Rongeurs

430 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte du kaolin ou du liquide cérébrospinal dans la grande citerne pour provoquer une hydrocéphalie, puis ils subissent des chirurgies intrathécales répétées, jusqu'à cinq IRM sous anesthésie et une perfusion intracardiaque terminale, pour évaluer la toxicité d'oligonucléotides antisens administrés dans le système nerveux central. Le porteur indique que le modèle kaolin peut entraîner des sécrétions nasales et orbitales de sang et une euthanasie dans les cinq jours. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne récapitule la complexité des mécanismes en jeu et qu'il est "indispensable" d'évaluer cette toxicité avant les études cliniques.

Objectifs

L'hydrocéphalie est une pathologie neurologique dans laquelle une quantité excessive de liquide cérébrospinal (LCS) s'accumule dans le cerveau (au niveau des ventricules, cavités naturelles de cet organe). Il se produit alors une dilatation et les tissus environnants sont compressés entravant le bon fonctionnement cérébral. Les causes d’hydrocéphalie sont multiples : elles peuvent être congénitales, infectieuses, hémorragiques tumorales ou médicamenteuses. L’hydrocéphalie est souvent diagnostiquée avec des tests d’imagerie tels que l’imagerie par résonance magnétique (IRM) qui est devenue l’examen de référence pour ce type de pathologie. En clinique, de nouvelles thérapies utilisant l’administration de molécules appelées oligonucléotides antisens (ASO) sont actuellement proposées. Il s’agit de petites molécules d’acide nucléique qui vont venir réprimer l’expression protéique d’un gène d’intérêt. Ces composés ne franchissent pas aisément la barrière hématoencéphalique; d’où la nécessité, dans le cadre du traitement des atteintes du système nerveux central, d’administrer les candidats-médicaments par voie intrathécale (dans l’espace où circule le LCS). Or, quelques cas d’hydrocéphalie ont été rapportés suite à des injections réalisées par voie intrathécale de ce genre de composés. Dans ce contexte, il apparaît important d’évaluer le profil sécurité des candidats-médicaments en préclinique sur ce point de vigilance. Dans ce contexte, nous proposons d’évaluer en IRM, chez le rat, le risque d’hydrocéphalie associé à l’injection intrathécale d’ASO amenés à être proposés au développement clinique chez l’humain, pour le traitement d’atteintes cérébrales spécifiques. Ce projet se décompose en deux parties. Dans un premier temps, nous chercherons à reproduire, chez le rat, un modèle d’hydrocéphalie déjà bien caractérisé de façon à optimiser l’acquisition et le traitement des données imagerie IRM pour la détection d’anomalies cérébrales associées à cette pathologie. Puis, nous chercherons ensuite à évaluer l’effet de différents ASO administrés par voie intrathécale sur les paramètres volumétriques tels que le volume des ventricules cérébraux, la taille globale du cerveau, et/ou déformations des différentes structures cérébrales. Ce projet permettra de sécuriser l’approche en développement clinique de ces produits qui pourraient être proposés comme traitement de maladies invalidantes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à terme de valider les méthodologies pour la sélection des meilleurs candidats médicaments nécessitant une injection par voie intrathécale pour le passage en développement clinique.

Procédures

• Imagerie IRM sur animal anesthésié : jusqu’à 5 sessions d’imagerie/animal espacées au moins d’une semaine d’intervalle sur une durée maximale de 5 mois. Durée maximale d’une session IRM/animal : 1 heure • Injection unique (CSF ou kaolin) au niveau de la grande citerne. La durée de la procédure n’excèdera pas 20min • Chirurgie intrathécale pour administration des ASO : 3 administrations à une semaine d’intervalle. C’est ce qu’on appelle le « bolus de charge » et qui sera la méthodologie préconisée chez l’humain. La procédure chirurgicale n’excèdera pas 30min • Prélèvements sanguins et de LCS chez animal anesthésié juste au moment du sacrifice (stade terminal sans réveil) • Perfusion intra-cardiaque PFA 4% pour permettre l’analyse histologique post-mortem des tissus cérébraux. La durée de la procédure n’excèdera pas 15min

Impact sur les animaux

Ce projet permettra justement de définir quels peuvent être les effets indésirables associés à l’administration répétée par voie intrathécale (dans l’espace où circule le liquide cérébrospinal) d’un traitement par oligonucléotides antisens (ASO) destiné à traiter des atteintes du système nerveux central ; voie d’administration préconisée chez l’humain. Effets indésirables liés à l’apparition d’une hydrocéphalie chez le rat. Possibilité de sécrétions nasales et orbitales de sang et de liquide clair dans les quelques jours suivant l’induction. Selon la littérature, ces évènements n’ont pas été rapportés dans le modèle kaolin (euthanasie dans les 5 jours suivants l’injection) que nous souhaitons évaluer en imagerie IRM. Effets indésirables liés à l’administration intrathécale de composés. Paralysie des membres postérieurs, inflammation locale au niveau du site d’injection, paralysie motricité vésicale ou digestive. L’administration des composés est réalisée en conditions d’aseptie optimale de façon à limiter la survenue d’effets indésirables associés à cette voie d’administration. Effets indésirables liés aux anesthésies successives Anesthésie gazeuse (isoflurane) durant les examens IRM et procédure chirurgicale. Aucun effet indésirable n’est attendu. Surveillance des paramètres physiologiques (température, respiration) durant toute la session d’acquisition des données imagerie ou chirurgie. Surveillance des animaux (en chambre thermostatée) jusqu’à leur réveil avant réintroduction dans leur cage.

Devenir

Pour chaque procédure les animaux doivent être euthanasiés pour analyse post-mortem (analyse immuno-histochimiques et dosages biochimiques) et corrélation avec les données d’imagerie acquises in vivo.

Remplacement

Il est indispensable de pouvoir évaluer la toxicité de candidats médicaments et définir la marge sécurité pour les futures études cliniques. Actuellement les études in vitro permettent de sélectionner une grande partie des composés et de restreindre drastiquement le nombre de produits qui seront testés in vivo. Cependant, il n’existe aucun modèle in vitro ou synthétique qui récapitulerait la complexité des mécanismes déclenchés par l’administration d’un candidat médicament dans un organisme ; Le recours à l’animal reste donc obligatoire et nécessaire pour envisager les études réglementaires qui permettront de poursuivre le développement du produit jusqu’à l’autorisation de mise sur le marché.

Réduction

Dans ce projet, le nombre d’animaux a été réduit au minimum pour garder une puissance statistique raisonnable et s’assurer que les résultats puissent être exploitables en vue de la variabilité inter-individuelle. Généralement, un minimum de n=10 animaux/groupe est nécessaire quand nous cherchons à mesurer des paramètres en imagerie pour lesquels nous n’avons pas d’expérience au préalable. Le fait d’envisager un suivi continu en imagerie permet de limiter le nombre d’animaux utilisés dans les études en limitant l'euthanasie à différents temps.

Raffinement

Les composantes physiologiques seront surveillées durant les examens d’imagerie : respiration, température corporelle. Le réveil de l’animal se fera en chambre thermostatée avant sa réintroduction dans sa cage L’alimentation et l’eau de boisson seront disponibles à volonté Les procédures de chirurgie intrathécale seront accompagnées par des injections d’analgésiques (avant et après la chirurgie) Les animaux seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens et les expérimentateurs afin de détecter au plus tôt tout signe d’inconfort ou de douleur qui pourraient survenir, et administrer le soin correspondant

Choix des espèces

La réglementation impose que les études de toxicologie soient effectuées sur une espèce de rongeur au minimum. Dans ce projet, le choix du rat est privilégié du fait que l’injection intrathécale des composés est possible chez cette espèce, à la différence de la souris. Les volumes des prélèvements (sang, LCS) pour l’identification de biomarqueurs sont potentiellement également plus importants chez le rat que chez la souris; ce qui facilite les dosages sans à priori. L’évaluation de la tolérance chez le rat de l’administration intrathécale de candidats médicaments préalablement sélectionnés (criblage in vitro/études chez la souris) aidera aux choix des doses à évaluer sur une espèce non rongeur avant le début des essais cliniques où la voie d’administration intrathécale est celle qui sera préconisé chez l’humain. Dans ce projet, nous utiliserons des rats Wistar pour lesquels nous disposons déjà de données historiques concernant les analyses biochimiques et de formulation sanguine. Dans ce ce projet, nous utiliserons des rats jeunes ou adultes, conformément aux requis réglementaires

112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante sous anesthésie une pompe sous-cutanée diffusant en continu de la phényléphrine ou de l'angiotensine II, ce qui provoque une hypertension artérielle, puis elles subissent jusqu'à cinq séances d'imagerie sous anesthésie et un prélèvement sanguin à la queue, pour caractériser un modèle de fibrose cardiaque et tester de nouveaux traceurs d'imagerie. Le porteur indique que la chirurgie mène à un stress et une douleur au réveil qu'il évalue comme modérés. Il affirme que l'étude de la fibrose cardiaque ne peut se passer de l'animal, les modèles cellulaires ne reflétant pas l'environnement neuro-hormonal.

Objectifs

Il existe à l’heure actuelle peu de méthodes permettant un diagnostic précoce de la fibrose interstitielle cardiaque et par conséquent peu de traitements disponibles. L’objectif de ce projet est donc de mettre en place et caractériser un modèle de fibrose cardiaque interstitielle chez la souris, puis d’évaluer de nouveaux traceurs d’imagerie diagnostique précoce de cette pathologie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra dans un premier temps de caractériser un modèle de fibrose interstitielle cardiaque avant d’explorer de nouvelles stratégies de diagnostic précoce. Par la suite, des études visant à évaluer de nouveaux traitements seront possibles avec à terme une possible translation à la clinique grâce à l’utilisation ici des mêmes imageries que celles réalisées chez l’homme.

Procédures

les animaux subiront les actes suivant : * implantation d’une pompe sous-cutanée sous anesthésie générale Durée : 15 à 20 minutes * prélèvement sanguin (procédure 1 seulement) sur souris vigiles : Durée : 30 secondes * Imagerie in vivo avec injection intraveineuse sous anesthésie isoflurane. L’imagerie se déroulera au maximum sur 1h. La procédure d’imagerie n’est pas répétée dans la procédure 1 et sera répétée 5 fois à une semaine d’intervalle dans la procédure 2.

Impact sur les animaux

la chirurgie d’implantation d’une pompe sous la peau fermée par une suture mènera à un niveau de stress et douleur évalué comme modéré au réveil de l’animal. L’infusion continue de 2 composés par cette pompe (phenylephrine / angiotensine II) provoquera une hypertension artérielle également évaluée à un niveau modéré. Le prélèvement sanguin (procédure 1 uniquement) nécessitera une contention de quelques secondes et la réalisation d’une piqure à la queue et est évalué comme léger. Enfin la procédure d’imagerie pourra engendrer un stress léger au moment de la mise sous anesthésie et du réveil de l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir réaliser différentes analyses complémentaires sur le tissu cardiaque.

Remplacement

L’étude de la fonction et de la fibrose cardiaque ne peut se passer d’une étude chez l’animal. En effet, les modèles cellulaires ne reflètent pas l’environnement neuro-hormonal présent physiologiquement, ni la fonction cardiaque dans son ensemble (contraintes de pression par exemple).

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons choisi de construire notre projet en 2 étapes et d’y associer des analyses in vitro. De plus, en comparaison avec une étude classique qui nécessite la mise à mort des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie peut être répétée à différents temps et permet de réduire le nombre d’animaux d’autant.

Raffinement

L’imagerie est une méthode non invasive permettant de réduire la douleur à son minimum. De plus, la majorité des procédures (injection intraveineuse, prélèvements et imagerie) est réalisée sous anesthésie sur lit/plaque chauffant(e) réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Enfin le geste chirurgical appliqué dans ce projet est assez peu invasif (pose d’une pompe sous cutanée) et sera associé à une couverture analgésique.

Choix des espèces

Le rongeur est le modèle de référence en cardiologie car l’environnement neuro-hormonal et la physiologie cardiaque sont proches de l’humain. Les animaux seront commandés à l’âge de 8-9 semaines et seront traités de 10 à 14 semaines comme décrit précédemment dans la littérature

3 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intra-mammaire de cellules tumorales, des chimiothérapies et immunothérapies répétées par voie intrapéritonéale sur deux semaines, des mesures de tumeur au pied à coulisse tous les deux jours et des prélèvements sanguins, pour étudier le rôle d'enzymes dégradant l'ADN tumoral dans l'immunité anti-tumorale. Le porteur indique que les animaux sont mis à mort après avoir atteint les points limites ou pour prélever leurs tissus. Il décrit cette question comme "fondamentale" et affirme qu'une étude sur échantillons humains ne peut remplacer des souris génétiquement modifiées développant des tumeurs mammaires.

Objectifs

Le cancer est la principale cause de mortalité en Europe et 14.1 millions d’individus dans le monde sont affectés par cette maladie. Malgré les avancées technologiques dans le diagnostic et le traitement des cancers, de nombreux patients succombent à la maladie. Il est donc urgent de développer de nouvelles études afin d’améliorer la prise en charge des patients, ainsi que d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de développer des traitements efficaces. Le système immunitaire est au centre de nouvelles approches thérapeutiques et permet d’induire une immunité anti-tumorale et donc la destruction des tumeurs. L’efficacité de ces immunothérapies requiert au préalable une inflammation dans le site tumoral. Celle-ci n’est présente que dans un nombre limité de tumeurs et peut être induite par l’ADN tumoral. De plus, de nombreuses thérapies, incluant la chimiothérapie et la radiothérapie ont été montrées comme induisant une mort des cellules tumorales conduisant à la libération de l’ADN tumoral qui stimule les réponses inflammatoires et « booste » l’immunité anti-tumorale. Ces observations posent la question fondamentale de savoir comment et par quels mécanismes est régulée la capacité de l’ADN dérivé des tumeurs à stimuler l’immunité anti-tumorale. Nous avons caractérisé récemment des enzymes dont la fonction principale est de couper/digérer l’ADN libéré par les cellules mourantes contrôlant ainsi sa capacité à induire une réponse inflammatoire par le système immunitaire. Nos résultats préliminaires suggèrent que la déficience d’une de ces enzymes limite l’impact thérapeutique des chimiothérapies et leur capacité à induire une réponse immunitaire anti-tumorale. Nous proposons donc dans le cadre de cette demande d’autorisation de projet d’étudier les mécanismes d’action de ces enzymes, ciblant l’ADN tumoral, dans la régulation de l’immunité anti-tumorale en réponse aux thérapies conventionnelles (chimiothérapie et immunothérapies). Cela nous permettra de caractériser la fonction de ces enzymes dans la régulation de l’immunité anti-tumorale et d’identifier de potentielles pistes thérapeutiques afin de renforcer l’efficacité thérapeutiques des traitements communément utilisés chez les patients.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de caractériser le rôle d'enzymes ciblant l’ADN tumoral dans la régulation de l’immunité anti-tumorale induite par différents traitements couramment utilisés en thérapie des cancers. C’est une question fondamentale car l’ADN libéré par les cellules tumorales joue un rôle clef dans l’activation de l’immunité tumorale en réponse à diverses thérapies. Il semble que ces enzymes soient requises pour l’induction de l’immunité anti-tumorale induite par certaines chimiothérapies selon nos résultats préliminaires. Ainsi, une meilleure compréhension du rôle de ces enzymes pourrait déboucher sur de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients atteints de cancer.

Procédures

1. L’injection intra-mammaire des cellules tumorales est effectuée sur des animaux anesthésiées en moins d’une minute. 2. Injection intrapéritonéale avec des thérapies anti-cancéreuses conventionnelles (chimiothérapie (5 injections tous les 2 jours) et immunothérapies (3 injections tous les 4 jours) est effectué durant 2 semaines sur des animaux vigiles. Cette injection est très rapide et dure moins de 30 secondes par souris. 3. La mesure de la taille tumorale est effectuée tous les deux jours avec un pied à coulisse sur des animaux anesthésiées. Cette procédure dure moins d’une minute par souris. 4. Les prélèvements sanguins sont effectués sur des animaux anesthésiés à deux reprises espacées de deux semaines. Cette procédure est très rapide et dure moins d’une minute par souris. 5. La vaccination par les cellules tumorales morte en sous-cutanée sur des souris anesthésiées s’effectue à 3 reprises espacées d’une semaine. L’injection dure environ une minute par souris.

Impact sur les animaux

1. La présence de tumeur du sein chez la souris peut impacter le bien-être des animaux. 2. Le traitement des souris par des thérapies anti-cancéreuses conventionnelles (chimiothérapie et immunothérapies) peut induire des effets secondaires (dans notre cas mineurs) qui peuvent impacter le bien-être des animaux. 3. Les prises de sang chez les animaux peuvent conduire à un affaiblissement transitoire. 4. Les injection sous-cutanées et intrapéritonéales peuvent induire un inconfort transitoire des animaux

Devenir

Tous les animaux inclus dans l’expérimentation seront mis à mort à la fin de ce projet, soit après avoir atteint les points limites soit afin de procéder à des prélèvements tissulaires pour des analyses supplémentaires.

Remplacement

Afin d’étudier la fonction des enzymes coupant/digérant l'ADN des cellules tumorales dans l’immunité anti-tumorale et dans la régulation de l’efficacité thérapeutique de traitement anti-cancéreux, nous utilisons des animaux génétiquement modifiés qui à la fois ont des déficiences en ces enzymes digérant l’ADN et développent spontanément des tumeurs mammaires. Ainsi, cette étude ne peut pas être réalisée avec des échantillons humains. De plus nous étudions l’interaction entre le système immunitaire et les cellules tumorales dont la modélisation dans un système d’organoïdes n’est pas à ce jour optimale et ne peut remplacer les modèles in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales ont été déterminés pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes. Nous utilisons les souris femelles pour notre projet car nous travaillons sur le cancer du sein. Cependant, les souris mâles issues de nos croisements ne seront pas mises à morts mais utilisées dans le cadre d’un projet sur l’obésité et pour le maintien de nos colonies.

Raffinement

1.Hébergement : les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention : les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maîtrise des méthodes de préhensions douces, les animaux sont attrapés par la peau du dos afin de ne pas les manipuler par la queue. 3. Formation : une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Minimiser la douleur : Les prises de sang sous mandibulaires, les injections s.c, ainsi que la mesure des volume tumoraux sont réalisés sur des animaux anesthésiés afin de réduire l’inconfort et la douleur incombé par ces procédures.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris pour répondre à nos objectifs de recherche. Les souris sont les animaux de choix pour notre projet car des souches génétiquement modifiées déficientes pour les enzymes qui digèrent l’ADN que nous étudions sont disponibles et permettent de répondre au mieux à nos objectifs. Des souris génétiquement modifiées qui développent des tumeurs mammaires seront aussi utilisées dans notre projet. Celles-ci sont idéales pour notre étude car elles récapitulent très bien le processus de développement des tumeurs mammaires humaines, ce qui en fait un excellent modèle d’étude et facilite l’applicabilité des résultats à l’Homme. Nous utiliserons les souris adultes entre 8 et 14 semaines. En effet, nous nous intéressons au rôle de nos enzymes digérant l’ADN dans l’induction de l’immunité anti-tumorale en réponses aux thérapies conventionnelles dans le cancer du sein, une pathologie qui affecte presque exclusivement l’adulte.

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses du sein sous la peau, puis une résection chirurgicale de la tumeur sous anesthésie et un suivi de l'évolution métastatique. Le porteur mène un criblage pan-génomique par CRISPRi pour identifier des gènes régulant la progression métastatique du cancer du sein. La mise à mort sert à prélever les organes et à rechercher les métastases par imagerie et analyse moléculaire.

Objectifs

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent dans le monde (2,26 millions) et malgré les progrès des thérapies, un grand nombre de patientes décède chaque année des suites métastatiques (685,000). La majorité des cancers du sein sont d’origine canalaire, et 15% sont diagnostiquées in situ, c’est-à-dire qu’ils n’ont pas franchi la barrière physique qui les entoure constituée par la lame basale. Au moins un tiers des tumeurs resteraient in situ et bénignes, et près de deux tiers de ces tumeurs évoluant vers un stade invasif. A ce jour, en absence de marqueurs prédictifs de l’évolution vers le stade invasif, les médecins traitent les patientes porteuses de tumeurs in situ comme si elles avaient des tumeurs malignes. Ceci a un coût humain et économique important qui va en augmentant avec les progrès des techniques d’imagerie. En outre, il n’existe pas de traitement spécifique contre la transition in situ-invasif ou la progression métastatique. Il est urgent d’identifier des biomarqueurs prédictifs pour évaluer le risque de transition vers le stade invasif - première étape du processus métastatique - pour éviter un traitement lourd et inutile aux patientes porteuses de tumeurs bénignes. Il est tout aussi nécessaire de trouver des cibles thérapeutiques pour combattre la dissémination des cellules tumorales. Nous souhaitons identifier de nouvelles protéines inhibitrices de l’invasion, dont la réduction de l’expression a une action pro-métastatique. Jusqu’alors, les divers criblages génomiques de nombreux cancers n'ont pas permis d'identifier de mutations somatiques responsables spécifiquement de la progression métastatique. Une raison possible est que l'acquisition des capacités métastatiques, contrairement à la transformation et à la prolifération, serait principalement causée par des mécanismes de régulation épigénétique, post-transcriptionnelle ou post-traductionnelle. Nous proposons de réaliser un criblage in vivo afin d'identifier les gènes dont la répression de l’expression confèrerait aux cellules tumorales des propriétés agressives et métastatiques. Nous utiliserons les métastases générées après xénogreffe de cellules mammaires humaines comme sources pour identifier les ARN enrichis dans les métastases comparées aux tumeurs primaires. Notre modèle d'étude est le cancer du sein mais les gènes identifiés dans notre étude pourraient permettre de dessiner un paradigme pour d'autres cancers invasifs.

Bénéfices attendus

Au travers de ce projet, nous identifierons de nouveaux gènes régulateurs du processus métastatique dont l’étude permettra une meilleure compréhension de la progression de la maladie cancéreuse et de la transition d’une tumeur in situ à une tumeur invasive. Les gènes identifiés serviront à établir une signature du risque de développer des tumeurs invasives pour aider au pronostic et diagnostic. Enfin, les voies de signalisation associées à ces gènes ouvriront de nouvelles perspectives dans la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques des cancers métastatiques.

Procédures

Sur le plan des gestes chirurgicaux prévus dans ce projet, les animaux receveurs de greffe par voie sous cutanée seront soumis à une résection de la tumeur au site initial d’injection. Les procédures expérimentales de transplantation et de résection seront réalisées sous anesthésie, et la mise en place d’une analgésie pré, per et post opératoire sera assurée pour une bonne prise en charge de la douleur chez les animaux. La durée estimée pour la transplantation (de l’induction de l’anesthésie à la greffe) est de 5 minutes par animal. La procédure de résection (de l’induction de l’anesthésie à la phase de réveil sur tapis chauffant) représente 15 minutes par animal. Le retrait des agrafes qui interviendra 10 à 15 jours après l’exérèse des greffons nécessite 5 minutes par animal. En complément de ces approches, dans le contexte du suivi hebdomadaire, les souris feront l’objet d’une mesure du greffon induit. Ce geste basé sur la de préhension nécessite 1 minute par animal. La surveillance de la survenue métastatique par imagerie optique -de l’induction de l’anesthésie à l’acquisition des signaux bioluminescents - est estimée à 10 minutes pour chaque animal

Impact sur les animaux

Les principaux effets délétères attendus portent sur l’induction d’une pathologie cancéreuse chez le modèle murin. Par ailleurs, l’injection sous-cutanée d’une grande quantité de cellules est connue pour engendrer une réaction inflammatoire mais qui est contenue en raison du statut immunodéprimé de la souche murine utilisée. Outre l’application du principe des 3Rs, afin que ces dommages soient réduits à un minimum, nous procéderons par étape tout au long de ce projet et nous nous appuierons sur la mise en place d’une grille de score pour définir une fréquence d’interventions la plus adaptée afin de garantir le bien-être des animaux. L’expérience préliminaire servira de base pour déterminer l’impact de l’injection de 30x10E6 de cellules, évaluer les caractéristiques cinétiques de croissance tumorale et ajuster au mieux le suivi des animaux. Par ailleurs, les souris feront l’objet d’une phase d’acclimatation en vue de leur inclusion dans les procédures expérimentales et seules les manipulations nécessaires seront effectuées. Nous veillerons à conserver les caractéristiques de l’espèce par le maintien des animaux en groupe tout au long de leur stabulation et l’apport d’enrichissement dans les cages pour améliorer leur bien-être.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure en vue de l'investigation tissulaire ex-vivo. L’analyse des tissus (organes) par imagerie optique nous permet d’explorer la présence de métastases. Les foyers tumoraux distants ainsi mis en évidence seront préparés pour l’extraction de matériel biologique en vue de l’identification des gènes associés à l’évolution métastatique de la pathologie par analyse moléculaire.

Remplacement

Le processus métastatique très complexe impliquant l’organe d’origine de la tumeur, les organes receveurs des métastases et les systèmes de circulation des cellules invasives par voie sanguine ou lymphatique ne peut pas encore être reconstitué in vitro. Si la recherche de nouveaux gènes impliqués dans ce processus par un criblage pan-génomique ne peut pas être effectué in vitro, des méthodes complémentaires pourront tout de même être utilisées pour certaines étapes du projet. Sur la base des gènes identifiés in vivo, on utilisera donc des approches in vitro dès que possible et dès qu’elle sera pertinente en vue de disposer de modèles d’études complémentaires notamment en matière de caractérisation moléculaire. In fine ces modèles d’étude complémentaires nous permettront d’utiliser moins de souris.

Réduction

Dans un souci de réduction du nombre d’animaux, le suivi du développement de la pathologie maligne chez les animaux transplantés se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés non invasifs, tels que la mesure des greffons à l’aide d’un pied à coulisse et le recours à l'imagerie optique in vivo par bioluminescence. Tout au long de ce projet, nous procéderons par étape et nous mettrons en place des groupes contrôles pour nous assurer de la pertinence de notre modèle et passer à l’étape suivante.

Raffinement

Afin d’améliorer le cadre de vie des animaux, les besoins physiologiques seront respectés (nourriture et eau ad libitum). Nous optimiserons les conditions d’hébergement des animaux par la présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés, lanières de papier et/ou coton) et par leur maintien en groupes de 3 à 5 afin d’éviter le stress de l’isolement. Les procédures expérimentales de transplantation seront réalisées sous anesthésie, et la mise en place d’une analgésie pré, per et post opératoire sera assurée pour une bonne prise en charge de la douleur chez les animaux. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.

Choix des espèces

Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. L’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de notre approche, permettant la transplantation de cellules d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris). C’est de plus, le modèle le plus fourni en études pour ce qui concerne le domaine de la cancérologie. Les animaux utilisés dans ce projet seront des animaux à l’âge adulte (8-10 semaines) De par notre expérience et selon les données de la littérature, cette fenêtre d’âge est optimale pour la prise de greffe de cellules tumorales chez le modèle murin dans un contexte de xénogreffe.

213 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des composés perfluorés par voie intraveineuse ou orale, séjournent 24 heures en cage à métabolisme, puis sont tuées après un prélèvement de sang important, l'appareil chauffant utilisé pour l'injection dans la queue pouvant provoquer des brûlures. Le porteur cherche des stratégies pour accélérer l'élimination des PFAS accumulés dans l'organisme. Il affirme qu'il n'est "pas possible de s'affranchir" de l'animal, le devenir d'une molécule n'étant pas prévisible par des études in vitro.

Objectifs

L’objectif du projet est d’élaborer et évaluer une ou des stratégies de remédiation pour augmenter l’élimination corporelle des composés alkyl perfluorés (PFAS) accumulés dans l’organisme et réduire ainsi les niveaux d'exposition systémique des PFAS et leurs impacts sur la santé Pour atteindre cet objectif, il est nécessaire de caractériser les processus physiologiques qui limitent l’excrétion des PFAS et conduisent à leur accumulation. La clairance rénale jouant a priori un rôle majeur par rapport à la clairance biliaire, nous analyserons ensuite les mécanismes qui contrôlent l’élimination rénale des PFAS dont les propriétés de la liaison des PFAS aux protéines plasmatiques et les processus de filtration glomérulaire, de sécrétion et de réabsorption tubulaires des PFAS. Les résultats orienteront les approches exploratoires de remédiation vers l’utilisation d’inhibiteurs de la réabsorption rénale des PFAS. L’étude de la relation entre l’exposition systémique aux PFAS et un ou des biomarqueurs prédictifs de leurs effets perturbateurs métaboliques pourra être utilisée comme critère de jugement de la capcité des approches exploratoires à réduire les concentrations au-dessous des seuils d’expression des effets délétères des PFAS.

Bénéfices attendus

La prévention des effets délétères des contaminants environnementaux repose essentiellement sur la réduction des expositions externes via l’établissement de doses sans danger. Cette approche ne permet cependant pas de protéger l’homme des substances chimiques dont la principale source d’exposition est interne, comme certains des composés alkyls perfluorés (PFAS). La très faible capacité d’élimination corporelle de ces composés serait à l’origine de la demi-vie plasmatique élevée, de certains d’entre eux qui s’élève à plusieurs années chez l’homme, et est à l’origine de leur bioaccumulation. L’augmentation de l’élimination de ces composés représente le moyen de diminuer l’exposition des tissus aux effets toxiques de ces substances. Pour cela, notre approche basée sur la caractérisation des processus physiologiques qui limitent l’excrétion des PFAS et leurs effets toxiques permettra d’identifier des méthodes de remédiation.

Procédures

Dans le cadre de la procédure 1, 84 souris recevront une administration intraveineuse unique (N=42) ou une administration orale unique (N=42). Les souris seront hébergées pendant 24h dans une cage à métabolisme. Un prélèvement de sang unique sera réalisé chez l’animal anesthésié et immédiatement suivi de la mise à mort et des prélèvements de tissus. Six autre souris (contrôles) seront hébergées pendant 24h dans une cage à métabolisme et à l'issue des 24h, un prélèvement de sang unique sera réalisé chez l’animal anesthésié et immédiatement suivi de la mise à mort et des prélèvements de tissus. Au cours de la première étude de la procédure n°2, un prélèvement unique de sang sera réalisé chez l’animal anesthésié (n=15) et immédiatement suivi de la mise à mort. Au cours de la deuxième étude de la procédure n°2, toutes les souris (n=36) recevront une administration orale quotidienne d’un mélange de composés alkyl perfluorés pendant 4 jours et, 3 jours après le début des administrations orales, une administration unique intraveineuse d’iohexol seul (n=12), avec du mannitol (n=12) ou avec un inhibiteur des transporteurs rénaux (n=12). Suite à l'administration intraveineuse, les souris seront hébergées pendant 24h dans une cage à métabolisme afin de recueillir les urines et les fèces. Trois prélèvements sanguins de sang seront réalisés au cours des 24h chez l’animal anesthésié. Le dernier prélèvement sera immédiatement suivi de la mise à mort. Les 60 souris de la procédure 3 recevront une administration orale quotidienne pendant 28 jours. Au bout des 28 jours, un prélèvement de sang unique sera réalisé chez l’animal anesthésié et immédiatement suivi de la mise à mort et des prélèvements de tissus. Les administrations orales seront réalisées par gavage. La durée du gavage varie de 10 à 30 secondes. Les administrations intraveineuses seront réalisées dans une veine latérale de la queue à l’aide d’une seringue à insuline de 0.5ml avec aiguille sertie (0.30mm x 12mm, Aniject 0.5ml INS 100U Pentafine, 30Gx1.2). Les souris seront placées dans le tube de contention de l’appareil illuminateur de queue pour permettre une bonne contention de la queue qui sera placée dans la gouttière prévue à cet effet de façon à ce qu’elle soit éclairée, et forme un angle de 45° entre l’aiguille et la queue. La durée des administrations intraveineuses varie de 30 secondes à 2 minutes. La durée des prélèvements sanguins varie de 10 à 30 secondes.

Impact sur les animaux

Une brûlure de la queue pourrait être induite par l’appareil illuminateur de queue utilisé pour les administrations dans la veine caudale. Cet appareil illumine efficacement la queue mais du fait de la température élevée, la queue ne doit pas être maintenue en continu plus de 2-3 minutes dans la gouttière d’éclairage pour éviter les brûlures

Devenir

Les souris seront mises à mort après le prélèvement d’un volume de sang important qui est requis pour l’ensemble des dosages réalisés pour chacune des procédures du projet (dosage des PFAS, dosage de l’iohexol, évaluation des marqueurs métaboliques).

Remplacement

Pour l’ensemble du projet, il n’est pas possible de s’affranchir de l’utilisation d’animaux vivants car le devenir d’une molécule dans un organisme (pharmacocinétique) n’est pas prévisible par des études in vitro compte-tenu de la complexité des mécanismes mis en jeu (absorption, destruction par la flore intestinale, métabolisme hépatique, diffusion tissulaire, élimination rénale, …).

Réduction

Une réduction très importante du nombre d’animaux sera permise par l’administration des PFAS en mélange. En effet, l’administration simultanée des 10 PFAS permettra d’évaluer sur les mêmes animaux le devenir des 10 PFAS et de réduire d’un facteur 10 le nombre d’animaux. La méthode d'analyse des données qui sera mise en œuvre permettra de réduire à un seul, le nombre de prélèvement par animal. En effet, contrairement aux méthodes classiques d'analyse qui nécessitent d'obtenir un grand nombre de données sur le même animal, cette approche permettra d’analyser simultanément toutes les données obtenues avec des animaux différents. Aucune approche statistique ne sera réalisée.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des milieux enrichis : tunnels et papier pour faire des nids. Excepté lors de l'hébergement en cage à métabolisme, les animaux seront hébergés en groupe. Les animaux seront habitués au contact avec les expérimentateurs et une surveillance accrue des souris par ces mêmes expérimentateurs sera réalisée lors de l’hébergement des souris dans les cages à métabolisme. Les animaux seront également habitués à entrer dans le tube de contention et à séjourner dans une cage à métabolisme afin de les entrainer à coopérer lors des manipulations. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Durant toute l'étude, les animaux seront surveillés deux fois par jour afin de s’assurer de leur prise alimentaire et de leur accès au système de distribution d’eau. Une pesée réalisée toutes les deux semaines permettra de s’assurer de leur prise normale de poids au cours de l’étude. Les procédures n’induisant que peu de souffrance, un animal dont l’état est préoccupant (présentant au moins un des facteurs répertoriés ci-après) serait éliminé et mis à mort car considéré comme anormal par rapport aux autres : mauvais état du pelage, pâleur des yeux ou des extrémités, perte de poids, anorexie prolongée, difficultés respiratoires sévères ou prolongées (particulièrement si accompagnés de cyanose), difficultés digestives (diarrhée prolongées, …), diminution marquée de l’activité ou décubitus latéral, léthargie, hémorragie sévère incontrôlée, déshydratation sévère ou prolongée, signes neurologiques sévères (ex : tête penchée, tremblements, grincement de dents, convulsions, paralysie, incoordination motrice, etc.).

Choix des espèces

La souris est choisie au titre de modèle de référence en toxoicologie. Le choix du modèle des souris femelles C57BL6 s’appuie sur des résultats préliminaires qui montrent la pertinence de ce modèle pour évaluer les effets des PFAS sur le métabolisme énergétique hépatique. Ainsi, une étude récemment réalisée au laboratoire a montré qu’une stéatose hépatique était induite par un traitement par voie orale des souris C57BL6 avec du PFOA à une dose très faible (5 ng/kg.j). De plus, la comparaison des résultats avec ceux précédemment obtenus chez des souris femelles C57BL6 invalidées pour les récepteurs CAR (Constitutive Androstane Receptor) et PXR (Pregnane X Receptor) apportera des informations très importantes sur le rôle de ces récepteurs nucléaires dans les mécanismes de contrôle de la réabsorption rénale des PFAS. Le projet sera réalisée chez des souris adultes âgées de 10 semaines. L’étude toxicocinétique se déroulant sur une période de 120 jours, il est important que les animaux soient au même stade physiologique (adulte) tout au long de l’étude.