Rongeurs
Etude de la fonction de Kat2b et autres mécanismes moléculaires dans le développement de la Fibrose Hépatique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Cinq jours en cage métabolique, des tests métaboliques de quatre heures toutes les deux semaines, des injections d'insuline et de pyruvate dans l'abdomen et une prise de sang derrière l'œil sous anesthésie en fin de protocole : 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue par dislocation cervicale sous anesthésie. Les régimes et traitements imposés altèrent le fonctionnement du foie, avec un risque de fibrose et de troubles digestifs, afin d'évaluer le rôle du gène KAT2B dans l'identité des cellules hépatiques. Une partie des souris est génétiquement modifiée pour ne plus exprimer ce gène dans le foie. Le porteur affirme qu'il est "impossible de modéliser ces interactions complexes in vitro", et annonce adosser au projet le développement d'organoïdes de foie humain censés fournir "un modèle pertinent vis-à-vis de la recherche translationnelle".
Objectifs
Notre projet vise à définir le gène de la lysine acetyl transferase 2B (KAT2B) comme un gardien de l'identité des hépatocytes et une cible pharmacologique pour contrecarrer la perte d'identité et de fonction hépatocytaire caractérisant les foies gravement lésés.
Bénéfices attendus
Le contrôle et le rétablissement de l’identité hépatocytaire émergent comme des voies thérapeutiques potentielles dans les formes graves d’atteinte à la fonction du foie. En identifiant un acteur pouvant être ciblé pharmacologiquement dans ce but, notre projet fera passer un cap permettant d’envisager plus sérieusement cette approche thérapeutique. D’autre part, en y adossant le développement d’organoïdes de foie humain, ce projet contribuera à fournir un modèle pertinent vis-à-vis de la recherche translationnelle.
Procédures
La totalité des souris sera soumise à différentes régimes ou traitements (6 protocoles de traitements ou régime) associés à des tests métaboliques et cages métaboliques (5 jours) afin de mesurer l'éfficacité des traitements provoquant la dysfonction hépatique et le rôle de nos gènes d'inéterets ou molécules pharmacologiques dans la physiopathologie hépatique. Ces tests métaboliques seront réalisés tous les 2 semaines sur les mêmes animaux afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pendant une durée de 4 heures. La totalité des souris sera soumise à un prélèvement sanguin à la veine caudale lors des tests de tolérance au glucose afin de determiner l'insulinémie et la glycémie. La totalité des souris sera soumise à une injection intra péritonéale d'insuline et de pyruvate. Un prélèvement de sang par voie rétro-orbitaire d'une durée de 3 minutes sera réalisé sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane à l'issu des protocoles expérimentaux. Nous utiliserons 60 souris de chaque génotype (wt/ko) pour les 5 procédures, traitées ou non avec l'activateur pharmacologique.
Impact sur les animaux
L'effet indésirable qui pourrait être attendu sur les animaux est l'apparition d'un stress en lien avec la manipulation des animaux. Le développement d'une fibrose du foie pourra également générer des effets indésirables, notamment des troubles digestifs.
Devenir
A l'issu des protocoles, les souris seront euthanasiées par dislocation cervicale après anesthésie générale de l'animal. Des dissections des échantillons biologiques seront réalisées pour mener les études histologiques, moléculaires et épigénétiques.
Remplacement
Nos objectifs sont de mieux comprendre la physiopathologie de stéatose hépatique. Pour cela, la validation chez l'animal est une obligation pour déchiffrer les mécanismes moléculaires et physiopathologiques à l'origine de CETTE maladie. Nous devons donc utiliser des souris génétiquement modifiées pour identifier certains gènes intervenant dans le dévelopement de cette maladie. Il est nécessaire de travailler sur un organisme entier vivant pour reproduire la physiopathologie complexe de la stéatose hépatique, car cette maladie fait intervenir plusieurs types cellulaires dans le foie mais également d'autres organes comme l'intestin. Il est donc impossible de modéliser ces interactions complexes in vitro.
Réduction
Pour définir statistiquement le nombre d'animaux, une étude statiistique (utilisation du logiciel gpower pour definir le nombre d'animaux necessaires) est utilisée pour réduire au minimum le nombre d'animaux, permettant ainsi de générer le nombre exact d'animaux par expérimentation en fonction des paramètres recherchés (glycémie, poids, ...).
Raffinement
Un suivi quotidien et une observation des animaux sont réalisés par les membres de l'équipe de l'animalerie dans laquelle les animaux sont hébergés. Les membres de l'équipe travaillant sur ce projet suivent également les animaux afin de garantir leur bien-être et minimiser au maximum leurs éventuelles souffrances. L'état général des animaux est évalué tous les jours par des observations quotidennes et pesées hebdomadaires.
Choix des espèces
La souris génétiquement modifiée reste le meilleur modèle pour étudier l'effet d'un gène sur le développement d'une maladie. Nous utiliserons donc des souris invalidées pour notre gène d’intéret spécifiquement au niveau hépatique. Ces souris seront soumises à différents traitements régimes afin de mimer le développement d’une maladie du foie. Les animaux utilisés sont des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines (pesant entre 20 et 30g) possédant un système digestif et immunologique mature, permettant l'étude d'un système physiologique digestif optimal.
Criblage de vecteurs AAV chez la souris C57BL/6 : comparaison entre administration intracérébrale et une approche moins invasif, l’ administration intraveineuse.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
218 souris saines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent soit une injection dans le cerveau après craniotomie sous anesthésie de 70 minutes, soit une injection rétro-orbitaire, pour comparer ces deux voies d'administration de vecteurs de thérapie génique. Le porteur nomme des atteintes possibles comme un saignement lors de la craniotomie, un risque d'exophtalmie et d'infection oculaire après l'injection rétro-orbitaire, et une perte de poids. Les souris sont tuées quatre semaines après pour des analyses, cette étude servant à valider les vecteurs chez des souris saines avant emploi sur des modèles de maladie.
Objectifs
Les maladies neurodégénératives comme la maladie de Huntington (MH) et la maladie d’Alzheimer sont une préoccupation croissante en santé publique. Malgré d’importants efforts de recherche, il n’existe encore aujourd’hui aucun traitement capable de combattre de façon efficace la progression de ce type de maladies. De nouvelles approches thérapeutiques sont essentielles pour améliorer la qualité de vie des patients. Parmi ces nouvelles approches prometteuses se trouve la thérapie génique. Elle utilise l’ADN pour soigner ou prévenir de la maladie. Cet ADN peut être délivré de différentes manières. L’injection intracérébrale est l’approche de référence pour de nombreuses maladies neurodégénératives. Nous souhaiterions tester l’efficacité d’une approche moins invasive qu’est l’injection intraveineuse. Ceci dans le but de prévenir une approche invasive d'injection intracérébrale remplacée par une injection intraveineuse.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet permettrait d’opter pour un mode d’administration de notre produit le moins invasif possible pour l’appliquer chez l’homme et plus précisément chez les patients atteins de la maladie neurodégénératives.
Procédures
Les animaux seront soumis à 4 semaine d’âge soit : -à une injection stéréotaxique sous anesthésie gazeuse (durée de 70 min), -ou à une injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse (durée de 5 min), Dans les deux cas l’animal est endormi avec une prise en charge analgésique afin d'éviter la douleur, par l'administration d'analgésiques avant et après la chirurgie. Les animaux réaliseront des tests comportementaux (tests de performance motrice et activité locomotrice), les semaines 5, 6 et 7 et 1 jour de repos sera laissé entre ces deux tests. Un des tests de performance de la motricité est réalisé en 3 sessions pendant 3 jours consécutifs et dure 5 minutes maximum par session. Le test de l’activité locomotrice dure 10 minutes par animaux. Un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie avec animal endormi et immédiatement après les animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux. Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. Un risque traumatique mécanique local relativement faible peut être également être observe suite l’injection de l’aiguille dans le striatum des souris. Un risque anesthésique pouvant entrainer des séquelles chez l’animal existe également. Un risque d’infection oculaire et d’hématome peut-être observé après les injections intra-veineuses en retro-orbitales. Une perte de poids dû à l’injection de vecteur viraux pourrait être observée, (5 à 7%) du poids total de l’animal, (selon nos précédentes études), bien que les concentrations des vecteurs utilisées soient déjà été évaluées in vitro dans nos précédentes études afin d’éviter toute toxicité chez la souris. Un risque d’hématome (exophtalmie), au niveau de l’IV peut survenir car l’injection est réalisée en rétro-orbitaire.
Devenir
Les souris seront euthanasiées 4 semaines après les injections (temps d'expression des vecteurs viraux étudiés) - pour les differentes études biocellulaires et biomoléculaires.
Remplacement
Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. De plus, le modèle murin de la maladie de Huntington est bien caractérisé. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (218) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. En effet, des travaux précédents ont permis d’établir les doses de vecteur à injecter et les temps d'analyses.
Raffinement
Afin de réduire la douleur lors de la mise en barre d’oreille nous enduisons préalablement les oreilles de l’animal de crème analgésique. Le geste réalisé pour la craniotomie est maitrisé au sein de l’équipe et les risques de saignement n’apparaissent que rarement. Pour limiter le risque de traumatisme mécanique local, relativement faible lié à l’injection, nous utilisons des aiguilles fines acquises avec l’expérience de nos études précédentes). Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance; 6h après l’acte chirurgical, une première injection d’analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. 24h après une fiche de scoring (fournie en annexe ) est remplie pour tout animal et une deuxième est réalisée. 4h/5h après cette injection les animaux seront observés par l’expérimentateur pour examiner les animaux et vérifier qu’aucun signe de douleur est détecté. Si besoin, une injection d’analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. La prophylaxie de la douleur sera donc adaptée à l’examen clinique de l’animal. Le protocole d’analgésie post opératoire a été décidé avec l’accord du vétérinaire. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. L’application de critères d’arrêts en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. Le suivi est renforcé au cours des 48h suivant la chirurgie puis celle-ci est ensuite allégé a 1 fois par semaine sauf a l’approche de points limites. De plus, le suivi du poids et les tests comportementaux étant réalisé de façon hebdomadaire (période de repos d’un jour entre chaque test, favorise un suivi renforcé). Les animaux seront hébergés en groupe et un igloo sera ajouté dans chaque cage stabulée en portoir ventilé.
Choix des espèces
L’objectif de ce projet est d’évaluer et de comparer des sérotypes de vecteur virauxs modifiés et donc améliorer l’expression des transgènes, étape importante pour maximiser l’effet d’un traitement dans une future thérapie génique après injection d’un vecteur viral exprimant des gènes thérapeutiques dans la structure cible. Nous commencerons par valider nos vecteurs dans des souris saines avant son utilisation future chez la souris modèle. Nous commencerons donc par valider dans la présente demande nos vecteurs dans des souris saines avant son utilisation future chez la souris modèle. En effet à ce jour, seules les souris transgéniques pour la MH ou MA permettent de mimer suffisamment fidèlement la pathologie et donc d'être utilisés dans des études de comparabilité et d'efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques. Les souris qui seront utilisées sont des souris adultes (4 semaines), dans lesquelles nous avons déjà optimisé les coordonnés d’injection dans le cerveau.
Etude du rôle de TBK1 dans les cellules microgliales sur la dégénérescence et la régénérescence des motoneurones dans des modèles murins de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées au stade symptomatique de la maladie, à cinq mois, ou à son stade terminal, à six mois, 114 souris d'une lignée transgénique de SLA sont d'ici là pesées et soumises chaque semaine à un test de force musculaire. Au total, 174 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour des analyses de leurs organes. Les 60 autres, issues d'une seconde lignée, subissent sous anesthésie une lésion du nerf sciatique à quatre ou douze mois, puis une mesure quotidienne de l'écartement des doigts pour suivre la paralysie de la patte, avant leur mise à mort une semaine ou un mois plus tard. Le porteur dit avoir obtenu des résultats "prometteurs" sur des cultures de cellules immunitaires du cerveau, et affirme que pour étudier leurs interactions avec les motoneurones "un modèle in vivo est crucial".
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative qui touche 7000 adultes en France, caractérisée par une atteinte des motoneurones et résultant par la paralysie et le décès des patients 2 à 5 ans après le diagnostic. Tandis que la plupart des cas de SLA sont sporadiques, certaines formes sont familiales. Les formes génétiques de SLA sont cruciales pour la recherche car elles permettent de modéliser la maladie. Cependant, la plupart des mutations dans les gènes impliqués dans la SLA induisent plutôt un gain-de-fonction-toxique inconnu - difficile à étudier. Recemment, des mutations dans un nouveau gène ont été impliquées dans la SLA. Les mutations dans ce gène induisent une perte de la protéine, un phénomène plus facilement étudiable. Ce gène est impliquée dans la dégradation des protéines et la réponse immunitaire. Comme il a déjà été montré que les cellules immunitaires étaient impliquées dans la SLA, nous étudions plus spécifiquement le rôle de ce gène dans les cellules immunitaires du cerveau. Nous cherchons à savoir si des cellules immunitaires déficientes en ce gène produisent une réponse altérées à un stress des neurones, et si elles améliore ou au contraire altèrent les problèmes moteurs associés au stress.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait nous permettre de mieux comprendre le rôle de notre gène d'intêret, un gène dont la mutation peut causer la SLA, dans les cellules immunitaires du cerveau. Si nous montrons que la perte de ce gène dans ces cellules est toxique, cela contribuerait à expliquer pourquoi des mutations dans ce gène peut causer la SLA. Si nous montrons au contraire que ces cellules immunitaires sans ce gène sont bénéfiques pour les neurones, cela pourrait en faire une cible thérapeutique pour ralentir le cours de la maladie chez tous les patients atteints de SLA.
Procédures
• 114 souris d'une première lignée transgénique d’intérêt etudiée, subiront uniquement un suivi par pesée et test de la mesure de la force musculaire (2 minutes par souris) une fois par semaine. • La totalité de ces 114 souris seront euthanasiés au stade symptomatique (à 5 mois) ou terminale (à 6 mois) pour prélèvement des organes. Deux méthodes d’euthanasie distinctes seront utilisées, nécessaire pour l’analyse des differents types d'échantillons. • 60 souris d'une deuxième lignée transgénique d’intérêt etudiée, subiront une chirurgie sous anesthésie pour léser le nerf sciatique, à 4 mois (jeune), ou à 12 mois (agées). Elles recevront une analgésie 2 fois par jour pendant les 3 jours suivant la chirurgie et les sutures seront désinfectées (5 min par souris). Tous les jours, on évaluera la paralysie de la patte par mesure de l’écartement entre les doigts de la patte (2 min par souris). • La totalité de ces 60 souris seront euthanasiés 1 semaine ou 1 mois après lésion du nerf, pour prélèvement des organes d'intéret. • TOTAL - interventions sur 174 souris.
Impact sur les animaux
Modèle SLA: Le modèle souris transgénique de SLA est un modèle à phénotype dommageable. Cependant, nous nous attendons à ce que la délétion de notre gene d'intêqret dans les cellules immunitaires du cerveau n’aggrave pas ce phénotype, au contraire, elle devrait plutôt augmenter améliorer le phénotype. Lésion du nerf sciatique chez la souris: Les souris subissant une lésion du nerf sciatique peuvent éprouver de la douleur dans les premiers jours mais qui sera pris en charge. Il y aura aussi une diminution (transitoirement) de leur mobilité, nous leur proposerons donc de la nourriture directement dans la cage sous forme de bouillie. Cependant, nous nous attendons à ce que la délétion de notre gene d'intêret dans les cellules immunitaires du cerveau n’aggrave pas ce phénotype, au contraire, elle devrait plutôt augmenter la vitesse de la régénérescence.
Devenir
Tous les animaux dans les deux procédures sont utilisées à la fin de la procedures pour des analyses (histologique ou durée de la maladie) - et donc euthanasiées.
Remplacement
Avant de réaliser les expériences in vivo que nous proposons dans ce protocol, nous avons mené des études in vitro, pour tester si notre hypothèse est solide. Nous avons utilisé des cultures primaires de cellules microgliales (isolées de cerveaux de souris nouveau nées), avec une délétion de notre gène d'intêret, pour tester si elles répondent différemment que les cellules microgliales contrôles - à un stimulus inflammatoire. Nos résultats étant prometteurs, nous avons donc décidé de passer à des expériences plus complexes, in vivo. Comme notre question concerne les intéractions entre les motoneurones et les cellules immunitaires, un modèle in vivo est crucial. Des intérations aussi complexes seraient difficiles à modéliser en culture.
Réduction
Nous avons déterminé notre stratégie de croisement afin de produire le moins possible de génotypes non intéressants. Cependant, cette stratégie est nécessaire pour que tous les génotypes étudiés soient générés dans la même portée. Pour l'étude de l'effet sur les souris SLA, le modele de la maladie humaine avec phenotype dommageable, nous avons besoin de 20 souris par génotype. Il s’agit du nombre minimal de souris nécessaire pour évaluer un modificateur génétique dans les souris SLA - défini par des consignes internationales de la communauté de la recherche contre la SLA. Pour l'analyse des organes à deux differentes stades de la maladie, on a besoin 6 souris par génotype (nombre minimal de souris nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable de ce type de résultats). Le nombre d'animaux utilisés pour cette premiere partie est de 114. Pour l'étude de la lésion du nerf sciatique, nous utilisons une lignée transgénique avec modification de notre gène d'interet, mais sans phenotype dommageable. Nous aurons besoin de 5 souris/génotype pour s’assurer une analyse finale robuste (nombre minimal nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable de ce type de résultats). L'analyse doit être fait à 2 stades différentes: pendant la régénérescence, et après régénérescence complète, pour déterminer les effets sur la vitesse et l'éfficacité. Et à 2 âges differentes, jeune et agé, pour déterminer l'effet du vieillissement sur la capacite regenerative du nerf. Le nombre d'animaux utilisés pour cette deuxième partie est de 60. Le nombre TOTAL d'animaux utilisés : 174.
Raffinement
Pour la stimulation environnementale (enrichissement), nous utilisons toujours des petites maisons en carton et des fibres en carton permettant de faire des nids dans chaque cage. Les femelles sont hébergées ensembles (au moins 2 par cage) et les mâles sont hébergés entre fratrie autant que possible mais peuvent être séparés en cas de bagarre. Pour les souris SLA, les souris montrant des signes de paralysie sont surveillées quotidiennement par un expérimentateur. Un mélange de poudre de nourriture et d'eau est proposé dans la cage aux souris ayant des difficultés à se déplacer afin d'éviter une deshydratation et une dénutrition. Un soin particulier est apporté aux yeux des souris partiellement paralysées qui peuvent être salis. Proche du stade terminal, les souris sont surveillées 1 à 2 fois par jour, tous les jours. Pour la lésion du nerf sciatique, nous allons léser un seul nerf sciatique pour éviter que la souris ne soit trop paralysée durant la première semaine après la chirurgie. Les souris subissant une lésion du nerf sciatique peuvent éprouver de la douleur dans les premiers jours mais qui sera bien pris en charge, pré- et post- opératoire par des analgésiques. Durant la première semaine après la chirurgie, nous ajoutons de la nourriture en poudre avec de l’eau directement dans la cage, car le membre opéré est partiellement paralysé. Comme nous n’utiliserons que des mâles, après la chirurgie ces mâles sont hébergés en isolement ou par maximum trois, jusqu’à la fin de la procédure, pour éviter que des bagarres ne dommagent les sutures. Pour les deux procédures, des points limites sont définis : les souris doivent impérativement être euthanasiées si elles les atteignent.
Choix des espèces
Il existe différents modèles animaux utiles pour étudier la SLA : souris, rats, poissons, mouches, vers. Cependant, nos questions concernent les interactions entre motoneurones et cellules immunitaires dans un système nerveux central mammifère (pour l'étude, souris SLA), mais aussi dans un système nerveux périphérique à la jonction entre motoneurone et muscule de membres éloignés (pour l'etude, lésion du nerf sciatique). Par conséquent, poissons/mouches/vers ne sont pas de bon modèle pour répondre à nos questions. Nous avons une grande expérience avec les souris, et les deux modèles (SLA et lésion du nerf sciatique) sont mieux établis chez la souris que chez le rat; c’est pourquoi nous avons décidé d’utiliser les souris comme modèle pour ce projet. Dans un premier temps: l'étude de l'effet sur le phénotype des souris SLA et étude histologique du stade terminale. Les souris SLA atteignent le stade terminal vers 6 mois. Pour l'étude histologique du stade symptomatique avant le stade terminal, les souris sont utilisées at 5 mois (quand la perte de pois atteigne 10%). Dans un deuxieme temps: l'étude du nerf sciatique dans les souris avec modification du gène d'intêret : la chirurgie est faite au stade adulte/jeune à 4 mois, et au stade adulte/agée à 12 mois - suivi de 1 mois (pour étudier la régénérescence complète/efficacité) ou 1 semaine (pour étudier la vitesse de la régénérescence).
Mise en place du test de charge calcique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage quotidien de vitamine D pendant trois jours puis une charge calcique, subissent un jeûne pouvant atteindre 18 heures et un isolement en cage métabolique, avant une prise de sang terminale. Le porteur reconnaît que les gavages peuvent irriter l'œsophage et que le jeûne et l'isolement sont sources de stress. L'objectif est de "mettre en place" un test de charge calcique chez la souris, les animaux étant ensuite tués pour analyser les tissus.
Objectifs
L'homéostasie calcique est un réseau finement régulé impliquant de nombreux organes (i.e. glandes parathyroides, intestin, rein, os). Dans de nombreuses pathologies, dont beaucoup sont encore idiopathiques, les patients pédiatriques ou adultes présentent des hypercalcémies et des hypercalciuries. Ces patients partagent un tableau clinique similaire : des niveaux circulants de vitamine D élevés et ceux d'hormone parathyroidienne effondré. L'ensemble de ces résultats indiquent que bien que la cause ne soit pas toujours connue, les symptômes sont liés à une augmentation des niveaux de vitamine D. Le diagnostique ainsi que l'effet des traitements se basent principalement sur les dosages biochimiques urinaires et sanguins suite à une charge calcique. Le diagnostique ainsi que l'effet des traitements se basent principalement sur les dosages biochimiques urinaires et sanguins suite à une charge calcique. L'objectif de ce projet est de mettre en place un protocole de charge calcique chez la souris sauvage pour déterminer les niveaux de calcium urinaire, et de déterminer les effets de bolus de vitamine D sur ce paramètre.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet se basent sur la mise au point d'un paramètre clinique pertinent pour déterminer les effets de mutations chez la souris et également l'effet de nouvelles options thérapeutiques. Les résultats obtenus permettront d'améliorer l'évaluation clinique des hyperabsorptions calciques et des hypercalciuries et d'ameliorer le diagnostique et la prise en charge clinique des patients.
Procédures
1 administration par jour de vitamine D par gavage (15 sec par administration) pendant 3 jours, puis une administration unique par gavage de solution calcique, et une prise de sang terminale (30 sec). Une mise à jeun de 18H maximum et une mise en cage métabolique pendant 4H.
Impact sur les animaux
D'après nos travaux précédents, le régime de vitamine D administré n'induit pas de nuisances ni de souffrance aux animaux. L'expérience de charge calcique est classiquement réalisée chez les jeunes enfants chez l'humain, et aucun effet indésirable n'a été rapporté. Les gavages réalisés peuvent induire une irritation de l'oesophage et l'isolement dans les cages métaboliques ainsi que le jeun peuvent entrainer un stress.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour étudier les effets sur les tissus.
Remplacement
L'homéostasie phospho-calcique implique un réseau finement régulé impliquant les glandes parathyroides, l'intestin, les reins et les os. Aucune méthode alternative n'est disponible en raison de la compléxicité de ce réseau qui ne permet pas d'étudier les conséquences d'une dysfonction dans des systèmes cellulaires. La souris est un organisme modèle pour l'étude de l'homéostasie calcique, les paramètres biochimiques sanguins et urinaires étant similaires à ceux chez l'Homme.
Réduction
L'expertise du laboratoire dans le phénotypage des souris a permis de déterminer que 12 animaux est le nombre d'animaux optimal afin d'obtenir des résultats avec une puissance statistique supérieure à 80%.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupe afin de préserver les interactions sociales, dans des cages agrémentées avec un nid. Si une souris présente des difficultés pour se nourrir suite à une irritation de l'oesophage induite par les gavages, de la nourriture en gelée sera placée dans le fond de la cage. Les autres points limites sont un pelage terne ou hérissé, un ecoulement lacrymal, l'immobilité, ou une baisse de la température corporelle. Dans ce cas, des mesures appropriées seront prises en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
L'homéostasie calcique est finement régulée par de nombreuses hormones dont la vitamine D. De nombreuses études réalisées chez la souris ont mis en évidence les mécanismes fins régulant les niveaux de calcium sériques et urinaires, et leurs similitudes avec ceux chez l'Homme. Le diagnostique de ce type de pathologie peut se faire soit chez l'enfant ou chez le jeune adulte. Ainsi la moitié des animaux sera utilisé à l'age de 5-6 semaines, l'équivalent du jeune enfant, et entre 12-15 semaines l'équivalent du jeune adulte.
Fonction cardiaque (hypertension)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
1 800 rats vont être utilisés dans des procédures menées en partie sous anesthésie sans réveil, en partie avec un niveau de souffrance modéré, 100 étant réutilisés et les autres tués. Ils servent à tester des candidats médicaments contre l'hypertension pour le développement préclinique de produits pharmaceutiques, certains subissant une néphrectomie, la pose d'un clip sur une artère rénale ou une ligature du canal biliaire sous anesthésie. Le porteur indique que le modèle de ligature biliaire provoque une jaunisse puis une ascite, et que le modèle d'hypertension pulmonaire entraîne une dégradation de l'état général et une perte de poids rapide, les rats étant tués avant les stades les plus avancés. Il affirme que les tests in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent "entièrement suppléer" les modèles animaux.
Objectifs
L’hypertension artérielle (HTA) est l’un des principaux facteurs de risque cardiovasculaire, c’est-à-dire qu’elle augmente fortement les risques de développer des complications cardiovasculaires (AVC, infarctus du myocarde, insuffisance rénale, artériopathie des membres inférieurs…). Dans 90% des cas, l’origine de l’hypertension est inconnue, elle n’a pas une seule cause directe mais est souvent multifactorielle. Si l’HTA systémique est la plus connue, une hypertension peut également apparaitre plus spécifiquement au niveau pulmonaire ou portal. L’HTA pulmonaire constitue une complication courante des maladies cardiopulmonaires. Les patients atteints d’HTA pulmonaire développent une hypertrophie ventriculaire droite et à long terme une insuffisance cardiaque. L’hypertension portale (HTP) résultant d’une augmentation des résistances intra-hépatiques est une complication courante des maladies chroniques du foie et constitue une des causes entrainant la mort de patients atteints de pathologie du foie. Les tests décrits dans ce projet ciblent l'évaluation des effets de substances dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles sont mis en place et utilisés afin de tester l'efficacité de médicaments par la réduction de différentes formes d'hypertension et de leurs conséquences.
Bénéfices attendus
Les modèles décrits dans ce projet sont nécessaires à la découverte et à la mise sur le marché de nouveaux médicaments efficaces pour traiter l’hypertension systémique, pulmonaire ou portale, et leurs conséquences. Avant les tests sur l’animal, les produits sont généralement testés et présélectionnés avec attention dans des tests in silico, in vitro ou ex vivo.
Procédures
Dans les modèles anesthésiés, les animaux sont anesthésiés jusqu'à la fin de la procédure (sans réveil). Des cathéters et/ou électrodes (électrocardiogramme) sont positionnés dans des artères/veines et/ou en sous cutané respectivement, pour la mesure en continue de paramètre cardiovasculaire (pressions, fréquence cardiaque, ECG). Pour les besoins de l'étude, des prélèvements de sang peuvent être réalisés (sous anesthésie) pendant le test et/ou en fin de test (immédiatement avant l'euthanasie). La procédure (sous anesthésie) n'excède généralement pas 2 heures et les animaux sont immédiatement euthanasiés (sans réveil préalable). Dans les modèles éveillés, les animaux sont dans une première phase opérés sous anesthésie (néphrectomie, pose de clip vasculaire autour d’une artère rénale, ligature du canal biliaire) et/ou équipés d'un implant de télémétrie qui permet l'enregistrement en continu de paramètres cardiovasculaires (pressions, fréquence cardiaque, électrocardiogramme ou ECG) par cathétérisme des lits artériels d’intérêt (ou d’une cavité cardiaque) et positionnement d’électrodes pour l’ECG. Après réveil et une période de récupération (généralement une semaine au minimum), les paramètres sont enregistrés en continu, généralement avant (au moins 1 heure) et après administration de la substance à évaluer (classiquement 24 heures par période d’enregistrement). Les administrations par bolus rapide (par voie orale, intraveineuse, souscutanée, intra-péritonéale, intramusculaire) ou par perfusion lente (intraveineuse) sont effectuées selon les bonnes pratiques vétérinaires. La durée de la procédure d’administration par bolus est de quelques secondes. Celle d’une administration par perfusion intraveineuse peut durer de quelques minutes à plusieurs heures en fonction des spécificités du candidat traitement. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours (le plus souvent) ou plusieurs semaines, en fonction des spécificités du candidat traitement. La fréquence des administrations (exemple : journalière, hebdomadaire) est variable et également adaptée à la spécificité de la substance testée. Pour les besoins de l'étude, des prélèvements de sang (classiquement 2 maximum par 24 heures, volume et fréquence adaptés à l'espèce) peuvent être réalisés (animal vigile ou anesthésié) pendant le test et/ou en fin de test, selon les bonnes pratiques vétérinaires. La durée de la procédure de prélèvement est de quelques secondes.
Impact sur les animaux
Des effets toxiques majeurs des substances testées ne sont pas attendus. A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Dans les modèles nécessitant une intervention chirurgicale (sous anesthésie) suivie d’un réveil, les animaux sont hébergés en cage individuelle (avec enrichissement) pendant la période de récupération post-chirurgicale (généralement pour une période d'une semaine) afin d'éviter que les animaux ne retirent les agrafes/sutures de leurs congénères. Lors de la phase de récupération, une attention particulière est apportée (surveillance des cicatrices, état général, poids, température corporelle, appétit…). Pendant les mesures par télémétrie, l’hébergement en cage individuelle est également nécessaire (généralement environ 24h) pour éviter les interférences entre les implants ainsi que les contaminations croisées (les animaux ne recevant généralement pas tous le même traitement le même jour. De même, pendant les phases de mesure de la pression artérielle par la méthode du tail cuff, les animaux doivent être placés dans des boites de contention (généralement pour des périodes de 45 minutes maximum et une fois par semaine, avec un nombre de semaines variant d’une étude à l’autre). Si des périodes de récolte de l'urine (24 heures maximum) sont inclues dans l’étude, l'isolement des animaux est nécessaire et peut aller jusqu'à 24 heures (pour la détermination de la filtration glomérulaire, les urines doivent impérativement être collectées individuellement pendant 24 heures). Pendant les phases d'hébergement individuel, les animaux gardent cependant un contact visuel, olfactif et auditif avec leurs congénères. Plus spécifiquement, dans le modèle BDL/cholestase (ligature du canal biliaire), une jaunisse apparait progressivement. Elle peut être accompagnée d'ascite (à un stade plus tardif, environ 4 semaines) et une diminution de l'appétit. Le stade d'encéphalopathie hépatique (et de coma), observé chez l'homme à un stade terminal, n'est pas atteint dans ce modèle (les animaux étant euthanasiés avant ce stade). Egalement, dans le modèle d’hypertension pulmonaire MCT, l’état général des animaux peut se dégrader, généralement à partir de la 5ième semaine (le premier signe étant une perte de poids rapide). Cependant ce stade n'est pas atteint dans ce modèle (les animaux étant euthanasiés avant ce stade).
Devenir
Dans les procédures sans réveil, les animaux ne sont pas réutilisables. Dans les procédures modérées ne nécessitant pas de prélèvements d'organes, les animaux peuvent être gardés en vie et réutilisés, sauf si, pour les besoins de l’étude, un volume de sang non-compatible avec la survie est nécessaire. Dans les procédures modérées pour lesquelles des prélèvements d’organes sont prévus, le maintien en vie n'est pas possible. De plus le niveau de l’hypertension atteint en fin de test n’est à terme pas compatible avec le maintien en vie.
Remplacement
En amont des tests in vivo sur des modèles d'hypertension, des tests in silico, in vitro ou ex vivo peuvent être envisagés. Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires , ils ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer ces pathologie évolutives et leurs conséquences dans un environnement biologique et immunologique intact comme cela est possible chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test a été optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet, la comparaison par rapport à une substance de référence, et un effectif suffisant pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition du test. Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègre dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de stopper précocement la douleur, la souffrance ou l'angoisse. Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif (et positif si approprié). Lorsque celà est possible, des prélèvements sanguins intermédiaires (autre que terminal) peuvent être envisagés sur un même animal, permettant ainsi de générer de données sur la cinétiques d'action de la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant stopper précocement la douleur, la souffrance ou l'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs, et sont suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur les différentes formes d'hypertension chez le rat dans les modèles décrits, est prédictif de leur efficacité en clinique. Principalement rats sevrés, âge variant entre 3 semaines et 6 mois, conformément aux données historiques.
Étude de l’effet de candidats médicaments sur un modèle de dyskinésies tardives (TDs) induites par l’injection d’halopéridol chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
760 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection quotidienne d'halopéridol dans l'abdomen pendant 21 jours pour provoquer des dyskinésies, mouvements involontaires de la mâchoire et de la langue, puis un candidat médicament d'un "sponsor" à évaluer. Le porteur reconnaît que les injections répétées peuvent provoquer une péritonite ou toucher d'autres organes, et que le trouble moteur induit est source de stress. À l'issue, un prélèvement intracardiaque sous anesthésie précède la mise à mort et le prélèvement du cerveau.
Objectifs
L’utilisation de substances antipsychotiques est une stratégie thérapeutique importante pour traiter les troubles liés aux pathologies psychiatriques telles que les psychoses. Cependant, l’efficacité de ces traitements est limitée à certains symptômes et leur utilisation prolongée est associée à de nombreux effets secondaires. En effet, les antipsychotiques agissent en bloquant les voies dopaminergiques induisant sur le long terme, l’augmentation du nombre et de la sensibilité des récepteurs D2 à la dopamine. En conséquence, il est observé, chez plus de 30% des patients, l’apparition de troubles moteurs involontaires et aberrants appelés dyskinésies tardives (TDs). Afin de lutter contre ces effets secondaires, plusieurs modèles précliniques chez le rongeur ont été développés dans le but de comprendre la physiopathologie liée à l’apparition de ces troubles moteurs pour ensuite tester différentes stratégies thérapeutiques visant à les diminuer. Actuellement, les traitements de référence pour soulager les TDs sont basés sur des molécules diminuant la recapture et la libération de dopamine au niveau synaptique telles que les tétrabénazines. Malgré cela, ces substances présentent des inconvénients importants car elles ont une demi vie très courte (10h) et nécessitent donc des doses quotidiennes multiples. De plus, elles n’ont pas un effet spécifique ce qui contribue à induire des effets secondaires obligeant à diminuer le dosage pouvant être administré et donc leur efficacité. Ainsi, l’objectif de ce projet est de tester l’efficacité de candidats médicaments à plusieurs dosages sur le développement des TDs chez le rat, induites par l’administration quotidienne et prolongée d’halopéridol, un antipsychotique. Pour cela, des rats Wistar subiront une injection quotidienne d’halopéridol par voie intrapéritonéale (i.p) sur une durée de 21 jours. Lors du 21ème jour, ces animaux seront traités à partir d’une administration i.p unique soit du véhicule, soit de tétrabénazines, le composé référence, soit de candidats médicaments à plusieurs dosages. Les effets de ces traitements seront évalués sur les mouvements involontaires de la région orofaciale (i.e. évaluation du nombre d’ouverture de la mâchoire non dirigée vers une cible) et/ou de protrusion de la langue, tous deux très caractéristiques de TDs chez le rat, tout comme chez l’Homme. Pour terminer, le plasma et le cerveau des animaux seront prélevés afin de quantifier la biodisponibilité des candidats médicaments.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter plusieurs informations sur l’effet de candidats médicaments sur 1) les troubles moteurs involontaires de la région orofaciale associés aux dyskinésies tardives induites par la prise prolongée d’antipsychotiques, 2) sur la biodisponibilité plasmatique et cérébrale de ces mêmes composés et 3) sur leurs potentielles répercussions thérapeutiques au niveau histologique.
Procédures
Au cours de ce projet, les animaux subissent un maximum de 4 interventions distinctes en fonction des groupes expérimentaux. Durant la 1ère intervention du protocole, des rats mâles (âge : 6 semaines) sont soumis à une administration quotidienne d’halopéridol, un antipsychotique, sur une durée de 21 jours afin d’induire une dyskinésie tardive (mouvement moteur involontaire et aberrant (durée de l’acte d’injection i.p : 1min/rat). Au cours de la seconde intervention, à J21, les 6 groupes d’animaux sont également traités par voie i.p avec soit le candidat médicament administré à 3 différentes doses (une dose par groupe sur 3 groupes), soit avec de l’halopéridol, soit avec un composé de référence, les tétrabénazines soit avec le véhicule (NaCl 0,9%). La 3ème intervention consiste à effectuer l'évaluation comportementale des rats, mesurant les mouvements involontaires de la région orofaciale et les protrusions de langue (durée d’intervention : 10min x 3). Finalement au cours de la dernière intervention, un prélèvement sanguin terminal intracardiaque est réalisé sous anesthésie gazeuse avant la mise à mort des animaux afin de prélever le cerveau (durée de l’intervention de l’anesthésie à la mort : 20 min).
Impact sur les animaux
Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration du candidat médicament du sponsor. Le personnel est formé et entrainé aux voies d’administration classiques pour réduire tout risque. Cependant, un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. L’administration quotidienne par voie intrapéritonéale est une source de stress puisqu’il est nécessaire d’appliquer une contention chez le rat afin de pouvoir réaliser ce geste. De plus, il est possible que les piqures répétées au niveau du péritoine engendrent une inflammation du péritoine (péritonite) voir une injection au niveau d’autres organes (vessies, intestins.). L’injection i.p peut également engendrer un léger écoulement de sang dans le cas où l’aiguille perfore un vaisseau sanguin. L’induction de TDs représente également une nuisance car elles entrainent une altération de l’activité motrice de la région orofaciale (mouvement aberrants et involontaires) et sont sources de stress. De plus, au cours d’une session permettant d’évaluer les caractéristiques comportementales de la TD, les animaux sont isolés dans un open field durant 3 fois 10 min ce qui peut à nouveau être à l’origine de stress.
Devenir
Tous les animaux de la procédure 1 sont mis à mort à la fin du protocole afin de prélever les organes.
Remplacement
Les dyskinésies tardives sont les principales sources de troubles moteurs résultant de la prise quotidienne d’antipsychotiques. Ainsi, pour ce projet, les candidats médicaments ont comme principal objectif de diminuer ces mouvements moteurs involontaires et aberrants. Ainsi, le modèle in vitro ne permet pas d’induire et d’étudier les répercussions comportementales associées aux antipsychotiques. Il n’est donc pas possible de tester par la suite, l’effet d’un candidat médicament sur l’ensemble de ces mécanismes.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu par groupe (maximun n=10) pour ce projet est basé sur une estimation prenant en compte des études précédentes (n=8) utilisant le même modèle de rat de TDs induites par l’administration quotidienne d’halopéridol sur 21 jours. Cependant, une certaine hétérogénéité entre les animaux a été observée quant à la réussite de l’induction de la TDs. Pour cette raison et le faible recul de ce modèle au sein de l’entreprise nous pousse donc à choisir un N = 10 incluant 2 animaux de sécurité. Cependant, le nombre d’animaux par groupe pourrait être réduit une fois ce modèle maitrisé et validé au sein de l’entreprise.
Raffinement
Les expérimentations sont effectuées par un personnel compétent et entraîné. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites et d’arrêts sont fixés avant le début des expérimentations selon une grille d’évaluation cliniques basées sur des critères d’observations. Les animaux sont familiarisés avec l'ensemble des outils de mesures ainsi qu'aux nouveaux environnements. Le matériel utilisé est adapté à l’espèce. Par ailleurs, les animaux sont hébergés par 3 dans les cages. Pour l’induction de la dyskinésie tardive par administration quotidienne d’halopéridol en i.p: - les administrations sont réalisées dans une pièce attenante aux pièces d’hébergement - les animaux sont pesés chaque début de semaine afin d’adapter le volume et le dosage administré et permettant d’éviter le surdosage - les administrations se font avec une seringue de 1ml et une aiguille de 26G - pour les administrations i.p, l'animal est maintenu en contention et l’aiguille est insérée dans le cadrant ventral inférieur gauche ou droit en évitant la ligne médiane. Les sites d’administration sont alternés chaque jour entre gauche et droite. Une légère aspiration est effectuée avant d’injecter pour confirmer que l’aiguille n’a pas perforé un vaisseau sanguin ou un autre organe. En cas de signe de déhydratation (test du plis de peau) ou de perte de poids, une injection de sérum physiologique est effectuée en s.c. Le prélèvement de sang en intracardiaque ainsi que la thoracotomie précédent la perfusion de l’animal sont réalisées sous anesthésie générale avec un cocktail de Kétamine/médétomidine et sous analgésique systémique.
Choix des espèces
Le rat et particulièrement la souche Wistar, est l’espèce de référence dans l’étude des dyskinésies tardives induites par l’halopéridol. En effet, plus de 68% des études répertoriées dans la littérature utilisent des rats dont plus de 33% sont de la souche Wistar. Afin de pouvoir maximiser la standardisation et donc favoriser la comparaison des données avec la littérature, il est fortement conseillé d’utiliser des rats Wistar sur ce sujet. De plus, les symptômes principaux des TDs au niveau de la région orofaciale observés chez l’Homme, sont également retrouvés chez le rat et à la même fréquence. Pour ce projet, nous utilisons des jeunes rats Wistar mâles adultes (6 semaines, poids 200-280g) car la grande majorité des résultats observés dans la littérature concernant les études sur les dyskinésies tardives induites par l’halopéridol sont obtenus chez cette catégorie d’animaux.
Potentiel thérapeutique des lymphocytes T régulateurs dans la maladie de Charcot
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
375 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, une partie sous anesthésie sans réveil, l'autre dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire la maladie de Charcot, elles développent une paralysie progressive et sont suivies jusqu'au point limite, fixé à l'incapacité de se retourner en quinze secondes ou une perte de poids dépassant 15 %. Certaines reçoivent un transfert de lymphocytes T régulateurs par voie intraveineuse, d'autres un prélèvement intracardiaque après injection létale. Le porteur revendique une approche de thérapie cellulaire à amener "au plus proche de la clinique".
Objectifs
La maladie de Charcot est une maladie du motoneurone adulte qui se caractérise pas une paralysie progressive. Bien que les neurones moteurs soient sélectivement atteints dans la maladie, le système immunitaire se retrouvent également impliqué dans cette maladie. En effet, des lymphocytes T dits régulateurs (Treg), une population de globules blancs dont la fonction est de supprimer les réponses immunitaires potentiellement dangereuses, voient leur nombre et leur propriétés régulatrices fortement diminuées chez les patients et les souris. L’hypothèse de départ est que les altérations métaboliques présentes dans la maladie de Charcot contribuent au dysfonctionnement des lymphocytes T régulateurs dont la fonction est directement gouvernée par l’environnement métabolique. Notre projet consiste donc à étudier le métabolisme des lymphocytes T régulateurs dans la maladie et d’évaluer le potentiel thérapeutique d’une correction métabolique de ces cellules dans un modèle de maladie de Charcot.
Bénéfices attendus
Notre projet a pour vocation d'explorer de nouvelles pistes thérapeutiques. En ciblant l'interaction entre système nerveux et système immunitaire, notre objectif est d'amener le plus proche possible de la clinique une approche de thérapie cellulaire compatible avec les contraintes cliniques.
Procédures
L’étude du métabolisme implique des prélèvements intra-cardiaques suite à une injection léthale d’un mélange anesthésique/analgésique chimique sur des animaux modèles de la maladie de Charcot avec un phénotype dommageable. Un total de 54 animaux avec phénotype dommageable seront soumis à ce prélèvement sanguin. Le prélèvement prend moins de 5 min par animal. L’étude de l’effet thérapeutique d’un transfert de lymphocytes régulateurs d’origine différente dans des souris modèles de la maladie de Charcot comprend une injection de cellulaire en intra-veineuse sur un total de 192 souris à phénotype dommageable. 4 souris à phénotype dommageables serviront de souris donneuses de lymphocytes qui seront modifiés in vitro avant réimplantation. 72 souris qui ont été transfusées seront incluses dans une étude comportementale qui débute à l’âge de 60 j jusqu’à son incapacité à effectuer le test moteur, et qui atteint donc le point limite. Chaque test moteur est non-invasif et non-contraignant prend entre 20 sec et 5 min par souris. Un total de 168 souris seront utilisées pour une étude de cytométrie et d’histologie. Ces souris recevront une injection terminal d’un mélange anesthésique/analgésique chimique pour ensuite être soumis à un prélèvement sanguin ou une perfusion intra-cardiaque pour préparation à l’histologie. L’anesthésie profonde et très rapide, la manipulation prend moins de 5 min.
Impact sur les animaux
Le modèle de maladie de Charcot que nous utilisons a été généré chez la souris. Les premières souris transgéniques récapitulant la maladie de Charcot ont fait l’objet de nombreuses études nous permettant de connaître très précisément leur tableau clinique, électrophysiologique et histopathologique. Un manuel d’utilisation standardisé respectant les bonnes règles relatives à l’expérimentation animale est d’ailleurs publié. L’évolution de la maladie chez ces souris se fait par le suivi du poids la souris (comme témoin d’une amyotrophie qui signe la dégénérescence des neurones moteurs) et le test de la grille. La paralysie affecte systématiquement les membres postérieurs en premier. Afin d’estimer l’espérance de vie des souris dans les différents groupes, la mortalité sera fixée à l'âge auquel l’animal est incapable de se retourner dans les 15 secondes lorsqu'il est placé sur son dos (ou bien lorsque sa perte de poids excède 15% du poids maximum.
Devenir
Les souris porteuses de la mutation causant la SLA ont une espérance de vie limitée. L'ensembles animaux seront euthanasiés selon les critères d'interuption définis préalablement
Remplacement
Le modèle murin de la maladie de Charcot que nous utilisons mime l’ensemble des traits cliniques, électrophysiologiques et histopathologiques de la maladie humaine. Un effort est réalisé pour minimiser et optimiser le nombre d’animaux. Cependant, la validation fonctionnelle et le protocole thérapeutique pré-clinique que nous proposons requiert une expérimentation sur les modèles animaux de la maladie. Notre étude a en effet pour objectif d’amener au plus proche de la clinique une stratégie d’immunothérapie cellulaire.
Réduction
Le nombre de souris est déterminé en suivant scrupuleusement les recommandations internationales et les études qui définissent les tailles optimales des cohortes de souris modèle de la maladie.
Raffinement
Une connaissance extensive de ces deux modèle de la maladie de Charcot permet de connaître et donc anticiper les différentes étapes de la maladie et donc d’optimiser l’expérimentation. Une surveillance régulière est mise en place et assurée par les expérimentateurs et nous travaillons étroitement avec la structure du bien-être animal. L’enrichissement du milieu avec des copeaux dans les litières, igloo, PVC et du coton vierge pour faire un nid végétal contribue à fournir un environnement enrichi. Cet environnement permet d’améliorer le bien-être des animaux en créant un microenvironnement propice au repos. Une grille de suivi est scrupuleusement suivie avec une définition claire des points limites. Les souris sont euthanasiées par injection d’une dose léthale d’anesthésique chimique (kétamine) en combinaison avec un analgésique (xylazine).
Choix des espèces
Le modèle de la maladie de Charcot que nous utilisons a été généré chez la souris. Les premières souris transgéniques récapitulant la maladie ont fait l’objet de nombreuses études nous permettant de connaître très précisément leur tableau clinique, électrophysiologique et histopathologique. Un manuel d’utilisation standardisé respectant les bonnes règles relatives à l’expérimentation animale est d’ailleurs publié. L’évolution de la maladie chez ces souris se fait par le suivi du poids la souris (comme témoin d’une amyotrophie qui signe la dégénérescence des neurones moteurs) et le test de la grille. La paralysie affecte systématiquement les membres postérieurs en premier. Afin d’estimer l’espérance de vie des souris dans les différents groupes, la mortalité sera fixée à l'âge auquel l’animal est incapable de se retourner dans les 15 secondes lorsqu'il est placé sur son dos (ou bien lorsque sa perte de poids excède 15% du poids maximum.
Impact du jeûne intermittent sur les épilepsies de type absence chez la souris: modèles génétiquement modifiés
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
1 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire des épilepsies-absence, elles subissent la pose chirurgicale d'un implant crânien d'enregistrement (EEG) de 45 minutes et des prélèvements sanguins, pour tester si un jeûne intermittent réduit les crises. Le porteur indique que ces crises ne sont ni douloureuses ni convulsives et classe la procédure en modéré à cause de la chirurgie et des prélèvements. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" à l'animal pour évaluer un modèle épileptique.
Objectifs
Historiquement, des changements de régime alimentaire ont été utilisés pour soigner les épilepsies. Notamment, un régime cétogène riche en protéines et gras, et faible en carbohydrates, est un traitement de choix pour certains types d’épilepsies pharmacorésistantes. Cependant, ce régime est assez désagréable, surtout pour les enfants, et ses effets secondaires sont très lourds. En nous basant sur des résultats issus d’autres pathologies, nous avons avancé l’hypothèse qu’un régime basé sur le jeûne intermittent (intermittent fasting, IF) consistant à limiter la prise alimentaire à certaines heures de la journée, sans restriction calorique, pourrait avoir des effets bénéfiques sur les épilepsies infantiles: les épilepsies “absence”. Le but de ce projet sera d'évaluer si le régime IF est capable d’améliorer le poids des crises épileptiques (nombre, durée) ainsi que les déficits cognitifs et comportementaux associés. Nous utiliserons 2 modèles d’épilepsie infantile “absence” chez la souris. Nous allons aussi examiner si le régime IF permet de baisser la dose efficace de médicaments anti-épileptiques communément utilisés en clinique (ex. ethosuximide, valproate), en réduisant leurs effets secondaires. En parallèle, nous essayerons de comprendre les régulations des réseaux neuronaux sous-tendant la pathologie, ainsi que les modifications métaboliques, physiologiques et transcriptomiques qui accompagnent le régime IF.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à une réduction des crises d’épilepsie et une amélioration des comorbidités comportementales en agissant uniquement sur la fenêtre de la prise alimentaire, pas sur sa quantité ni sur sa composition. Il s’agit d’une approche facilement transposable dans le cadre clinique et qui pourrait aider les patients atteints d’épilepsie dans leur quotidien. De plus, l’administration de médicaments durant le régime IF pourrait permettre de baisser la dose efficace de ces composés, en limitant ainsi leurs effets secondaires.
Procédures
Tous les animaux subiront une intervention chirurgicale, pour la pose d'un implant afin d'effectuer des enregistrements électroencéphalogramme (EEG), ainsi que des prélèvements sanguins à un mois minimum d'interval (voir chronogramme en annexe). L'acte chirurgical dure environ 45 minutes. Le prélèvement sanguin dure 10 secondes max entre la contention et l'acte de prélèvement.
Impact sur les animaux
Le régime IF a été prouvé comme étant bénéfique pour la santé chez l'homme et l'animal. A noter que les modèles d'épilepsie que nous utilisons n'induisent pas de crises convulsives (motrices) mais de perturbations cérébrales qui provoquent un arrêt de l'activité locomotrice pour quelques secondes, plusieurs fois par heure. Les crises ne sont donc pas douloureuses ni fatigantes. La procédure prévoit des prélèvements sanguins ainsi qu'une chirurgie: ces actes pourraient induire une nuisance ou des effets indésirables sur les animaux (perte de poids, détachement de l'implant EEG, dégradation de l'apparence physique ou troubles du comportement). C'est pour cela que la procédure est classée modérée. Cependant nous mettrons en place une grille de scores dès l'apparition de signes cliniques. D'autre part, selon notre expérience le type de chirurgie prévue est très bien supporté par les animaux.
Devenir
A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus.
Remplacement
Il n'existe pas d'alternative autre que les animaux pour évaluer avec précision et pertinence un modèle épileptique dans notre projet de recherche.
Réduction
Nous utiliserons un même animal pour l'exploitation de plusieurs tissus, ce qui nous permettra de réduire le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de l'étude. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé selon Dell et al. (Samplesize determination, Ilar Journal, 2002, 43 :207) et le logiciel G*power, sur la base de publications précédentes et de notre expérience de manière à allier réduction du nombre d'animaux et validité statistique des expériences (niveau de significativité: p=0.05).
Raffinement
Des dispositions seront prises pour le raffinement des conditions d'élevage et d'expérimentation. Le maintien d'enrichissement de la naissance à l'expérimentation sera effectif dans toutes les cages. Un enrichissement supplémentaire de type paille en carton ("sizzle"), igloo, ou maison en carton sera mis en place en cas d'isolement des souris pour les besoins des expériences. Le bien-être animal sera au centre de notre projet. Un suivi régulier sera appliqué dès le débuts de nos expérimentations. Les chirurgies seront effectuées en suivant les règles d'anesthésie et analgésie. Une grille de score sera mise en place dès l'apparition de signes cliniques : dos vouté, poils ébouriffés, comportement anormal, stéréotypies.
Choix des espèces
L'espèce souris (Mus musculus) est un modèle très étudié dans tout projet de recherche. Les souris fournissent des excellents modèles d'épilepsie de type "absence", au cœur de notre projet. Les autres espèces utilisables ne sont pas envisageables à ce stade de l'étude en vue des contraintes éthiques et/ou d'hébergement requises par ces espèces. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes sur un point de vue médical. Nous utilisons les animaux à partir de 6 semaines car c'est l'âge à laquelle les crises d'absence commencent à se manifester. Les animaux seront utilisés à 6 semaines d'âge, âge à laquelle les premiers symptômes épileptiques sont visibles sur nos modèles génétiquement modifiés.
Étude de l’induction d’une immunité entrainée chez le souriceau en comparasion de l’adulte.
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Injectés par voie intrapéritonéale à une puis deux semaines de vie, éveillés et sous contention, des souriceaux reçoivent des immunostimulants censés installer une mémoire immunitaire innée, comparée à celle de souris adultes traitées de la même manière. 2 700 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélever leurs tissus, et le porteur prévoit 20 à 30 % de mises en reproduction en plus parce que le stress de certaines lignées "favorise le cannibalisme", les surnuméraires pouvant être "introduits dans un autre protocole". Des femelles, gestantes ou non, boivent une eau additionnée d'antibiotiques, et toute médication est proscrite pour ne pas fausser les mesures immunitaires. Sur l'injection, le porteur écrit qu'"aucune nuisances n'est observée", puis que "des douleurs légères peuvent être liées à l'injection intra-péritonéale", et juge "impossible d'anticiper" les effets indésirables des immunostimulants.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer la capacité de divers immunostimulants à induire une réponse immunitaire innée mémoire lorsqu’ils sont administrés en début de vie de l’animal. L’implication du microbiote intestinal sera également étudiée dans la modulation et la mise en place de l’immunité innée mémoire. La stimulation et la modulation des cellules de l’immunité innée en période néonatale pourraient permettre d’induire une réponse durable, avec une mise en place de la mémoire immunitaire innée pour favoriser le contrôle d’infections futures à l’âge adulte.
Bénéfices attendus
Les stratégies de contrôle pour lutter contre les infections sont parfois limitées et trop spécifiques d’un agent (ex : vaccin). L’idée ici est de proposer une nouvelle stratégie prophylactique qui cible l'hôte lui-même et plus spécifiquement son système immunitaire inné. Il repose sur l'utilisation d’immunostimulant favorisant la stimulation des récepteurs de l’immunité, et ainsi booster la réponse immunitaire innée pour mieux contrôler une infection zoonotique présente ou ultérieure (d’où les essais d’induction de mémoire innée).
Procédures
Les souriceaux seront soumis à deux administrations intra-péritonéales des immunostimulants : une fois à l’âge d’une semaine, puis à l’âge de deux semaines. Les souris adultes seront soumises à deux administrations intra-péritonéales des immunostimulants sur la période de 6-8 semaine à une semaine d’intervalle. Cette administration est réalisée sur animaux vigiles sous contention. Pour évaluer l’implication du microbiote intestinal, les souris adultes gestantes ou non recevront des antibiotiques dans l’eau de boisson.
Impact sur les animaux
Il est impossible d’anticiper, mais il est possible que des effets indésirables altérant l’état général de l‘animal puissent être remarqués avec certains immunostimulants. Concernant l’injection intra-péritonéale aucune nuisances n’est observée, en effet, nous utilisons des seringues adaptées (seringue insuline, 30G pour les souriceaux, et aiguille 29G pour les adultes), neamoins des douleurs légères peuvent être liées à l’injection intra-péritonéale.
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvements de tissus biologiques voués à l’étude scientifique.
Remplacement
L’étude des réponses immunitaires de l’hôte ne peut pas être réalisée sans expérimentation animale. En effet, les études in vitro ne tiennent pas compte de la complexité des coopérations cellulaires et de l’environnement biologique (interaction cellulaire, recrutements cellulaires, …).
Réduction
Le plan expérimental (nombre d’animaux par lot, nombre de lots expérimentaux, répétition des expérimentations) a été établi de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de l’exploitabilité et de la significativité des résultats. Toutefois, malgré l’enrichissement, l’état de stress qui caractérise certaines lignées de souris, favorise le cannibalisme, c’est pourquoi plus d’animaux sont mis en reproduction (20 à 30% de plus, les reproductions sont gérées par l’établissement). Les animaux surnuméraires sont toujours utilisés et peuvent être introduits dans un autre protocole. Les immunostimulants cibleront spécifiquement des récepteurs des cellules immunitaires. Les immunostimulants non commerciaux seront tous préalablement validés in vitro pour leur capacité à stimuler fortement les cellules immunitaires avant de procéder à des études in vivo. L’étude de l’immunité innée mémoire s’effectuera dans différents organes. Afin de réduire le nombre d’animaux inclus dans l’expérimentation, les différents organes prélevés sur un même animal seront utilisés autant que possible pour réaliser différents types d’analyse. Pour analyser les données, nous utiliserons des modèles statistiques mixtes adaptés qui tiennent compte à la fois des traitements immunostimulants et de la répétition des expériences.
Raffinement
Les souris sont hébergées en animalerie A2 en atmosphère contrôlée, à raison de 5 souris maximum lorsqu’elles sont adultes, dans un environnement enrichi (refuge en polycarbonate, feuilles de papier absorbant, copeaux, morceau de bois) ou 1 mère avec sa portée par cage, dans un environnement enrichi (papier absorbant qui diminue le cannibalisme des souris à la mise-bas, sizzle-nest, bâtonnets de coton, morceau de bois). Toute médication est proscrite pour ne pas interférer avec les paramètres immunologiques étudiés. Cependant les animaux sont suivis 2 fois par jour afin de prendre une décision rapide en cas d'atteinte des points limites durant tout le protocole et de limiter la douleur induite : (i) de souriceaux mis à l’écart par la mère, qui ne grossissent pas ou dont le pelage ne se développe pas (lié au retard de croissance), (ii) de souris amaigries, prostrées et avec le poil ébouriffé. Nous prenons encore plus de précautions (bruits) lors des visites lorsqu’il s’agit d’expérimentations avec les femelles gestantes et les premiers jours suivant la mise-bas
Choix des espèces
Dans la présente demande, l’utilisation de souris (souriceaux, souris adulte) nous permettra d’étudier et décrire très précisément les mécanismes d’induction des réponses immunitaires innées mémoires après l’administration d’immunostimulants. 1. Des souriceaux entre 0 jours et 3 semaines seront utilisés car c’est la fenêtre que nous souhaitons étudier pour l’induction de l’immunité innée mémoire. Des souris gestantes fourniront les souriceaux 2. Des adultes seront utilisés dans le cadre de l’étude de l’immunité innée mémoire, afin de comparer ces évènements entre la période néonatale (premières semaines de vie) et la période adulte (6-8 semaines).
Influence du système leptinergique sur la commande respiratoire chez un modèle murin du syndrome d’Ondine
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
Lors des administrations de leptine par le nez sous anesthésie, le point limite retenu pour les souris adultes est l'arrêt cardiorespiratoire, ces souris mutantes présentant un risque accru de troubles respiratoires mortels sous anesthésie. 211 souris porteuses de la mutation Phox2b, présentées comme reproduisant le syndrome d'Ondine, vont être utilisées dans des procédures classées sans réveil pour une partie et d'un niveau de souffrance modéré pour l'autre, toutes tuées. Les souriceaux de cinq jours au plus et les juvéniles de quinze jours au plus sont tués dès le début des procédures pour prélever une partie de leur système nerveux central, tandis que les adultes inhalent du solvant et de la leptine à 48 heures d'intervalle, ou en reçoivent par le nez sous isoflurane, avant des enregistrements en chambre de pléthysmographie et leur mise à mort. Le projet doit décrire l'action de la leptine sur la commande respiratoire, et le porteur en attend des données qui "devraient permettre de constituer un socle de connaissances" pour la prise en charge future des patients.
Objectifs
Les syndromes d’hypoventilation alvéolaire centrale sont des pathologies associées à une dérégulation du fonctionnement du système nerveux autonome. Dans le cadre de ces pathologies, des perturbations de la commande respiratoire sont observées en lien avec un dysfonctionnement de sa régulation. Ces syndromes englobent le syndrome d’Ondine. Cette pathologie survient dès la naissance. Son nom provient de la mythologie germanique. En effet une nymphe trompée par son conjoint lui jeta un sort l’obligeant à toujours penser à respirer. Un jour il s’endormit et cessa de respirer. Les personnes atteintes de ce syndrome doivent tout au long de leur vie supporter une aide ventilatoire dès qu’elles s’endorment. Les expérimentations réalisées chez des souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine permettront notamment de caractériser l’action de la leptine sur la commande respiratoire et d’étudier s’il est possible d’améliorer la respiration de ces souris. Les souris mutantes qui modélisent le syndrome d’Ondine feront l’objet de deux procédures expérimentales. La littérature indique que la leptine contribuerait au contrôle de la respiration. Une première procédure s’intéressera chez des souris nouveau-nées à l’action de la leptine sur la commande respiratoire ou sur des neurones de cette commande. Les approches utilisées iront de l’analyse de la commande respiratoire sur des préparations isolées de système nerveux central, à l’étude sur tranches de système nerveux central de l’activité des neurones modulant la commande respiratoire. Une deuxième procédure s’intéressera à l’action de la leptine sur la ventilation des souris adultes mutantes modèle du syndrome d’Ondine. La leptine sera administrée par nébulisation ou par injection intranasale. La ventilation sera ensuite enregistrée sur animal non contraint, vigile et de manière non invasive. Enfin, l’analyse des populations neuronales impliquées dans l’action de la leptine sera réalisée par des approches histologiques. In fine, les données obtenues devraient donc permettre de mieux comprendre comment la leptine peut moduler la commande respiratoire. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) devraient permettre de constituer un socle de connaissances participant à la prise de décision quant à la prise en charge future de patients atteints du syndrome d’Ondine.
Bénéfices attendus
Les souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine que nous utilisons dans ce projet sont porteuses d’une mutation sur un gène dont la protéine, est exprimée dans une population de neurones indispensables à la réponse respiratoire à l’hypercapnie ou chémosensibilité au CO2/H+. Ces souris, à la naissance ne présentent pas de réponse à l’hypercapnie qui est partiellement restaurée chez les souris adultes. La stimulation des systèmes leptinergiques pourrait potentiellement i) améliorer la respiration de ces souris nouveau-nées, juvéniles ou adultes et ii) restaurer une réponse à l’hypercapnie chez les souris nouveau-nées ou juvéniles et restaurer ou potentialiser cette réponse chez les souris adultes. De plus nous voulons décrypter quelles sont les cibles de la leptine au niveau de la commande centrale respiratoire et si ces cibles évoluent selon l’âge des souris mutantes dont certaines récupèrent naturellement une faible réponse à l’hypercapnie. In fine, les données obtenues devraient donc permettre de mieux comprendre comment la leptine peut moduler la commande respiratoire. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) devraient permettre de constituer un socle de connaissances participant à la prise de décision quant à la prise en charge future de patients atteints du syndrome d’Ondine.
Procédures
Les souris nouveau-nées ou juvéniles sont euthanasiées dès le début des procédures afin d'isoler rapidement une partie du système nerveux central. Les souris adultes utilisées, ne sont exposées à aucun prélèvement sur animaux vigiles ou procédures chirurgicales. Elles vont être exposées à la nébulisation de solvant et de leptine (10 minutes à chaque fois) avant la mesure des variables ventilatoires, 48h sépareront la nébulisation du solvant de la nébulisation de leptine. Les souris adultes de la procédure seront anesthésiées à l'isoflurane et dès l'anesthésie installée, l'administration par voie nasale du solvant ou de la leptine (volume 24 microlitres dans les 2 cas) sera réalisée. 48 heures sépareront les 2 anesthésies.
Impact sur les animaux
Les souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine présentent une absence à la naissance de la réponse à l’hypercapnie. Les données de la littérature indiquent une restauration partielle de la réponse respiratoire à l’hypercapnie à l’âge adulte. Nos données non publiées à ce jour font de plus état d’une hypoventilation en normocapnie. Malgré ces atteintes respiratoires, nous n’avons pas observé de différence dans la masse des souris quel que soit l’âge. De plus, la mortalité périnatale est identique chez les souris mutantes et leurs congénères sauvages. Les données de la littérature sur ces souris mutantes mettent en évidence une sensibilité exacerbée à l’anesthésie. Ce qui conduit à un risque accru de troubles respiratoires mortels lors des injections intranasales sous anesthésie.
Devenir
Les souris nouveau-nées utilisées sont toutes euthanasiées dès le début de la procédure pour les prélèvements de préparations permettant l'enregistrement ex vivo de la respiration. Les souris nouveau-nées et juvéniles utilisées sont toutes euthanasiées dès le début de la procédure afin de prélever des tranches de bulbe rachidien comportant la commande centrale respiratoire permettant d'enregistrer les neurones de cette commande. Les souris adultes seront toutes euthanasiées à la fin des enregistrements et le tissu nerveux central sera prélevé post mortem.
Remplacement
L’utilisation de neurones isolés en culture ne permet pas d’appréhender les relations entre les structures neuronales et de mettre en évidence le développement de réseaux substitutifs nécessaires à la correction de la pathologie. La fonction respiratoire nécessite l’utilisation de modèle ex vivo et in vivo. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande respiratoire dans des conditions qui ne peuvent être obtenues autrement que par un travail sur des souris vivantes. L’étude de l’influence de la leptine sur la commande centrale respiratoire de souris nouveau-nées ou nécessitent de conserver ex vivo un réseau de neurones vivant et fonctionnel et donc l’utilisation de souriceaux. L’étude des corrections des variables respiratoires par la leptine ne peut être réalisée que sur des souris adultes vivantes.
Réduction
Nous utilisons aussi bien les souris mâles que les femelles dans nos travaux afin de limiter le nombre d’animaux. Le nombre total d’animaux impliqués sera de 211. L’expérimentation s’appuie sur la comparaison de variables physiologiques entre deux lots ou entre deux conditions dans un même lot. Le nombre d’animaux par groupe a établi que des groupes de 23 souris nouveau-nées et 25 souris adultes mutantes Phox2b sont nécessaires pour mettre en évidence des différences biologiquement significatives dans les variables respiratoires. Les mêmes animaux seront engagés dans l’analyse de la commande respiratoire et dans l’analyse des populations cellulaires impliquées.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. L’habituation aux enceintes de pléthysmographie se traduit par la disparition des épisodes de tachypnées et de toilettages des souris lorsqu’elles sont dans un nouvel environnement. Après 5 jours d’habituation, les souris sont calmes et leur respiration est régulière dès le placement dans l’enceinte. Les souris mutantes présentent une sensibilité exacerbée à l’anesthésie ce qui conduit à un risque accru de troubles respiratoires mortels lors des injections intranasales sous anesthésie. De ce fait, lors des injections intranasales de leptine ou du solvant sous anesthésie, une surveillance accrue et en continue du rythme cardiorespiratoire est assurée par l’expérimentateur jusqu’au réveil complet de la souris. En cas de défaillance cardiorespiratoire, l’anesthésie est stoppée, la souris est réanimée si nécessaire par l’expérimentateur. Les points suivants seront considérés comme des points limites : -tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire -modification du comportement caractéristique d’une douleur intense, une détresse ou une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et ou terne, prostration, dos vouté) -anomalies pouvant entrainer une douleur intense ou une souffrance, par exemple une perte de la masse corporelle supérieure ou égale à 20% de la masse initiale de l’animal, plaies et ulcères, tumeurs, fractures… -Lors des injections intranasales de leptine ou du solvant sous anesthésie, une surveillance accrue et en continue du rythme cardiorespiratoire est assurée par l’expérimentateur jusqu’au réveil complet de la souris du fait d’une sensibilité accrue des souris mutantes à l’anesthésie. L’arrêt cardiorespiratoire est considéré comme le point limite associés à ces injections.
Choix des espèces
Les rongeurs (rats et souris) sont depuis de nombreuses années les espèces animales de choix pour l’étude des mécanismes associés à la genèse et à la régulation de la commande respiratoire. Le modèle animal du syndrome d’Ondine n’existe, de nos jours, que sur modèle murin : souris portant la mutation Phox2b de manière constitutive ou souris dont la mutation Phox2b est restreinte au noyau rétrotrapezoide impliqué dans la chémosensibilité au CO2. Ces souris mutantes ont été validées par des études antérieures. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande respiratoire dans des conditions qui ne peuvent être obtenues autrement que par un travail sur les souris Phox2b mutées : étude de l’influence sur commande centrale respiratoire ex vivo de la leptine ; étude sur des tranches de tissu des changements des propriétés électriques des neurones avec l’âge ; étude de la respiration par pléthysmographie de l’influence de la leptine appliquée in vivo par nébulisation ou par administration intranasale. -nouveau-né de 5 jours maximum pour l’étude de la commande respiratoire générée par des préparations ex vivo de système nerveux central. Ce stade de développement est imposé par l’approche méthodologique ; Ces préparations génèrent une activité rythmique. Au-delà de 5 jours de vie postnatale, elles ne génèrent plus cette activité du fait de la maturation du système nerveux. -juvénile de 15 jours maximum pour l’étude des modifications des propriétés électriques des neurones impliqués dans la chémosensibilité au CO2. Ces travaux dépassant l’âge de 12 jours postnataux apporteront des informations importantes pour comprendre comment les souris mutantes exprimant la mutation Phox2b dans une structure clé de la chémosensibilité au CO2 récupèrent partiellement une sensibilité à l’hypercapnie. -adulte à partir de 2 mois, les souris auront récupérées 40% de la réponse à l’hypercanpnie. Nous pourrons combiner l’enregistrement de la ventilation par pléthysmographie à l’exposition par inhalation à la leptine.
Le rôle des plaquettes dans la formation des anévrysmes intracrâniens
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 179 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et chacune subit deux opérations de cinquante minutes, cinq prises de sang, dix jours de séances où elle est maintenue immobile pour mesurer sa pression artérielle, trois échographies et deux IRM. La première opération consiste à ligaturer la carotide gauche et l'artère rénale droite, la seconde à injecter une molécule dans le cerveau et à poser sous la peau du dos un dispositif qui élève la pression artérielle, afin de provoquer en 23 jours des anévrismes intracrâniens. Une partie des souris appartient à des lignées génétiquement modifiées dont les plaquettes sont privées de certaines molécules. Le porteur prévoit environ 10 % de décès à chacune des deux chirurgies, et les souris dont l'anévrisme se rompt, avec hémorragie et signes neurologiques, sont tuées dès la rupture identifiée, les autres à la fin du protocole. Le gain reste au conditionnel : si des antiplaquettaires empêchaient ces anévrismes, "le bénéfice pour les êtres humains pourrait être conséquent", écrit le porteur.
Objectifs
Les anévrysmes intracrâniens (AI) sont des déformations des vaisseaux sanguins présentes dans le cerveau chez environ 4% de la population avec une majorité de femmes atteintes. La rupture d'un anévvrysme entraine des saignements dans le cerveau, ce qui provoque le plus souvent la mort du patient. L’unique traitement des AI, rompus ou non, consiste en une intervention chirurgicale risquée permettant de retirer l'anévrysme du cerveau. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, moins lourdes, pour améliorer la prise en charge des patients. Il est aujourd’hui admis qu'un flux sanguin anormal et une inflammation de la paroi vasculaire sont à l'origine de l'anévrysme car ils fragilisent la paroi, ce qui permet la déformation du vaisseau. Cette déformation du vaisseau qu'est l'AI évoluera ou non jusqu’à sa rupture. Il apparait que les plaquettes, petites cellules sanguines responsables, entre autre, de la cicatrisation lorsqu'on se coupe et de la coagulation, pourraient être impliquées dans les processus pathologiques de formation d'AI. Ces cellules sont en effet les garantes de la bonne santé de la paroi des vaisseaux. Ce projet a pour but de caractériser la contribution des plaquettes et leur mécanismes de réponses lors des stades précoces de la pathologie anévrysmale. Pour cela, nous allons appliquer un modèle d’induction d’anévrysme bien connu et documenté chez la souris. Ce modèle permet d’obtenir en 23 jours chez la souris la formation d'AI. Pour étudier dans la pathologie anévrysmale le rôle de différentes molécules plaquettaires nous disposons de lignées murines génétiquement modifiées ayant des plaquettes déplétées pour ces différentes molécules plaquettaires que nous voulons tester. Nous utiliserons aussi différents médicaments ciblant tous différentes propriétés plaquettaires.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre dans un premier temps d'identifier des molécules plaquettaires impliquées dans la formation des anévrysmes et leur croissance. Il permettra par la suite de tester des médicaments antiplaquettaires déjà utilisés chez l'Homme (comme par exemple l'Aspirine qui empêche les plaquettes de remplir leur rôle dans la coagulation)ainsi que de nouvelles molécules antiplaquettaires en développement. Si nous validons des médicaments empêchant la formation ou la croissance des anévrysmes, le bénéfice pour les êtres humains pourrait être conséquent. De plus, comme les médicaments que nous allons tester sont pour la plupart déjà administrés à l’Homme il n'y aura pas à attendre pour obtenir toutes les autorisations nécessaires à l'utilisation d'une nouvelle molécule chez l'Homme. Finalement, ce projet pourrait permettre de remplacer un traitement chirurgical compliqué et dangereux par un traitement médicamenteux simple et beaucoup moins dangereux.
Procédures
Tous les gestes techniques à l’exception de la mesure de la pression artérielle sont réalisés sur animaux anesthésiés à l’aide d’une anesthésie gazeuse. Tous les animaux prévus dans ce projet seront soumis à une procédure permettant de créer des anévrysmes intracrâniens. Avant l'intervention chirurgicale : un prélèvement sanguin (1 minute) est prévu ainsi qu'une session de rasage des zones opérées (5 minutes). 4 autres prélèvements sanguins (1minute) sont prévus afin de pouvoir étudier les propriétés du sang des souris tout le long du modèle. la première procédure chirurgicale de 50 min consiste en la ligature de la carotide commune gauche, la ligature de l’artère rénale droite (30 min de procédure pour ces deux ligatures) + 20 min de suture du muscle abdominal et de la peau. Les ligatures consistent à faire un noeud autour des artères avec un fil, ce qui permet de couper la circulation sanguine et la suture permet de remettre les bords de l'incision faite au niveau du ventre de la souris ensemble ce qui permettra la cicatrisation. Cette procédure s’effectue sur animaux analgésiés. Une autre procédure chirurgicale de 50 min est prévue durant laquelle l’animal reçoit une injection d'une molécule dans le cerveau (40min) et la pose d'un dispositif en sous cutanée au niveau du dos permettant de diffuser une molécule augmentant la pression artérielle(10min). Cette procédure s’effectue sur animaux analgésiés. La pression artérielle des souris sera mesurée sur souris vigile lors de session de 15 minutes de mesure. Chaque souris aura 4 jours de session constituant des séances d’habituation à la machine et 6 jours de mesure de pression. L'évolution de leur pathologie sera surveillée par des méthodes d'imagerie: 3 séances d’échographie doppler (15min par séance) + 2 séances d’IRM (30 min par séance)
Impact sur les animaux
Une certaine mortalité est attendue lors de la chirugie de ligature des artères (obstruction d'artère permettant de modifier le flux sanguin dans le cerveau de l'animal), estimée être de l’ordre de 10%. Il en est de même pour la chirurgie d’injection de molécule dans le cerveau, il existe une mortalité de 10%. Les effets indésirables prévus sur les animaux sont : douleur post-opératoire (modérée grâce à l'utilisation d'antidouleur, pendant environ 24h) après chaque chirurgie; perte de poids postopératoire. Pendant la mesure de leur pression artérielle, les animaux peuvent ressentir du stress car ils sont maintenus immobiles (de façon non douloureuse pour l'animal). Si les animaux souffrent d'une rupture d’anévrisme : brusque perte de poids ; Apparition de symptomes neurologiques, hémorragie.
Devenir
Dès lors qu'une rupture d'anévrysme est identifiée, les animaux sont euthanasiés. Les animaux arrivant jusqu'à la fin de la procédure sans avoir eu de rupture d'anévrysme sont aussi euthanasiés. Nous effectuons des euthanasies afin de pouvoir analyser le cerveau des souris et les anévrysmes qui s'y sont développés. Nous étudions aussi leur sang pour analyser les caractéristiques de leur plaquettes.
Remplacement
La maladie que nous cherchons à étudier est une maladie complexe qui fait intervenir beaucoup de paramètres (inflammation, remodelage de la paroi des vaisseaux sanguins, flux sanguin, pression artérielle...). Il n'existe pas de dispositif aujourd'hui permettant de mimer tous les paramètres nécessaires à la maladie. Il est nécessaire d'utiliser des animaux vivants pour provoquer une maladie qui se rapproche de celle des Humains
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grace aux données disponibles dans la litératture scientifique du domaine. Des tests statistiques pour connaitre le nombre de souris minimum nécessaire ont aussi été réalisés.
Raffinement
Une grille de score a été mise en place, nous permettant d'agir sur la souffrance des animaux avec euthanasie lorsque des points limites sont atteints. La douleur post-opératoire est évaluée chez nos animaux, et est traitée préventivement grâce à l’administration d'un antidouleur. Après les chirurgies, les souris sont gardées en observation car il peut arriver qu’une hémorragie (due au passage de la micropipette dans un vaisseau par exemple) survienne. Ceci s’exprime par l’apparition de symptome neurologique et la souris est alors euthanasiée. Après cette chirurgie, les souris peuvent aussi être gênées dans leurs mouvements pendant 1 à 2 jours. De la nourriture humide est donc placée au sol dans leur cage, plus facile d’accès. L'apparition de symptôme neurologique, l'apparence général des animaux ainsi que leur poids sont contrôlés tous les jours. Enfin, du coton est placé dans leur cage ce qui permet aux animaux de faire des nids.
Choix des espèces
La souris présente un système vasculaire, c'est à dire une organisation des vaisseaux sanguins proche de l'Homme. De même son système immunitaire impliqué dans les inflammations ressemble aussi à celui de l'Homme, permettant une transition des résultats trouvés chez la souris à l'Hommme plus facile. De plus, il existe un grand nombre de souris ayant différentes protéines de plaquette absentes, nous permettant d'en tester un grand nombre. Sa large utilisation dans le domaine scientifique a conduit au développement de nombreux modèles d’anévrysme intracranien dont celui sur lequel se base le projet, qui permet de mimer certaines caractéristiques de la pathologie humaine. Age adulte (entre 8 et 12 semaines). Notre étude porte sur le rôle des plaquettes dans une pathologie touchant principalement des individus adultes.
Création d’une plateforme préclinique d’étude des malformations caverneuses cérébrales sporadiques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement modifiées pour développer des malformations caverneuses cérébrales, elles reçoivent une injection intracrânienne à la naissance puis un traitement pendant trente jours, et le porteur indique qu'elles développeront crises convulsives et déficits moteurs. À l'issue des procédures, elles sont tuées pour évaluer les malformations et la réponse aux traitements. Le porteur présente les retombées au conditionnel, ce projet "pourrait" jeter les bases d'un essai clinique de l'Alpelisib chez l'humain.
Objectifs
Des mutations de PIK3CA ont récemment été découvertes dans 39% des cavernomes sporadiques et un premier modèle souris génétiquement modifié de cavernome muté PIK3CA a été publié. Des mutations de MAP3K3 ont également été mises en évidence dans 44% des cavernomes sporadiques sans réalisation de modèle souris associé. Le présent projet propose la réalisation d'un modèle souris génétiquement modifié de cavernome muté MAP3K3 et l'utilisation dans un essai pré-clinique des deux modèles sus-cités.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre les mécanismes de formation des cavernomes sporadiques, confirmer le rôle central de PIK3CA et jeter les bases d'un essai clinique chez l'homme pour l'Alpelisib, offrant ainsi un traitement à des patients parfois en impasse thérapeutique.
Procédures
Les animaux porteurs de cavernomes seront détectés par IRM puis seront soumis à des injections intra-crâniennes néo-natales (1 injection par animal) et à un traitement par voie orale (7 animaux) ou par voie intra-péritonéale (7 animaux), tous deux durant 30 jours. La durée procédures sera de 30 minutes par animal pour les IRM et de 1 minute par animal pour les gavages.
Impact sur les animaux
Les animaux vont développer des symptômes cliniques liés à la présence de cavernomes, notamment des crises convulsives et/ou des déficits moteurs, et seront donc étroitement surveillés pour limiter la souffrance à l'apparition des premiers symptômes. Il n'existe pas d'effet indésirable rapporté chez la souris pour les traitements proposés dans notre projet, qui ont déjà fait l'object d'essais pré-cliniques chez la souris.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue de l'ensemble des procédures afin de pouvoir évaluer la survenue de malformations dans les nouveaux modèles souris décrits et d'évaluer la réponse morphologique des malformations vasculaires aux différents traitements dans le cadre de l'essai pré-clinique.
Remplacement
Les modèles in vitro et sur animaux invertébrés ne permettent pas l'obtention de cavernomes avec un aussi grand niveau de reproduction de la pathologie humaine que les modèles souris que nous avons déjà réalisés. La souris reste donc l'espèce les plus appropriée pour cette étude.
Réduction
Nous avons réduit le nombre d’animaux utilisés au maximum (nombre total: 160)pour nous permettre de générer des résultats solides. Afin d'assurer la fiabilité statistique et de limiter le nombre d'animaux, nous avons estimé l’effectif a priori sur la base de travaux antérieurs.
Raffinement
Les procédures d'injection intra-crânienne ont été adaptées pour diminuer le stress et la douleur en réduisant notamment au maximum le temps d’exposition au stress en limitant le nombre d'injections par animal au minimum. Les procédures seront stoppées en cas de stress ou douleur non contrôlé, non traitée.Les animaux auront accès à l'eau et à la nourriture ad libitum et disposeront d'enrichissements. Toutes les conditions sont réunies pour prendre en compte la douleur de l'animal, une anesthésie étant pratiquée quand cela est nécessaire. Les points limite sont définis. Les animaux seront suivis par un personnel compétent au sein d'un milieu enrichi.
Choix des espèces
Le modèle animal est le seul moyen de déterminer avec précision la capacité de MAP3K3 à initier ou promouvoir la formation des cavernomes, notamment en raison de l'absence de cultures cellulaires de cavernomes en général et plus particulièrement avec le profil mutationnel désiré. Les autres expériences prévues dans le projet doivent être réalisées chez la souris car elles utilisent un modèle souris déjà publié et validé par la communauté scientifique internationale. Les animaux seront utilisés de la naissance à l'âge de 12 mois de manière similaire aux précédents modèles de cavernomes publiés par l'équipe.