Rongeurs
Rôle des canaux TRP dans l’hypersensibilité viscérale générée par la consommation d’un régime riche en fer héminique chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 72 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 24 modéré. Nourries trois semaines à un régime enrichi en fer héminique, 72 subissent une chirurgie d'une à deux heures pour poser un dispositif de mesure puis une pression douloureuse répétée dans le côlon, les 24 autres passant 24 heures en cage à métabolisme. Le porteur teste l'hypothèse que le fer des viandes rouges et charcuteries active des récepteurs de la douleur intestinale, en vue de futures pistes thérapeutiques contre le syndrome de l'intestin irritable. Il affirme qu'aucune approche in vitro n'évalue la sensibilité viscérale et que seule une approche in vivo intégrée le permet.
Objectifs
Le syndrome de l’intestin irritable est une pathologie intestinale chronique très répandue (10-15% de la population), altérant la qualité de vie des patients par l’inconfort digestif et les douleurs abdominales générées, et une cause majeure de consultations médicales dans le monde occidental. Bien que d’origine multifactorielle, des facteurs nutritionnels contribuent fortement à l’aggravation des symptômes. Les viandes rouges et charcuteries ne sont actuellement pas connues comme des aliments associés à l’exacerbation des symptômes de douleurs viscérales associées à ce syndrome mais une étude suggère que le fer héminique de ces produits carnés, de par le stress oxydatif induit dans le côlon, engendre une sensibilité viscérale accrue en réponse à un stimulus douloureux. Une étude complémentaire est nécessaire pour comprendre comment ce stress oxydatif induit cette hypersensibilité. Sur la base de la littérature scientifique et des métabolites identifiés dans le contenu du côlon de souris nourries avec un régime supplémentés en fer héminique, nous émettons l’hypothèse que les métabolites associés à ce stress oxydatif activent au niveau de l’épithélium intestinal certains récepteurs de la famille des TRP, et plus particulièrement 2 d’entre eux, TRPA1 et TRPV1, pour lesquels des inhibiteurs pharmacologiques sont connus et déjà utilisés chez la souris pour inhiber les voies de signalisation suspectées.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mettre en lumière un nouveau facteur alimentaire à prendre en compte dans le régime des patients atteints du syndrome de l’intestin irritable, à savoir la consommation de viandes rouges et charcuteries. Ces données contribueront par ailleurs à préciser les bénéfices/risques et les recommandations nutritionnelles en fer au sein de la population générale. Enfin et surtout, elles devront permettre, par l’approche mécanistique envisagée, de comprendre comment cet inconfort digestif survient. Il s’agit donc d’un prérequis pour envisager à l’avenir de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
24 souris nourries avec un régime supplémenté ou non en fer héminique pendant 3 semaines seront placées chacune 24 heures en cage à métabolisme. 72 souris nourries avec un régime supplémenté ou non en fer héminique pendant 3 semaines seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (analgésiques/myorelaxants) à raison de 1h-2h par intervention pour placer un dispositif de mesure des contractions abdominales. Le nombre de contractions sera compté en réponse à l’application d’une pression intracolique pendant 10 secondes à 4 reprises par palier. Un inhibiteur pharmacologique ou son solvant sera administré par injection intrapéritonéale 2 heures avant la mesure pour inactiver les récepteurs TRPA1 et TRPV1.
Impact sur les animaux
Le stress modéré induit par la stabulation sur grille en cage à métabolisme pourrait modifier la mesure des contractions abdominales, c’est pourquoi ces 24 souris seront uniquement destinées à la collecte des échantillons. Pour minimiser ce stress, une buchette de bois à ronger est ajoutée dans la cage à métabolisme. Pour les souris dont l’amplitude des contractions abdominales sera mesurée, la douleur sera palliée pharmacologiquement pendant l’intervention chirurgicale et en post-opératoire tout en veillant au maintien de la température corporelle par un hébergement dédié en armoire ventilée chauffée, et à la réhydratation des souris. L'injection intra-péritonéale est un geste, rapide et indolore qui sera conduit après convalescence sur les souris vigiles. La pression intracolique appliquée à 4 reprises est associée à un inconfort, un stress et une mobilité réduite de la souris. L’arrêt entre chaque palier permet de retrouver immédiatement un enregistrement de base, signifiant l’arrêt instantané du stimulus douloureux. Si, comme attendu, le/les inhibiteurs pharmacologiques suppriment les effets induits par le fer héminique du régime des souris, alors le ressenti sera similaire à celui des souris sous régime conventionnel. Un personnel compétent ayant l’expérience de ces procédures fera un suivi quotidien pour leur apporter tous les soins nécessaires et maximiser leur bien-être. Il leur assurera en parallèle des manipulations les moins stressantes possibles avec des conditions d'hébergement les plus optimales.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les souris seront mises à mort et divers prélèvements seront effectués post-mortem pour des analyses histologiques et biochimiques ultérieures.
Remplacement
Les modèles cellulaires ont montré que le stress oxydatif généré dans la lumière colique lors de la consommation d’un régime riche en produit carné, pouvaient induire une cytotoxicité différentielle entre des cellules normales et précancéreuses. Cependant, aucune étude in vitro ou ex-vivo à ce stade du projet nous permet d’évaluer les conséquences d’un régime sur la physiologie digestive et plus particulièrement sur la sensibilité viscérale. Seule une approche in vivo intégrée nous permettra de prendre en compte la complexité des répercussions de l'exposition à ces contaminants d’origine alimentaire.
Réduction
Les études précédentes associées à ce projet nous ont permis d’améliorer la procédure en termes de technicité (expérience de l’expérimentateur) et de bien-être (de l’animal). L’amélioration de la prise en charge de la phase opératoire (technicité) et post-opératoire (augmentation de la température de l’hébergement sur 3 jours en armoire à 26°C) a permis de diminuer le nombre d’animaux requis pour aboutir à des résultats significatifs et fiables : de 15 souris initialement par groupe, 12 souris par groupe sont aujourd’hui considérées comme nécessaires pour compenser une variabilité interindividuelle résiduelle. Étant donné l’expertise technique acquise, la reproductibilité des mécanismes induits pour ce projet jusqu’ici, nous estimons qu’une répétition de cette étude ne sera pas nécessaire, ce qui permet de réduire également le nombre de souris requis.
Raffinement
Pour assurer une fiabilité des résultats tout en limitant le nombre d’animaux utilisés, une attention particulière est accordée au bien-être de l’animal (conditions d’hébergement, libre accès à l’eau et à la nourriture, contrôle de l’environnement, respect du cycle jour nuit, manipulations douces). Des buchettes en peuplier disposées sur la litière leur permettront de satisfaire le besoin de ronger. Un abri en aluminium leur permettra de s’y loger. Une observation quotidienne des animaux sera effectuée pour détecter à temps toute anomalie et minimiser la durée de toute souffrance constatée. Toutes les mesures seront prises pour réduire la douleur (anesthésie, prise en charge de la douleur post opératoire, tapis chauffant, hébergement transitoire en armoire chauffée en période post-opératoire, réhydratation...). En parallèle, une combinaison d'analyses statistiques intégratives permettra d'exploiter l'ensemble des données générées et explorer plus finement les intéractions entre l'hôte et son microbiote.
Choix des espèces
La souris est un modèle rongeur largement utilisé pour la mesure de la sensibilité viscérale. Nous avons choisi la lignée C3H/HeN car les travaux précédents de l’équipe avec cette lignée permettent d’avoir maintenant une bonne base de connaissance de sa barrière intestinale, son microbiote, son système immunitaire et de sa réponse à la sensibilité viscérale. Pour l’analyse de la sensibilité viscérale, les animaux seront âgés de 9-10 semaines car il est indispensable d'avoir un tractus digestif à pleine maturité physiologique.
Evaluation de l’imagerie multiparamétrique et spectroscopique pour localiser la zone épileptogène
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
325 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans l'hippocampe pour déclencher une épilepsie, l'implantation d'une pompe sous anesthésie, jusqu'à quatre séances d'IRM et huit jours de médicaments, avant l'analyse de leur cerveau et de leur sang. Le porteur cherche à mieux localiser par imagerie la zone du cerveau à retirer chez les patients épileptiques opérés, les retombées cliniques étant renvoyées à une évaluation en préparation. Il indique qu'une recherche bibliographique n'a révélé aucune alternative in vitro et que les cultures cellulaires ne reproduisent pas la communication entre cellules.
Objectifs
Un tiers des patients épileptiques ne répondent pas correctement aux médicaments antiépileptiques et, parmi eux, 1/4 peuvent bénéficier d'une chirurgie résective. L'identification des zones du cerveau à enlever par chirurgie (la zone épileptogène (ZE)) est un processus difficile. Il nécessite un ensemble d'outils complexes comprenant des examens cliniques, d'imagerie et neurophysiologiques, y compris des enregistrements électroencéphalographiques intracrâniens. Cependant, même en combinant toutes les informations actuellement disponibles, la chirurgie de l'épilepsie ne fonctionne pas correctement chez 20 à 60% des patients. Il est donc nécessaire développer de nouvelles méthodes pour délimiter la ZE. La neuro-imagerie, non invasive et largement disponible dans le contexte clinique, apparaît comme un candidat naturel pour aborder cette question. A terme, l'objectif est d'améliorer la chirurgie chez les patients.
Bénéfices attendus
Les données recueillies dans cette étude nous permettrons de caractériser l'impact de différents médicaments anti-épeliptique sur les mesures IRM (mqMRI et GABA-MRS). Ces informations seront utilisées pour modéliser l'impact attendus des médicaments chez l'homme lors de l'évaluaton clinique qui est en cours de préparation.
Procédures
- Procédures chirurgicales sous anesthésie : i) Injection intra-hipppocampique (induction de l'épilepsie) : durée maximum 1h30. ii) Implantation d'une pompe osmotique sous anesthésie (durée maximum 30min). Maximum deux procédures / animal. - IRM sous anesthésie : maximum 2h30/session IRM, maximum 4 sessions IRM / animal. - Administration de médicaments : durée de quelques minutes / jours pendant 8 jours.
Impact sur les animaux
i) Douleur modérée au moment de l'induction de l'épilepsie, procédure conduite sous anesthésie, ii) Crises épileptiques pendant la phase d'épileptogenèse iii) Douleur modérée au moment du traitement pharmarcologique iv) Douleur légère au moment de l'examen IRM, procédure conduite sous anesthésie
Devenir
Le tissu cérébral et le sang des animaux utilisés dans ce projet est analysé en fin de projet (sauf pour les animaux utilisés pour l'optimisation des protocoles IRM). Tous les animaux sont mis à mort au court du projet.
Remplacement
Nous avons effectué une recherche approfondie sur Pubmed et Google Scholar afin de nous assurer de l'inexistence d'approches alternatives in vitro qui pourraient être utilisées pour reproduire l'interaction entre malformations du développement corticale, crises épileptiques et fonction de la barrière hémato-encéphalique. Nous avons utilisé des combinaisons de mots-clés tels que épilepsie, crise, électroencéphalographie, dysplasie, cerveau, neurone, modèles animaux, in vitro et tests animaux alternatifs. Cette recherche n'a pas identifié de solution in vitro alternative pour notre étude. En effet les méthodes in vitro basées sur la culture cellulaire ne présentent pas les systèmes de communication multicellulaires nécessaires pour ce projet.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats : 15 animaux par groupe sont prévus ainsi que deux groupes pour l'optimisation du modèle animal et de l'imagerie, pour un total de 325 souris sur 5 ans. De plus, nous commencerons ce projet par un groupe préliminaire qui permettra la mise au point du protocole : si cette étude préliminaire révèle que le nombre de rats par groupe est surévalué, nous le réduirons de façon à atteindre un nombre d'animaux nécessaire et suffisant.
Raffinement
L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance (notamment, suppression de la douleur grâce à l’administration d’antalgiques). Les animaux utilisés pour ce projet sont nés et élevés en Europe. Leur nombre a été réduit au minimum nécessaire afin d’obtenir des données suffisantes pour évaluer l’efficacité de cette stratégie d’imagerie pour définir la zone épileptique en cas de prise de médicaments anti-épileptiques.
Choix des espèces
Notre projet propose l'utilisation de petits animaux in vivo (souris). Les souris ont été choisies à cause de leurs caractéristiques neuro-vasculaires et profils électroencéphalographiques bien étudiés. Ils expriment les mêmes marqueurs neuronaux, gliaux et péricytaires que l'Homme. Ils constituent donc un modèle adapté pour les expériences proposées par notre étude, où l'entité neuro-vasculaire complètement fonctionnelle est requise pour investiguer les effets des malformations corticales et des crises. La littérature fournit des preuves de la fiabilité du monitoring électroencéphalographique in vivo et IRM in vivo pour l'évaluation des modifications pathophysiologiques des tissus. De plus, un fort taux de survie est observé lorsque les rongeurs sont utilisés dans ce type d'étude par rapport à d'autres espèces.
Mise au point d’une méthode d’administration orale non invasive chez le rat
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
52 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 36 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 16 modéré. Ils reçoivent des administrations orales répétées pendant 21 jours, soit par gavage soit par une micropipette à l'excipient sucré, subissent deux tests comportementaux (labyrinthe en croix surélevé et openfield), puis sont tués pour doser dans leur sang les substances et les marqueurs de stress. Le porteur présente le projet comme une amélioration du bien-être des rats de laboratoire, la micropipette étant moins stressante que le gavage. Il affirme que cette mise au point doit se faire chez le rongeur puisqu'elle vise à remplacer une technique déjà pratiquée sur lui.
Objectifs
Les études précliniques sont indispensables au développement et à l’évaluation d’une substance active mais également à la détermination d’éventuels effets indésirables de médicaments. Chez le rongeur, il existe de nombreuses méthodes permettant l’administration de principes actifs. Invasives par nature, ces méthodes peuvent entrainer des infections ou lésions au site d’injection. La probabilité de survenue de telles lésions est d’autant plus vraie que la contention – nécessaire à l’administration du principe actif - est mal maitrisée ou moins bien réalisée. De plus, cette contention entraine un stress chez l’animal – qui peut venir à se répéter lorsque le protocole d’administration est chronique. Dans le cas d’étude pharmacocinétique, les modifications des paramètres cardiovasculaires associés à cet état de stress peuvent biaiser l’analyse des données. L’objectif de cette étude est de mettre au point et de valider une méthode non invasive d’administration orale chez le rat ; cette méthode devra non seulement respecter le bien-être animal et de surcroit être comparable à la voie orale chez l’homme. La méthode que nous allons utiliser s’inspire d’une technique décrite et validée chez la souris qui est appellée MDA pour Micropipette-guided Drug Administration (méthode d’administration orale par micropipette). La validation se fera au travers d’une étude pharmacocinétique comparative (gavage versus MDA) de substances actives aux propriétés pharmacologiques et physico-chimiques différentes (prégabaline et aripiprazole). La compatibilité de la méthode à des régimes chroniques d’administration ainsi qu’avec des études comportementales utilisant un nombre d’animaux important seront vérifiées.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de développer un protocole décrivant une méthode d’administration respectant le bien-être animal pouvant être utilisée plus largement en recherche préclinique (notamment chez le rat). La méthode MDA administre à l’aide d’une micropipette, un excipient suffisamment sucré (lait concentré sucré dilué au 3/10ème) pour que les animaux ingèrent son contenu volontairement et que leur motivation reste constante au cours du temps. Cette méthode d’administration peut donc aussi bien être utilisée pour des administrations aiguës de substances actives que pour des administrations chroniques, et ainsi remplacer les techniques conventionnelles plus à risque et plus stressantes. Les bénéfices attendus par rapport aux méthodes conventionnelles sont la diminution du stress dû à la manipulation des animaux (pas de contention) et au fait que cette méthode n’est pas une méthode invasive, la diminution des risques liés aux lésions/irritations des méthodes conventionnelles. De plus, cette méthode étant une méthode d’administration par voie orale, elle se rapproche de la cinétique d’administration la plus utilisée chez l’homme (la voie orale). Cette méthode permet également de minimiser la manipulation des animaux puisque la micropipette peut être présentée aux rats directement à travers la grille de leur cage.
Procédures
Les gestes techniques qui seront réalisés sur les animaux sont des administrations orales : - Administrations aiguës soit par la méthode MDA (micropipette) soit par gavage - Administrations chroniques (1 administration par jour pendant 21 jours) soit par la méthode MDA (micropipette) soit par gavage chronique. En ce qui concerne le gavage, la durée totale de la manipulation de l’animal est de moins de 3 minutes. Pour la méthode MDA, la manipulation de l’animal durera environ 1 minute. Ces administrations sont précédées d’une pesée des animaux.
Impact sur les animaux
Nous souhaitons comparer la méthode testée à une méthode de référence, le gavage, qui peut entrainer un stress chez les animaux notamment du fait de la contention ; mais également des irritations, voire lésions des voies aéro-digestives supérieures. Deux tests comportementaux seront effectués durant l’étude : labyrinthe en croix surélevé et le test de l’openfield. Ces tests peuvent entrainer un stress chez les animaux. Concernant les molécules utilisées pour les administrations, elles ne devraient normalement peu ou pas engendrer d’effets indésirables (risque d’étourdissement, de somnolence ou de légers effets locomoteurs).
Devenir
La mise à mort d’une première partie des animaux permettra d’obtenir des échantillons sanguins pour doser les concentrations en substances actives et vérifier l’équivalence pharmacocinétique entre la méthode MDA et le gavage. La mise à mort de l’autre partie des animaux permettra d’obtenir des échantillons sanguins pour doser des taux de corticostérone et de glucose afin de comparer les niveaux de stress entrainés par les 2 méthodes citées ci-dessus en aigu et en chronique mais également d’évaluer l’impact de l’utilisation d’un excipient sucré sur la glycémie des rats.
Remplacement
L’objectif de cette étude est d’améliorer le bien-être animal, notamment des rongeurs (animaux les plus utilisés lors des essais pré-cliniques), dans la recherche scientifique médicale : diminution du stress, diminution des risques de lésion/irritations par rapport aux méthodes d’administration conventionnelles chez le rongeur. Cette étude vise à améliorer les conditions de manipulation des rongeurs en laboratoire et doit donc par conséquent être effectuée chez le rongeur. De plus, la méthode MDA a déjà été validée chez la souris mais n’a jamais été décrite chez le rat.
Réduction
Le nombre de rats prévu dans les expérimentations a été réduit à son strict minimum. Un seul sexe sera testé afin de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés. Pour la première partie de l’étude (étude pharmacocinétique), des groupes de n=4 rats seront formés (2 méthodes d’administration et 2 molécules testées par méthode) pour un total de 16 rats. Pour la deuxième partie de l’étude, en aigu, 3 groupes de n=4 rats seront également formés (groupe MDA, groupe gavage et groupe témoin). En chronique, il y aura 2 groupes de n=10 pour les groupes MDA et gavage. Le groupe témoin a été, quant à lui réduit à n=4. De plus, en utilisant des rats, nous pouvons réduire le nombre d’animaux utilisés car le rat possède un volume sanguin plus important que celui de la souris et nous permet donc de pouvoir effectuer tous les dosages sanguins en un seul prélèvement.
Raffinement
Diverses mesures seront prises pour raffiner les expérimentations qui ne seront réalisées que par du personnel formé et ayant un livret de compétences à jour. Après leur arrivée au laboratoire, les animaux seront stabulés dans des cages par 2 de surface de 1 092cm2 avec une Longueur de 42cm, une largeur de 26cm et une hauteur de 18,5cm, avec un rouleau en carton et des lamelles de papier kraft afin d’assurer un enrichissement minimum, permettant aux animaux de trouver un abri en cas de conflit et d’avoir une activité minimale (construction de nid). Ils seront laissés au repos sans intervention (hormis la surveillance quotidienne et le change de cage bi-hebdomadaire) durant 1 semaine, ensuite ils seront manipulés quotidiennement (handling) durant 1 semaine afin de les habituer petit à petit au contact humain et à la future expérimentation. Les principaux raffinements de cette expérience concernent les méthodes d’administration. En effet l’objectif de cette étude est de mettre au point une méthode d’administration non stressante qui ne nécessite aucune contention : la méthode MDA (Micropipette-guided Drug Administration). Une partie des animaux sera donc traitée par cette méthode. L’autre sera traitée par gavage (méthode comparative). Afin de raffiner la méthode de gavage, nous utiliserons des sondes de gavage en silicone, qui de par leur souplesse, sont moins susceptibles d’entrainer des irritations et/ou lésions chez l’animal. Les animaux seront pesés tous les jours (suivi de poids individuel). Les méthodes d’euthanasies seront adaptées afin de diminuer au maximum la souffrance chez les animaux. Pour une partie des animaux, l’euthanasie par percussion crânienne sera effectuée, celle-ci est rapide et évitera tout stress. Pour l’autre partie des animaux, l’utilisation d’un anesthésique, le pentobarbital par voie intrapéritonéale sera effectuée pour chaque mise à mort, afin de réduire la douleur de la procédure de dislocation cervicale pour le groupe de rats concerné.
Choix des espèces
L’espèce choisie est la rat (Rattus norvegicus), il s’agit avec la souris, d’espèces très utilisées en recherche pré-clinique. Le rat est une espèce facile à maintenir, en termes de coût et de place, son comportement est bien connu et détaillé dans la littérature et sa proximité génétique avec l’espèce humaine permet d’accéder à des mécanismes cérébraux communs et à des fonctions cognitives et des comportements en beaucoup de points similaires et mesurables (anxiété, locomotion). Du fait de sa taille supérieure, le rat possède un plus grand volume sanguin que la souris et permet donc d’augmenter le nombre d’analyses sanguines réalisées tout en diminuant le nombre d’animaux utilisés. De plus, la méthode que nous cherchons à mettre au point n’a jamais été décrite chez le rat. A leur arrivée, les rats seront âgés de 6 semaines, afin qu’ils atteignent l’âge adulte pour le début de la phase de traitement (après les 2 semaines d’acclimatation).
Contrôle chez la souris et le cobaye d’innocuité non spécifique, de toxicité d’une formule vaccinale destinée aux animaux de rente
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Cochons d'Inde : 600
700 animaux non-humains, 600 cobayes et 100 souris, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent une injection sous-cutanée ou intrapéritonéale d'un vaccin ou d'un adjuvant, puis sont mis à mort en raison de leur statut EOPS qui interdit toute réutilisation. Le porteur présente ces tests d'innocuité comme menés sur des espèces alternatives pour épargner les animaux d'élevage et les chiens, et chiffre qu'un lot contrôlé sur quelques individus libère la vaccination de centaines de milliers d'animaux d'élevage. Il affirme que la Pharmacopée européenne exige ces tests et qu'aucun modèle in vitro ne peut les remplacer sans changement réglementaire.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’être en adéquation avec les exigences réglementaires de la Pharmacopée Européenne et des pays tiers destinataires pour la constitution du dossier d’AMM et pour la fabrication d’un lot commercial. Les tests ont pour but de confirmer l’innocuité et de vérifier la toxicité de vaccins ou principes actifs, et de confirmer l’innocuité d’adjuvants entrant dans la composition de vaccins vétérinaires. Ils sont effectués sur espèce alternative (souris, cobayes) pour limiter le recours à l’espèce cible (animaux de rente). Une équivalence entre les modèles animaux (espèce cible et espèce alternative) a été définie par les Pharmacopées. Ceci permet d’utiliser les modèles rongeurs et d’éviter le recours aux espèces cibles afin de garantir une commercialisation de vaccins sûrs.
Bénéfices attendus
Ces tests garantissent la sûreté et la qualité du produit pour les animaux de rente. Ces tests permettent la libération d’un maximum de doses de vaccins améliorant considérablement la qualité sanitaire des élevages et la sécurité alimentaire des consommateurs. Pour libérer le nombre nécessaire de doses de vaccins vétérinaires nous utiliserons, au maximum, 600 cobayes et 100 souris sur 5 ans. Le nombre utilisé varie d’année en année en fonction du nombre de lots de vaccins ou formules vaccinales à tester et des réglementations des différents pays destinataires. - 1 lot de vaccin contrôlé sur 5 souris et 3 cobayes permet la vaccination de 89 500 chevaux ou 119 000 porcs ou chiens - 1 lot de vaccin contrôlé sur 17 cobayes permet la vaccination de 481 000 bovins ou 962 000 ovins/caprins ou 200 000 équins
Procédures
Deux procédures sont prévues dans ce projet liés aux deux espèces. Les animaux seront soumis à une injection soit par voie sous-cutanée soit intra-péritonéale. Aucun prélèvement n’est réalisé.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les opérations conduites sur les animaux peuvent au plus générer un stress et une douleur légère de courte durée en fonction de l’occurrence des administrations et des examens individuels. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l'animal ne serait plus dans sa zone de confort.
Devenir
Les animaux ayant terminé une procédure ne peuvent pas intégrer une autre procédure comme exigé par leur statut d’animaux EOPS. Ainsi, en fin de procédure, ils seront mis à mort.
Remplacement
La nécessité d’utilisation des animaux provient de la réglementation en vigueur sur ces tests, en conformité avec la réglementation du pays destinataire. Elle permet de démontrer l’innocuité et l’absence de toxicité du vaccin ou de la formulation vaccinale. A ce jour, ces tests in vivo ne sont pas remplaçables par un modèle in vitro. La Pharmacopée Européenne et les réglementations des pays destinataires du produit demandent des tests sur animaux pour la mise sur le marché de lot commercial. Il n’est actuellement pas possible de les remplacer sans un changement de la réglementation de tous les pays.
Réduction
Le nombre, le statut et le sexe des animaux utilisés est décrit dans les réglementations des pays ou par la Pharmacopée. Le nombre d’animaux utilisés par lot est faible (compris entre 3 et 17 animaux). La réduction du nombre est possible grâce à la mutualisation des groupes témoins. Les souris et les cobayes sont des espèces alternatives pour réduire le nombre de tests faits sur les animaux de l'espèce cible (animaux de rente et chiens).
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe et soignés quotidiennement dans des conditions conformes à la réglementation et dans une ambiance propice au bien-être des animaux. Tous les animaux passent par une phase d’acclimatation à leur nouvel environnement d’au moins 3 jours pour les souris et d’au moins 14 jours pour les cobayes avant le début du test. Les animaux ont accès à la nourriture et à l’eau à volonté et sont hébergés dans une ambiance musicale. Des enrichissements sont installés dans les hébergements (alimentaire et/ou objets de type huttes, tunnels, palets de foin de Crau et lanières de nidification selon les espèces). Par ailleurs, ces procédures sont mises en œuvre depuis 2005 conformément à la version APAFIS précédente.
Choix des espèces
Les souris et les cobayes sont des espèces alternatives, décrites dans la Pharmacopée Européenne et les réglementations pour réduire le nombre de tests faits sur les animaux de l'espèce cible (animaux de rente et chiens). En fonction des techniques utilisées, les cobayes pèsent entre 250g et 350g ou entre 350g et 450g et les souris entre 17 et 22 g le jour de l'injection (J0). Ce stade de développement correspond à celui requis pour répondre à la Pharmacopée Européenne et au dossier déposé aux autorités.
Étude du rôle des neutrophiles dans la thrombose associée au cancer du pancréas.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 188 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 36 modéré. Elles reçoivent une implantation de cellules cancéreuses, soit sous la peau soit directement dans le pancréas au cours d'une chirurgie de 45 minutes, des prélèvements sanguins, puis des modèles de thrombose déclenchée au laser ou une thrombose veineuse maintenue 48 heures. Le porteur étudie le rôle d'un globule blanc, le neutrophile, dans la thrombose associée au cancer du pancréas, en situant au long terme et au conditionnel un meilleur traitement chez l'humain. Il affirme qu'aucune lignée cellulaire ne produit ces cellules en quantité suffisante et que l'intégrité du vaisseau ne se reproduit pas in vitro.
Objectifs
La principale comorbidité du cancer pancréatique est la thrombose. La probabilité de décés de patients developpant un cancer du pancréas et une thrombose est augmentée de 50%. Un type de globule blanc (le neutrophile) est impliqué dans la thrombose. Ce neutrophile est l'élement initiateur de la thrombose. Il existe plusieurs sous population de neutrophiles présents dans le compartiment sanguin. Le but de cette étude est de déterminer la sous population de neutrophiles impliquée dans la thrombose associée au cancer du pancréas. Pour cela nous utiliserons un modèle de cancer du pancréas murin dans le lequel nous testerons leur impact sur le développement de thrombose. Nous évaluerons également le rôle d'un récepteur porté par les cellules cancéreuses dans la progression tumorale et le développement de la thrombose.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux appréhender le rôle des neutrophiles et du récepteur à l’adenosine diphosphate dans la thrombose associée au cancer et dans l’évolution du cancer du pancréas. A long terme cela pourrait permettre de mieux traiter les thromboses associées au cancer chez l’homme.
Procédures
Les animaux seront soumis à des implantations de cellules cancéreuses. Ces implantations sont realisées soit en sous cutanée et d'une durée de maximum deux minutes d'intervention soit directement dans la tête du pancreas, intervention de 45 minutes. Ces procédures sont realisées sous anesthsesie, les animaux sont surveiller gràce à des grilles specifiques d'evalaution de la douleur et seront traités par des analgesiques si necessaire. Des prélèvements sanguins sont realisés sous anesthesie volatile (durée 5 minutes maximum) et sont espacés d'au moins une semaine. Les modèles de thromboses spontanée et induite par laser sont des expériences sans reveils. Le modéle induit de thrombose veineuse necessite 48 heures de developpement les animaux sont sous analgèsique durant ces 48 heures.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues pour les animaux sont de la douleur pouvant être induite par la croissance du cancer et leurs métastases. Dans le cas des deux types d’implantation les animaux sont étroitement surveillés et la douleur est évaluée grâce à des grilles de scores adaptées à chaque type d’implantation, en fonction du score les animaux sont traités par analgésique à dose croissante. Nous veillions également à ce que les animaux soient bien hydratés, ils reçoivent tous une injection de solution saline en sous cutané après les opérations chirurgicales . Nos points limites qui sont précoces, l’utilisation des grilles d’évaluation de la douleur et notre connaissance de ces modèles nous permettrons de limiter le plus possible la douleur des animaux.
Devenir
Les animaux sont tous euthanasiés à la fin des procédures, différents organes seront prelevées en post mortem.
Remplacement
Les neutrophiles, les plaquettes et les cellules endothéliales sont des cellules clefs dans l’immunothrombose et de l’immonothrombose associée au cancer. A ce jour, Aucune lignée cellulaire immortalisée ne permet de produire dans des proportions satisfaisantes des neutrophiles et de plaquettes. D’autre part, Il n’est pas possible de reproduire à l’heure actuelle l’intégrité du vaisseau, ni l’activation des cellules endothéliales in vitro.
Réduction
Dans une première phase nous testerons plusieurs modèles pour caractériser et produire une sous population de neutrophiles particuliers. en parallèle nous testerons des strategie in vivo. Ces stratégies seront nous l’espérons plus efficace que la production in vitro déjà testée qui ne permet de produire suffisamment de neutrophiles de la sous population recherchée viables à ce jour dans notre laboratoire. Nous ne reproduirons les résultats que pour le groupe présentant les meilleurs taux de neutrophiles recherchés pour les tester sur les modèles de thrombose. D’autre part à résultats identiques entre les deux groupes in vivo nous choisirons le modèle préclinique présentant le moins de sévérité pour réaliser les deux modèles induits de thrombose .
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes de 5, en présence de coton de nidification ; avec boisson et nourriture adlibitum. Une période de 7 jours d’acclimatation sera réalisé pour tous les animaux avant expérimentation. Les animaux sont suivis et pesés quotidiennement après implantations. Les implantations sont réalisées sous anesthésie accompagnées d’analgésique. Les animaux sont observés toutes les 12 heures durant les 48 premières heures suivant les implantations, en cas de signe de souffrance les animaux seront administrés avec un analgesique. La visualisation de la thrombose spontanée est sans reveil et realisée sous anesthesie. Les animaux seront euthanasiés par un excès d’anesthésiques. Le modèle au laser est une expérience sans réveil réalisés sous anesthésie, les animaux seront euthanasiés par un excès d’anesthésique. Dans le cas du modèle de thrombose veineuse, les animaux sont pendant toute la durée de l’expérience jusqu’48 heures sous anagesique et sont euthanasiés par dislocation des cervicales sous anesthésie volatile.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle de choix pour l’étude préclinique de la thrombose. En effet la formation d’un thrombus dans le modèle murin est excessivement proche de celle de l’Homme, aussi bien au niveau des molécules que des cellules impliquées. Le modèle murin offre également la possibilité de travailler sur des animaux transgéniques, pour ce projet nous avons choisi d’utiliser en plus des animaux sauvages des souris transgenique sur le recpteur de l'adénosine diphosphate. Les animaux seront utilisés entre la 5eme semaine et la 12 eme semaine. Les expériences seront effectuées sur des animaux adultes (pancréas mature) puisque les cancers du pancreas se developpent chez l'Homme Adulte.
Etude de l’activité thérapeutique de deux anticorps pour le traitement de la leucémie lymphoïde chronique
- Recherche appliquée
- Cancers
30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques de patients, trois injections intraveineuses sous anesthésie et un prélèvement sanguin terminal, pour tester l'association de deux anticorps au rituximab contre la leucémie lymphoïde chronique. Le porteur situe le bénéfice thérapeutique observé in vitro et renvoie au long terme le développement en clinique humaine. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit cette maladie et conclut au recours à la souris.
Objectifs
La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est une maladie touchant des cellules du sang appelées les lymphocytes B (LB). Comme toutes les cellules, les lymphocytes B ont normalement une durée de vie limitée, de l’ordre de quelques jours à quelques mois. Au cours de la LLC, une partie des LB ne meurt plus. Leur cycle de vie est en quelque sorte bloqué lorsqu’ils parviennent à maturité. Comme leur production se poursuit, ces LB finissent par s’accumuler dans le sang, dans les ganglions, la rate et la moelle osseuse. La LLC reste une maladie fréquente avec 4500 nouveaux cas chaque année. Pour les patients, le traitement repose actuellement sur la chimiothérapie et l’immunothérapie utilisant des anticorps monoclonaux dont le rituximab. Certains patients ne répondent pas au traitement initial et d’autres rechutent après l'administration des anticorps. Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques est donc nécessaire pour pallier aux mécanismes d'échec et ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour les patients. Nos études préliminaires in vitro sur cellules de patients ont montré que l'association de deux anticorps au rituximab renforce son activité thérapeutique. Ce projet a pour objectif de montrer in vivo que la combinaison du rituximab à un nouvel anticorps thérapeutique améliore l'activité du rituximab. Pour tester cette hypothèse, nous utiliserons la souris immunodéfiente NSG (NOD Scid Gamma) qui permet de greffer des cellules primaires de patients atteints de LLC pour modéliser cette pathologie. Nous évaluerons à J5 la maladie résiduelle (nombre de cellules malignes persistant après traitement et qui est le critère le plus puissant pour prédire la rémission ou la rechute après traitement). Les résultats permettront de savoir si la combinaison des deux anticorps administrés de façon séquentielle permet de détruire plus efficacement les cellules de LLC.
Bénéfices attendus
A court terme, la réalisation de ce projet permettra de recueillir des données in vivo et confirmer que l'injection des deux anticorps confère un bénéfice thérapeutique pour le traitement de la LLC, synergie observée in vitro. A long terme, ce projet va permettre la poursuite du développement notre nouvel anticorps en clinique humaine. Ce dernier pourra venir renforcer l'activité du rituximab déjà utilisé en clinique chez l'homme mais qui présente des limites d'efficacité.
Procédures
Les souris seront soumis à 3 pesées durant moins de 30 secondes (réalisées sur animal vigile), à 3 injections intraveineuses réalisées sous anesthésie gazeuse durant moins de 30 secondes puis elles seront repositionnés dans leur cage. La récupération après l’anesthésie est très rapide, en moins de 2 minutes les souris retrouvent le réflexe de marche dans la cage. A la fin de la procédure, un prélèvement sanguin unique et terminal sera réalisé sur animaux anesthésiés et analgésiés, durée de 1 minutes maximum.
Impact sur les animaux
Du stress pourra être généré lors de la pesée des animaux, trois pesées d'une durée d'environ 30 secondes, seront réalisées durant le suivi (J0; J2 et J5). Du stress pourra également être généré au moment de l'anesthésie gazeuse, cette dernière dure environ 5 minutes et lors de l'injection intrapéritonéale pour réaliser l'anesthésie chimique pour le prélèvement sanguin terminal, durée de 1 minutes maximum.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. Afin de réaliser les analyses histologiques et de cytométrie en flux, des prélèvements d’organes et de sang terminaux seront effectués sur les souris.
Remplacement
La LLC est une maladie multifactorielle impliquant les cellules circulantes et les organes lymphoïdes secondaires. L’étude des mécanismes qui provoquent ou contribuent à l'activité des anticorps thérapeutiques nécessitent la mise en place de protocoles in vivo car il n’est pas possible aujourd'hui de reproduire la LLC par l’utilisation de modèles in vitro. Cependant, l'activité des anticorps a été au préalable évaluée in vitro sur des cellules cancéreuses, sur cellules primaires de LLC de patients et sur cellules saines. Les études préliminaires in vitro sur cellules de patients ont montré que l'association de nos nouveaux anticorps au rituximab renforce son activité cytotoxique direct. De plus, ces études ont permis de déterminer les posologies optimales qui seront utilisées dans le projet in vivo chez la souris.
Réduction
Il s'agit d'une étude sur petit effectif d'animaux, 30 animaux au total, 5 par groupes, 6 groupes d'animaux. Nous utiliserons le test non paramétrique de test de Kruskal-Wallis pour comparer les 6 moyennes.
Raffinement
Les souris seront acclimatées durant 5-7 jours à l'animalerie avant d'être incluses dans la procédure. La procédure expérimentale a été conçue de manière à minimiser les dommages causés aux animaux. Les pesées seront réalisées sur animal vigile par contre tous les autres gestes techniques seront réalisés sur animal anesthésié/analgésié afin de diminuer le stress et l'inconfort de l'animal. Tout au long de la procédure, les souris sont suivies quotidiennement, le registre de soins est complété en se rapportant à la grille de suivi de soins.
Choix des espèces
Nous utiliserons comme modèle, la souris NSG (NOD Scid Gamma). Cette souris est immunodéficiente et caractérisée par une absence de lymphocytes T, lymphocytes B et de cellules tueuses (NK). Cette immunodéficience nous permet de greffer des cellules humaines primaires de LLC et modéliser cette pathologie. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines dont le poids varie entre 20-30 grammes. C'est l'âge des souris adultes couramment utilisées dans la littérature lors de la greffe de cellules primaires humaines de LLC.
Evaluation de l’efficacité de plusieurs doses de vecteurs AAV dans le cadre de la mise en place d’une approche de thérapie génique dans un modèle murin de la maladie de Huntington
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
354 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 288 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 66 modéré. Elles subissent une chirurgie du cerveau avec mise en barre d'oreille et craniotomie, l'injection d'un virus AAV dans le striatum, puis des tests moteurs répétés (openfield, rotarod, analyse de la marche) de 4 à 12 mois et un prélèvement de sang et de liquide céphalorachidien avant la mise à mort. Le porteur teste une thérapie génique contre la maladie de Huntington, les retombées pour les patients restant renvoyées à un futur essai clinique. Il affirme que seuls les modèles murins miment fidèlement la pathologie et que la preuve de concept chez les rongeurs est exigée par l'ANSM.
Objectifs
Les maladies neurodégénératives comme la maladie de Huntington (MH) sont une préoccupation croissante en santé publique. Malgré d’importants efforts de recherche, il n’existe encore aujourd’hui aucun traitement capable de combattre de façon efficace la progression de ce type de maladies. De nouvelles approches thérapeutiques sont essentielles pour améliorer la qualité de vie des patients. Parmi ces nouvelles approches prometteuses se trouve la thérapie génique. Elle utilise l’ADN pour soigner ou prévenir de la maladie. Selon la pathologie, cet objectif peut être atteint en délivrant aux cellules un gène sain qui prendra le relai du gène déficient et un inhibiteur du gène qui permettra de réduire l’expression délétère de ce gène déficitaire. Un virus modifié (AAV) non pathogène nous permettra de délivrer cet ADN avec cette inhibiteur au cœur même des cellules. Nous avons déjà la preuve de concept de notre stratégie dans des modèles murins pour la maladie de Huntington : l’enzyme déficiente à l’origine de la pathologie est remplacée par cet ADN permettant la synthèse d’une enzyme assurant la fonction normale permettant de corriger les anomalies neuropathologiques et comportementales chez la souris malade. Le but est de tester l’efficacité des AAV exprimant un gène témoin ou des gènes thérapeutiques (pour éteindre l’expression de la protéine huntingtine mutée) sous contrôle des promoteurs qui ciblent de façon spécifique les neurones dans différentes régions du cerveau des modèles murins pour la MH
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de tester l’efficacité et de trouver la dose efficace minimale d’un AAV exprimant le gène thérapeutique dans la région cible du cerveau (striatum) du modèle murin pour la MH, en injectant le même lot qui va être utilisé chez les patients atteints de la MH dans le cadre du futur essai clinique.
Procédures
Les animaux commerciaux seront soumis à 8 semaine d’âge à une injection stéréotaxique sous anesthésie générale (durée de 70 min), animal endormi avec une prise en charge analgésique afin d'éviter la douleur, par l'administration d'analgésiques avant et après la chirurgie. A 11 semaines d’âge, les animaux seront euthanasies pour l’analyse post mortem des tissus. A partir de 6 mois d’âge, les animaux modèles de la maladie d’Huntington développeront un phénotype dommageable. Ces animaux seront soumis à 2 mois d’âge à une injection stéréotaxique sous anesthésie générale (durée de 70 min), animal endormi avec une prise en charge analgésique afin d'éviter la douleur, par l'administration d'analgésiques avant et après la chirurgie. Les animaux modèles pour la maladie d’Huntington seront soumis à tests comportementaux des 4 mois d’âge. L’openfield sera réalisé a 4, 6 , 8 et 11 mois avec une session de 10 minutes a chaque fois. Le rotarod est réalisée en 3 session pendant 3 jours et est réalisés a 4, 5, 6, 7 , 8 , 9, 10, 11 et 12 mois d’âge. Enfin le gait analysis est réalisé a 12 mois + 1 semaine et consiste en 3 sessions de 10-30 secondes. A 12 mois d’âge, un prélèvement unique de sang et de LCR seront effectués avant euthanasie pour l’analyse post mortem des tissus.
Impact sur les animaux
Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux, Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. Un risque traumatique mécanique local relativement faible peut être également être observe suite l’injection de l’aiguille dans le striatum des souris. Une perte de poids dû a l’injection de AAV pourrait être observé, 5 à 7% du poids total de l’animal, (selon nos précédentes études), bien que les concentrations des AAVs utilisées ont déjà été évaluées in vitro et dans nos précédentes études afin d’éviter toute toxicité chez la souris. L’injection de AAV avec le gène thérapeutique améliore l’état général de l’animal ; améliore les performances motrices, présente un effet trophique au niveau des neurones.
Devenir
Les animaux d’intérêt produits/commerciaux seront maintenus en vie pour la chirurgie stéréotaxique et/ou les tests comportementaux. Les souris seront euthanasiées de 3 semaines a 10 mois après les injections décrites , pour continuer les différentes études moléculaires et cellulaires.
Remplacement
A ce jour, seuls les modèles murins de la MH permettent de mimer suffisamment fidèlement la pathologie et donc d'être utilisés dans des études d'efficacité de nouveaux traitements. Toutes les études in vitro possibles ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité des AAVs. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de l’approche thérapeutique chez l’Homme, nécessite une preuve de concept chez les rongeurs (souris modèle). Ces étapes sont requises par l’ANSM pour toute demande d’autorisation d’étude clinique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (354) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. En effet, des travaux précédents ont permis d’établir les doses de vecteur à injecter et les temps d'analyses.
Raffinement
Afin de réduire la douleur lors de la mise en barre d’oreille nous enduisons préalablement les barres d’oreilles de crème analgésique. Le geste réalisé pour la craniotomie est maitrisé au sein de l’équipe et les risques de saignement n’apparaissent que rarement. Pour limiter le risque de traumatisme mécanique local, relativement faible lié à l’injection, nous utilisons des aiguilles fines 32G de type 3 non biseautés acquise avec l’expérience de nos études précédentes).. Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance.; 6h après l’acte chirurgical, une première injection d’analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. 24h après une fiche de scoring est remplie pour tout animal et une deuxième est réalisée. 4h/5h après cette injection les animaux seront observés par l’expérimentateur pour examiner les animaux et vérifier qu’aucun signe de douleur est détecté. Si besoin, une injection d’analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. La prophylaxie de la douleur sera donc adaptée à l’examen clinique de l’animal. Le protocole d’analgésie post opératoire a été décidé avec l’accord du vétérinaire. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. L’application de critères d’arrêts en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. Le suivi est renforcé au cours des 48h suivant la chirurgie puis celle-ci est ensuite allégé a 1 fois par semaine sauf a l’approche de points limites. De plus, le suivi du poids et les tests comportementaux étant réalisé de façon mensuelle (période de repose d’une semaine entre chaque test, il favorise un suivi renforcé). Les animaux seront hébergés en groupe et un igloo sera ajouté dans chaque cage stabulée en portoir ventilé.
Choix des espèces
L’objectif de cette étude est d'évaluer l’efficacité et de trouver la dose efficace minimale de notre produit dans la région cible du cerveau (striatum) du modèle murin pour la MH, en injectant le même lot qui sera utilisé par la suite chez les patients atteints de la MH dans le cadre du futur essai clinique. Nous commencerons donc par valider l'expression de notre produit , dans des souris saines avant son utilisation future chez un modèle de souris de la MH. Les souris qui seront utilisées sont des souris âgée de 2 mois, dans lesquelles nous avons déjà optimisé les coordonnées d'injection dans le cerveau.
Effets métaboliques d’une eau traitée par électrolyse
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Soumis à un régime gras et sucré, ils subissent des mises à jeun, des gavages de glucose avec prélèvements de sang répétés à la queue et des isolements de 24 heures pour l'analyse vidéo de leurs déplacements. Le projet, mené pour une entreprise, teste si une eau traitée par électrolyse limite le syndrome métabolique. Le porteur présente le rat comme un "donneur" d'organes et affirme qu'une étude in vitro n'aurait "pas d'intérêt" ici.
Objectifs
La prévalence de l'obésité ne cesse de croître. D'ici 2030, on prévoit que 40% de la population mondiale sera en surpoids et 20% sera obèse. L'obésité est un facteur de risque important pour de nombreuses maladies non transmissibles, notamment : les troubles métaboliques (par exemple, le diabète et la résistance à l'insuline), les maladies pulmonaires (syndrome d'hypoventilation lié à l'obésité, apnée du sommeil), les maladies cardiovasculaires, les maladies digestives (stéatose hépatique non alcoolique) et les cancers. De nombreux mécanismes expliquent ces complications, mais l'inflammation associée à l'obésité figure parmi les principaux. En effet, l'obésité se caractérise par un dysfonctionnement immunitaire, une altération de la perméabilité intestinale (qui favorise la translocation bactérienne et l'inflammation systémique). Cette inflammation de bas grade va avoir un impact sur le métabolisme, notamment en favorisant le développement d'une résistance à l'insuline et le développement d'un syndrome métabolique (première étape vers le diabète de type 2). Ainsi, toute stratégie permettant de limiter l'inflammation de bas grade au cours du syndrome métabolique permettra de limiter ses conséquences délétères. Parmi ces stratégies, l'apport d'une eau de boisson traitée pour éliminer tout matériel organique pourrait contribuer à diminuer l'inflammation de bas grade. Nous proposons d'évaluer le potentiel d'une telle eau traitée par un procédé innovant dans un modèle de syndrome métabolique et d'obésité chez le rongeur. Le 1er critère sera de déterminer la capacité de cette eau à limiter et/ou à prévenir le syndrome métabolique évaluée par une meilleure tolérance au glucose déterminée par un test de charge orale en glucose. Afin de contrôler l'impactéventuel d'une modification de lactivité locomotrice, celle-ci sera déterminée à l'aide d'un système de video-tracking.
Bénéfices attendus
Selon l'entreprise sollicitant cette prestation, cette eau traitée pourrait permettre de limiter l'inflammation de bas grade associée au syndrome métabolique permettant ainsi de limiter ses conséquences délétères.
Procédures
Certains animaux seront soumis à un régime riche en graisses et en sucres. Ils recevront également soit l'eau du réseau de ville qui répond aux critères très stricts dictés par le Ministère de la Santé et le Conseil supérieur du secteur d’Hygiène Publique soit cette même eau traitée par électrolyse, durant 8 à 16 semaines, selon les groupes concernés. Tous les animaux seront soumis à 3 tests de tolérance au glucose en début de protocole (S0), au mileu (8 semaines de régime et/ou de traitement par l’eau traitée) et à la fin du protocole à 16 semaines de régime et/ou traitement. Les animaux seront mis à jeun à 16 heures, la veille de chaque test. De l’eau sera laissée à leur disposition. Le matin du test, vers 8 heures, les animaux seront pesés puis laissés au calme pendant 30 minutes. Le test débutera par une prise de sang à la queue sur animal vigile. Une goutte de sang suffit pour le dosage de la glycémie en direct grâce à un glucomètre (T0). Le test se poursuit par l'administration d'une dose de glucose en fonction du poids de chaque animal par gavage oral (niveau de douleur 0). Une goutte de sang est ensuite prélevée 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 60, 90 et 120 min après l'administration de la dose de glucose pour le dosage de la glycémie. Après le test, le site de prélèvement est désinfecté à la Chlorhexidine. L'activité locomotrice spontanée des animaux sera déterminée à partir de l'enregistrement de leur déplacement pendant 24h à l'aide d'un système de video-tracking en début de protocole (S0), au mileu (8 semaines de régime et/ou de traitement par l’eau traitée) et à la fin du protocole à 16 semaines de régime et/ou traitement). Pendant cette mesure, les animaux seront placés en cage individuelle, de modèle identique à celui utilisé pour le reste de l'hébergement. Pendant le durée de l'étude, les animaux seront pesés 2 fois par semaine nécessitant brièvement une préhension et une lègère contention réalisée par du personnel habitué à effectuer ces gestes.
Impact sur les animaux
Il n’est pas attendu d’effets indésirables de cette eau traitée. Le régime gras et sucré utilisé sur les animaux favorisera la prise de masse grasse et le développement d'un syndrome métabolique. Ceux recevant l'eau traitée devraient montrer des symptomes moindres que ceux recevant de l'eau classique. Il est attendu des nuisances légères liées à : - l'isolement en cages individuelles pendant 24, prévu pour l'analyse de l'activité locomotrice spontanée par videotracking - la mise à jeune à 3 reprises pendant la durée du projet, préalable aux tests de tolérance au glucose - le prélèvement de sang selon les détails indiqués dans la procédure 1.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure 1. Le sang et divers tissus d'intérêt sont prélevés sur l'animal une fois mort, pour être conservés en vue d'analyses futures.
Remplacement
Ce projet étudie les conséquences d'un modèle d'induction de syndrome métabolique sur les différents organes ou systèmes physiologiques. Le recours à l’utilisation de modèles alternatifs comme des cellules en culture ne permet pas d'étudier les relations inter-organes ni d'avoir une approche fonctionnelle des organes. Le choix du rat se justifie par les connaissances déjà accumulées dans le laboratoire et dans la littérature sur ce modèle d'induction du syndrome métabolique sur cette espèce. Le rat est utilisé comme "source" de tissus d'intérêt en vue de constituer une tissuthèque permettant des analyses ultérieures. Il n’est pas possible d’évaluer un effet in vitro, car une eau ultra pure sera fortement hypo-osmotique et entrainera une mort cellulaire immédiate. Si elle est diluée dans un mélange complexe, elle n’a plus d’intérêt.
Réduction
Nous prendrons le soin d’utiliser le nombre minimal d’animaux mais qui permette cependant de tirer des conclusions statistiques avec une puissance suffisante. Le nombre d’animaux par groupe a été estimé sur la base d’études publiées, qui utilisent le même modèle d'exposition à un régime riche en graisses et en sucres. Les expériences ont été soigneusement planifiées (par rapport aux données bibliographiques et à nos résultats préalables) pour permettre la collecte d’un maximum d’informations à partir des individus étudiés. De plus, les organes non utilisés seront congelés pour des études complémentaires éventuelles.
Raffinement
Ce protocole ne fait appel qu’à des procédures expérimentales légères ou sans réveil (après anesthésie gazeuse à isoflurane puis exsanguination) et à des prélèvements de tissus sur animal mort ne pouvant donc pas entraîner de douleur ou une douleur ou une contrainte légère et très brève (manipulation/contention). Outre la surveillance réglementaire quotidienne, nous suivrons très précisément l’état général des animaux, leur poids ainsi que leur prise alimentaire à raison de 2 fois par semaine tout au long du protocole. S’il s’avérait que l’un d’entre eux perde du poids de façon importante (15% au cours d'une semaine), soit blessé ou souffrant, il sera exclu du projet et mis à mort. Une autopsie sera réalisée pour identifier plus précisément les causes de cet état ayant justifié la mise à mort le cas échéant, de façon à optimiser nos procédures pour d'éventuelles études futures. La décision sera prise par un des responsables du projet.
Choix des espèces
Le choix du rat se justifie par les connaissances déjà accumulées dans le laboratoire et dans la littérature sur le modèle d'exposition à un régime riche en graisses et en sucres sur cette espèce. Pour ces études, le rat est utilisé comme « donneur » d’organes. C'est également une des espèces la plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants et la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous n’utilisons que des rats males car il est difficile de maitriser le cycle menstruel chez la rate et celui-ci modifie le métabolisme en particulier le métabolisme du glucose qui nous intéresse particulièrement. De plus, nous utiliserons une souche connue dans la littérature pour être plus sensible à l’installation d’un syndrome métabolique sous régime gras et sucré que d’autres souches.
Evaluation de l’immunogénicité de deux candidats vaccins lentiviraux chez le rat
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
54 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent des immunisations et jusqu'à trois prélèvements de sang, pour mesurer la réponse immunitaire à deux candidats vaccins, l'un anti-COVID par voie nasale, l'autre thérapeutique contre le papillomavirus. Le porteur indique que ces rats immunisés ne peuvent être ni réutilisés, ni adoptés, et seront donc tués. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'établir l'immunogénicité d'un vaccin et qualifie les futures études réglementaires d'"indispensables".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de déterminer de façon préalable l’immunogénicité, chez le rat, des produits suivants: 1- un candidat vaccin anti-COVID à administrer par la voie nasale. Ce vaccin est plus efficace que les vaccines à base d’ARN messager et présente l’avantage d’être administrable par la voie nasale et donc de protéger directement les voies respiratoires, de réduire la transmission virale et dont l’efficacité n’est pas affectée par les mutations qui s’accumulent dans l’antigène Spike des variants émergeants du SARS-CoV-2, et 2- un candidat vaccin à usage thérapeutique contre le papillomavirus humain qui est responsable de tous les cancers du col de l’utérus, ainsi qu’une grande proportion des cancers oro-pharyngés. Ce candidat vaccin permet une éradication totale tumorale dans le modèle préclinique. Ce projet permettra de valider l’espèce animale rat pour sa capacité à répondre à la vaccination par les produits développés. Une fois l’immunogénicité établie chez le rat, un organisme indépendant réalisera les expériences précliniques réglementaires chez cette espèce animale. Les futures expériences réglementaires, qui ne font pas partie de ce projet, sont nécessaires pour établir l’innocuité de ces produits et sont requises pour l’obtention de l’autorisation des autorités réglementaires avant d’administrer ces produits chez l’humain.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est d’obtenir l’autorisation de réaliser les deux essais cliniques que nous mettons en place: un pour un candidat vaccin de seconde génération contre le COVID et un autre pour une immunothérapie des cancers de col de l’utérus et des cancers oro-pharyngés liés à l’infection par HPV. Il est à noter que les vaccins anti-HPV actuellement disponibles sont des vaccins préventifs et n’ont aucun effet bénéfique sur les tumeurs déjà développées. En effet, une fois l’immunogénicité établie chez le rat selon le projet présenté ici, un organisme indépendant réalisera les expériences précliniques réglementaires chez cette espèce animale pour établir l’innocuité de ces deux candidats vaccins. Ces futures expériences précliniques réglementaires sont indispensables pour l’obtention de l’autorisation des autorités réglementaires pour réaliser les essais d’administration chez l’humain.
Procédures
Prise de sang (quelques secondes) sur animal vigile, maximum de 3 prélèvements espacés au moins de 10 jours.
Impact sur les animaux
Bien que les procédures proposées soient de classe légère et qu’aucune souffrance animale particulière ne soit attendue, la grille d'évaluation de la douleur nous permettra d'établir des points limites qui entraineraient la mise à mort des rats dès l'apparition de critères définis. Il n’est pas attendu que les injections/administration nécessaires pour l’anesthésie générale ou immunisation génèrent de la douleur particulière. De même, aucune perte de poids, inactivité, réduction de la mobilité, manifestation de stress notable ou de comportement anomal n’est attendue chez les animaux suite aux traitements envisagés.
Devenir
Les animaux des procédures 2 et 3 seront mis à mort, ce que le prélèvement d’organe oblige. Tous les animaux de la procédure 1 seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, ces animaux traités et immunisés peuvent difficilement être réformés pour d’autres expériences. Nous n’aurons par ailleurs pas d’autres utilisations possibles de ces animaux rarement utilisés dans nos projets.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer les expériences in vivo d’immunisation et l’étude de l’immunogénicité par d’autres type d’expériences. En effet, aucune méthode alternative in vitro n’est disponible pour établir l’immunogénicité d’un candidat vaccin. Cependant le modèle animal envisagé reste un modèle de petit rongeur qui évitera l’utilisation d’animaux de plus grande taille.
Réduction
Le nombre de rats utilisés est réduit tout en conservant un minimum d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs et interprétables. Le nombre d’animaux à utiliser a été déterminé avec l’aide d’un biostatisticien et des tests statistiques recommandés seront réalisés pour déterminer la significativité des résultats.
Raffinement
Bien que les expériences envisagées soient de classe légère et qu’aucune souffrance particulière ne soit attendue, la grille d'évaluation de la douleur nous permettra d'établir des points limites qui entraineraient la mise à mort des rats dès l'apparition de critères définis. Une réhydratation sous-cutanée avec NaCl (1ml) sera réalisée entre les épaules après chaque prélèvement sanguin. Les rats ne seront pas hébergés seuls, mais - 2 rats de 350 g/cage - 3 rats de 300 g/cage - 4 rats de 200 g/cage Après l’anesthésie générale, donnée par la méthode gazeuse, une surveillance renforcée sera planifiée jusqu’à ce que les animaux se réveillent.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce animale de choix pour valider les expériences précliniques réglementaires en vaccinologie en vue d’obtention des autorisations nécessaires pour réaliser des essais cliniques. Dans les essais envisagés, l’espèce animale doit être différente par rapport à celle chez laquelle le développement du produit a été réalisé, en l’occurrence souris. Un second rongeur de petite taille est parfaitement accepté pour les autorités réglementaires pour établir l’innocuité du produit. L’étude de l’immunogénicité est aisée chez ce petit rongeur, ce qui évite également l’utilisation d’animaux de plus grande taille. De nombreux outils immunologiques sont disponibles pour réaliser l’étude envisagée de façon complète. Par ailleurs, les rats Sprague Dawley ont été utilisés auparavant pour d’autres études impliquant des vecteurs lentiviraux. Nous avons donc une expérience précédente qui nous indique que ces animaux répondront bien à une immunisation par nos nouveaux candidats vaccins proposés. Les rats de 6 semaines d’âge seront commandés. Après au moins une semaine de stabulation, la première injection sera réalisée. Les rats de 7 semaines sont considérés comme adultes et leur système immunitaire sera mature à partir de cet âge pour répondre à l’immunisation envisagée.
Suivi de souris lupique
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
25 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Issues de deux lignées développant spontanément un lupus et une insuffisance rénale progressive, elles font l'objet d'un suivi, jusqu'à onze pesées et mesures d'urine hebdomadaires, avant un prélèvement de sang terminal. Le porteur indique que les animaux peuvent perdre du poids, présenter des lésions de peau, une prostration ou des difficultés à respirer au fil de la maladie. Il affirme ne pas pouvoir remplacer les souris car les organes sont "nécessaires" aux analyses.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de mettre à mort des animaux pour prélever des organes et réaliser des analyses cytométriques et tissulaires sur ces derniers. Deux lignées de souris mutantes développant un lupus érythémateux disséminé spontané semblable à la maladie auto-immune humaine, tant au niveau des signes cliniques que du développement progressif d’une insuffisance rénale, seront utilisées dans ce projet. Comme les animaux utilisés peuvent présenter un phénotype dommageable au cours de leur vieillissement, une demande d'autorisation de projet comportant une procédure de suivi des animaux doit être déposée.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la production de connaissances dans le but d’élaborer des stratégies permettant de traiter efficacement les symptômes du lupus, et par extension, les symptômes observés dans d’autres pathologies inflammatoires autoimmunes.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à une pesée et une protéinurie hebdomadaire, soit un maximum de 11 pesées et protéinuries par animal d'une durée de 30 secondes. Un prélèvement sanguin terminal sera réalisé sur animal anesthésié et analgésié.
Impact sur les animaux
Les souris pourront développer des effets indésirables dus au développement du lupus : perte de poids, augmentation de la protéinurie urinaire, modifications de l’état général (absence de toilettage, sécrétions nasales et/ou ophtalmiques, alopécie, lésions de la peau), comportement (prostration, difficultés à respirer, agressivité), présence de ganglions. La durée des symptômes pourra varier de quelques jours à quelques semaines, avec une intensité de gravité légère à sévère. Du stress pourra être généré lors des pesées pour le suivi général des animaux et lors de l'injection intrapéritonéale pour réaliser l'anesthésie chimique pour le prélèvement sanguin terminale (durée de 1 minutes maximum).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour prélèvement d'organes pour analyses tissulaires et cytométriques.
Remplacement
Nous ne pouvons pas remplacer les souris car nous avons besoin des organes pour faire des analyses tissulaires et en cytométrie.
Réduction
Il s'agit d'une étude sur 25 animaux, 5 par groupes. Les groupes sont restreints sans nuire aux analyses statistiques et aux résultats du projet.
Raffinement
Les souris seront réceptionnées à l'animalerie, hébergées et suivies au cours du temps. La procédure est une procédure de gravité sévère en raison du phénotype dommageable des deux lignées de souris. Tout au long de la procédure, les souris seront suivies quotidiennement, le registre de soins sera complété en se rapportant à la grille de suivi. Des analgésies seront mises en place en cas de douleur.
Choix des espèces
Nous utiliserons deux lignées de souris développant un lupus érythémateux disséminé spontané semblable à la forme humaine, tant au niveau des signes cliniques que du développement progressif d’une insuffisance rénale. Ces deux modèles murins ont été validés par de nombreux travaux et ce sont les modèles les plus fréquemment retenus pour étudier de nouveaux médicaments dans le lupus. Les animaux utilisés seront agés entre 8 et 30 semaines afin d'étudier des variations tissulaires et cellulaires au cours du vieillissement des animaux. Pour information, le lupus commence à s'installer chez la première lignée de souris à partir de 10 semaines jusqu'à atteindre sa sévérité maximale à 35 semaines ; chez la seconde lignée à partir de 24 semaines jusqu'à atteindre sa sévérité maximale à 72 semaines.
Facteurs génétiques de régulation de la fonction surrénalienne chez la souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement modifiées, elles reçoivent une injection intraveineuse d'un vecteur réduisant un gène des glandes surrénales, un prélèvement de sang, puis passent deux tests comportementaux, l'exploration d'un nouvel environnement et un test d'enfouissement. Le projet étudie le rôle génétique de la réponse au stress, en vue de cibles thérapeutiques renvoyées au conditionnel. Le porteur affirme que ces boucles de régulation entre cerveau et surrénales se modélisent difficilement en culture.
Objectifs
Une situation physique comme émotionnel perçue comme dangereuse, provoque une réaction de stress de l’organisme pour y faire face. Cela se traduit physiologiquement, notamment, par la synthèse d’hormones par les glandes surrénales. Cette réaction est fondamentale et permet de mobiliser l’organisme pour répondre au danger par des réactions physiologiques et comportementales. La régulation de la synthèse des hormones surrénaliennes est complexe et dépend en partie de la génétique propre à chacun, ce qui peut expliquer en partie pourquoi la réponse au stress peut être différentes d’une personne à l’autre. Le but de ce projet est de mieux comprendre cet aspect génétique, en étudiant les conséquences de la variation d’un gène régulateur de la synthèse hormonale dans les surrénales sur le stress et la réponse au stress. Ce projet sera mené chez la souris adulte, par l’étude d’une lignée de souris transgénique permettant la réduction de l’expression de ce gène dans les surrénales. Ces conséquences seront mesurées sur la synthèse hormonale, le comportement anxieux et l’anatomie surrénalienne.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension du fonctionnement surrénalien, incluant ses dysfonctionnements. En effet, si le stress est un mécanisme de défense indispensable du corps, ses conséquences peuvent être néfastes à long terme. Les connaissances nouvelles que devraient permettre ce projet, en plus des avancées dans la compréhension du fonctionnement des surrénales, pourraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour réguler la réponse au stress. Les résultats obtenus sont mis à la disposition de tous via leur publication dans la presse spécialisée.
Procédures
Ce projet comporte deux procédures, l’une de classe modérée et l’autre de classe légère, qui reposent sur l'invalidation de notre gène d'intérêt sélectivement dans les surrénales par l’administration d'un vecteur par injection intraveineuse, rapide et peu invasive. Nous en étudierons l’impact sur la production d’hormones et le comportement de réponse à un stress léger. Ainsi, 2 semaines après l’injection, un bilan hormonal sera réalisé sur un prélèvement sanguin. 3 semaines après injection, les souris injectées seront incluses dans des analyses comportementales mettant en jeu des comportements naturels et comparées avec un groupe témoin : exploration d’un nouvel environnement et interaction avec des objets inconnus. A l’issue de ces expériences, les souris seront euthanasiées et les surrénales prélevées post-mortem pour corréler les résultats hormonaux et comportementaux avec des analyses histologiques des surrénales.
Impact sur les animaux
Le projet repose sur l'injection intraveineuse d'un vecteur réalisée sous contention. Cette opération est simple, rapide et peu invasive car le volume injecté est très petit (0,1 ml). Le vecteur injecté induira une réduction de la synthèse d’hormones surrénaliennes qui sera quantifiée sur un prélèvement unique d’un petit volume de sang. Les mêmes animaux effectueront également un test d’exploration et un test d’enfouissement, pour évaluer leur stress. Il s’agit de tests rapides reposant sur des comportements naturels de l’animal et ne nécessitant pas d’apprentissage. Ils sont donc peu stressants. L’ensemble de ces nuisances sont réparties en deux procédures, l’une de classe modérée et l’autre de classe légère.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour permettre une analyse à postériori de leurs surrénales prélevés post-mortem. Cela permettra de corréler l'efficacité du vecteur aux conséquences anatomiques et/ou comportementales induites par l'invalidation génique.
Remplacement
L’étude de la réponse au stress par les surrénales implique d’étudier un organe au sein duquel dialoguent différents types cellulaires, qui sont eux-mêmes régulés par des interactions à longue distance avec le cerveau. Ces boucles de régulation physiologiques peuvent difficilement être modélisées, ou reproduites en culture ce qui justifie de réaliser des expériences chez l’animal.
Réduction
Les procédures sont conçues pour réduire le nombre d'animaux inclus dans le projet. La première procédure permet à la fois l’étude de l’effet de l’expression génique sur les surrénales et la recherche de la dose efficace de vecteur à administrer. Cela permettra à la seconde procédure une efficacité optimale des conditions expérimentales pour réduire le nombre d'animaux à inclure en réduisant le risque d’avoir à la répéter. Enfin chaque prélèvement réalisé sera scindé en plusieurs séries, ce qui permettra de réaliser de nombreuses expériences sur chacun des prélèvements, sans avoir besoin de traiter de nouveaux animaux.
Raffinement
Les conditions d’hébergement de nos souris sont prévues pour minimiser le stress pendant la croissance et la période expérimentale : hébergement par fratries de même sexe, présence d'ouate et d’igloos dans les cages pour faciliter la construction de nids. Tout au long du projet, le bien-être des animaux sera évalué quotidiennement selon une grille de scoring multicritères dont les critères seront adaptés à chaque procédure. Cette évaluation individualisée contiendra deux paliers : le premier déclenchant une surveillance renforcée deux fois par jour et le second déclenchant l’arrêt de l’expérience s’il est atteint. Les conditions expérimentales seront optimisées pour causer une douleur minimale et un stress réduit : injection intraveineuse optimisée, prélèvement sanguin de petit volume effectués à une veine superficielle, examen fonctionnel non-invasif analysés sur vidéos, par l’observation de la réalisation de tâches naturelles de la souris (exploration, enfouissement).
Choix des espèces
Ce projet propose d'étudier le rôle de l’expression génique dans les fonctions endocrines des surrénales. -Cette approche génétique nécessite de travailler sur des animaux chez lesquels les outils génétiques sont disponibles et fiables. Notre équipe travaille de longue date sur cette approche. Nous avons développé des outils génétiques et des approches histologiques efficaces. -Notre projet repose en partie sur des analyses hormonales, comportementale, ce qui nécessite une espèce avec des tests validés. Seule la souris remplit l’ensemble de ces critères. En particulier, les tests que nous proposons d’utiliser sont validés par de nombreuses publications.
Tests précliniques chez la souris modèle de leucémie
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
3 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 2 700 un niveau modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques humaines, des traitements à évaluer et jusqu'à huit prélèvements de sang, avec un suivi de la maladie par imagerie sous anesthésie. Le porteur agit comme prestataire de services pour des laboratoires publics ou privés qui testent leurs candidats-médicaments. Il affirme que le passage au modèle in vivo est "indispensable" et que la souris est le rongeur le plus utilisé pour modéliser cette maladie.
Objectifs
Les leucémies et maladies apparentées, en forte augmentation et affectant aujourd’hui 2,3 millions de patients dans le monde, sont le plus mortel des cancers du sang et touchent environ 9 000 personnes chaque année en France. Ce sont aussi le premier cancer de l’enfant. Le besoin médical insatisfait est donc considérable. Dans ce contexte, notre plateforme propose à ses partenaires de réaliser des tests précliniques chez la souris afin d'évaluer l'efficacité de leurs différentes stratégies thérapeutiques innovantes les plus prometteuses in vitro. L’objectif de cette demande est donc de développer des modèles précliniques robustes, pour évaluer l’effet anti leucémique in vivo de thérapies innovantes en utilisant des modèles de lignées cellulaires et des échantillons de patients leucémiques déjà bien caractérisés.
Bénéfices attendus
En tant que prestataire de services, nous réalisons ces études pour des laboratoires partenaires publics ou privés. Dans ce projet, nous offrons la possibilité à la communauté scientifique de pouvoir évaluer l’efficacité de nouveaux candidats thérapeutiques à l’aide de modèles précliniques dont nous assurons la reproductibilité et la robustesse nécessaires au développement des projets en immuno-oncologie. Bien que ces modèles demandent à être améliorés, ils ont permis de reproduire chez la souris certains aspects des pathologies humaines et, en complément des autres modèles expérimentaux, ils laissent ainsi espérer le développement dans un futur proche de thérapies innovantes.
Procédures
L’ensemble des animaux recevra des administrations de candidats thérapeutiques dont la fréquence et la route seront dépendantes de la pharmacocinétique du composé à évaluer. Unje partie des animaux subiront une transplantation de cellules leucémiques humaines (1 injection durant 1 min / animal) ainsi que des prélèvements sanguins (au maximum 8 sur 6 mois) réalisés sous anesthésie volatile ( 5 min/souris), en alternant les sites de prélèvement et espacés d’au minimum 15 jours afin de favoriser la cicatrisation. Enfin, lorsque possible, le développement de la leucémie sera effectué hebdomadairement par imagerie optique par bioluminescence, un procédé non invasif mais nécessitant l’anesthésie des souris (durée= 6 à 10 minutes/souris).
Impact sur les animaux
Les animaux seront transplantés avec des cellules leucémiques et développeront donc une pathologie humaine potentiellement grave. L'administration des traitements à évaluer constituera une nuisance sur les animaux. L'anesthésie ainsi que les pesées peuvent être source d'angoisse.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de caractériser ex-vivo le développement leucémique en fonction des conditions expérimentales.
Remplacement
Notre projet se fera dans la continuité d'études in vitro. Le passage au modèle in vivo est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez les patients. Nous avons besoin d’un modèle permettant de reproduire d’un point de vue phénoménologique toute la complexité de la croissance leucémique. Un organe isolé ou une espèce, autre que les mammifères, ne permettra pas d’évaluer la biodistribution du candidat thérapeutique évalué ni les éventuels phénomènes de résistance. La souris est alors le modèle rongeur le plus utilisé permettant de modéliser cette pathologie humaine et de faire un suivi de croissance leucémique.
Réduction
Ce projet sur 5 ans présente un nombre maximum de 3500 souris, cependant ces études seront menées avec un système de GO/No GO. Une première étape permettra de vérifier l’absence de toxicité des composés à évaluer. Si des problèmes de tolérance sont identifiés, l’étude de cette molécule sera interrompue. Dans le cas contraire, l’étude sur lignées cellulaires leucémiques transplantées sera initiée =étape 2. Pour l’étape 3, s’agissant de l’étude à partir de greffes de prélèvements de patients, seuls les composés ayant des résultats positifs à l’étape 2 seront lancés. Afin de réduire au strict nécessaire le nombre d’animaux, un calcul d’effectif pour chaque groupe sera réalisé sur la base de notre expérience et de la littérature scientifique du domaine. D’autre part, dès que possible, nous procèderons à la mutualisation de groupes contrôles.
Raffinement
Dans un souci de raffinement, le suivi du développement leucémique se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés peu ou pas invasifs (dosages sur prélèvements sanguins ou d'imagerie optique). De même, l’ensemble de ces procédures de prélèvements et d'imagerie sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température ; renouvèlement d’air ; éclairage artificiel avec alternance jour/nuit). Afin de respecter leur instinct grégaire, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de copeaux de bois compactés et/ou de coton. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal.
Choix des espèces
Le recours à l’expérimentation animale se justifie par l’impossibilité réglementaire de conduire ce type de développement chez l’homme en l’absence de données précliniques. Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’homme pour sa physiologie. L’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de notre approche, permettant la transplantation de cellules d’un individu d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris). Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ce type de modèle d’injection de cellules leucémiques humaines, c’est à dire des souris « jeunes adultes » âgées de 6 à 12 semaines au moment de la greffe.