Rongeurs

9 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie d'injection d'un composé dans le cerveau, puis des injections quotidiennes de molécules à tester et des tests comportementaux, dont un test d'évitement passif fondé sur un choc électrique aux pattes, pour évaluer des molécules contre la maladie d'Alzheimer. Le porteur indique que les injections génèrent du stress et que la mémoire est évaluée par la perception de ce choc électrique. Il affirme que les modèles murins sont "indispensables", seuls recours in vivo autre que l'humain à présenter les symptômes de la maladie.

Objectifs

Trouver un traitement contre la maladie d’Alzheimer (MA) est aujourd’hui une priorité. Cependant la MA étant une maladie complexe, les chercheurs s’accordent à dire qu’un seul traitement ciblant un seul mécanisme pathologique de la MA ne sera pas suffisant. Nous cherchons donc à identifier de nouvelles molécules à fort potentiel neuroprotecteur. Nous développons également des molécules hydrides, composés de deux entités ciblants des combinaisons de cibles. Il est donc primordial de tester ces molécules sur un modèle in vivo de la MA afin de pouvoir un jour procéder au développement clinique d’un traitement innovant. Pour cela un modèle pharmacologique de souris Alzheimer sera utilisé pour injecter pendant 7 jours les molécules seules ou en combinaison, puis le statut mnésique des animaux sera évalué grâce à des tests comportementaux.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de découvrir des molécules neuroprotectrices très efficaces sur un modèle aigu prédictif de la MA, avant de plus longue expérimentations sur un modèle transgénique, pour contrer les symptômes de la maladie d'Alzheimer, et espérer un développement pré-clinique et clinique de molécules de nouvelle génération active seule ou en combinaison pour une action modifiant de façon durable le décours de la maladie.

Procédures

Les animaux auront au cours de leur vie une chirurgie permettant l'injection du composé dans le cerveau. Cette intervention est d'une durée de 7 minutes maximun entre le début de l'anesthésie gazeuse et la fin de l'inoculation du composé. Ensuite durant 1-7 jours les animaux recevront une injection dans l'abdomen des molécules à tester. Suite à ce traitement les performances mnésiques des animaux seront testées, avec des tests comportementaux.

Impact sur les animaux

La chirurgie sous anesthésie est peu invasive. Cette procédure sera suivie par une ou plusieurs injections systémiques dans l'abdomen, ce qui pourra engendrer du stress chez l'animal. Par ailleurs, le test d'évitement passif permettant d'évaluer la mémoire à long terme repose sur la perception d'un choc électrique de très faible intensité au niveau des pattes de la souris.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de récupérer le cerveau et procéder à des tests biochimiques post-mortem.

Remplacement

L’utilisation de modèles murins de la MA pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques de la MA dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement.

Réduction

Les molécules sont testées sur une gamme de doses réduite . Les animaux sont testés sur différents tests comportementaux de façon à mesurer différents types de mémoire sur chaque animal. Le nombre d’animaux est calculé pour ne pas compromettre les objectifs du projet. Le nombre d'animaux est basé sur une connaissance approfondie des modèles et de l'expérience acquise par notre équipe. Le nombre d'animaux a été déterminé par un logiciel de statistique.

Raffinement

Les animaux seront reçu une semaine avant le début de l'expérimentation et gardés en groupe de 8-10 individus par grande cage. Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des maisons en cartons et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Après les tests comportementaux les animaux sont directement remis dans la cage d’origine à l’écart du test de comportement afin de retrouver leur environnement sécurisant. Dans le cas où le traitement pharmacologique serait à l’origine de douleur visible ou de détresse le traitement serait interrompu et si nécessaire la mise à mort de l’animal serait anticipée. Ce sera le cas lorsque l'animal perdra 20% de son poids de départ ou lorsque celui-ci présentera des lésions cutanées signe d’un stress ou d'une agressivité vis à vis de ses congénères. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur.

Choix des espèces

Le modèle souris permet de mimer rapidement les symptômes de la maladie d'Alzheimer et le modèle permet d'obtenir des données préliminaires transférables aux modèles transgéniques murins. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte soit à partir de 6 semaines. C'est à cet âge que la toxicité induite par le composé est la plus marquée, que l'injection dans le cerveau est la plus simple à faire et que les déficits comportementaux et altérations biochimiques ont été caractérisés.

60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cinquante d'entre eux reçoivent sans anesthésie une injection de parois bactériennes déclenchant une inflammation générale, suivie de traitements répétés, de prises de température rectale toutes les heures et d'une évaluation comportementale, pour tester quatre formulations anti-inflammatoires. Le porteur indique que l'inflammation induit une souffrance modérée et que la contention répétée génère un stress chez tous les animaux. Il affirme que le remplacement par des modèles in vitro n'est pas envisageable pour mesurer des paramètres physiologiques et comportementaux.

Objectifs

L’inflammation est une réaction de défense immunitaire stéréotypée du corps à une agression : infection, brûlure, allergie…. L'inflammation chronique est reconnue comme une réponse à de nombreuses transformations de l'environnement et du comportement modernes (sédentarité, malbouffe, pollution,…) et un facteur important dans le développement de maladies de civilisation telles que la résistance à l'insuline, l'obésité, les maladies cardiovasculaires, les maladies immunitaires, et même les troubles de l'humeur et du comportement. L’inflammation se manifeste par différentes phases successives au niveau des vaisseaux avec leur dilatation et une augmentation de leur perméabilité, et des cellules de l’organisme, notamment des globules blancs. Cela permet d’augmenter la circulation du sang afin d’éliminer les cellules mortes et les toxines responsables de cette inflammation, et d’apporter les éléments nécessaires à la guérison, notamment des globules blancs (lymphocytes) pour combattre les corps étrangers. Les objectifs de ce projet sont d’évaluer les effets anti-inflammatoires de 4 formulations administrées de façon répétée sur l’inflammation générale induite chez le rat par des bactéries appelées lipopolysaccharides ou LPS. Les 4 formulations testées ont été sélectionnées sur la base d’études in vitro ayant démontré des propriétés anti-inflammatoires qu’il est nécessaire de confirmer in vivo sur un modèle animal avant d’envisager un développement chez l’Homme.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet va permettre d’évaluer les effets anti-inflammatoires de 4 formulations administrées de façon répétée sur l’inflammation générale induite chez le rat par des parois bactériennes. Les données physiologiques et comportementales générées par l’ensemble des paramètres mesurés au cours de l’expérimentation et les analyses qui seront effectuées sur le sang, ainsi que les analyses qui seront effectuées sur les organes prélevés, en fin d’expérimentation, permettront de sélectionner une ou plusieurs formulations afin de poursuivre leur développement et d’envisager leur utilisation future chez l’Homme. Cela permettrait à terme de proposer de nouvelles solutions thérapeutiques pour le traitement de pathologies inflammatoires aiguës mais également chroniques.

Procédures

50 des 60 rats seront soumis à l’induction d’une inflammation générale par injection de parois bactérienne, les 10 rats restant recevant l’injection de placebo. L’induction de l'inflammation générale est effectuée 1 seule fois sans anesthésie, le geste étant très rapidement en quelques secondes. Les rats seront observés toutes les heures pendant les 24 heures de l’expérimentation. Les 60 rats seront traités avec chacune des 4 formulations anti-inflammatoires à évaluer, immédiatement après induction de l’inflammation générale puis 6 heures, 12 heures et 18 heures après celle-ci. Les injections seront effectuées sans anesthésie après placement des rats dans une boîte de contention spécifique adaptée à leur poids et leur taille, celles-ci étant effectuées en moins d’1 minute. Une prise de température corporelle au niveau rectal sera effectuée sur les 60 rats toutes les heures pendant 12 heures ainsi qu'à 18 heures et 24 heures après induction de l’inflammation générale. Les mesures seront faites sur animal vigile. A la fin de l’expérimentation une évaluation comportementale sera effectuée en plaçant chacun des 60 rats dans un dispositif expérimental spécifique pendant 5 minutes pour déterminer les effets de l’induction de l’inflammation générale et des traitements réalisés sur leur comportement locomoteur. Cette évaluation sera faire sur animal vigile. Enfin un prélèvement de sang sera réalisé sur les 60 rats, sous anesthésie générale, effectué une seule fois et en une minute environ avant leur mise à mort.

Impact sur les animaux

L’induction d’une inflammation générale affectant l’organisme entier va induire une souffrance modérée pour 50 des 60 rats utilisés pour ce projet, se traduisant par des modifications dans leur comportement et dans leurs paramètres physiologiques. La mise en cage de contention pour effectuer les traitements avec les 4 formulations à évaluer et la réalisation de celles-ci, ainsi que les mesures répétées de température corporelle, vont induire un stress pour la totalité des animaux. Le placement des animaux dans le dispositif expérimental pour la réalisation de l’évaluation comportementale à la fin de l’expérimentation pourra également générer un stress léger mais très limité dans le temps, la durée du test étant de seulement 5 minutes.

Devenir

A l’issue de l’unique procédure expérimentale, après réalisation d’un prélèvement de sang, les rats seront mis à mort afin de permettre le prélèvement d’organes et de pouvoir ainsi réaliser un ensemble d’analyses permettant d’étudier les effets de l’inflammation générale induite et des traitements avec les 4 formulations évaluées sur ces organes.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro (culture de cellules) ou ex vivo (organes isolés) pour évaluer les effets anti-inflammatoires de formulations au travers de paramètres physiologiques tels que la température corporelle et surtout de paramètres comportementaux. Les 4 formulations qui seront évaluées dans ce projet ont cependant été sélectionnées sur la base d’études in vitro ayant démontré des propriétés anti-inflammatoires qu’il est donc nécessaire de confirmer in vivo sur un modèle animal avant d’envisager un développement chez l’Homme.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir de résultats d’études antérieures et d’un calcul de puissance statistique. Sur la base de ce calcul il est nécessaire d’utiliser au moins 9,5 rats par groupe de traitement pour 6 groupes de traitement. Nous utiliserons donc des groupes de 10 rats.

Raffinement

Les administrations et les mesures de température corporelle ne pouvant pas être effectuées sous anesthésie afin de ne pas impacter la physiologie et le comportement des rats, et de ne pas intérférer avec l’interprétation des résultats de l’étude, les rats seront observés quotidiennement depuis leur arrivée jusqu’au démarrage des expérimentations, et toutes les heures pendant les 24 heures de l’expérimentation. Leur poids sera mesuré avant l’induction ou non de l’inflammation générale et 24 heures après. Si des modifications importantes du comportement sont observées suite à l’induction de l’inflammation générale ou les administrations des traitements, ceux-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Des briques d’Aspen seront placées dans chaque cage de rats comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacées lors de chaque change de litière.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de la réponse à l’induction d’une inflammation générale, sa facilité de manipulation pour la réalisation d’injections en condition vigile et pour l’évaluation comportementale largement décrite dans la littérature scientifique sur cette espèce. Les animaux seront de jeunes rats âgées de 6-7 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7-8 semaines pour la réalisation des expérimentations. Cela correspond à l’âge moyen de rats décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur ce modèle d’inflammation générale, et de rats utilisés lors d’études précédentes menées dans notre laboratoire selon le même protocole expérimental et ayant donné des résultats probants.

448 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat subit l'implantation chirurgicale d'un cathéter dans la veine jugulaire, puis des sessions répétées d'auto-administration intraveineuse de nouvelles drogues de synthèse ou de cocaïne, pour évaluer le pouvoir addictif de ces substances. Le porteur indique que la prise chronique peut induire un état émotionnel négatif, avec poil hérissé, irritabilité et agressivité envers l'expérimentateur. Il affirme que ce type de recherche ne peut être mené que sur un animal vivant, l'étude du comportement exigeant des "réseaux neuronaux intacts et fonctionnels".

Objectifs

Ce projet a pour but principal de dépister et caractériser les effets récompensants de nouvelles substances psychostimulantes de synthèse. En effet, depuis vingt ans, l’usage de ces produits n’a pas cessé d’augmenter ainsi que le nombre de cas d’accidents liés à leur usage. Par exemple, à la fin de 2019, le « Observatoire Français des Drogues et des Tendances addictives pour l’Europe » (OFDT) avait recensé plus de 700 nouvelles substances psychostimulantes. Le problème majeur avec ces nouvelles substances est qu’elles miment l’effet des drogues psychostimulantes traditionnelles (ex. amphetamines) mais qu’elles ont des nouvelles structures chimiques qui ne sont pas connues et classifiées par la législation française et européenne et donc, qu’elles peuvent être librement achetées et utilisées. Ainsi, il existe un important décalage temporel entre l’apparition des intoxications et les fatalités liées à leur usage, et le moment où elles sont déclarées illégales et que leur vente et leur usage sont interdits. Le but principal de ce projet est d’identifier et caractériser précocement les nouvelles substances psychostimulantes de synthèse qui présentent un risque d’abus important afin d’informer le législateur sur les mesures à mettre en place le plus rapidement possible pour limiter les risques associés à leur usage. Ce projet fait partie d’un projet international financé par l’Union Européenne qui prévoit l’interaction étroite entre des spécialistes de différents domaines allant de la chimie en passant par les modèles d’addiction in vivo. Notre rôle dans le projet est de tester chez le rat le pouvoir addictogène de nouvelles substances psychostimulantes en utilisant l’auto-administration intraveineuse. Pour cela, nous allons tester les effets récompensants de 8 nouvelles substances psychostimulantes de synthèse sélectionnées par le consortium européen en fonction de leur risque d’abus prédit sur la base « théorique » d’une comparaison de la structure chimique des nouvelles substances psychostimulantes de synthèse avec celle des molécules connues.

Bénéfices attendus

Les nouvelles substances psychostimulantes de synthèse constituent un risque majeur pour la santé humaine. Ce projet permettra d'être en capacité d'anticiper les risques d'abus de ces nouvelles substances psychostimulantes de synthèse ce qui permettra aux autorités judiciaire et policière de mettre en place des contre-mesures pour limiter les dégâts induits par ces molécules. Ce projet, financé par l’Union Européenne, devrait permettre de coordonner les efforts de lutte contre ces nouvelles drogues.

Procédures

Tous les rats (448) seront soumis à une chirurgie d’implantation de cathéter dans la veine jugulaire sous anesthésie générale de 15 minutes pour pouvoir suivre les sessions d’auto-administration de drogue. 224 rats suivront 21 sessions d’auto-administration de nouvelle substance psychostimulante de synthèse (20 sessions de 2h et 1 session de 5h à raison d’1 session par jour). 224 rats suivront 20 sessions d’auto-administration de cocaïne (1 session de 2h par jour) et 15 sessions d’auto-administration de nouvelle substance psychostimulante de synthèse (12 sessions de 2h et 3 sessions de 5h à raison d’1 session par jour). Tous les rats (448) seront pesés 16 fois (2 fois par semaine, 10 secondes par pesée, pendant 8 semaines).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour cette procédure sont : - cathéter : gène légère - auto-administration : La prise de drogue chronique (bien que volontaire) peut causer un stress modéré chez certains individus, ce qui est attendu car, comme chez l’Homme, un état « dépendant » chez le rat peut être associé à un état émotionnel négatif. Cet état peut se révéler par le poil hérissé, par une certaine irritabilité et agressivité envers l’expérimentateur, mais pas d’agressivité vis-à-vis des congénères. Dans la plupart des cas, cet état est transitoire et l’état du pelage et les niveaux d’agressivité reviennent à la normale après quelques semaines. - stress léger lié à l’isolement temporaire (2jours) des animaux au cours du projet

Devenir

Tous les animaux, à l’issue de tous les tests d’auto-administration, seront mis à mort pour le prélèvement de leur cerveau pour pouvoir étudier les mécanismes cérébraux des nouvelles substances psychostimulantes de synthèse.

Remplacement

Ce type de recherche, visant à comprendre les effets comportementaux des drogues d’abus, peut-être uniquement menée sur un animal vivant. En effet, l’étude du comportement nécessite la présence de réseaux neuronaux intacts et fonctionnels qui sont uniquement accessibles dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. Il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Des études statistiques préalables nous ont permis de définir les effectifs nécessaires à la réalisation de ce projet de façon à mettre en évidence des différences significatives tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles et en ayant recours à des analyses statistiques . Ainsi 14 animaux par lot seront nécessaires à notre étude, avec 32 lots, soit 448 animaux au maximum. Les cerveaux seront prélevés après la mise à mort à la fin des procédures afin de constituer une banque de tissus utilisable si besoin.

Raffinement

Nous avons planifié ce projet en gardant à l'esprit la nécessité de réduire, sinon de soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse des animaux, et dans le but d'obtenir plus d'informations pertinentes à moindre coût en terme de "mal être" animal. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal. En cas d’apparition de signes de mal-être, et suivants des points limites établis, une prise en charge adaptée et sans délai sera appliquée et un traitement antalgique sera mis en place si nécessaire. Le bien-être animal est également assuré pendant la chirurgie par le recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques. De plus, pendant la chirurgie l’animal sera placé sur un tapis chauffant pour assurer le maintien de sa température corporelle. Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger ou tunnel) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum. Les manipulations sont réalisées par des expérimentateurs expérimentés et compétents.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux car les rats ont des réponses aux drogues qui sont similaires à celles de l’Homme et ils s’auto-administrent toutes les drogues abusées par l’Homme de façon spontanée. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est à dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus pour un meilleur reflet de ce que l’on trouve chez l’Homme. Les rats Sprague-Dawley sont les plus utilisés dans le domaine biomédical. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet (qui durera environ 3 mois) afin de limiter le risque de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rats en phase d’adolescence (juvéniles).

210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une injection de cellules tumorales, des traitements répétés et un suivi de la tumeur par imagerie sous anesthésie, pour tester des chimiothérapies adaptées aux sous-types de cancer colorectal. Le porteur indique que les traitements peuvent provoquer perte d'appétit et de poids, et que toutes les souris ayant reçu des cellules cancéreuses sont tuées pour prélèvement d'organes. Il affirme qu'aucun modèle alternatif ne permet d'étudier l'évolution dynamique du cancer colorectal, les molécules ayant déjà été sélectionnées in vitro.

Objectifs

Les cancers colorectaux (CCR) font partis des cancers les plus fréquents en France avec 43336 nouveaux cas en 2018 et représentent la deuxième cause de mort par cancer avec 17117 décès. Ils peuvent être classés selon un consensus de quatre sous-types moléculaires. Un de ces sous-types est notoirement résistant aux interventions thérapeutiques, comme démontré par des études précliniques et des observations cliniques rétrospectives. En se basant sur ce constat, nous avons réalisé des criblages pour identifier les médicaments qui agissent sélectivement sur de telles cellules. Nous avons donc démontré dans des expériences in vitro que 2 molécules sont particulièrement efficaces contre une lignée cellulaire humaine du sous-type résistant mais pas contre une lignée cellulaire non résistante. Nous souhaitons donc confirmer ces résultats in vivo afin de pouvoir par la suite trouver les schémas de chimiothérapie les plus adaptés en fonction des CMS.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique des chimiothérapies adaptées aux différents sous-types moléculaires spécifiques du cancer colorectal. Les résultats ont donc le potentiel d'améliorer les méthodes de traitement de certains cancers colorectaux.

Procédures

Les souris recevront une injection de cellules tumorales par animal. Cette procédure durera en moyenne 5 min. Par la suite, les souris seront manipulées brièvement 1min 2-3 fois par semaine pour mesurer la croissance tumorale. Les traitements se font sous anesthésie local par injection. une fois tous les 2 jours. L’injection prend 1 min. Une fois par semaine,la croissance tumorale et l’apparition de métastases sera suivi avec la machine d'imagerie en bioluminsescence : sous anesthésie générale (durée maximum 5 minutes).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à : - Une injection de cellules tumorales sous anesthésie, avec croissance tumorale limitée - L’injection de traitements - Un suivi de la croissance tumorale par contention de l’animal vigile à l'aide d'un pied à coulisse 3 fois par semaine Ces différentes manipulations pouvent entrainer du stress chez l’animal. Les traitements chimiotherapeutiques peuvent entrainer une perte d’appétit et donc une perte de poids chez la souris.

Devenir

Toutes les souris auront reçu des cellules cancéreuses, il n’est donc pas possible de les garder en vie à la fin de la procédure. Des prélèvements post-mortem d'organes et de tumeurs pour analyse seront également effectués.

Remplacement

Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour étudier l’évolution dynamique du cancer colorectal et trouver des chimiothérapies adaptées. Les traitements ont déjà été testés et sélectionnés in vitro sur des lignées cellulaires cancéreuses caractéristiques dérivées de patients.

Réduction

Pour la réalisation de ce projet, nous utiliserons des groupes de 10 souris (avec un maximum de 210 animaux) pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous chercherons à regrouper les expériences dans le but de réduire le nombre d'animaux contrôles. Les échantillons obtenus seront partagés avec des collaborateurs.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, au moins une fois par semaine et avant euthanasie lors de l’expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids, de tunnels en carton. Des mesures seront prises pour limiter le stress: plusieurs souris par cage pour un élevage social (mais maximum 5 par cage, exclusion des souris agressives), animaux hébergés au calme. Les manipulations, injections et l’euthanasie seront réalisées à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les procédures expérimentales seront effectuées sous anesthésie.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : De par sa petite taille, la souris est un animal facile à manipuler et il est possible d’en héberger un nombre relativement important. C’est aussi un animal suffisamment grand pour pouvoir recevoir des injections de cellules tumorales. La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en technique et de suivi microbiologique et vétérinaire. La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux sont utilisés au stade adulte (8 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

504 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit sous anesthésie deux injections d'air pour former une poche cutanée, puis une injection infectieuse par la bactérie Cutibacterium acnes, avant un prélèvement sanguin terminal, pour étudier la réponse inflammatoire à ce microbe impliqué dans les infections de prothèses. Le porteur indique que l'infection peut provoquer gonflement, écoulement, perte de poids et repli de l'animal. Il affirme avoir atteint "les limites des modèles in vitro" et juge indispensable l'étude d'un "hôte complet".

Objectifs

Le projet vise à étudier la réponse de souris mise en contact avec une bactérie causant des infections lors de la mise en place de prothèses (Cutibacterium acnes (C. acnes)). En effet, ce microbe est responsable de nombreuses infections qui ont la particularité ne se manifester que très discrètement, voire pas, au niveau clinique aboutissant à une prise en charge trop tardive. Nous cherchons donc à caractériser la réponse de l’organisme à ce microbe afin de savoir si cette faible réponse est liée à un défaut de reconnaissance par l’hôte ou bien à la mise en place de stratégies de défense par le microbe. Les microbes utilisés seront de deux types : une bactérie de référence commercialement disponible et trois bactéries récupérée sur des infections humaines cliniques réelles. Ces bactérie ont déjà été étudiées en laboratoire dans le cadre d’interactions avec des cellules du système immunitaires de l'homme et ont permis de mettre en évidence une réponse augmentée lors de l’utilisation des souches cliniques. Cependant, ces conditions d’étude étant extrêmement éloignées de la réalité il est nécessaire d’analyser la réponse du système immunitaire dans un organisme complet afin de pouvoir conforter les réponses obtenues in vitro et pouvoir ainsi envisager de découvrir de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous proposons donc d’utiliser un modèle d’étude, développé chez la souris, des réponses de l’organisme vis-à-vis d’agents infectieux afin de collecter, quantifier et identifier la réponse de l’organisme. Ce travail permettra de mieux comprendre les interactions entre les cellules de l’hôte et le microbe dans un contexte d’infection sur prothèse et donc à plus long terme mieux lutter contre ce type d’infections. Ce projet nécessitera l’utilisation d’au minimum 126 souris et n’excèdera pas 504 souris. Des procédures de réduction faisant appel à des analyses intermédiaires de la réaction permettront de stopper toute condition d’expérience qui ne fonctionne pas ou génère un mal-être exagéré des animaux et ainsi de réduire au maximum le nombre d’animaux exposés.

Bénéfices attendus

Cutibacterium acnes (C. acnes), microbe naturellement présent sur la peau humaine, est surtout connu pour son rôle dans l’acnée. Cependant ce microbe est également identifié comme responsable d’infections au niveau des os, et plus particulièrement autours des prothèses articulaires (IOA). La prise en charge des infections à C. acnes est complexe et coûteuse avec la nécessité de coupler plusieurs antibiotiques et la nécessité d’un changement de prothèse, et donc de nouvelles interventions chirurgicales pour le patient. C. acnes semble pouvoir échapper au système de défense de l'organisme probablement, en partie, grâce à sa capacité à se dissimuler. Peu de données sont disponibles sur l’existence de marqueurs spécifiques de ces infections. Aussi, le projet ici présenté nous permettra d’étudier la réponse de l'organisme, dans un environnement proche de celui qui est retrouvé autour d’une prothèse, induit par diférentes souches de C. acnes. Rapidement, ce travail permettra de mieux comprendre les interactions entre l'organisme et ce microbe. A plus long terme, les résultats obtenus devraient permettre d’améliorer la prise en charge des patients souffrant d’une infection ostéo-articulaire et donc mieux lutter contre ce type d’infections.

Procédures

Chaque animal sera soumis à deux injections d’air sous la peau pour former une poche ainsi qu’à une injection supplémentaire pour l’infection. Un prélèvement sanguin terminal sera réalisé. Chaque injection sera précédée d’une anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Nous proposons d’utiliser le modèle de poche a air car il est souvent utilisé en recherche et n’entraine pas de souffrance particulière chez l’animal. Il permet de délimiter physiquement une cavité qui permettra de contenir les agents pathogènes en évitant leur dissémination dans le corps de l’animal. Compte tenu des éléments disponibles dans la littérature, nous n’attendons pas une très forte réaction qui pourrait changer le comportement des animaux. Néanmoins il est possible d’observer un gonflement, un écoulement et/ou une irritation susceptibles d’amener à une diminution de l’activité de l’animal, pouvant l’empécher de se nourrir correctement et donc mener à une perte de poids et un comportement de repli.

Devenir

A l’issue des procédures tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour observer le recrutement des cellules immunitaires ainsi que du sang pour d’autres analyses indispensables à l’évaluation de la réponse inflammatoire.

Remplacement

Une phase initiale de recherche in-vitro a permis d’apporter un grand nombre de données concernant les capacités de réponses du système immunitaire face aux infections par C. acnes. Cet agent microbien est incriminé dans de nombreuses infections sur matériel prothétique qui ont la particularité de ne se manifester que très discrètement, voire de façon paucisymptomatique, au niveau inflammatoire. Cette diversité a été retrouvée in-vitro. Les 4 souches étudiées ont déjà été étudiées in-vitro dans le cadre d’interactions avec des cellules de l’immunité et ont permis de mettre en évidence des réponses inflammatoires différentes. Nous cherchons maintenant à caractériser la réponse d’un hôte complet afin de déterminer si cette très faible réponse est liée à un défaut de reconnaissance par l’hôte voire à une réponse complexe faisant intervenir les différents acteurs du système immunitaire ou bien à la mise en place de stratégies particulières par le microorganisme, les modèles de culture cellulaire étant assez éloignés de la réalité physiologique. Dans ce cadre, nous pensons avoir atteints les limites des modèles in vitro disponibles concernant les informations que nous pouvons obtenir. Aucun test alternatif ne peut remplacer l’étude in vivo de l’intégralité des systèmes physiologiques de l’hôte impliqués dans la réponse inflammatoire aigüe vis-à-vis des infections bactériennes

Réduction

Des méthodes de réduction du nombre d'animaux impliqués dans l'expérimentation (mise en place d'expérimentation sur un nombre réduit d'animaux avec poursuite uniquement si l'expérimentation fonctionne, arrêt précoce des conditions jugées non exploitables, analyse/projection mathématiques à mi-parcours avec arrêt de l’étude si aucun résultat exploitable ne peut être envisagé) seront appliquées. Pour que les valeurs obtenues soient exploitables du point de vue statistique un nombre minimum de 6 animaux par groupe sera utilisé. Les données quantitatives obtenues seront analysées par des tests permettant la comparaison d’échantillons de faible taille. Une logique d’arrêt des procédures est mise en place : en cas de dépassement par 3 animaux pour chaque groupe de points limites, la procédure sera interrompue.

Raffinement

A leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés pendant une semaine pour leur permettre de s’acclimater à leur nouvel environnement. Les cages seront enrichies de divers matériaux permettant aux animaux d’exprimer des comportements variés dans leur lieu d’hébergement. Tout au long de l’étude, un suivi régulier sera effectué de façon à observer l’apparence, le comportement des animaux et à contrôler l’absence de points limites tout au long de l’étude. A chaque manipulation les animaux seront anesthésiés afin de limiter le stress et la douleur. Un suivi rapproché sera effectué dès les premiers signes d’inconfort détectés. Un protocole de suivi définissant des points limites aisément mesurables ainsi que les mesures à prendre en cas d’atteinte est réalisé conformément aux études de prise en charge des éventuelles souffrances exprimées. Ainsi, en fonction du résultat, une prise en charge adaptée sera réalisée. En cas de situation non connue l’appel à un vétérinaire sera réalisé.

Choix des espèces

Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique rencontrée en médecine humaine, les souris C57Bl6 utilisées seront des souris adultes âgées de 8 semaines.

185 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une transplantation de microbiote de patients par gavages répétés ou une induction d'arthrite par injection d'anticorps, l'implantation chirurgicale d'un capteur de télémétrie, puis un test de sensibilité tactile de von Frey, pour étudier le rôle du microbiote intestinal dans la douleur de la polyarthrite rhumatoïde. Le porteur indique que l'induction d'arthrite peut provoquer diarrhée et déshydratation et que les mesures cardiaques imposent un isolement en cage individuelle. Il affirme qu'aucun modèle de substitution ou in silico ne convient, la perception de la douleur étant selon lui propre à "l'organisme conscient".

Objectifs

Il existe actuellement de très nombreux traitements pour les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde (PR). Bien que ces traitements soient très efficaces sur l’inflammation, on observe chez 20 à 30 % des patients la persistance de douleurs chroniques diminuant grandement leur qualité de vie au quotidien. Ces patients présentent une sensation douleureuse déclenchée plus facilement que ches des personnes non atteintes. C'est la sensibilisation des voies nerveuses de la douleur. Ce mécanisme pathologique est responsable de la douleur chronique. De plus en plus de travaux montrent que le microbiote intestinal agit sur le contrôle de la douleur. On parle de l’axe intestin-cerveau. Cet axe repose entre autres sur les voies d'entrée de la douleur via le nerf vague parasympathique. Nous émettons l’hypothèse que le microbiote intestinal des patients atteints de PR est à l’origine de la sensibilisation de la douleur en modulant les neurones parasympathiques. Une fois altérés, ces neurones vont entrainer des douleurs pathologiques chroniques, malgré le contrôle l’inflammation articulaire. Notre objectif est d'évaluer in vivo l’impact du microbiote intestinal sur la sensibilisation à la douleur et sur la fonction du système nerveux parasympathique dans un contexte de polyarthrite rhumatoide. Nous voulons identifier quels facteurs issus du microbiote intestinal est/sont impliqué(s).

Bénéfices attendus

Une fois la preuve de concept apportée, l'analyse et la comparaison des souches bactériennes et métabolites du microbiote des différentes conditions (polyarthrite douloureuse, non douloureuse et de différents groupes contrôles), en fonction du stade clinique et de la sensibilisation obtenue in vivo permettront d’identifier quels facteurs du microbiote pourraient être impliqués dans ce mécanisme allodynique. Ceci ouvrira de nouvelles voies de recherche sur ce phénomène pathologique. De plus, une fois le facteur identifié, nous pourrons continuer d'explorer ce mécanisme in cellulo (neurones de ganglions jugulaires et noueux murins contenant les corps neuronaux des afférences du parasympathiques).

Procédures

Selon le groupe de souris, les animaux auront soit un transfert de microbiote intestinal de patients (4 gavages (durée 2 à 4 minutes) sur 4 semaines, précédés d'une semaine d'antibiotique par voie orale), soit une induction de polyarthrite rhumatoïde (injection d'anticorps anti-collagènes). Tous les animaux auront une implantation de capteurs de télémétrie sous-cutanée pour enregistrement de l'électrocardiogramme (2 mesures). L'implantation chirurgicale en sous cutanée dure environ 20 minutes. D'une manière hebdomadaire, des recueils de selles seront effectués et une pesée sera réalisée. Un test de détermination de la sensibilité tactile sera effectué à 2 temps du protocole (avant/après). La durée du test de Von Frey est d'environ 20 minutes par animal. Plusieurs prélèvements seront effectués en post-mortem.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés à des fins d'enregistrement de l'electrocardiogramme devront être mis en cage unique. Concernant l'execution du test de sensibilité tactile (Von Frey), ce dernier sera mené de manière éthique et consiste à ne pas faire durer l'inconfort/la douleur d'un animal au cours du test. L’étude de la douleur se fera donc dans la recherche des seuils de douleur avec un cut off pour ne pas faire souffrir en excès les animaux. Concernant l'induction d'arthrite, l’injection de LPS peut entraîner des diarrhées et une déshydratation.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort pour éffectuer des prélèvements, soit pour récupérer le télétransmettteur de télémétrie.

Remplacement

Ce projet s'interressant aux mécanismes de régulation de la douleur par le microbiote intestinal, il n'existe pas de modèle de substitution ou in silico permettant d'étudier les mécanismes mis en jeu. Par ailleurs, la perception de douleur est un phénomène appréhendé par l’organisme conscient, et lui seul. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.

Réduction

Pour réduire la variabilité interindividuelle et donc le nombre de souris nécessaires pour démontrer un effet, nous utiliserons des lots d’animaux du même âge et du même genre au moment de l’initiation du protocole. Nous avons fait le choix de méthodes (télémétrie, von Frey), permettant le suivi des animaux dans le temps pour réduire le nombre de groupes utilisés et obtenir le maximum d'information sur chaque animal. AInsi nous étudierons les paramètres avant/après intervention sur le même animal. De plus, nous effectuerons les mesures d'ECG, de pharmacologie, les tests d'allodynie, les analyses de microbiote chez le même animal afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et augmenter la puissance statistiques des tests (tests appariés). Les tissus d'intéret (tissu nerveux, cardiaque, digestif) seront prélevés sur tous les animaux en vue de leur étude ultérieure.

Raffinement

Les souris sont hébergées dans l’EU, régulée à 22-24°C avec un cycle jour/nuit 12h/12h, avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau de boisson et un bruit de fond d’ambiance. Les conditions de stabulation sont effectuées en ambiance EOPS (pas de pathogène, pas d'opportuniste, pas de parasite) avec maintien en groupe dans des cages de taille appropriée avant inclusion dans le protocole. Les animaux sont stabulés en condition d'enrichissement intermédiaire (copeaux de différentes origine et texture, cotons et substrat de nichage, aliment accessible sur le substrat au besoin). Une visite quotidienne par un zootechnicien ou investigateur principal des animaux pour le suivi journalier est effectuée. L'ensemble des procédures sera réalisé avec l'objectif de réduire /limiter l'angoisse tout au long du projet, de limiter la douleur au seul besoin du projet (test d'allodynie de von Frey) en utilisant les méthodes appropriées d'analgésie et d'anesthésie lors de l'implantation des capteurs de télémétrie., et dans le respect de l'animal. Une grille d'évaluation clinique et des actions à mener en conséquences est mise en annexe. En particulier, le jour de l’implantation ECG, les animaux sont surveillés une fois par heure. Puis, les animaux sont surveillés une fois par jour. En cas de présence de douleur (échelons décrits dans la grille), un renforcement des visites sera conduit : Echelons 1 & 2 : 2 à 3 visites/jour; Echelon 3 : 4 visites/jour et 1 visite/heure en échelon 4. Si l’animal est inactif, incapable de se déplacer, avec les poils très hérissés, le dos courbé (possibilité de décubitus latéral) et des difficultés respiratoires ou bien avec les yeux fermés, et une perte de poids (>15% du poids initial), la mise à mort de l’animal est décidée.

Choix des espèces

Le projet utilise la souris car c’est le modèle mammifère de référence pour les expériences de transfert de microbiote chez l’animal in vivo, permettent d’évaluer les conséquences fonctionnelles intégrées d’un microbiote précis. La régulation autonomique (afférences/éfférences) est largement similaire entra l'Homme et la souris, tout comme les mécanismes de l'allodynie. L'expérience du laboratoire dans le transfert de microbiote chez la souris, dans les investigations cardiaques et autonomique (HRV) permet d'éviter une mise au point/validation du protocole et la consommation d'animaux pour cela. Par ailleurs, un projet connexe sur le modèle murin est déjà en cours sur cette thématique au laboratoire. L’arthrite sera induite chez des animaux de 10 à 12 semaines d'âge comme cela est conseillé dans la littérature. Le protocole d’humanisation nécessitera 4 semaines et donc l’utilisation de souris âgées de 8 semaines pour qu’elles atteignent les 12 semaines au moment de l’induction de l’arthrite.

50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections sous-cutanées puis des mesures d'électromyographie et de contractilité musculaire sous anesthésie gazeuse, pour mettre au point une technique de mesure de l'activité électrique du muscle sur un modèle de myopathie de Duchenne et un modèle de vieillissement. Le porteur indique que les souris âgées peuvent présenter une perte de poids massive ou des tumeurs, et les souris Duchenne des atteintes locomotrices. Il affirme que ce test ne peut pas être reproduit sur un modèle cellulaire, aucun organoïde ne reproduisant le nerf, la jonction neuromusculaire et le muscle.

Objectifs

Au cours du vieillissement et dans de nombreuses maladies neuromusculaires (myopathies), la masse et la fonction musculaires diminuent progressivement. Lorsque la perte musculaire est excessive, elle peut conduire à une pathologie : l'atrophie musculaire. L'atrophie est à l'origine d'une détérioration générale de la condition physique qui se traduit par un risque accru de chutes, des problèmes moteurs et une perte d'autonomie progressive. Elle conduit inévitablement à une augmentation du taux de morbidité et de mortalité. Il n'existe actuellement aucun traitement pharmacologique de cette pathologie. La masse musculaire squelettique dépend de l'état d'innervation des muscles. Lorsque le nerf périphérique est endommagé, la jonction neuromusculaire est altérée et le muscle squelettique subit une atrophie. La diminution d'activité électrique peut être mesurée par la technique d'ElectroNeuromyographie (ENMG) après une stimulation du nerf. Cette méthode donne des indications sur la neurotranmsission du signal électrique. Dans ce projet, nous mettrons en place cette technique au laboratoire. Après mise en place des conditions optimales de mesure, cet outil sera utilisé dans deux populations de souris présentant une atrophie importante: un modèle murin de la myopathie de Duchenne et un modèle de vieillissement. Ces deux modèles ont été choisis car ils seront utilisés par la suite dans le cadre d'un projet thérapeutique visant à corriger l'atrophie.

Bénéfices attendus

Ce projet de développement et validation technologique permettra une meilleure caractérisation de 2 modèles d'intérêt pour notre laboratoire, les modèles murins de Dystrophie de Duchenne et de vieillissement. Leur caractérisation est un prérequis à de nombreux projets thérapeutiques.

Procédures

Les souris seront soumises à des injections sous-cutanées (20 secondes) et à des mesures fonctionnelles: mesure du poids ( minutes -indolore); électromyogramme ( 20 minutes) et mesures de la contractilité musculaire (20 minutes).

Impact sur les animaux

Nous utiliserons des souris âgées qui peuvent présenter une perte de poids massive ou développer des tumeurs et des souris modèle de la pathologie de Duchenne, qui peuvent également présenter des atteintes musculaires affectant leur capacité locomotrice.

Devenir

Tous les animaux inclus dans une procédure expérimentale seront euthanasiés pour prélever et analyser les tissus à la fin de la procédure.

Remplacement

Le projet a pour but de mesurer l'activité électrique passant du nerf au muscle squelettique: ce test ne peut pas être reproduit dans des modèles cellulaires car il n'existe pas de modèle cellulaire ou d'organoides pouvant reproduire le nerf, la jonction neuromusculaire et le muscle. Notre projet nécessite donc l'utilisation d'animaux.

Réduction

Ce projet consistant en la mise en place d'une nouvelle technique, nous n'avons pas les données permettant de calculer les effectifs par statistiques prédictives. Cependant, considérant l'expérience de nos collaborateurs de l'AIM, une mortalité élevée de 20-30% chez les souris agées, des groupes de 10 souris par condition seront nécessaires pour permettre une analyse statistique fiable et éviter que la variabilité des paramètres de mesures in vivo puisse empêcher la bonne exploitation des résultats.

Raffinement

Les conditions d'hébergement et d'enrichissement du milieu sont gérés par l'animalerie. Les souris étant sociables, aucun animal ne sera isolé dans une cage, sauf si des traitements spécifiques s'avéraient nécessaires. Les électroneuromyogrammes, qui mesurent l'activité électrique du muscle, seront réalisés dans un environnement calme, dans une pièce isolée du lieu d'hébergement. Au cours de la procédure, afin d'éviter les douleurs éventuellement créées par la stimulation électrique, une prémédication par un antalgique fort sera administrée par voie sous-cutanée. La procédure sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Les souris seront placées sur une plaque chauffante afin de maintenir la température de leur corps. En fin de procédure, les animaux seront remis dans une cage et surveillés jusqu'à leur réveil. Ils recevront par voie sous-cutané un antalgique fort toutes les 12h pendant 48h.

Choix des espèces

Les souris reproduisent bien les caractéristiques des maladies neuromusculaires, notamment l'atrophie, et sont les modèles les plus couramment utilisés par la communauté scientifiques du domaine pour estimer l'efficacité d'approches thérapeutiques sur des myopathies. Ce modèle est également très bien adapté aux études sur l'atrophie au cours du vieillissement. Le développement de l'ENMG sur cet animal permettra donc de mesurer l'efficacité thérapeutique de nombreux produits dans nos projets futurs. L'anatomie des souris permet d'accéder facilement au nerf sciatique et aux muscles qu'il controle, ce qui facilitera la mise en place de la méthode d'ENMG. Les souris C57Bl6 seront des adultes jeunes (12 semaines) afin que le développement du muscle soit terminé mais qu'il n'y ait aucun signe de vieillissement. Ces souris seront comparées à des souris du même fond génétique agées de 18 mois afin que l'atrophie soit à un stade avancé. Les souris C57bl10 et les mdx seront utilisées à l'âge de 3 à 6 mois (selon les disponibilités des mdx), car les différences d'activités au niveau de l'ENMG sont bien présentes à ces âges.

552 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent sous anesthésie une chirurgie de trente à quarante-cinq minutes pour injecter un marqueur fluorescent dans les embryons, et d'autres femelles reçoivent des embryons génétiquement modifiés, afin d'étudier la létalité embryonnaire liée à des défauts de réparation de l'ADN. Le porteur indique que ces gestes peuvent provoquer douleur et infection post-chirurgicale, et que certaines lignées mutantes développent un déficit immunitaire menant à l'euthanasie. Il affirme que ces questions ne peuvent être étudiées que chez le mammifère "in toto", aucun modèle in vitro ne reproduisant le développement du cortex cérébral.

Objectifs

Les cassures de l’ADN sont des lésions génomiques très toxiques qui interviennent lors du développement du système nerveux central. La mauvaise réparation de ces lésions est à la base de nombreuses pathologies chez l’homme comme certaines maladies neurodégénératives, des déficits immunitaires sévères et le développement de cancers. Chez l’animal, les formes les plus sévères de déficit de réparation des lésions de l'ADN se traduisent par une létalité embryonnaire. Plusieurs facteurs impliqués dans les voies de réparation des dommages à l'ADN ont été identifiés à partir de l’analyse de situations pathologiques chez l’homme et analysés dans des modèles animaux d’invalidation génique afin d’en mieux comprendre la fonction. L'objectif du présent projet est d'identifier les raisons de la létalité embryonnaire de certaines lignées de souris déficientes en voie de réparation de l'ADN. Nous projetons de générer une lignée de souris mutantes incapables de générer les lésions de l'ADN dans le cerveau en développement et d'évaluer si ce fonds génétique peut préserver les animaux déficients en réparation de l'ADN de la létalité embryonnaire.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est la détermination de la fonction des lésions programmées de l’ADN dans les phases précoces du développement du cerveau. Cette fonction est jusqu'à présent inconnue. Cette étude nous permettra alors de mieux comprendre la mort cellulaire neuronale et la létalité embryonnaire qui en découle chez les animaux porteurs d'anomalies de la réparation de l'ADN. In fine, cette étude participera à la compréhension de maladies génétiques de l'enfant caractérisées par des anomalie du développement, l'existence de microcéphalies ainsi que le développement de tumeurs cérébrales et les mécanismes de vieillissement accéléré.

Procédures

Pour générer certaines souris mutantes, 30 femelles pseudogestantes seront réimplantées avec des embryons génétiquement modifiés. Pour l'analyse in vivo des lésions programmées de l’ADN, des embryons à E12.5 ou 14.5 recevront par injection in utero (en une seule intervention et sous anesthésie générale) des souris femelles gestantes un marqueurs fluorescent de ces dommages. La chirurgie dure entre 30 et 45 min selon le nombre d’embryons avec 45 min comme durée maximum.

Impact sur les animaux

Les souris avec un défaut de réparation de l'ADN ont un phénotype dommageable connu ; une létalité embryonnaire. Nous n’envisageons pas de phénotype dommageable des deux lignées mutantes faisant l’objet de ce dossier. L’analyse des lésions de l’ADN dans le cerveau par l'introduction intra-embryonnaire d'un marqueur fluorescent ainsi que la réimplantation d'embryons génétiquement modifiés dans des femelles receveuses peuvent présenter quelques nuisances (douleur, infection post-chirurgicale) liées à l'expérimentation.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure pour prélèvement d'organes et analyses phénotypiques

Remplacement

Les questions scientifiques que nous posons ne peuvent être étudiées qu’in vivo ou ex vivo, sur des cerveaux prélevés sur des embryons. Il s’agit ici d’études sur le développement du cortex cérébral, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère in toto. En effet, le développement du cortex des mammifères et son fonctionnement ultérieur sont de mieux en mieux caractérisés chez la souris et aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de ces processus dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part.

Réduction

Notre expérience préalable sur ce type de modèles animaux nous montre que les phénotypes, lorsqu’ils sont dommageables (létalité embryonnaire, baisse de viabilité avant sevrage ou déficit immunitaire), sont en général suffisamment importants et homogènes pour être statistiquement significatifs sur de faibles cohortes. Nous calculons le nombre minimal d'animaux nécessaire à l'aide d'outils statistiques.

Raffinement

Un des phénotypes dommageables possible des animaux par ailleurs viables étant un déficit immunitaire plus ou moins sévère, ils seront obtenus et maintenus en portoirs ventilés, en zone protégée afin de minimiser leur exposition à des agents pathogènes. Un suivi quotidien permettra de s’assurer que les animaux ne développent pas de signes cliniques d’infection. Devant un état moribond du pelage, une voussure ou prostration sévère ou un amaigrissement important laissant supposer une telle infection ou un mal-être général, les animaux seront systématiquement euthanasiés. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (coton, bâton, tunnel) avec eau et nourriture ad libitum et en groupe social avant et après la procédure. Pour certaines procédures la litière utilisée dans la cage est spécifique pour les animaux opérés et permet de diminuer le risque d'infection de la cicatrice. La nourriture ainsi qu’un gel hydrique sont placés directement dans la litière pour une meilleure accessibilité. Lors des actes chirurgicaux, les souris placées sur une plaque chauffante sont anesthésiées et reçoivent des injections sous-cutanées d'analgésiques en pré́- et post-opératoire. Un gel ophtalmique est également utilisé pour éviter un dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance. Une grille d'évaluation des animaux est mise en place. Une injection d'analgésique ou le sacrifice de l'animal sont envisagés en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle pour mener les études sur le développement du cerveau, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce pour la réalisation du projet. L'analyse des phénotypes dommageables éventuels se fait sur des femelles gestantes pour la létalité embryonnaire et sur des animaux nouveau-nés de la naissance jusqu'au sevrage pour la baisse de viabilité. L'analyse in vivo des lésions programmées de l’ADN est effectuée sur des embryons à E12.5 et E14.5. Les embryons sont ensuite analysés à E16.5 et E18.5 après activation d'un marqueur spécifique fluorescent.