. 5. La pertinence des installations d’hébergement. Pour le modèle intracrânien de gliome, l’injection de cellules dans les souris sera réalisée au deuxième jour après la naissance. À cet âge, une injection intracérébrale est faisable sans procédures chirurgicales, ce qui réduit considérablement la souffrance animale et la manipulation. Il est aussi important que le cerveau soit à un stade de développement précoce pour être proche du microenvironnement présent chez les enfants atteints de gliomes du tronc cérébral.
Utilisation d’ARN interférants pour inhiber le facteur Willebrand in vivo
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection d'ARN interférents puis, sous anesthésie, un test de saignement consistant à couper les trois derniers millimètres de la queue, ou un test de thrombose par extériorisation des vaisseaux intestinaux pendant une heure. Le porteur indique que ces tests ne sont pas compatibles avec un réveil et que la perte de sang serait trop importante pour une réutilisation. Il affirme que les tests sans animaux ne reproduisent pas "l'intégralité" du processus de coagulation.
Objectifs
La maladie hémorragique génétique la plus fréquente est la maladie de Willebrand qui affecte jusqu’à 1% de la population dans sa forme modérée. Cette pathologie est causée par des mutations sur le gène qui produit le facteur Willebrand, une protéine impliquée dans la coagulation sanguine. La maladie de Willebrand est très hétérogène et est divisée en plusieurs types et sous-types. Le sous-type 2B par exemple est caractérisé par la présence d’un facteur Willebrand anormal. Même si les mutations responsables de la maladie de Willebrand 2B ne sont présentes que sur une des copies du gène du facteur Willebrand (chaque gène est en double chez tous les individus, un qui vient de la mère et un qui vient du père), la protéine anormale va aller empêcher la protéine normale de faire son travail. Si trop peu de facteur Willebrand ou un facteur Willebrand anormal conduit à des hémorragies, à l’inverse, une quantité trop importante de facteur Willebrand entraîne un risque de thrombose ou survenue de caillots sanguins dans les vaisseaux. Dans les deux cas, il serait donc très utile de pouvoir inhiber la production de facteur Willebrand à partir d’une des deux copies du gène : soit pour empêcher la protéine anormale d’être produite (dans le premier cas), soit pour diminuer la quantité totale de facteur Willebrand (dans le deuxième cas). La difficulté est d’aller cibler spécifiquement une des deux copies du gène sans affecter l’autre. C’est donc le but de ce projet qui va consister à utiliser des inhibiteurs de la production du facteur Willebrand à partir d’une seule copie du gène. Pour cela le croisement de souris de deux souches génétiques différentes va permettre d’obtenir des souris avec deux gènes légèrement différents (reproduisant la situation humaine où les gènes reçus de ses deux parents sont différents) et ce sont ces petites différences qui vont être exploitées pour développer des inhibiteurs spécifiques d’une des copies du gène et non pas des inhibiteurs qui aboliraient totalement la production de facteur Willebrand.
Bénéfices attendus
A court-terme, les résultats de cette étude permettront 1) de montrer qu’il est possible de cibler une copie d’un gène directement chez un animal, ce qui important d’un point de vue preuve de concept bien au-delà de la maladie de Willebrand et 2) de déterminer si l’inhibition du gène anormal corrige les symptômes hémorragiques dans la maladie de Willebrand 2B. A long terme, le projet contribuera à renforcer l’idée de cibler le facteur Willebrand anormal dans la maladie de Willebrand dans le cadre d’une médecine personnalisée et éventuellement de réduire les quantités de facteur Willebrand chez les patients à fort risque de thrombose.
Procédures
Les souris seront soumises à une procédure impliquant plusieurs gestes sur une période de 4 jours maximum. Les souris recevront une injection intraveineuse unique pour leur administrer les inhibiteurs de la production du facteur Willebrand. Quatre jours après cette injection, les souris seront anesthésiées et tout le reste de la procédure se déroulera pendant cette anesthésie. Pour toutes les souris, une prise de sang sera alors effectuée afin de mesurer divers paramètres biologiques. A la suite de la prise de sang un groupe de souris sera soumis à un test de saignement. Ce test consiste à couper les 3 derniers millimètres de la queue de la souris et à mesurer la quantité de sang perdu en 10 minutes. Pour un autre groupe de souris, nous évaluerons leur capacité à développer des thromboses dans les vaisseaux intestinaux à l’aide d’un microscope. Ceci impliquera l’injection intra-veineuse d’un marqueur fluorescent sur les souris anesthésiées puis le test de thrombose sur une durée de 60 minutes, le tout sous anesthésie. Au terme des 10 minutes (pour le test de saignement) ou des 60 minutes (pour le test de thrombose), l’animal toujours sous anesthésie sera euthanasié par les méthodes réglementaires.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent expérimenter une légère douleur transitoire pendant et après l’injection intra-veineuse qui a lieu 4 jours avant les tests. La seconde partie de la procédure se fait entièrement sous anesthésie/analgésie chimique et sera sans réveil.
Devenir
En fin de procédure, tous les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Les tests de thrombose impliquent d’extérioriser des vaisseaux intestinaux ce qui n’est pas compatible avec un réveil éventuel. Pour le test de saignement, les souris peuvent perdre beaucoup de sang, ce qui provoquerait un impact trop important sur une ré-utilisation potentielle.
Remplacement
Le système de la coagulation est complexe, faisant intervenir de nombreux acteurs, que ce soit les cellules sanguines, les protéines qui circulent dans le sang mais aussi la paroi des vaisseaux sanguins. Actuellement les tests disponibles qui ne font pas appel aux animaux, même s’ils se sont beaucoup améliorés depuis quelques années, ne permettent pas de reproduire l’intégralité de ce processus.
Réduction
Afin de déterminer le nombre d’animaux approprié pour le projet, nous avons réalisé une analyse de puissance. Les hypothèses sous-jacentes à nos calculs sont basées sur la littérature existante et sur notre expérience des modèles expérimentaux et de la variabilité qui leur est associée. La mise au point et le développement des inhibiteurs a été conduit dans des modèles cellulaires afin qu’un seul d’entre eux soit testé sur des animaux. D’autre part, s’il s’avère après les premiers essais que le nombre d’animaux par groupe peut être réduit, nous adapterons les groupes suivants.
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes d’anesthésie. L’ensemble des expériences seront effectuées par une personne habilitée à expérimenter sur animaux et la procédure aura lieu principalement sous anesthésie et sans réveil. Au cours de ce projet, les opportunités de raffinement seront régulièrement ré-évaluées pour nous assurer de la mise en place rapide de tout nouveau développement technique qui interviendrait pendant la période du projet. D'autre part, nous appliquerons de manière stricte les points limites définis spécifiquement pour le projet.
Choix des espèces
Ce projet fait appel à un modèle murin déjà développé qui reproduit le pathologie étudiée (maladie de Willebrand 2B). Ce modèle a d’ores et déjà montré sa pertinence en tant que modèle de la pathologie humaine. Pour ce qui concerne les tests de saignement, des souris adultes jeunes (8 semaines environ) des deux sexes seront utilisées. En ce qui concerne le groupe de souris qui sera évalué dans le modèle de thrombose, des souris des deux sexes seront utilisées à un âge entre 3 et 4 semaines. Le modèle de thrombose ne peut être réalisé que sur des souris très jeunes car sinon le tissu adipeux autour des vaisseaux intestinaux empêche leur bonne visualisation sous microscope.
Etude du couplage neuromécanique par imagerie ultrasonore
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
107 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère, la plupart menées sous anesthésie sans réveil. Ils subissent une chirurgie puis environ trois heures d'imagerie cérébrale, et 15 d'entre eux reçoivent cinq injections destinées à induire des crises de migraine. Le porteur reconnaît qu'il "n'est pas possible" de soulager les animaux pendant ces crises, la douleur faisant l'objet de l'étude, et applique un test de sensibilité par pression d'un poil sur la face. Il affirme qu'étudier le cerveau "entier et fonctionnel" rend impossible tout recours à l'in vitro ou l'in silico.
Objectifs
Le cerveau, comme les autres organes, nécessite un apport en énergie pour maintenir son activité. Ainsi, lors de l’exécution d’une tâche, l’activation neuronale résultante s’accompagne d’une augmentation locale du flux sanguin, permettant un approvisionnement des neurones en oxygène et nutriments. Ce phénomène physiologique, appelé couplage neurovasculaire, est à la base de plusieurs techniques d’imagerie fonctionnelle. En plus d’une augmentation de la désoxygénation locale, puis de l’afflux sanguin induits par l’activité cérébrale au cours d’une tâche qui sont les éléments clés mesurés dans de nombreux types d’imagerie, cette activité cérébrale pourrait s’accompagner de changements locaux de dureté des tissus. Ce phénomène est appelé couplage neuromécanique, par analogie au couplage neurovasculaire. Le but de ce projet est : 1) de mettre au point une méthode permettant d’étudier l’existence de ce couplage neuromécanique dans le cerveau, puis 2) de l’appliquer à l’étude d’une pathologie vasculaire cérébrale : la migraine. Ces travaux seront réalisés chez le rat anesthésié. Dans la première partie du projet, nous souhaitons développer cette technique de mesure combinée de l’activité neuronale (par suivi du débit sanguin local) et de la dureté du tissu (élastographie). Cette première partie méthodologique définira et optimisera les éléments essentiels expérimentaux de ces expérimentations, c’est-à-dire les paramètres physiques d’imagerie à utiliser pour mesurer ces deux composantes de la réponse cérébrale, mais également les conditions expérimentales permettant une activation optimale. Ces travaux reposent sur une expertise reconnue de notre laboratoire dans l’étude fonctionnelle des zones cérébrales chez le rongeur. Ainsi, 4 grands types d’éléments clefs à optimiser ont été identifiés et chacun d’entre eux sera l’objet d’une étude sur deux types de stimulations. La deuxième partie de ce projet a pour but d’utiliser cette méthologie mise au point et de l’appliquer à l’étude du couplage neuromécanique dans un modèle animal de migraine chez le rat. Nous avons choisi le modèle le moins invalidant et le plus court possible. Tous les animaux seront euthanasiés en fin d’expérience d’imagerie. Cette séance d’imagerie durera environ 3h. Aucune douleur , ni souffrance n’est attendue du fait des mesures mises en place et de l’anesthésie de l’animal au cours de la procédure.
Bénéfices attendus
Le couplage neuromécanique est un sujet qui n’a jusqu’à présent pas fait l’objet de nombreuses recherches et dont l’existence reste encore controversée dans la littérature. Les quelques études faisant état de ce phénomène physiologique utilisent la technique d’élastographie par résonnance magnétique, qui est moins précise temporellement que la technique que nous souhaitons mettre en place et nécessite un plus grand nombre d’acquisitions pour obtenir un signal exploitable. Par conséquent, le projet décrit ici pourrait permettre une observation plus fine du phénomène, sur un plus grand nombre de mesures, et comprendre ainsi le lien fondamental entre activation neuronale et élasticité des vaisseaux. Si la thématique de cette étude est très fondamentale, ce projet est aussi translationnel. En effet, le couplage neuromécanique pourrait, à plus long terme, permettre de diagnostiquer certaines pathologies vasculaires, telles que la HHT (Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia), caractérisée par l’absence de capillaires entre les veines et les artères, ou encore CADASIL, une maladie génétique qui atteint les petits vaisseaux dans le cerveau. La mesure combinée des variations de flux sanguin et de la rigidité dans le cerveau pourrait permettre de discriminer ces pathologies et d’en établir un diagnostic plus complet et plus fiable en clinique.
Procédures
Sous anesthésie générale, les animaux subiront une opération chirurgicale, pendant environ 1h. Cette anesthésie sera ensuite maintenue pour réaliser les mesures d’imagerie (les acquisitions en imagerie dureront environ 3 heures). Au cours des expériences d’imagerie, aucune nuisance n’est attendue puisque les expériences seront réalisées sur animaux anesthésiés et seront sans réveil. L’anesthésie prolongée des animaux pour ces séances d’imagerie pourrait induire des effets indésirables notamment sur les constantes vitales de l’animal. Celles-ci seront suivies au cours du temps grâce au suivi des fréquences cardique et respiratoire (Labchart). Tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. correction du taux d’isoflurane pour maintenir le niveau adéquat d’anesthésie, modification de la procédure ou mise à mort de l’animal). Comme nous voulons étudier les mécanismes neuromécaniques cérébraux associés aux douleurs migraineuses, nous devrons induire ce modèle chez 15 animaux et pour cela, réaliser 5 injections intrapéritonéales (une par jour sur 5 jours). Il est possible que certaines de ces injections induisent une douleur aiguë orofaciale transitoire. La crise migraineuse elle-même aura lieu sous anesthésie à la 5ème injection. Les animaux du groupe contrôle recevront une injection de sérum physiologique avec la meme fréquence. Il ne nous est malheuresement pas possible de soulager les animaux pendant les crises migraineuses qui pourraient se mettre en place suite aux 4 premières injections d’ISDN. Cet effet devrait être modéré cependant car il a été montré qu’il fallait attendre la 5ème injection pour observer l’induction d’une crise migraineuse. Un suivi étroit de la sensibilité orofaciale des animaux sera réalisé et tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. traitements antalgiques, modification de la procédure ou mise à mort de l’animal si la souffrance devenait incontrôlable). Ce test de sensibilité, qui dure moins d’une heure, sera réalisé avant le développement du modèle, puis au 4ème jour d’induction du modèle. Il implique de laisser les animaux libres de leurs mouvements, seuls dans une cage ouverte. Après une phase d’habituation, l’expérimentateur appliquera un poil calibré sur la face de l’animal afin de réaliser une pression douce de ce poil. Les animaux seront directement mis à mort à la fin de la séance d’imagerie.
Impact sur les animaux
- Au cours des expériences d’imagerie, aucune nuisance n’est attendue puisque les expériences seront réalisées sur animaux anesthésiés et seront sans réveil. - Les seules nuisances envisagées sont celles causées par le modèle de migraine. Comme nous voulons étudier les mécanismes cérébraux associés aux douleurs migraineuses, il ne nous est pas possible de soulager les animaux pendant les crises migraineuses qui pourraient se mettre en place suite aux 4 premières injections de la molécule induisant la migraine. La douleur associée aux crises migraineuses se mettra en place progressivement suite aux injections de la molécule induisant la migraine et correspond à une douleur modérée. Un suivi étroit de la sensibilité orofaciale des animaux sera réalisé et tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. traitements antalgiques, modification de la procédure). Les animaux seront directement mis à mort après la dernière séance d’imagerie. Notons que la plupart de nos analyses en imagerie se feront sur animal anesthésié, limitant ainsi la perception douloureuse de l’animal. Néanmois, l’anesthésie prolongée des animaux pour les séances d’imagerie pourrait induire des effets indésirables notamment sur les constantes vitales de l’animal. Celles-ci seront suivies au cours du temps grâce au suivi des fréquences cardiaques et respiratoires (Labchart). Tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. correction du taux d’isoflurane pour maintenir le niveau adéquat d’anesthésie, modification de la procédure ou mise à mort de l’animal).
Devenir
Pour toutes les procédures, les animaux seront mis à mort car ils auront subi une ouverture de leur boîte crânienne donc ne pourront pas être réveillés.
Remplacement
Notre étude s’intéresse aux propritétés hémodynamiques et mécaniques du cerveau en activité, entier et fonctionnel ; il est par conséquent impossible de réaliser ces manipulations ex vivo, in vitro ou in silico. Par ailleurs, les ultrasons n’ont jamais été utilisés pour étudier parallèlement le flux sanguin et la rigidité. Aucune donnée n’a donc été collectée à ce sujet, d’où la nécessité de réaliser les manipulations décrites dans ce projet
Réduction
Pour déterminer le nombre d’animaux nécessaires à notre projet, nous avons utilisé un logiciel de statistiques. Le nombre d’animaux ainsi estimé est de N = 10 par groupe pour la première procédure. La mise au point réalisée en manipulation préliminaire permettra de réduire le nombre d’animaux utilisé dans la suite du projet. Pour la seconde procédure, en tenant compte du fait que la différence d’effet entre nos deux groupes expérimentaux (rats migraineux et contrôles) n’est pas connue et, de plus, que 20% des animaux injectés avec le donneur de monoxyde d’azote étaient non-répondeurs, il sera nécessaire d’inclure N =12 animaux contrôles et N =15 animaux injectés avec le donneur de monoxyde d’azote. Au total, le nombre d’animaux nécessaire au projet est de 107.
Raffinement
Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. Ils seront hébergés deux par deux dans une cage contenant un enrichissement (tube en carton, bois à ronger). Un suivi quotidien sera assuré, contrôlant leur comportement général, leur apparence et la présence d’eau et de nourriture (échelle de suivi de la douleur). Nous avons déterminé des points limites anticipés, liés à l’état général de santé et de bien-être et liés au modèle expérimental et aux procédures détaillées. Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous définirons un score décisionnel en fonction des observations quotidiennes permettant de modifier la procédure en cours avec administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou de mettre à mort par administration d’une dose létale d’Euthasol sous anesthésie. Application d’Ocrygel sur les yeux au cours de la chirurgie pour éviter que les yeux ne se dessèchent. Pendant les acquisitions, monitoring des paramètres physiologiques (fréquence cardiaque, fréquence respiratoire, température) pour surveiller le maintien du niveau d’anesthésie. Pendant toute la durée des actes sous anesthésie, les constantes vitales seront suivies : température corporelle, et fréquences cardiaque et respiratoire. Aucun acte ne sera entrepris avant que l’animal ne soit stabilisé pour ces différentes constantes. Si un animal anesthésié présentait une détresse respiratoire ou cardiaque ou s’il se trouve en hypothermie, nous procéderons à un arrêt immédiat du protocole en cours et en l’absence de rétablissement la mise à mort de l’animal sera envisagée par l’administration d’une dose létale d’Euthasol.
Choix des espèces
Les modèles rongeurs sont des modèles de choix pour l’étude des bases physiologiques du cerveau car ils présentent des mécanismes cognitifs complexes et une cartographie fonctionelle transposables à l’Homme. Du fait du développement et de la grande caractérisation morpho-fonctionnelle du cortex chez le rat et la souris, ces deux espèces de rongeurs sont – dans l’absolu – deux espèces de choix pour notre étude fonctionnelle neuromécanique. Cependant, la souris ayant une taille de cerveau significativement plus petite que celle du rat complique grandement la mise au point et l’application à court terme de la technique. En effet, une surface de cortex, ainsi que des distances de transmission de ces ondes de cisaillementvgf sont nécessaire afin de mesurer de façon reproductible ce mécanisme. Ainsi, bien que nous souhaitions à plus long terme étudier ce couplage chez la souris, ce premier projet utilise exclusivement des rats. Les mises au point seront plus faciles car le cortex étant plus grand, il y aura une plus grande place pour la propagation des ondes de cisaillement et leur mesure. Les animaux utilisés dans cette étude seront des rats adultes (7 semaines et plus) car leur cerveau est pleinement développé et d’un grand volume, adapté pour des acquisitions en imagerie.
Étude des mécanismes de néphropathies et de lésions musculaires de la drépanocytose chez la souris et approche thérapeutique
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
1 376 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent des prises de sang sur animal vigile et des injections, 880 sont placées en cage métabolique jusqu'à 18 heures dont une période sans eau, et d'autres portent un modèle de drépanocytose provoquant des crises douloureuses. Le porteur indique anesthésier les gestes les plus invasifs et surveiller la douleur par une grille de score. Il affirme que la souris est "le seul modèle" permettant d'étudier à la fois les atteintes rénales et musculaires de la maladie.
Objectifs
La drépanocytose est la maladie génétique du sang la plus fréquente au monde. Cette maladie se manifeste par une déformation et une rigidification des globules rouges. Ces globules rouges déformés sont plus fragiles et sont la source de l’anémie hémolytique décrite chez les patients drépanocytaires. La forme en faucille de ces globules rouges favorise leur agglomération, l’interruption du flux sanguin et par conséquent, des crises vaso-occlusives, très douloureuses, au niveau de tous les organes du corps. La répétition de ces ischémies (un arrêt ou insuffisance de la circulation sanguine dans une partie du corps ou un organe, qui prive les cellules d'apport d'oxygène) induit des lésions sévères, notamment des organes les plus vascularisés et donc une réduction de la qualité et de l’espérance de vie des patients.Notre projet se concentre sur deux complications chroniques majeures de la drépanocytose : la maladie rénale et la fonte musculaire en s'intéressant aussi le point sur d’autres atteintes tel que la cardiomyopathie et la rétinopathie associée a la drépanocytose. Ainsi, les objectifs de notre projet sont de comprendre : 1- comment telles altérations multi-organes se produisent 2- si le muscle altéré peut avoir des effets déletèrent sur le rein ou vice-versa 3- comment pourrait on les prévenir ou les traiter
Bénéfices attendus
Cette étude pourra révéler une voie commune jusqu'alors non reconnue affectant à la fois le rein et les muscles dans la drépanocytose et éventuellement d'autres maladies hématologiques hypoxémiques. Elle pourra apporter une stratégie thérapeutique puissante pour la progression de la maladie rénale chronique et la fonte musculaire chez les patients atteints de cette maladie. En outre, l'exploration d'une interférence potentielle entre le néphropathie et la sarcopénie associées à la drépanocytose ouvre un nouveau domaine de recherche.
Procédures
Tous les souris (1376 souris) subiront un prélèvement de sang de 20 microlitres a sur souris vigile maintenue en contention manuelle. 160 souris subiront une injection deux fois par semaine pour six semaines sur souris vigile. 160 souris subiront une injection pour 5 jours consécutifs sur souris vigile. 160 souris subiront une injections de la patte postérieure aprés anésthésie gazeuse. 160 souris subiront deux injections séparées de 56 jours, de la patte, postérieure aprés anésthésie à l'isoflurane. 80 souris subiront une injection aprés anésthésie gazeuse. Tout les souris (1376 souris) subiront un prélèvement de sang aprés anésthésie à l'isoflurane et avant mis à mort. 880 souris seront mises en cages metaboliques, pour deux fois, séparées de 24 heures. La premier confinement en cages metaboliques sera pour 18 heures, le second sera pour 6 heures. 880 souris subiront deux mesures de pressions de 20 minutes non ivasives sur souris vigiles sur deux jours consécutifs.
Impact sur les animaux
Les souris subiront le stress d'être isolées pendant 20 minutes pour les mesures de pressions. Elles subiront aussi le stress d'être isolées pendant 6 heures allant jusqu'à 18 heures en cages metaboliques. Elles resteront sans eau pour 18 heures lors du confinement en cage metabolique. Elles subiront une douleur minime lors de certains prélèvements et injections. Cependant, lors des procédures plus invasives les souris seront anésthésiées à l'isoflurane et analgésiées.
Devenir
Etant donné que les organes de ses animaux seront analysés, les animaux de ce projet seront mis à mort.
Remplacement
Le modèle animal permet de réaliser des expériences de physiopathologie rénale et musculo-squelettique de mammifère en prenant en compte tous les paramètres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas relevantes en ce qui concernent l'étude des maladies glomérulaires et musculaire car il existe beaucoup de paramètres physiologiques qui entrent en jeu.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d'animaux requis afin de permettre une analyse statistiquement pertinente des résultats en prenant compte de la variabilité inter et intra expérience. Les résultats seront analysés par des tests statistiques adaptés à la taille de nos échantillons. Pour chaque animal, un maximum d'organes et de prélèvement biologique sera fait afin de ne pas avoir à refaire des experiences sur de nouveaux animaux.
Raffinement
Afin de réduire l'angoisse et la souffrance des animaux des mesures seront prises : 1) Une surveillance des animaux, quotidienne par les zootechniciens et bihebdomadaire par l'expérimentateur, sera réalisée. Une grille de score d'évaluation de la douleur a été établie permettant d'évaluer la souffrance des animaux et de déterminer des points limites. 2) La procédure terminale sera réalisée sous anesthésie. 3)Les procédures invasives tel que certaines injections seront réalisées aussi sous anesthésie et les souris recevront un traitement analgésique qui sera renouvelé et poursuivie si les animaux présentent des signes de souffrance. 4)Les souris seront hébergées en groupe et l’enrichissement de leur environnement sera à base de coton déchiquetable, préservant ainsi une activité et un exercice naturel.
Choix des espèces
La souris est le seul modèle permettant à la fois de réaliser des expériences de physiopathologie rénale et musculo-squelettique de mammifère et d'utiliser la recombinaison homologue ou l'excision allélique dirigée afin de connaitre la fonction des produits des gènes in situ et in vivo. A partir de 4 semaines, une fois que le sevrage physiologique est effectif et jusqu'à 6 mois pour ne pas observer une potentielle fibrose rénale liée au vieillissement. En effet, l'âge est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop âgées induirait une plus grande variabilité de nos résultats expérimentaux.
Implication du PEDF (Pigment Epithelial Derived Factor) sur la vascularisation osseuse et les ostéoprogéniteurs dans la formation osseuse chez la souris adulte.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
184 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections quotidiennes de tériparatide pendant trois semaines, une chirurgie mettant le tibia à nu pour y appliquer une sonde laser sous anesthésie sans réveil, un passage au micro-scanner et une injection de nanobilles par voie rétro-orbitaire. Le porteur situe l'intérêt dans une meilleure compréhension, "sur le long terme", des traitements de l'ostéoporose, alors que le prélèvement des os après la mort est immédiat. Il affirme qu'il est "impossible" de modéliser in vitro la moelle osseuse, jugée trop complexe.
Objectifs
Avec l'âge, on constate une diminution de la formation osseuse qui peut entraîner des maladies osseuses comme l'ostéoporose qui se caractérise par une fragilisation de l'os qui induit une augmentation du risque de chute et donc de fracture. Différents traitements contre cette maladie existent comme l'injection intermittente de tériparatide (fragment de l'hormone para-tyroïdienne) qui stimule la formation osseuse. Il a été montré récemment que le tériparatide stimule l'expression de gènes impliqués dans l'inhibition de l'angiogénèse (formation des vaisseaux sanguins) comme le PEDF (Pigment Epithelial-Derived Factor) par les ostéoblastes. Il semble donc avoir un lien entre la formation osseuse et la vascularisation et que cette relation serait médiée par le PEDF. Ce projet consiste donc à évaluer l'effet du tériparatide sur la formation osseuse dans un modèle de souris déficiente en PEDF (KO PEDF). Ce projet devrait nous permettre de mieux comprendre l’implication du PEDF dans la formation osseuse et de mieux appréhender les mécanismes moléculaires qui régissent le détachement des cellules ostéoprogénitrices des vaisseaux et de leur migration vers les surfaces osseuses.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre l’implication du PEDF dans la formation osseuse et d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires qui régissent le détachement des cellules ostéoprogénitrices des vaisseaux et leur migration vers les surfaces osseuses. Sur le long terme, cela nous permettra de mieux comprendre le mode d’action de certains traitements contre les maladies osseuses comme l’ostéoporose.
Procédures
Injection sous-cutanée journalière de tériparatide à 100 µg/Kg ou solution saline pendant 3 semaines. La perfusion sanguine osseuse se fait in vivo par technique LASER Doppler développée par notre laboratoire. Elle se fait sur animaux sous anesthésie gazeuse (Isoflurane), placés sur une couverture thermique avec une sonde rectale rétro-contrôlant leur température corporelle. Une incision cutanée est effectuée sur la face antérieure du tibia sous loupe grossissante. Le muscle tibial antérieur est récliné pour mettre à nu la face antéro interne du tibia. La sonde Laser est alors placée au contact de l’os. La patte est immobilisée dans une boule d’alginate pour empêcher tout mouvement. La mesure se fait sur 3 zones : au métaphyse haute, métaphyse basse et diaphyse pendant 30s et sont répétées 4 fois. La pression artérielle est mesurée avant et après la perfusion pour s’assurer de la stabilité hémodynamique de la souris. L’analyse par micro-tomodensitométrie de la masse et architecture osseuse se fait in vivo sur animaux sous anesthésie gazeuse (Isoflurane). Pour analyser de façon longitudinale l’évolution des paramètres osseux, une mesure est réalisée à l’inclusion et 3 semaines après l’injection quotidienne de tériparatide ou de solution saline. Les animaux sont préalablement anesthésiés puis immobilisés par bandes adhésives sur un support et placés à l’intérieur du scanner pour faire la mesure. Celle-ci se fait par émission de rayons X par une source qui tourne à 360° autour de l’échantillon, ce qui permet de faire une reconstruction 3D des structures minéralisées. La mesure dure 20min. L’injection de nanobilles fluorescentes se fait par voie retro orbitaire chez l’animal anesthésié. Les billes sont en suspension dans une solution aqueuse. Les souris sont sacrifiées après l’injection des billes.
Impact sur les animaux
L’injection de tériparatide se fait par voie sous-cutanée et celle de tetracycline se fait par voie intrapéritonéale. Ces procédures sont donc de classe modérée. On s’attend à un léger stress après les manipulations. Les mesures de masse osseuse par mCT ainsi que les injections retro orbitaires se font sous anesthésie gazeuse générale (Isoflurane). Cette procédure est donc de classe legère. La mesure de perfusion et la chirurgie qui s’y rapporte se fait également sous anesthésie gazeuse (Isoflurane) sans réveil.
Devenir
Mise à mort car il faut prélever les os des pattes pour pouvoir analyser les paramètres osseux par istomorphométrie et faire des marquages immunohistochimiques.
Remplacement
Nous cherchons à étudier la relation complexe entre la microvascularisation et la formation osseuse ainsi que les mécanismes moléculaires impliqués. Compte tenu du fait que la moelle osseuse est un tissu complexe constitué de très nombreux types cellulaires, il est impossible de modéliser ces expérimentations in vitro.
Réduction
En accord avec le pourcentage des variations observées dans les mesures des paramètres biologiques et pour réaliser une étude statistique solide, il faut au total 72 souris KO-PEDF et 112 souris sauvages (Roche et al 2013). Les souris de chaque génotype seront séparées en 2 groupes : 1 traité par tériparatide pendant 3 semaines (n=36) et un groupe contrôle traité par solution saline (n=36) sauf 40 sauvages utilisées pour les mises au point. - n=40 souris sauvages seront utilisées pour la mise au point de la technique de tri cellulaire et la mesure de la perméabilité vasculaire. Dix souris seront utilisées pour la mise au point du tri cellulaire. Trente souris seront utilisées pour la mise au point de la mesure de perméabilité. Sur chaque groupe : - 10 souris auront leur perfusion sanguine mesurée par LASER Doppler sous anesthésie gazeuse (Isoflurane). Afin de réduire le nombre de souris, les os de ces souris sont, après mise a mort, utilisés pour mesurer les paramètres osseux par histomorphométrie et pour l’immunohistochimie. - n=9 seront utilisées, à cause de la grande variabilité interindividuelle, pour l’analyse de transcriptome par Nanostring. - n=8 seront utilisées pour l’étude ex vivo de la migration des cellules LepR+. L’étude sera d’abord faite uniquement sur des souris sauvages pour vérifier la faisabilité de l’expérience. - n=9 seront utilisées pour l’analyse de la perméabilité vasculaire médullaire par injection de nanobilles fluorescentes.
Raffinement
Les animaux seront manipulés en limitant le stress au maximum, par des personnes compétentes en expérimentation animale, un temps d’acclimatation sera prévu avant toute manipulation et une définition précise des points limites conduisant à l’arrêt du protocole et à la mise à mort immédiate des souris. Une surveillance adaptée (observation des animaux) permettra de limiter au maximum la souffrance. L’injection de tériparatide se fait par voie sous-cutanée et celle de tétracycline se fait par voie intrapéritonéale. Ces procédures sont donc de classe modérée. On s’attend à un léger stress après les manipulations. Les mesures de masse osseuse par mCT ainsi que les injections retro orbitaires se font sous anesthésie gazeuse générale (Isoflurane). Cette procédure est donc de classe légère. La mesure de perfusion et la chirurgie qui s’y rapporte se fait également sous anesthésie gazeuse (Isoflurane) sans réveil.
Choix des espèces
Nous cherchons à étudier la relation complexe entre la micro vascularisation et la formation osseuse ainsi que les mécanismes moléculaires impliqués, ce qui est impossible à faire in vitro. Nous avons, de plus, validé toutes nos mesures chez des souris et le travail sera effectué chez des souris dont le gène du PEDF a été invalidé. Le mutant KO-PEDF chez la souris est une souche robuste sur laquelle des études ont déjà été faites, c’est donc actuellement le meilleur modèle. On utilise des souris adultes de 4 mois car on cherche à évaluer l’implication du PEDF dans un os mature.
Exploration de la pression arterielle chez la souris in vivo
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
1 370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère, une large part étant menée sous anesthésie sans réveil. Elles subissent des injections et des mesures de pression artérielle par brassard à la queue, et 530 d'entre elles portent un modèle de sclérose latérale amyotrophique entraînant une paralysie progressive des membres. Le porteur indique adapter les cages avec des tétines allongées pour les animaux affaiblis, et affirme qu'"il n'existe pas de modèle de remplacement" pour cette maladie. Il présente les retombées thérapeutiques au conditionnel et à terme, alors que la mise à mort des animaux est certaine.
Objectifs
L'ensemble des grandes fonctions de notre organisme (digestion, respiration, régulations cardiovasculaires...) est sous le contrôle du système nerveux autonome. Celui-ci se divise en deux grandes branches : le système nerveux autonome sympathique (SNAS) et le système nerveux autonome parasympathique. Nous menons actuellement au laboratoire deux projets de recherche qui utilisent la même procédure expérimentale afin de savoir (1) si certains neurones thoraciques de la moelle épinière qui présentent des propriétés de senseur chimique font partie du SNAS et (2) si lors de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), le SNAS est altéré et contribue à la physiopathologie de cette maladie. Afin de répondre à nos questions, nous regarderons l'effet de molécules, connues pour activer le SNAS, sur la pression artérielle. Celle-ci sera mesurée au niveau de la queue chez l'animal avec un système de brassard comme utilisé chez l’homme. Deux types de modèles murins seront utilisés dont un est un modèle murin de la SLA qui récapitule la maladie humaine (dégénérescence progressive des motoneurones entrainant progressivement une paralysie). Nous faisons l'hypothèse que les modifications génétiques portées par les souris modifient le fonctionnement du SNAS et que sa stimulation induira des effets différents entre souris sauvages et génétiquement modifiées.
Bénéfices attendus
Ce projet éthique fait partie d'un nouvel axe de recherche développé depuis deux ans au laboratoire qui vise à comprendre l'organisation et le fonctionnement du SNAS en situations physiologique et physiopathologique. Dans le contexte de la SLA, les données sur le SNAS sont parcellaires. Des données récentes montrent que le SNAS exerce un contrôle extrêmement puissant à tous les étages de la communication entre motoneurones et muscles. Nous espérons donc que cette étude permettra de démontrer l'implication du SANS dans la SLA et donc potentiellement à terme de développer de nouveaux outils thérapeutiques pour cette maladie pour laquelle encore aujourd'hui aucun traitement même partiel n'existe.
Procédures
1320 animaux recevront une à deux injections sous anesthésie générale sans autre procédure invasive. 50 mâles seront utilisés comme reproducteurs mais euthanasiés avant tous développement de signes cliniques liés à la maladie.
Impact sur les animaux
530 animaux présenteront un phénotype dommageable similaire aux symptômes de la SLA (sclérose latéral amyotrophique) avec diminution de la motricité des membres postérieurs. L'ensemble des animaux (1370) subiront une mise en contention, 2 à 3 injections sous cutanées, une anesthésie sans réveil ainsi que des mesures de pression artérielle répétées au niveau de la queue
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés dès la fin des manipulations.
Remplacement
Il n'existe pas de modéle de remplacement pour aborder la physiologie et la physiopathologie du système nerveux et de la maladie étudiée (SLA ou Sclérose Latérale Amyotrophique)
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous proposons d'injecter deux molécules d'interet par animal. Il n'est neanmoins pas possible d'augmenter le nombre de ces injections afin de limiter les effets croisés entre composés actifs. Le nombre d'animaux par lots à été déterminé grâce à un logiciel de statistiques en estimant qu'une différence est significative à partir de 5mmHg entre les groupes. Les analyses seront faites avec des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Le système de mesure de pression artérielle externe permet de n'être absolument pas invasif puisqu'il consiste en la pose d'un ballonnet sur la queue, similaire à ce qui est utilisé sur les bras des patients humains lors de consultations médicales. Les animaux présentant un phénotype dommageable seront suivis quotidiennement avec une grille de scoring validée. Des dispositifs d'adaptation de la vie des animaux commençant à présenter des faiblesses au niveau des membres seront mis en place comme des tétines de biberon plus longues et de la nourriture dans la cage pour un accès à l'alimentation et à l'eau facilité.
Choix des espèces
La souris est un modele le dont le genome est parfaitement connu. Le choix de l'espece souris est motivé par la présence de modeles genetiquement modifiés extremement pertinents pour les questions scientifiques posées. Le système de reproduction des souris permet d'avoir régulièrement des animaux dans un espace relativement réduit. Les souris présentant un déficit d'un gène codant pour un canal calcique seront utilisées lorsqu'elle auront entre 8 et 10 semaines (l'expression visible de l'absence du canal ne changeant pas avec l'âge) . Les souris présentant la maladie SLA (sclérose latéral amyotrophique) seront analysées à différents stades de la maladie et donc à différents âges (pré et postsymptomatiques): 21 jours, 40 jours, 60 jours, 75 jours, 90 jours, 105 jours et 110 jours d'âge).
Effet d’un traitement par exposition au plasma froid sur un modèle de carcinogenèse prostatique murin
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
Des souris ont l'abdomen ouvert pour que leur prostate soit exposée à une torche à plasma froid ou à un simple jet d'hélium, puis vivent sept jours avant d'être tuées pour l'analyse du tissu traité. 96 souris transgéniques, privées du gène suppresseur de tumeur PTEN et atteintes d'un cancer de la prostate, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, pour préparer l'emploi de la torche lors des ablations de la prostate chez des patients. Le porteur attend des effets indésirables "plutôt mineures", et écrit aussi que ce traitement "reste une procédure exploratoire, dont les conséquences restent à établir". Les souris sont hébergées en cage individuelle, ce que le résumé range sous un "enrichissement renforcé".
Objectifs
Le projet est basé sur l’intérêt de l’utilisation d’une torche à plasma pour le traitement des marges chirurgicales au cours d’une chirurgie de prostatectomie radicale (ablation de la prostate) chez des patients présentant un cancer localisé. Il existe aujourd’hui plusieurs appareillages pour le traitement focalisé d’une tumeur mais sans prostatectomie (Ultrasons, lasers, radiothérapie etc.). En revanche, l’utilisation de module spécifique pour le traitement des marges chirurgicales au cours de la prostatectomie est très limitée et encore exploratoire. De plus, la très large majorité des prostatectomies sont aujourd’hui réalisées par assistance robotisée sous coelioscopie. Cette technologie connaît un essor exponentiel et constitue une aire de développement technologique de premier plan dans la chirurgie de la prostate. L’opportunité de traiter avec une source plasma constitue donc une approche nouvelle qui nécessite d’être évaluer in vivo avant tout transfert technologique vers la clinique. La torche à plasma froid est constitué́ de deux électrodes entourant un tube de quartz dans lequel est injecté de l'hélium. Des pics de tension sont appliqués, transformant l'hélium et l'air environnant en plasma (mélange d'ions, de radicaux et d'électrons). Afin d’évaluer in vivo la pertinence de l’utilisation d’un tel dispositif, nous proposons de réaliser un traitement par plasma sur un modèle de cancer de la prostate induit chez des souris transgéniques. Une étude pilote sur un modèle de souris ayant subi une greffe de cellules tumorales dans la prostate nous a permis d'identifier les paramètres de fonctionnement de la torche à plasma in vivo. Ainsi, deux paramètres seront étudiés, i) l’effet spécifique du plasma comparé à de l’hélium non excité et ii) l'impact du milieu d’imprégnation du tissu pendant son exposition au plasma. Les zones de traitement seront analysées par des approches histologiques et moléculaires. Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, une étude pilote sera conduite permettant de vérifier la pertinence du traitement par plasma froid.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à caractériser in vivo l'effet d'une exposition d'un tissu tumoral à une source de plasma froid. Nous souhaitons ainsi obtenir, sur ce modèle préclinique, des informations sur le type de lésions engendré: apoptose? nécrose? inflammation? et la profondeur tissulaire atteinte. Ces résultats ont une valeur importante et capitale pour envisager un transfert vers la clinique humaine. Un projet vient d'être accepté dont l'exploration fonctionnelle sur ce modèle vivo fait parti. Par ailleurs, nous avons montré, ex vivo, que le milieu d'imprégnation des cellules tumorales est un paramètre important. Nous allons donc testé 2 milieux caractéritique pour tester l'efficacité de la torche in vivo : un milieu phosphate buffer saline (PBS 1X) de formulation très simple et un milieu de culture plus complexe adapté à la croissance des cellules tumorales prostatiques (RPMI1640).
Procédures
Les animaux subiront une laparotomie et un traitement par plasma froid de la prostate antérieure ou un traitement control (expostion jet Helium). L'ensemble de la procédure opératoire dure en moyenne 10 minutes +/- 2minutes. Les animaux seront maintenus en hébergement pendant 7 jours avant leur mise à mort et le prélèvement des tissus d'interêt. Les animaux pourront être pris en charge par un traitement anti-inflammatoire AINS le cas échéant par injection intraperitonéale. Cette injection, contention de l'animal comprise, durera environ 15 secondes.
Impact sur les animaux
Les potentiels effets indésirables sont attendus comme plutôt mineures puisque que le traitement est localisé à la prostate antérieure qui ne constitue pas un organe essentiel à la survie de l'animal. Par ailleurs, la procédure de traitement de la prostate par laparotomie est une procédure exécutée en routine par l'équipe et dont les suites post-opératoires sont completement connues et maitrisées. Toutefois, il est possible que le traitement par le plasma conduisent à une réponse inflammatoire du tissus prostatique. Grâce au suivi renforcé, nous surveillerons les points limites en terme de mal être ou de souffrance qui conduiraient à l'utilisation d'un traitement anti-inflamatoire si cela s'avérait nécessaire.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés et prélevés pour analyse du tissu prostatique traité.
Remplacement
La caractérisation des effets du plasma sur les tissus tumoraux sera complétée par des expositions sur des organoïdes et des tumoroïdes permettant ainsi de ne pas recourir à l'expérimentation animale. Ces experiences conduites in vitro permettent de calibrer des paramètres critiques (tension, débit helium, temps d'exposition...) du jet plasma sur des modèles intermédiaire entre culture 2D et modèle vivo. Cette approche permet dans une certaine mesure d'anticiper la réponse in vivo. Pour autant, l'utilisation sur le modèle souris est indispensable pour valider cette technologie sur organisme mammifère entier et envisager un transfert vers la clinique humaine.
Réduction
Ce projet d'exposition au plasma froid fait suite, d'une part, à des travaux réalisés en culture cellulaire qui ont permis de caractériser les paramètres d'utilisation de la torche à plasma froid, et d'autre part, à une expérimentation pilote sur un modèle de greffes orthotopiques intra-prostatiques. Ainsi, toute une partie du projet a été réalisé sur des modèles cellulaires en remplacement du modèle vivo et permet de limiter l'utilsation de l'animal à des conditions expérimentales que nous avons définies au préalable ex vivo. Concernant le nombre d'animaux utilisés pour l'étude, il est justifié pour assurer une puissance statistique suffisante pour l'exploitation des résultats et paramètres biologiques.
Raffinement
Le traitement par plasma froid d'un tissu vivant reste une procédure exploratoire, dont les conséquences restent à établir. Ainsi l'emergence potentielle de mal être ou souffrance de l'animal sera étudiée grâce à un suivi renforcer (visites 2x par jour). Si nécessaire les animaux pourront recevoir un traitement anti-inflammatoire. Enfin, les cages seront soumis à un enrichissement renforcé : cage individuelle avec tube carton et pad-fibre.
Choix des espèces
Modèle de souris transgénique invalidé pour l'oncosuppresseur PTEN. pas d'équivalent dans d'autres espèces adaptées à l'étude. Nous utiliserons de souris agées au moins de 6 mois qui permettront de traiter un carcinome de prostate installé. (Cinétique de carcinogenèse très largement décrite dans la littérature et maitrisée par l'équipe de recherche).
Étude du remodelage veino-lymphatique chez la souris pour comprendre la physiopathologie de l’hypertension intracrânienne idiopathique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Selon leur groupe, des souris subissent une ligature des deux veines jugulaires, reçoivent des vecteurs viraux dans le liquide céphalorachidien ou portent un cathéter intracrânien pendant douze à quatorze jours, seules en cage, avec une injection par jour pendant six jours. 696 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue de chaque procédure pour l'étude de leur cerveau et de la dure-mère, certaines au terme d'une mesure de pression intracrânienne menée sans réveil. Un régime gras rend une partie d'entre elles obèses pendant quatre à dix semaines, d'autres restent isolées jusqu'à 31 jours en cage d'activité locomotrice, pour tenter de reproduire l'hypertension intracrânienne idiopathique, maladie de la femme jeune en surpoids que l'équipe étudie aussi par IRM chez des patients. Les tests comportementaux, répartis sur deux jours et demi, ne sont pas nommés, et le porteur reconnaît que l'isolement des souris porteuses d'un cathéter "peut occasionner une souffrance de l'animal et des troubles du comportement".
Objectifs
Les vaisseaux lymphatiques récemment mis en évidence dans les méninges du système nerveux central semblent impliqués dans un grand nombre de pathologies neurologiques. Ces vaisseaux lymphatiques sont absents du tissu cérébral et uniquement présents dans l’enveloppe la plus externe au cerveau : la dure mère. Au sein même de cette enveloppe, ils sont plus spécifiquement localisés le long des sinus veineux duraux. Des travaux récents ont montré que cette proximité anatomique veino-lymphatique jouait un rôle clé dans l’immunité du système nerveux central. Nos hypothèses sont les suivantes : 1) Une altération du réseau veineux cérébral influera le réseau lymphatique, et inversement, 2) La dérégulation du complexe veino-lymphatique chez l’Homme pourrait être impliquée dans une pathologie rare dont les mécanismes sont encore inconnus : l’hypertension intracrânienne idiopathique (HTIC-I). Cette pathologie touche spécifiquement la femme jeune en surpoids et associe une rétention de fluide dans le système nerveux central à des sténoses, c’est-à-dire des rétrécissements, des sinus veineux duraux. Nos objectifs sont de caractériser les mécanismes de cette pathologie, et d’explorer la neuro-inflammation qui pourrait être impliquée dans l’altération des fonctions cognitives observées chez ces patientes. Dans cette étude, nous allons combiner une analyse par imagerie par résonnance magnétique (IRM) du réseau veino-lymphatique dural chez l’Homme (patients avec HTIC-I et contrôles), et une étude expérimentale sur des modèles animaux d’HTIC-I. Notre programme d’étude chez la souris est le suivant : 1) Modéliser chez la souris l’HTIC-I 2) Étudier comment une altération du flux veineux pourrait affecter le réseau lymphatique 3) Étudier comment une manipulation du réseau lymphatique (amplification et altération) pourrait induire, amplifier ou diminuer les caractéristiques de l’HTIC-I 4) Analyser les conséquences sur le comportement et la cognition de l’altération des réseaux lymphatique et veineux 5) Analyser les conséquences sur l’inflammation du cerveau et des méninges d’une altération des réseaux lymphatique et veineux 6) Étudier comment le genre féminin et l’obésité participent à la physiopathologie de la maladie. Nous utiliserons sur 5 ans un total de **696 souris non transgéniques.
Bénéfices attendus
D'un point de vue médical, l’hypertension intracrânienne idiopathique (HTIC-I) est une maladie mystérieuse aux frontières de la neurologie, de l'ophtalmologie et de la neurochirurgie. Cette maladie affecte les femmes jeunes en âge de procréer et peut conduire à une altération majeure du champ visuel ou à la cécité. Les traitements existants soulagent les symptômes, mais ne ciblent pas la cause de la maladie, ils sont invasifs, ont une efficacité limitée et sont associés à des risques et effets secondaires non négligeables. Des thérapies alternatives, plus efficaces et moins invasives, ciblant directement la cause biologique de la maladie semblent nécessaires. Cependant, un prérequis nécessaire de ce développement est de comprendre la physiopathologie et les mécanismes biologiques impliqués. A long terme, l'objectif de cette étude est d'ouvrir des pistes thérapeutiques nouvelles avec un potentiel réaliste pour améliorer le pronostic de cette maladie. D'un point de vue scientifique, l'HTIC-I est un modèle de maladie cérébrale paradigmatique qui semble parfaitement illustrer une dysfonction primitive du complexe veno- duro-lymphatique. Tandis que le rôle et l'anatomie des lymphatiques ont été bien étudiés chez l'animal, leur caractérisation chez l'humain et leur rôle dans les pathologies neurologiques est très méconnu. L'exploration du complexe veno-lymphatique et de sa plasticité pourrait conduire à des avancées significatives en neurosciences.
Procédures
Les procédures suivantes seront réalisées après une prise en charge première de la douleur par des médicaments, et hydratation. Les souris sont ensuite anesthésiées par anesthésie gazeuse. Les interventions sont réalisées en conditions stériles chirurgicales. Un protocole de prise en charge de la douleur sera suivi en post opératoire. On identifie les procédures suivantes qui seront réalisés selon le plan expérimental en fonction des groupes d’animaux : 1. Chirurgie de ligature bilatérale des veines jugulaires (Durée : 1 heure, préparation 30 min). 2. Mesure de pression intracrânienne : La mesure de la pression intracrânienne est une procédure sans réveil (durée : 30 minutes, préparation : 30 minutes). 3. Manipulation du réseau lymphatique par injection de vecteurs viraux dans le liquide céphalorachidien (durée : 30 minutes, préparation : 30 minutes). 4. Mise en place d'un cathéter intracrânien (durée : 30 minutes, préparation : 30 minutes). 5. Mise en place du cathéter intracrânien et injection de traceurs de fluorescence différente à 30 minutes d’intervalle (préparation : 30 min, durée : 1h30), procédure sans réveil. **6. IRM cérébrale avant et après chirurgie de ligature jugulaire (préparation : 30 minutes, durée de la procédure : 40 minutes)**. Les autres procédures ne nécessiteront pas d’analgésie ou d’anesthésie de l’animal et consiste en : 1. Des tests comportementaux répartis sur deux jours et demi. 2. Un régime riche en graisse pour rendre l’animal obèse pendant toute la durée de l’experimentation soit entre 4 et 10 semaines. 3. Isolement pour cathéter intracrânien laissé en place pendant 12 à 14 jours. 4. Injection par le cathéter intracrânine une fois par jour pendant 6 jours. **5. Étude d’activité dans des cages d’activité locomotrice nécessitant l’isolement de l’animal pendant 31 jours. 6. Étude d’activité dans des cages comportant une roue d’activité nécessitant l’isolement de l’animal sur 4 périodes de 3 jours**
Impact sur les animaux
Dans cette expérimentation, les nuisances ou effets indésirables attendus peuvent être divisés en effets indésirables liés aux chirurgies réalisés sous anesthésie générale et incluent les accidents survenant lors de l’anesthésie (accident opératoire, hémorragie, mauvaise tolérance de l’anesthésie pouvant conduire au décès de l’animal ou à l’interruption de la chirurgie), les effets indésirables post opératoires (douleur, infection de la cicatrice ou du site opératoire, stress, inactivité mobilité réduite, comportement anormal). Les procédures réalisées sans anesthésie sont de sévérité moindre mais peuvent entrainer un inconfort, ou un stress de l’animal qu’il conviendra de détecter et de prendre en compte. Le phénotype obèse peut engendrer des difficultés pour l’animal à se déplacer. L’isolement de l’animal porteur d’un cathéter intracrânien peut occasionner une souffrance de l’animal et des troubles du comportement qu’il conviendra de détecter et de prendre en charge précocement et préventivement par un enrichissement du milieu.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure afin de réaliser des études histologiques et biochimiques de la dure mère et du cerveau des animaux.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs du projet. En effet, l’étude des mécanismes physiopathologiques ne peut être modélisée autrement que par des modèles vivants. Le recours à ces animaux est indispensable afin de pouvoir analyser les réactions physiologiques à l’atteinte d’une fonction.
Réduction
Trois lots d’animaux seront nécessaires en raison de traitements différents des échantillons en post mortem (n= 660). **A ceci s’ajoutent les animaux des procédures 9 et 10 (n=36) dont l’analyse est clinique par IRM ou tests comportementaux.** Afin de réduire les contraintes pour les animaux, les études histologiques seront couplées aux études cliniques (comportement et mesure de PIC). Un calcul de puissance a été réalisé pour évaluer le nombre d’animaux par groupe, ainsi un nombre de 10 animaux pour chaque condition expérimentale pour analyse histologique a été calculé afin d’obtenir des données reproductibles et solides nécessaires pour réaliser des analyses robustes. Tenant compte du risque de perte d’animaux en per ou post opératoire immédiat, le nombre de 15 animaux par groupe a été estimé pour un groupe avec analyse post mortem en immuno histochimie. Pour le groupe avec analyse en cytométrie de flux, un nombre minimal de 18 souris par groupe est nécessaire sur le plan technique en raison de la faible cellularité de la dure mère. Tenant compte du risque de perte d’animaux pendant la chirurgie, le nombre de 20 animaux par groupe a été estimé pour ce groupe. Ce nombre de 18 souris par groupe a été validé également par le calcul de puissance réalisé pour évaluer la taille de l’échantillon. Un nombre minimal de 3 animaux est nécessaire pour les analyses en imagerie post mortem 3D, les données étant qualitatives et ne nécessitant pas d’analyse statistique. Par conséquent, tenant compte du risque de perte d’animaux en per ou post opératoire immédiat, le nombre de 5 animaux par groupe nous semble pertinent. **Pour la procédure 9 (IRM), chaque animal étant son propre témoin, un nombre de 6 animaux par lot a été validé. Pour la procédure 10 (tests comportementaux en cage individuelle), chaque animal étant son propre témoin, un nombre de 12 animaux par lot a été validé.** Pour analyser les résultats de l’étude, nous utiliserons les tests diagnostiques dédiés aux échantillons et à leur distribution. Ainsi, un total de **696 souris sera nécessaire en tout pour répondre à l’ensemble des objectifs.
Raffinement
A réception des animaux une procédure d’acclimatation d’une semaine aux nouveaux locaux sera réalisée. Pendant toute la durée de l’expérimentation les animaux seront hébergés en cage en portoir ventilé par groupes de 3 afin de fournir un environnement social enrichi. Les animaux auront à disposition des composants de nidification de type « Nestlet ». Ils auront à disposition de la nourriture en permanence et accès à l’eau . Si l’animal a du mal à se déplacer, par exemple juste après une chirurgie, les croquettes seront mouillées et une solution d’hydratation gélifiée sera mis en place. Les paramètres environnementaux (lumière, température, hygrométrie, pH de l’eau) seront surveillés quotidiennement. Un suivi de l’ensemble des animaux sera effectué quotidiennement. Le poids des souris sera vérifié deux fois par semaine après une chirurgie. Le cahier opératoire sera rempli le jour de l’intervention pour renseigner le temps per-opératoire et post opératoire immédiat, à J1-J2 et J8 post chirurgie. Il servira à notifier les éléments de surveillance, ainsi que les administrations d’antalgique. Une grille de surveillance sera remplie tous les jours les premières 48 heures puis tous les deux jours après une chirurgie, et utilisée pour la surveillance de la douleur et la détections de points limites. La grille sera cotée de 0 (aucune souffrance) à 15 (Souffrance maximale) et guidera l’administration d’antalgique et le rythme de surveillance des animaux. Les critères de surveillance seront : l’apparence de l’animal, le comportement naturel, la perte de poids, le comportement provoqué, le site de la chirurgie. Ce suivi permettra de vérifier l’état général des animauxet de détecter un état de stress ou de douleur nécessitant un traitement, ou la mise en place d’une procédure d’euthanasie. Un protocole d’antalgie adapté sera mis au point, pour traiter ou prévenir une douleur induite par une procédure. L’animal bénéficiera avant tout geste chirurgical d’une association d’antalgique par opiacés et d’anti-inflammatoire. Le protocole d’antalgie sera adapté à la grille de surveillance. L’indication d’antalgiques, le rythme de surveillance, et l’identification des points limites conduisant à l’euthanasie de l’animal seront définis en fonction du score.Une anesthésie sera réalisée pour tout geste susceptible d’entrainer une souffrance physique ou morale de l’animal. Les animaux isolés seront surveillés spécifiquement et auront accès à un enrichissement supplémentaire.
Choix des espèces
Notre objectif est d'identifier les mécanismes du remodelage veino-lymphatique et de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués. Le modèle animal est donc indispensable à notre recherche. Concernant l’espèce, les modèles de chirurgie et de manipulation du réseau lymphatique ont été préalablement développées chez la souris avec de bons résultats. L’expérience de notre équipe et les données existantes dans la littérature sont majoritairement basées sur la souris. Toutes les expérimentations seront réalisées sur l’animal adulte après développement du réseau lymphatique chez la souris c’est-à-dire après 8 semaines post-natal. Les injections intracrâniennes et la mesure de pression intracrânienne devront être effectuées sur des animaux jeunes adultes (âgés de 2 mois à un an), un âge auquel la boite crânienne est mature et stable, autorisant une chirurgie stéréotaxique précise.