Rongeurs
Analyse du role de Trim47 dans la barriere hémato encéphalique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 039 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie, des nouveau-nés placés avec leurs mères dans un caisson à 75 % d'oxygène, d'autres recevant un agent provoquant une hypertension ou une toxine bactérienne, subissent des injections de virus puis des tests d'apprentissage et de mémoire. Le projet fondamental étudie le rôle du gène Trim47 dans l'atteinte des petits vaisseaux du cerveau. Le porteur affirme que la physiologie complexe des vaisseaux ne peut être reproduite in vitro de façon satisfaisante.
Objectifs
Les récents progrès obtenus en imagerie par résonance magnétique (IRM) ont permis de mettre en évidence des images anormales au niveau du cerveau chez des patients atteints de maladies neurodégenératives : on parle de taches blanches ou de zones d’hyper-signal de la substance blanche. Ceci est le résultat de processus de démyélinisation ou de destruction de la myéline. Ces zones d’hyper-signal de la substance blanche sont associées à un risque accru de dysfonctionnement cognitif et moteur, de démence, de dépression et d’accident vasculaire cérébral. Le développement de ces lésions tissulaires seraient dues à une atteinte des petits vaisseaux cérébraux profonds. Malgré une héritabilité importante, peu de loci génétiques ont été identifiés. Une récente étude génétique a permis l’identification d’un nouveau gène de susceptibilité. Nous voulons dans ce projet fondamental comprendre le rôle de ce gène dans les pathologies neuro dégenératives en utilisant des modèles murins génétiques.
Bénéfices attendus
La prévalence des maladies neurodégenératives présentant des démences vasculaires augmente constamment avec le vieillissement de la population. Les études réalisées à partir de cohorte de patients atteints de troubles de démence ont permis d’identifier des marqueurs génétiques. Il est nécessaire maintenant de comprendre le rôle de ces gènes. La combinaison de modèles murins génétiques et de modèles pathologiques permet d’accroître cette connaissance. Identifier les mécanismes impliqués dans ces altérations du fonctionnement des petits vaisseaux cérébraux constitue aujourd'hui un véritable enjeu de santé publique pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Nous développerons plusieurs modèles pathologiques chez la souris afin de créer (1) un stress hypoxique (modèle d’hypoxie néonatales) (2) un stress d’hypertension systémique (3) stress inflammatoires du cerveau. Nous analyserons les conséquences sur les troubles de comportement, et l’apparition des marqueurs de dégénérescences neuronales et vasculaires. Le modèle d’hypoxie néonatales : Nombre d’animaux : 700. Des souriceaux nouveaux-nés 7 jours après leur naissance ainsi que leurs mères sont mis dans un caisson à 75 % d’oxygène. A P12, les souris retournent à une atmosphère normale avant d’être euthanasiées. Modèle d’hypertension artérielle systémique et trouble cognitif : Nombre d’animaux : 115. Les animaux auront : injection de virus en retroorbitaire sous anesthésie gaseuse, puis 2 semaines après, une implantation en sous cutanée de pompe diffusant un agent hypertenseur sous anesthésie gaseuse puis 3 semaines après ils seront analysés chaque jour pour l’apprentissage d’une tache pendant 5 jours. Une analyse de flux cérébral sera faite sous anesthésie avant euthanasie. Modèle de stress inflammatoires : Nombre d’animaux : 224. Les souris adultes (2 mois) auront : une injection de virus en retroorbitaire sous anesthésie gaseuse. Après 2 semaines, les souris seront inclues pour l’apprentissage d’une tache pendant 5 jours. Puis elles seront injectées avec une solution de toxine bactérienne à faible dose par voie intra péritonéale pendant 5 jours successifs. 6 heures après chaque injection elles seront soumises dans le test de mémoire. Elles seront euthanasiées à la fin du protocole soit pour une analyse histologique des tissus après une perfusion intracardiaque soit pour analyse moléculaire après dislocation. Un ensemble de souris suivront le meme protocole mais sous un régime supplémenté avec t-butylhydroquinone (tBHQ) (1% W/W) (agent anti oxydant) 2 semaines avant le protocole et maintenu pendant tout le protocole inflammatoire.
Impact sur les animaux
Le modèle d’hypoxie néonatale : Les altérations du comportement pourront apparaître entrainant un arrêt de l’expérience : 1/ Altération du comportement de la mère : ne se nourrit plus ; ne bouge plus ; délaisse et ne nourrit plus la portée ; les nouveaux nés sont dispersés dans la cage. 2/ Altération du comportement des nouveaux-nés : immobilité, arrêt de l’allaitement, exclusion du nid par la mère. Le stress inflammatoire : Les complications aigues pourront être l’apparition d’un syndrôme inflammatoire aigu. Cela entraine un arret de la mobilité de l’animal, une prostration, une altération de son apparence avec des poils ébouriffés et une diminution significative de la prise alimentaire. Modèle d’hypertension : les complications aigues pourront être des accidents cérébro vasculaires (l'animal montre des changements de mobilité, souvent déplacement en cercle) ou des infarctus cardiaques (animal reste prostré peu vigile).
Devenir
Tous les animaux inclus dans ce protocole seront ensuite euthanasiés. Tous les animaux sont euthanasiés pour des prélèvements de sang et et de tissus pour des analyses post mortem.
Remplacement
Ce projet sera réalisé en utilisant des modèles murins qui reproduisent des lésions neuropathologiques avec atteintes des petits vaisseaux du cerveau décrites dans les maladies neurovasculaires, ainsi que les signes cliniques associés à ces maladies, comme les déficits d’apprentissage et de mémoire. L'intégrité vasculaire dépend d'interactions multiples entre différents types cellulaires. Il est encore très difficile d'appréhender in vitro les interactions entre le tissu environnant et les réseaux tridimentionnels des vaisseaux et les altérations du phénotype vasculaire sur la fonction d'un organe (notamment le cerveau). L'expérimentation in vivo en association avec l'utilisation de souris transgéniques délétées spécifiquement dans certain tissu (endothélium...) permet de différencier l'action spécifique de chaque type cellulaire dans le tissu et fournit des informations de mécanismes physiopathologiques impossible à obtenir in vitro. Pour réduire le nombre des animaux aucune expérience déjà publiée n'est reproduite et lorsque cela est possible les études conceptuelles sont réalisées in vitro sur des cellules en culture avant d'être testé in vivo. Cependant la physiologie des vaisseaux est complexe, met en jeu des interactions mutiples entre les composants de la paroi vasculaire et le sang qui ne peuvent pas être reproduites in vitro de façon satisfaisante.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé à partir des expériences préliminaires qui ont permis d’identifier le nombre minimum d’animaux à utiliser par groupe pour permettre une analyse des résultats statistiquement significative. Pour réduire le nombre d'animaux, les animaux seront inclus dans plusieurs protocoles expérimentaux (tests de comportement, suivi des pressions systémiques et flux sanguin cérébral puis euthanasie pour analyse histologique
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions limitant au maximum le stress et la douleur. Ils sont élevés en groupe dans des cages ventilées maintenant une atmosphère saine. Des jouets de carton sont mis à disposition des animaux dans leur cage pour enrichir leur environnement, leur permettre de ronger et de se cacher. Les litières sont dépoussiérées et additionnés de cubes de coton leur permettant de construire des nids. Les opérations chirurgicales sont réalisées sur couverture chauffante, sous anesthésie gazeuse et en présence d’un antalgique. Après chirurgie nous plaçons dans la cage des souris des sachets de nourritures enrichie et hydratée. Les animaux sont surveillés par la visite quotidienne du zootechnicien. En cas de problème de santé des animaux, l'expérimentateur est immédiatement alerté. Il prendra la décision de la mise à mort en fonction de la grille "observation-Action" en annexe.
Choix des espèces
La souris a été choisie en raison de l'existence de souris transgéniques dont les gènes d'intérêt ont été mutés. C 'est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale du réseau vasculaire à de forte ressemblance avec celui décrit chez l'homme. Les animaux seront utilisés au stade suivant : - Post natal : Le modèle murin de rétinopathie induite par l’oxygène (OIR) est un modèle bien caractérisé qui récapitule les caractéristiques de la rétinopathie chez le prématuré. La souris est une espèce nidicole dont la rétine est immature à la naissance à terme. C’est donc un bon modèle pour le suivi de la maturation rétinienne depuis le début de l'exposition à des stress oxydatifs exogènes par des niveaux élevés d'oxygène (comme modèle de la rétinopathie du prématuré humain induite par l’oxygène). Le protocole consiste à introduire des souriceaux nouveaux-nés 7 jours après leur naissance (P7) dans un caisson où l’atmosphère est contrôlée à 75 % d’oxygène pendant 5 jours puis de les replacer en atmosphère à 21% d'oxygène. -Pour la mise en reproduction, tous les animaux seront utilisés au stade adulte soit plus de 8 semaines chez la souris. - toutes les autres expériences (stress inflammatoire, HTA) seront réalisées sur des animaux adultes (2 mois à 6 mois) car la maturation du système vasculaire au niveau du cerveau se fait dans les premier mois en post natal. Pour ne pas avoir de biais dans l’analyse des résultats, nous devons tester des animaux qui ont un réseau vasculaire mature.
Validation de compétences pour la pose de cathéters vasculaires chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
60 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie puis tuées avant tout réveil. Chacune sert à entraîner un doctorant à poser des cathéters dans la veine fémorale et l'artère carotide, lors d'une chirurgie pouvant durer deux heures, non pour produire des connaissances mais pour acquérir un geste technique. Après la mise à mort, les corps pourront resservir à des formations à la dissection. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de remplacement possible" pour s'entraîner à ces poses de cathéters.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de former le doctorant à des techniques de microchirurgies spécifiques nécessaires à ses expérimentations (pose de cathéter chez la souris au niveau de la veine fémorale et de l’artère carotide). Le doctorant porteur de projet (réglementairement compétent Diplôme Universitaire d'Experimentation Animale et Diplôme Universitaire de chirurgie) a déjà expérimenté la microchirurgie (repères anatomique, abord et préparation des vaisseaux cibles) sur une dizaine de souris dans un projet précédemment autorisé mais qui arrive à terme, et nécessite encore de l’entrainement pour valider un modèle de souris anesthésiée avec paramètres vitaux maintenus à valeurs physiologiques (fréquence cardiaque et pression artérielle) pendant 1 heure (durée des expérimentations qui seront réalisées ensuite sur ce modèle dans le laboratoire partenaire).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra au porteur de projet de valider un modèle murin (contrôler l’induction et le maintien de l’anesthésie, pose de cathéters vasculaires qui nécessite de l’entrainement afin d’acquérir les bons gestes de microchirurgie, et maintien des paramètres vitaux sous anesthésie). Ainsi, les expérimentations à réaliser dans le laboratoire partenaire seront sécurisées et de meilleure qualité, nécessitant moins d’animaux et respectant le bien être de ceux qui seront utilisés dans les expérimentations communes
Procédures
une seule procédure chirurgicale sous anesthésie et analgésie, de durée limitée à 2h
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont d'une part le stress de la prehension de l'animal qui sera réduit par une socialisation des animaux, et d'autre part, la, douleurs liées à la chirurgie qui seront réduites grâce à l’utilisation d’un analgésique (buprénorphine). De plus il s’agit d’une procédure sans réveil et tous les animaux du projet seront mis à mort à la fin de l’expérience.
Devenir
Comme il s'agit d'un entraînement à la microchirurgie vasculaire, les animaux n'ont pas vocation à être maintenus en vie -après mise à mort, ils pourront être utilisés pour des formations à la dissection
Remplacement
Pas de remplacement possible pour s’entrainer à poser des cathéters vasculaires, nécessires pour la mesure de paramètres cardiovasculaires lors de projets ultérieurs
Réduction
L'utilisation de souris surnuméraires sera privilégiée pour les premiers apprentissages lorsque cela sera possible. Le nombre d’animaux sera réduit au minimum, sur la base de 1 souris par jour pendant 30 jours jusqu’à validation des gestes par l’encadrant du doctorant porteur de projet (pose d’un cathéter artère carotide et un cathéter veine fémoral). Dés que la procédure sera un succès, les paramètres vitaux seront mesurés sous anesthésie pendant 1 h, soit 30 souris maximum. En cas de difficulté, le nombre d'animaux pourra etre étendu à 60 animaux maximum
Raffinement
Les animaux seront hébergés en portoir dans des cages ventilées et filtrées, à 5 souris par cage dans des cages de 500cm². Ces cages seront enrichies (tunnel en polycarbonate, buchette de peuplier…) – période d’acclimataion minimale de 1 semaine. Pendant toute la durée de la chirugie et jusqu’à la mise à mort de l’animal, la profondeur de l’anesthésie sera régulièrement contrôlée par l’absence de reflexe de retrait de la patte aux pincements interdigitaux et absence du réflexe cornéen ; un antalgique sera administré 1 h avant le début de la chirurgie ; la température corporelle sera contrôlée via une sonde rectale et maintenue à 37°C par plaque chauffante asservie ; la cornée sera protégée par un gel ophtalmique ; la longueur et la qualité des cathéters sont adaptées à chaque vaisseau pour ne pas perforer au niveau des bifurcations) ; la durée d’utilisation des animaux sera limitée à 2h sous anesthésie (chirurgie + contrôle des paramètres vitaux à des valeurs physiologiques).
Choix des espèces
C’est ce modèle de souris qui sera utilisé pour les études cérebrovasculaires et cardiovasculaires prévues dans les projets ultérieurs. Souris adultes acclimatées à leur nouvel environnement (1 semaine après leur arrivée à l’établissement utilisateur)
Évaluation de l’efficacité thérapeutique de la Leriglitazone dans un modèle murin de leucodystrophie métachromatique
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Génétiquement modifiées pour développer une leucodystrophie métachromatique, elles reçoivent la molécule Leriglitazone dans leur nourriture pendant deux à six mois et donnent jusqu'à six prélèvements de sang sous anesthésie. Le projet évalue si ce traitement freine la démyélinisation d'une maladie neurodégénérative mortelle, les bénéfices pour les patients restant au conditionnel. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro n'existe et que la souris est la seule espèce chez qui un modèle de cette maladie a été créé.
Objectifs
Nous avons pour objectif d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle molécule, la Leriglitazone, dans le traitement des patients symptomatiques souffrant de leucodystrophie métachromatique (MLD), maladie neurodégénérative héréditaire conduisant à une perte de myéline (isolation de la gaine nerveuse). L’efficacité de la thérapie sera conduite In vivo dans un modèle de souris préclinique de MLD déjà connu.
Bénéfices attendus
À l’heure actuelle il n’existe aucun traitement pour les patients atteints de leucodystrophie métachromatique (MLD) ayant des symptômes déjà bien installés (patients symptomatiques). Les patients MLD présentent des troubles sévères cognitifs et moteurs (perte de l’équilibre, trouble de la marche) qui sont un calvaire au quotidien et, dès l’apparition des premiers symptômes, l’état des patients se dégrade de façon fulgurante avec un décès certain dans les 2 ans au maximum. Le traitement à la Leriglitazone dont nous proposons d’évaluer l’efficacité, pourrait au niveau cellulaire diminuer la neuro-inflammations, diminuer les lésions cérébrales et prévenir la démyélinisation. Ces bénéfices pourraient s’accompagner au niveau clinique d’une amélioration des fonctions motrices et cognitives des patients et de ce fait soulager leur lourd quotidien et augmenter leur espérance de vie. Il est à savoir également que contrairement à d’autres traitements en cours d’études (comme la transplantation cellulaire), le traitement à la Leriglitazone est non invasif et facile d’administration car per os.
Procédures
Pour évaluer l’efficacité thérapeutique de l’administration orale de Leriglitazone sur le modèle murin de leucodystrophie métachromatique (MLD), le traitement à la Leriglitazone est administré en continu à partir de l’âge de 6mois (dans les croquettes ad libitum) pendant 2 mois ou 6 mois (2 temps d’analyse) avant l’euthanasie des animaux. Pour suivre en longitudinal les effets du traitement à la Leriglitazone, des prises de sang mensuelles sont effectuées. Le nombre de prise de sang est de 2 à 6 selon le temps d’analyse et groupe étudié (à 6 et 7 mois ; ou à 6,7,8,9,10 et 11 mois). Ces prises de sang sont réalisées sous anesthésie et ne durent que 2 minutes au maximum par animal. Durant toute la durée de l’anesthésie, la souris est placée sur un tapis chauffant afin d’éviter un éventuel début d’hypothermie, dont le risque reste faible aux vues de la durée de l’anesthésie qui est de 2 minutes au maximum.
Impact sur les animaux
Le principal effet indésirable concerne le stress que pourrait engendrer les prises de sang mensuelles sur l’animal. Le traitement à la Leriglitazone devrait améliorer quant à lui le phénotype des souris.
Devenir
En fin de procédure tous les animaux seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologiques et biochimiques) sont nécessaires post-mortem.
Remplacement
À l’heure actuelle il n’existe pas de modèle In vitro ou de système cellulaire pour étudier les symptômes et marqueurs moléculaires associés à la leucodystrophie métachromatique (MLD). Nous avons donc besoin de modèles animaux pour reproduire et étudier cette maladie et surtout évaluer l’effet thérapeutique de la Leriglitazone. Le modèle de choix pour étudier la MLD est la souris car seule espèce pour laquelle un modèle de MLD a été créé. La prise par voie orale nécessite aussi de tester la voie digestive comme voie d’administration, il faut donc un organisme pour tester ce type de traitement.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façons à obtenir des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un nombre de 12 souris par groupe a été choisi, ce qui va nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables et adéquats pour analyser nos résultats. Un nombre total de 144 souris (comprenant 2 répétitions des expériences par groupe) sera nécessaire pour ce projet. Nous avons décidé également de ne pas ajouter un groupe contrôle supplémentaire à notre étude car ces données ont déjà été publiées.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise en œuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress (anesthésie pour les prises de sang, manipulation en amont de la procédure pour une habituation au manipulateur, prise de poids mensuelle). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum et d'un enrichissement du milieu à l’aide de carré de coton, lanières de kraft et de maison de type celldom. En cours de procédure une attention particulière est donnée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne (points limites) et de soins adaptés.
Choix des espèces
Nous avons besoin d’un modèle animal pour reproduire et étudier la leucodystrophie métachromatique (MLD) et surtout évaluer l’effet thérapeutique de la Leriglitazone. Le modèle de choix pour étudier la MLD est la souris car seule espèce pour laquelle un modèle de MLD a été créé. Nous prévoyons de conduire notre étude sur un modèle murin déjà connu de MLD qui est génétiquement modifié, dont le phénotype est très proche de ce que l’on retrouve chez les patients. Notre projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité de l’administration de Leriglitazone sur notre modèle murin de MLD lorsque les symptômes sont installés, en vue d’une thérapie pour le traitement de patients MLD symptomatiques. Pour cela, les animaux entreront en procédure à 5mois et 2 semaines (pour une acclimatation et habituation au manipulateur) avant le début du traitement qui sera administré à partir 6 mois, âge auquel débutent des premiers symptômes chez la souris. La fin de la procédure aura lieu lorsque les souris auront 8 ou 12 mois afin de déterminer l’effet thérapeutique de la Leriglitazone sur le court et long terme.
Fonction cardiaque (hémodynamique et rythme)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Rats : 1000
Cochons d'Inde : 1000
Lapins : 180
Chiens : 300
Cochons : 200
3 180 animaux non-humains, souris, rats, cobayes, lapins, chiens et cochons, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou menées sous anesthésie sans réveil. On leur pose des cathéters et des électrodes ou un implant de télémétrie, sous anesthésie, pour enregistrer l'effet de nouvelles molécules sur le cœur avant leur passage chez l'humain. Le porteur indique que 1 750 de ces animaux, soumis à des procédures modérées, peuvent être réutilisés après accord du vétérinaire, tandis que 1 430 sont tués sans réveil. Il conclut que les tests in vitro et in silico ne remplacent pas l'évaluation dans un organisme intact.
Objectifs
Dans le cadre des études précliniques, les nouvelles molécules en voie de développement doivent être étudiées pour leur efficacité par rapport aux cibles thérapeutiques visées. Quel que soit le contexte d’étude de ces nouvelles substances, une difficulté majeure liée aux études de pharmacologie préclinique est de disposer de modèles suffisamment sensibles et/ou prédictifs afin de garantir la pertinence des résultats expérimentaux par rapport à l’utilisation thérapeutique des futurs médicaments. Les études précliniques menées dans le cadre réglementaire de la Pharmacologie de Sécurité ont pour objectifs de déterminer les effets secondaires possibles de nouvelles molécules en développement, avant ou au moment de leur passage en phase clinique et en vue de l’obtention de leur autorisation de mise sur le marché. Les études précliniques doivent au minimum étudier les possibles effets indésirables des nouveaux médicaments sur les trois systèmes vitaux que sont le système nerveux central, le système cardiovasculaire et le système respiratoire. Au niveau du système cardiovasculaire notamment, il est capital de pouvoir dépister toute molécule pouvant présenter un risque arythmogène, détectable par l’allongement de l’intervalle QT. En effet, de nombreux médicaments, anciens ou nouveaux, ont dû être retirés du marché suite à un taux de mortalité inquiétant constaté après administration chez des patients ayant développé des arythmies cardiaques. Les tests décrits dans ce projet ciblent l'évaluation des effets cardiovasculaires de substances dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles sont mis en place et utilisés afin de tester l'efficacité de médicaments ou de s'assurer qu'ils n'induisent pas eux-mêmes des effets secondaires.
Bénéfices attendus
Les modèles mis en place ont pour objectif d’évaluer les effets pharmacologiques principaux de substances en développement par rapport aux cibles thérapeutiques visées ou de s’assurer que ces substances n’induisent pas d’effets secondaires ou inattendus avant leur passage chez l’homme. Ils entrent comme prérequis règlementaires pour obtenir les autorisations de commercialisation des nouveaux médicaments. Avant les tests sur l’animal, les produits sont généralement testés et présélectionnés avec attention dans des tests in vitro.
Procédures
Dans les modèles anesthésiés, les animaux sont anesthésiés jusqu'à la fin de la procédure (sans réveil). Des cathéters et/ou électrode (électrocardiogramme ou ECG) sont positionnés dans/autour d’artères/veines et/ou en sous cutané, pour la mesure de paramètre cardiovasculaire (pressions, fréquence cardiaque, débit sanguins/cardiaque, ECG). Pour les besoins de l'étude, des prélèvements de sang peuvent être réalisés (sous anesthésie) pendant le test et/ou en fin de test (juste avant l'euthanasie). La procédure sous anesthésie n'excède généralement pas 2 heures (rat, cobaye, lapin) ou 6 heures (chien, porc) et les animaux sont immédiatement euthanasiés (sans réveil préalable). Dans les modèles éveillés, les animaux sont dans une première phase équipés (sous anesthésie) d'un implant de télémétrie qui permet l'enregistrement en continu de paramètres cardiovasculaires (pressions, fréquence cardiaque, ECG) par cathétérisme des lits artériels d’intérêt (ou d’une cavité cardiaque) et positionnement d’électrodes pour l’ECG. Après réveil et une période de récupération (généralement une semaine au minimum chez les petits animaux et deux semaines au minimum chez les gros animaux), les paramètres sont enregistrés en continu avant (baseline d'au moins 1 heure) et après administration de la substance à évaluer (classiquement 24 heures par session). Les administrations par bolus rapide (par voie orale, intraveineuse, sous-cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire) ou par perfusion lente (intraveineuse) sont effectuées selon les bonnes pratiques vétérinaires.La durée de la procédure d’administration par bolus est de quelques secondes. Celle d’une administration par perfusion intraveineuse peut durer de quelques minutes à plusieurs heures en fonction des spécificités du candidat traitement. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours (le plus souvent) ou plusieurs semaines, en fonction des spécificités du candidat traitement. La fréquence des administrations (exemple : journalière, hebdomadaire) est variable et également adaptée à la spécificité de la substance testée. Pour les besoins de l'étude, des prélèvements de sang (classiquement 2 maximum par 24 heures, volume et fréquence adaptés à l'espèce) peuvent être réalisés (animal vigile ou anesthésié) pendant le test et/ou en fin de test, selon les bonnes pratiques vétérinaires. La durée de la procédure de prélèvement est de quelques secondes.
Impact sur les animaux
Des effets toxiques majeurs ne sont pas attendus. A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée à l’administration des substances. Dans les modèles éveillés, certaines périodes d'hébergement en cage individuelle (avec enrichissement) sont cependant nécessaires: 1) pendant la phase de récupération post-chirurgicale, afin d'éviter que les animaux ne retirent les agrafes/sutures de leurs congénères (généralement pour un période d'une semaine); 2) pendant les mesures (généralement un peu plus de 24h), car soit le système de télémétrie ne fonctionne qu'avec une fréquence d'émission des signaux (petits animaux, un hébergement groupé ne permet donc pas d'identifier la source d'émission d'un signal ; interférence entre les implants), soit les animaux ne reçoivent pas le même traitement ce qui nécessite l’isolement pour éviter les contaminations croisées et donc un biais dans l’interprétation des résultats de l’étude. Lors de la phase de récupération post-chirurgicale, une attention particulière est apportée (surveillance des cicatrices, état général, poids, température corporelle, appétit…).
Devenir
Pour les procédures modérées, les animaux peuvent être réutilisés après l’approbation du vétérinaire. Pour les procédures sans réveil, les animaux ne sont pas réutilisables.
Remplacement
En amont des tests in vivo, des tests in silico ou in vitro peuvent être envisagés (ou même requis d'un point de vue réglementaire). Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires (permettant ainsi un tri des substances à étudier, et donc réduisant de fait le nombre d'animaux utilisés), ils ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer les effets dans un environnement biologique et physiologique intact comme cela est possible chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement par rapport à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison). Dans les procédures mises en place chez l'animal anesthésié et dans la mesure du possible (dépend de la durée d'action de la substance testée), plusieurs doses d'une même substance peuvent être testées chez le même animal, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Dans les procédures mises en place chez l'animal éveillé et dans la mesure du possible (dépend de la durée d'action de la substance testée), plusieurs doses d'une même substance peuvent être testées chez le même animal à des jours différents, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Nos analyses statistiques (basées sur des analyses de variances et test de Dunnett) indiquent qu’un effectif de 4-8 animaux par groupe (nombre de groupes variables, 2 en standard) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Dans le but de réduire le nombre d’animaux (dans l’application de la règle des 3R), certains animaux issus des procédures chez l’animal éveillé (étude par télémétrie) sont également réutilisés aux strictes conditions qu’ils n’aient pas subis de procédures sévères et après accord du vétérinaire.
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur la fonction cardiaque de rongeurs (rats, souris), de lapins, de cobayes, de chiens ou de porcs est prédictif de leur efficacité et/ou inocuité en clinique. Principalement rongeurs, cobayes et lapins sevrés, âge variant entre 3 semaines et 6 mois, conformément aux données historiques. Chiens adultes et porcs sevrés, conformément aux données historiques.
Impact du jeûne intermittent sur les épilepsies de type absence chez la souris: modèle pharmacologique
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle pharmacologique d'épilepsie infantile, elles subissent une chirurgie de 45 minutes pour implanter des électrodes d'électroencéphalogramme, restent isolées en cage individuelle et donnent des prélèvements de sang. Le projet teste si le jeûne intermittent réduit les crises et permet de baisser les doses de médicaments antiépileptiques. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative aux animaux pour évaluer un modèle épileptique.
Objectifs
Historiquement, des changements de régime alimentaire ont été utilisés pour soigner les épilepsies. Notamment, un régime riche en protéine et gras, et faible en sucres, est un traitement de choix pour certains types d’épilepsies pharmacorésistantes. Cependant, ce régime est assez désagréable, surtout pour les enfants, et ses effets secondaires sont très lourds. En nous basant sur des résultats issus d’autres pathologies, nous avons avancé l’hypothèse qu’un régime basé sur le jeûne intermittent (intermittent fasting, IF) consistant à limiter la prise alimentaire à certaines heures de la journée, sans restriction calorique, pourrait avoir des effets bénéfiques sur les épilepsies infantiles: les épilepsies “absence”. Le but de ce projet sera d'évaluer si le régime IF est capable d’améliorer le poids des crises épileptiques (nombre, durée) ainsi que les déficits cognitifs et comportementaux associés. Nous utiliserons 1 modèle pharmacologique d’épilepsie infantile “absence” chez la souris. Ce modèle présente des crises dites "absence atypiques", retrouvées chez des pathologies infantiles graves telle que le syndrome de Dravet ou Lennox-Gastaut. Nous allons aussi examiner si le régime IF permet de baisser la dose efficace de médicaments anti-épileptiques communément utilisés en clinique, en réduisant leurs effets secondaires. En parallèle, nous essayerons de comprendre les régulations des réseaux neuronaux sous-tendant la pathologie, ainsi que les modifications qui accompagnent le régime IF.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à une réduction des crises d’épilepsie et une amélioration des comorbidités comportementales en agissant uniquement sur la fenêtre de la prise alimentaire, pas sur sa quantité ni sur sa composition. Il s’agit d’une approche facilement transposable dans le cadre clinique et qui pourrait aider les patients atteints d’épilepsie dans leur quotidien. De plus, l’administration de médicaments durant le régime IF pourrait permettre de baisser la dose efficace de ces composés, en limitant ainsi leurs effets secondaires.
Procédures
Tous les animaux subiront une intervention chirurgicale, pour la pose d'un implant afin d'effectuer des enregistrements électroencéphalogramme (EEG), ainsi que deux prélèvements sanguins. L'acte chirurgical dure environ 45 minutes. Le prélèvement sanguin dure 10 secondes max entre la contention et l'acte de prélèvement. Les animaux implantés avec des connecteurs pour enregistrement EEG courent le risque de se les arracher mutuellement. Ils sont donc isolés en cage individuelles pour la durée du protocole et seront surveillé deux fois par jour. Ils auront un enrichissement spécifique (sizzle, nid en carton, coton), ils seront en contact visuel et olfactif avec les congénères et seront manipulés régulièrement.
Impact sur les animaux
Le régime du jêune intermittent ou intermittent fasting (IF) a été prouvé comme étant bénéfique pour la santé chez l'homme et l'animal. A noter que le modèle d'épilepsie que nous utilisons n'induit pas de crises convulsives (motrices) mais de perturbations cérébrales qui induisent un arrêt de l'activité locomotrice pour quelques secondes, plusieurs fois par heure. Les crises ne sont donc pas douloureuses ni fatigantes. La procédure prévoit des prélèvements sanguins ainsi qu'une chirurgie: ces actes pourraient induire une nuisance ou des effets indésirables sur les animaux (perte de poids, détachement de l'implant , dégradation de l'apparence physique ou troubles du comportement). C'est pour cela que la procédure est classée modérée. Cependant nous mettrons en place une grille de scores dès l'apparition de signes cliniques. D'autre part, selon notre expérience le type de chirurgie prévue est très bien supporté par les animaux.
Devenir
A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus.
Remplacement
Il n'existe d'alternative autre que les animaux pour évaluer avec précision et pertinence un modèle épileptique dans notre projet de recherche.
Réduction
Nous utiliserons un même animal pour l'exploitation de plusieurs tissus, ce qui nous permettra de réduire le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de l'étude. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé selon Dell et al. (Samplesize determination, Ilar Journal, 2002, 43 :207) et le logiciel G*power, sur la base de publications précédentes et de notre expérience de manière à allier réduction du nombre d'animaux et validité statistique des expériences (niveau de significativité: p=0.05).
Raffinement
Des dispositions seront prises pour le raffinement des conditions d'élevage et d'expérimentation. Le maintien d'enrichissement de la naissance à l'expérimentation sera effectif dans toutes les cages. Un enrichissement supplémentaire de type paille de carton, igloo, ou maison en carton sera mis en place en cas d'isolement des souris pour les besoins des expériences. Le bien-être animal sera au centre de notre projet. Un suivi régulier sera appliqué dès le débuts de nos expérimentations. Les chirurgies seront effectuées en suivant les règles d'anesthésie et analgésie. Une grille de score sera mise en place dès l'apparition de signes cliniques afin d'intervenir si besoin.
Choix des espèces
L'espèce souris (Mus musculus) est un modèle très étudié dans tout projet de recherche. Les souris fournissent des excellents modèles d'épilepsie de type "absence", au cœur de notre projet. Les autres espèces utilisables ne sont pas envisageables à ce stade de l'étude en vue des contraintes éthiques et/ou d'hébergement requises par ces espèces. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes sur un point de vue médical. Les animaux seront utilisés à 6 semaines d'âge, âge à laquelle les premiers symptômes épileptiques sont visibles sur le modèle d'épilepsie utilisé.
Développement d’un vecteur AAV de thérapie génique plus efficace dans le cadre du traitement de l’hémophilie B.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
612 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie, génétiquement modifiée pour être hémophile, saigne spontanément, et toutes reçoivent une injection de vecteur viral puis jusqu'à douze prélèvements de sang par sectionnement du bout de la queue. Le projet cherche à mettre au point des vecteurs AAV plus efficaces contre l'hémophilie B et d'autres maladies du foie. Le porteur affirme qu'après un tri sur cultures de cellules il faut mesurer l'efficacité sur un "organisme entier" capable de réagir au traitement.
Objectifs
L’hémophilie B est une maladie génétique due à un déficit du facteur de coagulation IX (FIX). L’incidence est de 1 à 2 cas pour 25 000 naissances. Elle est causée par des mutations du gène F9, qui se trouve sur le chromosome X. La fabrication de la protéine appelée facteur IX de la coagulation va être endommagée. Chez une personne saine, cette protéine est produite dans le foie et va être relachée dans la circulation sanguine. Elle joue un rôle essentiel dans le système de la coagulation: elle permet de former des caillots sanguins en réponse à une blessure. Quand le gène F9 est muté, la quantité de facteur de coagulation IX est réduite dans la circulation sanguine, ce qui empêche la coagulation normale du sang et provoque des épisodes de saignements excessifs. Actuellement, le traitement principal est un traitement de substitution qui consiste à administrer par voie intraveineuse des concentrés de FIX purifiés ou du FIX recombinant. Cependant ces traitements ont plusieurs inconvénients tels que les infusions répétées par intraveineuse. Le but de ce projet est de développer des outils plus performants lors de traitement par thérapie génique AAV de maladies hépatiques, telles que l'hémophilie B. Pour cela, on veut développer des capsides AAV (« boite de transport du médicament ») et des promoteurs (permet l’expression du médicament dans un tissus particulier) spécifiques du foie ce qui nous permettra d'augmenter la stabilité du gène médicament au cours du temps et ainsi éviter les problèmes de réaction immunitaire. Pour se faire, nous avons réalisé des modifications de capsides AAV, pour augmenter la spécificité du vecteur pour les cellules du foie. Parallèlement, nous allons tester différents promoteurs pour définir ceux qui permettent une efficacité supérieure à notre contrôle. Grâce à cela, nous réaliserons des combinaisons pour essayer de rendre synergiques les effets. Le but final étant de trouver un candidat thérapeutique qui permet une expression à long terme de notre gène médicament dans un contexte de maladie hépatique, comme l'Hémophilie B, mais adaptable à d'autres maladies hépatiques.
Bénéfices attendus
Le bénéfice de ce projet et de développer de nouveaux outils de traitement des maladies hépatiques. Ces outils permettront au traitement d’être plus efficace, plus stable, moins et moins couteux. Ces outils développés seront directement applicables pour améliorer le traitement de l’hémophilie, déjà existant.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule injection de vecteurs AAV en début de protocole, puis à différents prélèvements de sang hebdomadaires (J1, J7, J14, J21, J28) ou mensuels (M1 à M12).
Impact sur les animaux
Nuisances souris WT : 1 injection IV (J0), 5 prélèvements sanguins hebdomadaires (J1, J7, J14, J21, J28) pendant 1 mois, clip tail. Nuisances souris KO : Souris au phénotype dommageable (saignement), 1 injection IV (J0), 5 prélèvements sanguins (J1, J7, J14, J21, J28) pendant 1 mois pour l'étude à court terme ou 12 prélèvements sanguins (de M1 à M12) pour l'étude à long terme, clip tail. Pour les deux phénotypes : Stress au moment de l'injection ou des prélèvements.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de récupérer le foie pour les analyses.
Remplacement
Afin de limiter au maximum l'utilisation du modèle animal, nous avons réalisé un premier tri parmi notre liste de candidats (vecteurs viraux AAV) grâce à l'utilisation de culture cellulaire de foie humain. Néanmoins, nous devons approfondir ces résultats en mesurant l’efficacité de ces traitements sur un organisme entier, pouvant réagir contre ce traitement (par exemple, à cause de la réponse immunitaire) et également mesurer son efficacité de traitement sur une maladie hépatique.
Réduction
Afin de d'utiliser le moins d'animaux possible, nous avons calculé le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir des résultats suffisamment fiable (6 souris par groupe soit 612 souris). Le nombre de souris déterminé ici est le nombre maximal de souris utilisé, si la première étape n'aboutit pas à des résultats concluant, nous ne passerons pas aux étapes suivantes. De même, si le nombre de candidats efficace est inférieur à ce dont nous avons prévu, moins de souris seront utilisées. De plus, nous allons prioriser l'utilisation d'animaux sains (486 souris) lors de la sélection de nos meilleurs candidats, cela permettra d'obtenir des animaux plus rapidement (il est plus facile d'accoupler des animaux sains que malades et le nombre de petits par portée est plus important) et permettra aussi de limiter la génération de souris malade.
Raffinement
Les souris seront maintenues en élevage en nombre réduit par cage afin de limiter les bagarres entre souris, pouvant entrainer des blessures et saignement (4 souris par cages). Les souris seront observées régulièrement : les souris dominantes seront isolées, les souris blessées seront soignées (plaies désinfectées et cautérisées) pour éviter les hémorragies. Si une hémorragie ne peut pas être stoppée, la souris sera euthanasiée afin d'éviter des souffrances inutiles. Le nombre d'accouplement mit en place sera réduit au strict nécessaire afin de ne pas générer de souris inutilisée.
Choix des espèces
Les souris hémophiles présentent une activité de coagulation réduite conduisant à des hémorragies spontanées dans les tissus du coussinet plantaire et des hémorragies sous-cutanées. Ce modèle de souris hémophile est très proche de la maladie humaine. Les souris malades sont viables, fertiles et de taille normale. Nous utiliserons des souris mâles adultes, car c'est une maladie qui touche uniquement les males (souris ou humains). Les souris adultes seront injectées entre 6 et 8 semaines de vie, ce qui correspond à un âge adulte pour la souris, et nous permettra de comparer avec l’âge des adultes que nous souhaitons traiter.
Détermination de la dose maximum tolérée de composés pharmacologiques, candidats-médicaments, chez la souris.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
2 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des candidats-médicaments de 1 à 35 jours consécutifs, jusqu'à deux fois par jour, pour déterminer la dose maximale tolérée avant les études d'efficacité. Le porteur décrit des effets possibles comme des troubles gastro-intestinaux, des douleurs aiguës et une perte de poids, qui servent justement à repérer le seuil de tolérance. Il conclut à l'absence de modèle alternatif assez intégré et qualifie le recours au modèle animal d'"incontournable".
Objectifs
Le progrès de ces dernières années, dans le domaine de compréhension des pathologies humaines, a ouvert la voie sur d’autres stratégies thérapeutiques, qui peut avoir un impact important dans l’amélioration de prise en charge des patients. Avant de tester l'efficacité des candidats médicaments dans les modèles animaux de pathologies humaines (exemple : maladies inflammatoires, maladie neurodégénératives, infections virale) nous souhaitons déterminer la dose maximum tolérée par la souris. Notre objectif est de déterminer la dose maximum toléré par la souris, sans aucun effet secondaire, pour l’animal, pour que par la suite, les études d’efficacité, puissent se faire de manière optimum.
Bénéfices attendus
Le bénéfice porte sur la santé humaine (la mise au point des traitements plus efficace). Et le déroulement suit le même « schéma » qu’une étude clinique chez l’homme. C’est-à-dire une phase 1 pour déterminer la dose maximum toléré par les individus avant de commencer une étude d’efficacité (phase 2).
Procédures
Dans ce projet les animaux seront soumis aux interventions suivantes : administration du candidat médicament (dure quelques secondes). L'administration intraveinuese se fera sous anesthésie (dure environ 30 à 40 min). Le composé pharmacologique testé pourra être administré de 1 à 35 jours consécutifs et de 1 à 2 fois par jour selon le protocole et l’objectif de l’étude.
Impact sur les animaux
Les nuisances pour les souris, sont principalement le stress causé lors de la préhension et les administrations répétées des composés pharmacologiques. Les candidats médicaments sont administrés aux animaux selon différentes voies d’administration. Les injections répétées par voie intrapéritonéale, sous-cutanée ou intraveineuse peuvent entrainer une inflammation et induration au niveau de site d’injection. De même, nous ne pouvons exclure un risque de fausse route lors de l’administration des composés par voie orale. D’autre part, bien que tous les candidats médicaments auront été sélectionnées pour leur innocuité lors des analyses in-vitro, des effets indésirables peuvent survenir tel que des troubles gastro-intestinaux, des douleurs aigues, une perte de poids… qui sauront être mise en évidence lors de ces études de tolérances.
Devenir
Tous les souris de ce projet seront mis à mort afin de collecter le sang et les organes qui seront utilisés pour les analyses ultérieurs.
Remplacement
Du fait de l’absence de modèles alternatifs suffisamment intégré et complexe pour permettre d’évaluer la biodisponibilité d’une molécule, qui met en jeu les mécanismes d’absorption, de distribution, de dégradation, de transport et d’élimination des composés susceptibles d’affecter l’activité des molécules, l’emploi de modèle animal est incontournable.
Réduction
Seuls les molécules présentant le meilleur rapport efficacité/innocuité in vitro seront étudiées chez la souris. De plus avant de démarrer le protocole avec les souris, nous faisons une série de vérification pour être sûr que le produit administré présente le profil pour être administré à l'animal. Si le produit ne répond pas à ces attentes il ne sera pas étudié. Nous faisons une étude avec 5 souris par groupe ce qui est suffisant pour évaluer la dose maximale tolérée par la souris pour les futures études d'efficacité des candidats médicaments. En effet nos études antérieures ont montré que 5 souris par groupe est suffisant pour mettre en évidence des troubles liés aux candidats-médicaments et ainsi nous permettre d’identifier la dose maximum tolérée chez la souris.
Raffinement
Durant l'étude, nous portons une attention particulière au bien-être de l'animal. Ils sont hébergés en groupe dans des cages enrichies de coton. Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de l’état générale des animaux.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale de choix pour étudier la tolérance de composé pharmaceutique d'autant plus que des études d'efficacité vont être poursuivis sur des souris. En effet, efficacité de plusieurs médicaments aujourd'hui sur le marché ont été évalués grâce à ces modèles chez la souris. Les souris auront 5 semaines minimum. Les animaux doivent être adulte, afin d'avoir un système immunitaire, et métabolique fonctionnel.
Evaluation du potentiel anti-thrombotique d’anticorps antiplaquettaire dans le cas de formation de thrombi occlusifs
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
336 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie puis tuées avant tout réveil. Chacune subit une chirurgie au cou, l'induction d'un caillot dans l'artère carotide par électrolyse de la paroi du vaisseau, puis 40 minutes d'imagerie de fluorescence. Le porteur teste si un anticorps ciblant les plaquettes empêche la formation d'un thrombus occlusif, dans la perspective d'un futur essai clinique. Il affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas la complexité du processus et que les plaquettes, cellules sans noyau, ne peuvent être cultivées.
Objectifs
Lors d'un saignement les plaquettes s'accumulent au niveau de la lésion formant un clou hémostatique qui stoppe l’hémorragie. Un processus similaire peut survenir dans un vaisseau malade et mener à la formation d'un thrombus entrainant l’occlusion du vaisseau, responsable de maladies graves comme l’accident vasculaire cérébral (AVC) ou l’infarctus du myocarde, qui représentent la première cause de mortalité dans le monde. Un nouvel agent ciblant les plaquettes a déjà montré une efficacité chez l’homme dans le cadre d’un essai clinique. Nous avons récemment observé que cet agent entraine une désagrégation d’un thrombus plaquettaire non occlusif. Ce projet vise à déterminer si cet agent est également capable de prévenir la formation d’un thrombus occlusif dans l’artère carotide chez la souris. Cette étude pourrait suggérer qu'un tel agent soit particulièrement efficace pour traiter la thrombose artérielle occlusive et ainsi justifier l’utilisation de cet agent pour un futur essai clinique chez l’homme et pour de nouvelles indications thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet portent sur deux aspects différents : •Premièrement l'agent ciblant les plaquettes a déjà montré une efficacité anti-thrombotique lors d’un essai clinique en prévention d’AVC (Accident Vasculaire Cérébral). Nous souhaitons poursuivre l’étude de l’effet de cet agent dans le cas cette fois ci de thrombus occlusif plus sévère pour proposer de nouvelles indications. •Dans un deuxième temps si les résultats sont encourageant, une étude clinique pourra être envisagée sur des patients souffrant d’un thrombus occlusif.
Procédures
L’ensemble de la procédure expérimentale est réalisée sous anesthésie générale plus anestésie locale de la peau au moment de l’incision et elle est sans réveil. Tous les animaux subiront : • Une anesthésie générale ainsi qu’une anesthésie locale de la peau. • Une injection d’un mélange d’un anticorps anti-fibrine couplé à un fluorochrome d'un marqueur fluorecent des plaquettes • Tonte de la face ventrale du cou et nettoyage de la peau • Induction du thrombus par electrolyse à la paroi externe du vaisseau • Imagerie par macroscopie de fluorescence pendant 40 min
Impact sur les animaux
Lors de l’expérimentation nous pouvons nous attendre à une baisse de la fréquence cardiaque, respiratoire ainsi qu’une baisse de température dû à l’anesthésie de l’animal. Ces paramètres seront surveillés, la concentration d’anesthésique sera ajustée si nécessaire et l’animal sera réchauffé tout au long de la procédure. La procédure expérimentale comprenant une chirurgie au niveau du cou de la souris sera réalisée sous anesthésie générale et anesthésie locale au moment de l’incision de la peau. A l’issu de l’expérience, les animaux anesthésiés seront mis à mort.
Devenir
Le projet porte sur l’étude de l'effet d'un anti-thrombotique dans le cas d'un thrombus occlusif au niveau de l'artère carotide, en conséquence les animaux ne peuvent pas être garder en vie à l'issu de l'expérimentation.
Remplacement
Le but de ce projet est d’évaluer l’effet d’inhibiteurs dans un processus complexe et intégré qu’est la désagrégation plaquettaire. Les modèles in vitro n’étant pas assez sophistiqués pour reproduire toute la complexité de ce processus, un modèle in vivo sera utilisé. De plus, les plaquettes sont des cellules anucléées qui ne peuvent être cultivées, empêchant tout modèle reposant sur la culture cellulaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude sera réduit au minimum. Les groupes expérimentaux seront comparés en utilisant des tests statistiques pertinents permettant d’évaluer le potentiel anti-thrombotique d’anticorps antiplaquettaire dans le cas de formation de thrombi occlusifs.
Raffinement
Les conditions d’hébergement des animaux sont optimisées par l’enrichissement des cages. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. Les conditions de travail pour l’utilisation de modèles animaux ont été raffinées afin de limiter leur angoisse, stress et douleur lors des manipulations. Lors des procédures, les animaux sont anesthésiés, maintenus à une température de 38°C par l’utilisation d’une plaque chauffante (tout au long de la procédure) et un antalgique sera administré au niveau de la zone de chirurgie. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel qualifié.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont largement répendus et maitrisés. Les techniques de mutagenèse ont permis de générer des souris sur un même fond génétique : •Exprimant la Glicoprotéine VI humaine permettant de tester des anticorps humain chez la souris. •N’exprimant pas la protéine Glicoprotéine VI permettant d’évaluer l’importance de la glicoprotéine dans la formation de thrombus occlusif. Ces lignées sont parfaitement adaptées à cette étude et constituent des outils originaux et uniques. L’expression de la Gliprotéine VI humaine n’induit pas d’effet indésirable notable chez les souris. Ces souris seront utilisées en comparaison de souris contrôles sauvages. Les animaux seront utilisés au stade adulte entre 8 et 24 semaines. Cet âge correspond à la période permettant l’utilisation de souris pubères et ne présentant pas encore syndrome de vieillissement. Nous réaliserons des groupes homogènes en âge.
Etude du rôle de la vitamine D dans la progression des tumeurs prostatiques.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
4 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections de tamoxifène pour inactiver un gène, des gavages répétés de vitamine D, et une partie est castrée, avec amputation d'une phalange pour l'identification. Le projet étudie le rôle de la vitamine D dans la progression des tumeurs de la prostate et la résistance à la chimiothérapie, les retombées pour les patients restant au conditionnel. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la formation des lésions précancéreuses et conclut que l'expérimentation in vivo est "nécessaire".
Objectifs
Le cancer de la prostate (CaP) est le cancer viscéral masculin le plus fréquent. Les traitements actuellement utilisé en clinique inhibent les voies de signalisation et/ou la production d'androgènes et sont couplés à la chimiothérapie (i.e. docetaxel). Ces traitements induisent des resistances, ne sont pas efficaces contre les formes agressives et sont à l’origine de nombreux effets indésirables. Une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires impliqués dans la la progression des tumeurs et dans la resistance aux traitements est donc requise afin de développer des approches thérapeutiques plus efficaces. La forme active de la vitamine D ((calcitriol, VitD) est une hormone qui joue un rôle clé dans la régulation de l’homéostasie calcique, et dont les effets sont relayés par son récepteur VDR. La vitD possède des activités anticancéreuses, et des données cliniques indiquent que des patients avec des tumeurs prostatiques et déficients en vitamine D ont une espérance de vie inférieure à ceux ayant des niveaux de vitamine D suffisants. De plus, nos récents résultats indiquent que la vitamine D permet de lever les résistances au Docetaxel, la chimiothérapie classiquement utilisé en clinique. Ces résultats indiquent que les voies de signalisation de la vitamine D jouent un rôle clé dans l'évolution de la pathologie et la résistance aux traitements, mais les mécanismes restent mal connus. En tirant profit du modèle murin récapitulant la pathologie humaine, les objectifs de ce projet sont: de générer et caractériser des souris ayant une inactivation de VDR dans les cellules épithéliales prostatiques et de déterminer l'effet de la vitamine D sur l'efficacité de chimiothérapies de type alcaloide.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de cartographier l’évolution des lésions précancéreuses et l’implication des voies de signalisation de la vitamine D dans cette évolution ainsi que de déterminer son rôle dans la résistance aux traitements actuels.
Procédures
Chaque animal utilisé dans cette étude sera soumis à 5 injections intrapéritonéales du tamoxifène (15 sec par administration) réalisées au courant d’une semaine, une fois que cet animal aura atteint l’âge adulte (8 à 12 semaines après naissance) afin d'inactiver le gène. Certains animaux seront gavés (15 administrations, 15 sec par administration) et d'autres recevront une administration intra-péritonéale supplémentaire (15 sec par administration) . Parmis ces lots, certaines souris seront castrées (5-10 min par souris) ou subiront la même anesthésie et incision, mais sans enlever les organes (5-10 min par souris) . Les souris qui seront utilisées pour les analyses de cytométries en flux seront traitées avec un marqueur permettant de déterminer la prolifération des cellules (2 injections intrapéritonéales , 15 sec par administration). Une prise de sang juste avant la mise à mort sera réalisée (15 sec par souris).
Impact sur les animaux
Les injections par voie intra-péritonéale pour inactiver les gènes ou administrer du docetaxel, et les administrations par gavage seront réalisées par des personnes agrémentées et aguerries et n'induiront aucune nuissance. L'orchidectomie est une opération rapide qui est bien maitrisée au laboratoire. Après l'inactivation des gènes, l'évolution des lésions prostatiques sera monitorées mais d'après nos expériences, aucun inconfort majeur n'a été observé.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à différents points de cinétique afin de récupérer la prostate et différents organes en vue de la caractérisation.
Remplacement
Aucun modèle cellulaire ne récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.
Réduction
Pour les analyses moléculaires et de populations cellulaires, plusieurs paramètres seront évalués, notamment les niveaux d’expression des protéines ou des ARN. Pour les études histologiques, les niveaux d’expression des protéines, en plus de leur localisation, seront déterminés par immunofluorescence. Étant donnée l’hétérogénéité phénotypique et la variabilité interindividuelle attendue le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. Afin d’obtenir des résultats significatifs avec une bonne puissance, nous aurons besoin de 20 animaux par groupe. Le nombre d’animaux sera de 4960 souris maximum.
Raffinement
L'expertise du laboratoire dans l'étude de l'évolution des lésions précancéreuses prostatiques permettra la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées (i.e. points critiques étroitement surveillés). Pour l'identification, le nombre d’amputations sera limité à une seule phalange par patte et ne compromettra pas la préhension fine del’animal. Durant la durée de l'étude, les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement. Après injection par voie intra-péritonéale en alternée, une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d’injection pour éliminer tout risque d’infection (rougeur ou présence de pus au site d’injection). Si les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestes (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), l’animal sera retiré de l'étude et mis à mort. En pré-opératoire, une analgésie en injection intrapéritonéale est faite avant l’anesthésie des souris. En post-opératoire, une analgésie est réalisée. Nous surveillerons les animaux par inspection et palpation abdominale, en cas de rougeur ou de voussure, une infection pourra être supposée et une surveillance rapprochée sera effectuée. Lors des gavages succesifs avec la vitamine D, de la nourriture en gel sera proposée pour éviter une diminution de l'alimentation suite à l'irritation de l'oeosophage.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme animal modèle car l’expression des protéines jouant un rôle dans les développements du cancer de la prostate est similaire à celle de l’humain. De plus, l’évolution des lésions précancéreuses dans notre modèle murin récapitule de manière fidèle le développement du cancer de la prostate chez l’homme. Le système immunitaire murin est bien décrit dans la littérature et est proche de celui de l’humain, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. Enfin, les activités de la vitamine D chez la souris sont similaires à celles chez l'homme. L’ensemble de ces facteurs nous permettra d’étudier l’évolution des lésions de cancer de la prostate (CaP) afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les souris auront un fond génétique enrichi C57BL/6. Les souris mâles seront utilisées de 8 semaines à 17 mois après la naissance, la prostate n'étant mature qu'après puberté. Les injections de tamoxifène se feront sur des jeunes adultes à partir de 8 semaines après naissance.
Rôle de la chimiokine CCL5 dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique chez la souris: implications physiopathologiques
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 288 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 72 opérées puis tuées sans réveil. Rendues obèses et diabétiques par un régime gras de trois mois, elles reçoivent une canule implantée dans le cerveau et une mini-pompe sous-cutanée pendant trois mois, puis subissent 96 prélèvements de sang chacune au fil de tests de tolérance au glucose, à l'insuline et au pyruvate. Le porteur étudie le rôle d'une molécule pro-inflammatoire, la CCL5, dans la dérégulation de la glycémie par l'hypothalamus, en vue de cibles médicamenteuses renvoyées au conditionnel. Sur le remplacement, il affirme que seul un modèle in vivo chez "l'animal entier" permet de comprendre ce phénomène et conclut à l'utilisation de la souris.
Objectifs
L’obésité associé au diabète de type 2 (DT2) représente un problème majeur de santé publique dans la mesure où 11% de la population mondiale est obèse et 300 millions de personnes sont affectés par un DT2 selon l’« International Diabetes Federation ». 80% des personnes développant un DT2 sont obèses soulignant ainsi un lien étroit entre les 2 pathologies et, de fait, l’insulino-résistance est une caractéristique commune de l’obésité et du DT2. Ce lien étroit entre l’obésité et le DT2 nous incite à identifier les mécanismes fondamentaux couplant le contrôle de la balance énergétique et la régulation de la glycémie. De récentes études scientifiques suggèrent que l'inflammation favorise le développement de l'obésité et de l'hyperglycémie chronique caractérisant le diabète de type 2. Notre projet a pour objectif d'étudier les effets d'une substance pro-inflammatoire (CCL5) sur le développement de l'obésité et du DT2 au niveau d'une région bien précise du cerveau, l'hypothalamus qui contrôle le métabolisme énergétique et glucidique.
Bénéfices attendus
Si le contrôle de la glycémie par le cerveau reste un domaine de recherche encore peu exploré et mal compris, il ouvre de larges perspectives thérapeutiques. En effet, le système gluco-régulateur de l’hypothalamus pourrait intervenir à hauteur de 50% dans le maintien de l’homéostasie glucidique. Il semble donc probable que des dysfonctionnements de la régulation centrale de la glycémie participent au développement du diabète. L'identification de nouvelles molécules pouvant induire un dysfonctionnement du contrôle de la glycémie par le cerveau devrait permettre d’ouvrir de nouvelles voies pour le développement de médicaments anti-diabétiques et d’améliorer le traitement de cette pathologie.
Procédures
Cette étude sera réalisée sur des souris soumises à un régime standard et à un régime riche en lipide de 3 mois qui les rend obèses et diabétiques. Une puce électronique de traçabilité sera injectée dans l’espace sous-cutané interscapulaire après anesthésie. Les animaux seront hébergés à température (22°C) et humidité constantes et exposés à un cycle de 12h-12h lumière/obscurité. Les souris auront un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Dans le cas de la procédure 2, les animaux subiront la pause d'une canule en intracérébroventriculaire ainsi que d'une mini-pompe osmotique en sous-cutané (cette opération prend environ 30 mins) qui seront implantés pour une durée de 3 mois. Les souris seront ensuite laissées au repos pendant 2 semaines avant qu'elles soient soumises à la batterie de tests physiologiques. Chaque souris de chaque lot sera soumise successivement à l'ensemble des tests physiologiques afin de réduire le nombre d’animaux impliqués dans le projet. Au cours de chaque test, des prélévements da sang seront effectués à partir de la queue des animaux. Pour l'ensemble des tests (glycémie de base, test de tolérance au glucose, test de tolérance à l'insuline, test de tolérance au pyruvate et test de sécrétion d'insulie), chaque souris subira 96 prélèvements de sang. Chaque test comprendra 22 prélèvements (sauf pour le test de sécrétion d'insuline qui ne comprendra que 6 prélèvements) et la souris aura une période de récupération d'une semaine entre chaque test.
Impact sur les animaux
Le protocole de nutrition qui sera utilisé entraine un surpoids et une hyperglycémie chez la souris constituant un modèle d'obésité et de diabète de type 2 chez l'animal. Ce modèle est très largement utilisé dans la littérature scientifique. Le traitement par la chimiokine CCL5 ou par l'antagoniste du récepteur CCR5 n'entraine que très peu d'effets indésirables ou de nuisances chez la souris dans des études antérieures menées par d'autres équipe. Par conséquent, nous n'attendons pas de manifestations particulières chez les animaux qui seront utilisés dans ces études. De même, les injections ip de glucose, insuline, pyruvate sont utiliées en routine par de nombreuses équipes de recherche et par nous-même, et aucun effet indésirable n'est constaté pour ces substances aux doses administrées. Enfin, les actes chirurgicaux décrits dans cette DAP sont eux aussi réalisés en routine au sein de notre équipe et aucun effet indésirable sur le comportement et la santé de l'animal n'a été constaté sur la longueur du protocole expérimental.
Devenir
Les souris utilisées pour les tests physiologiques seront euthanasiées à l'issue du protocole expérimental. De même, les animaux prévus pour des prélévements d'organes seront euthanasiées.
Remplacement
Au cours de ce projet, les effets de la molécule pro-inflammatoire CCL5 seront tout d'abord évalués in vitro sur une lignée de cellules neuronales hypothalamiques, la lignée mHypoA-59, ce qui nous permettra d'excure certaines hypothèses de travail et ainsi réduire sigificativement le nombre d'animaux qui seront utilisés pour les tests physiologiques qui ne peuventêtre réalisés que chez l'animal entier.
Réduction
Compte tenu de la variabilité inter-individuelle des processus physiologiques étudiés, nous utiliserons des lots de 12 souris par condition de traitement. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement analysables. De plus, l'ensemble des 5 tests physiologique prévus pour évaluer l'homéostasie glucidique sera réalisé successivement sur une même souris afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Chaque nouveau test sera débuté lorsque les animaux auront bénéficié d’une période de rétablissement minimum d'une semaine qui permet aux animaux de reconstituer leur volume sanguin après les prélèvements effectués lors du test précedent et de stabiliser leur poids corporel. Pour les groupes dédiés au prélèvement des explants hypothalamiques ou cérébraux, les groupes de souris pourront être réduits à 10 animaux.
Raffinement
L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur (pose des puces de traçabilité, incision, actes chirurgicaux) sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale selon la méthode la plus adaptée) afin d’en minimiser l’impact au maximum. De plus, les animaux recevront en pré-opératoire et à 6-8 h puis 12-16 h post-opératoire un traitement analgésique pour prévenir la douleur. Le bien-être de l’animal sera évalué quotidiennement par la mesure des prises de nourriture et de boisson, et le suivi du poids de chaque animal. Au cours des expérimentations, une observation continue des animaux nous permettra d’arrêter le protocole en cas de souffrance.
Choix des espèces
Pour ce projet, des souris mâles âgées de 10 semaines en début d'expérimentation seront utilisées car c'est la physiologie adulte qui sera étudiée. Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre, de façon globale, le rôle de la chimiokine CCL5 dans la dérégulation de l’homéostasie glucidique au cours de l’obésité associée au diabète de type 2 et d’établir des comparaisons pertinentes avec les données obtenues chez l’homme. La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coûts d’entretien réduits, fortes performances reproductives. De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes.
Fibrose pulmonaire : Evaluation de l’efficacité de composés chimiques ou biologiques dans des modèles de fibrose pulmonaire
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
1 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une fibrose pulmonaire leur est induite par instillation de bléomycine dans la trachée ou par irradiation sous anesthésie, puis des composés à tester sont administrés par de multiples voies. Le porteur annonce une perte de poids de 15 à 20 % et des difficultés respiratoires, et prévoit une trachéotomie sous anesthésie profonde juste avant la mise à mort pour mesurer la mécanique pulmonaire. Il affirme que les données in vitro sont "souvent insuffisantes" pour prédire l'efficacité, ce qui justifierait le recours au rongeur.
Objectifs
L’objectif est de tester l’efficacité thérapeutique de composés chimiques ou biologiques dans un modèle de fibrose pulmonaire. La fibrose est la conséquence de l’activation chronique des fibroblastes et myofibroblastes qui se mettent à produire en permanence du tissu cicatriciel (dépôts de collagène, élastine, fibronectine). Dans les poumons, l’apparition de ce tissu cicatriciel s'accompagne ou est précédée d’une phase inflammatoire. La fibrose pulmonaire cause une perte d’élasticité du poumon et une insuffisance respiratoire chronique. Il n'existe pas de médicament éliminant la fibrose pulmonaire, les traitements disponibles ralentissent uniquement la progression de la maladie. La bléomycine (agent anti-cancéreux utilisé chez l’homme) est connue pour se concentrer dans les poumons, avec comme effet secondaire délétère le développement chez le patient d’une fibrose pulmonaire. Chez le rongeur, instillée par voie intratrachéale sous anesthésie générale ou par voie sous-cutanée via une mini-pompe la bléomycine induit une fibrose pulmonaire semblable à celle observée chez l’homme. Celle-ci atteint son maximum entre 3 et 4 semaines, puis se résout spontanément 6 à 8 semaines après exposition. La fibrose pulmonaire peut aussi être induite consécutivement à une radiothérapie anti-cancéreuse du poumon. C’est un effet secondaire sévère connu chez le patient car les rayons entraînent une destruction des tissus cancéreux mais aussi des tissus sains, avec une très forte inflammation et une cicatrisation anarchique. Le développement de la fibrose pulmonaire induit par la radiation est plus lent à se mettre en place, et dépend de la dose et de la fréquence des rayons. Ce projet reproduira chez le rongeur la pathologie pulmonaire fibrotique telle qu’elle est observée chez l’homme, et permettra l’évaluation de composés anti-fibrotiques. L’efficacité des composés testés sera déterminée par la mesure de marqueurs circulants et pulmonaires (TGFβ, dépôts de collagène, hydroxyproline…) ou encore par l’évaluation de l’évolution de la pathologie par imagerie. Les composés chimiques ou biologiques qui seront évalués dans ce projet auront au préalable été sélectionnés sur des critères de puissance et d’efficacité in vitro. En fonction de leurs propriétés pharmacocinétiques, ils pourront être testés en mode préventif ou thérapeutique par exemple par voie orale, intrapéritonéale ou sous-cutanée.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en curatif sur la fibrose pulmonaire. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette maladie pour laquelle les options sont pour le moment limitées.
Procédures
La fibrose pulmonaire sera induite sur des animaux sevrés de plus de 6 semaines soit par administration intra trachéale unique ou sous cutanée (à l’aide d’une minipompe osmotique pendant 28 jours) de Bléomycine soit par exposition à des radiations (unique). Ces deux procédures auront lieu sous anesthésie générale qui durera environ une heure. Afin d’évaluer de potentiels traitements, des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure, intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie, orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ), sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon), ou par minipompe osmotique posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). La phase in vivo pourra durer jusqu’à 35 jours pour la fibrose induite par la bléomycine et jusqu’à 15 semaines pour les radiations. Les volumes administrés respecteront les recommandations. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits administrés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera environ une heure. Des mesures de saturation en oxygène, sur animal anesthésié ou vigile, pourront être effectuées au cours des procédures. Les mesures vigiles impliquent que les animaux soient placés en hébergement individuel environ 1 heure. En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus, lavages broncho-alvéolaires. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, des mesures de paramètres mécaniques pulmonaires pourront être réalisées. Cette mesure impliquera la réalisation d’une trachéotomie. La mesure prendra environ 15 minutes avant l'euthanasie.
Impact sur les animaux
Dans ce modèle, nous attendons une perte de poids chez les animaux, de l’ordre de 15 à 20%, du fait de l’inflammation générée. Par ailleurs, nous attendons des signes de difficultés respiratoires.
Devenir
Après les deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, ainsi qu’à des lavages broncho-alvéolaires et des mesures de compliance pulmonaire, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt.
Remplacement
Toutes les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Elles auront aussi si possible été sélectionnées in vivo chez le rongeur sur leurs propriétés pharmacocinétiques (vérification de la compatibilité avec une efficacité dans la maladie visée). L’ensemble de ces données est souvent insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme.
Réduction
Chez la souris, dans le modèle Bléomycine, d’après la littérature et d’après les études déjà réalisées dans notre laboratoire et sur la base de tests de type ANOVA, un nombre minimum de 8 animaux adultes par groupe est nécessaire pour observer une réduction significative de 50% d’un seul paramètre d’intérêt (dosage hydroxyproline). Ce nombre pourra monter jusqu’à 12 pour une réduction significative sur plusieurs autres paramètres suite à un traitement préventif ou curatif (analyse histologique et dosage TGFb actif ou total). Par ailleurs, étant donné que certains animaux ne répondent pas à la procédure d’induction, 5 animaux supplémentaires par groupe seront systématiquement intégrés. La même stratégie sera appliquée lors de la mise en place du modèle induit par la radiation chez la souris.
Raffinement
Pour la mesure de saturation sur animal vigile, afin de limiter le stress lié à l’hébergement individuel durant la mesure, les animaux seront maintenus en contact visuel avec leurs congénères via une paroi transparente. Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : • A partir de 10% de perte de poids, les animaux seront pesés quotidiennement et une réhydratation sous-cutanée sera mise en place • Entre 10 et 15% du poids au J0 du protocole : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate, 0.5mL, une fois par jour. • Entre 15 et 25%% du poids au J0 du protocole : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate, 0.5mL, deux fois par jour. Un gel nutritif ou de l’eau gélifiée et de la nourriture seront placés au fond de la cage. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, les traitements seront interrompus. Les actes douloureux, tel que la thoracotomie, seront réalisés sous anesthésie profonde (Isoflurane, Kétamine/Xylazine) avec analgésie 30min avant la chirurgie (Buprénorphine). Les actes moins stressants (autres administrations et prélèvements) seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress (administrations IV, prélèvement d’urine) ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites est observé, l’animal est mis en observation. Si les signes persistent, une décision de suivi ou d’euthanasie devra être prise. Le fait de ne pas sacrifier l’animal qui a atteint le point limite doit être argumenté et justifié auprès de la structure chargée du bien-être animal. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction d’inflammation pulmonaire et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux.
Choix des espèces
LLa souris mâle C57BL/6J sera privilégiée pour le modèle de fibrose pulmonaire induit par la bléomycine car ce modèle est bien décrit et documenté dans la littérature avec cette souche et sexe en particulier. La souris femelle C57BL/6J sera utilisée pour le modèle de fibrose pulmonaire induit par la radiation, car ces modèles sont bien décrits dans la littérature sur ces souches et les femelles sont plus sensibles à la radiation que les mâles. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), étant donné que les modèles de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine et les radiations sont bien décrits dans la littérature sur des animaux sevrés de plus de 6 semaines.
Rôle du cholestérol dans l’activité du striatum dorsal lors de la recherche de drogue dans un modèle animal d’addiction
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
360 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après pose d'un cathéter dans la veine jugulaire et deux chirurgies cérébrales, ils s'auto-administrent cocaïne ou nicotine sur vingt-cinq sessions, isolés en cage individuelle, pour étudier le rôle du cholestérol cérébral dans la rechute. Le porteur décrit un état de dépendance avec poil hérissé, irritabilité et agressivité, et reconnaît que l'isolement prolongé est source de stress. Les rats sont ensuite tués pour des analyses du cerveau, et le porteur renvoie d'éventuelles thérapies à moyen terme.
Objectifs
Les mécanismes moléculaires impliqués dans la recherche de drogues chez des individus addicts restent mal connus ce qui limite le développement de thérapies efficaces. Quelques études antérieures ont suggéré que le métabolisme du cholestérol jouerait un rôle dans la recherche de drogue et dans la rechute. Ce projet a pour but d’étudier le rôle de ce métabolisme dans l’activité cérébrale déclenchée dans le striatum dorsal, une structure impliquée dans l’addiction, lors de la recherche de drogues. Dans ce projet, nous chercherons à démontrer un lien entre la manipulation du cholestérol dans le striatum dorsal et l’activité neuronale dans cette région lors de la recherche de drogue après une période d'abstinence.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont une meilleure compréhension des mécanismes sous-tendant le rôle du cholestérol cérébral dans la vulnérabilité à la rechute à l'addiction. Ces expériences pourraient conduire à moyen terme au développement de thérapies médicamenteuses pour réduire voire empêcher la rechute.
Procédures
Les rats des groupes cocaïne et nicotine seront soumis à une chirurgie d’implantation de cathéter dans la veine jugulaire sous anesthésie générale de 15 minutes pour pouvoir s’auto-administrer les drogues. Tous les rats seront placés dans les cages d’auto-administration pour suivre des sessions d’entrainement d’auto-administration (25 sessions, 1 session par jour ; durée d’une session : pour cocaïne=6h, nicotine=1h, sucre=4h). Tous les rats subiront un total de deux chirurgies cérébrales (1h30 par chirurgie) : - la première pour placer un senseur de l'activité des neurones avec (groupes cocaïne et nicotine) ou sans (groupe sucre) implantation d’un cathéter intraveineux - la seconde pour injecter une enzyme dégradant le cholestérol et pour implanter à demeure un système d’imagerie qui permettra de mesurer l’activité des neurones pour tous les animaux. Tous les rats auront deux sessions d'’adaptations et de test (30 min et 1h, respectivement) aux dispositifs permettant de mesurer simultanément l'activité de recherche de récompenses et l'activité des neurones du striatum dorsal.
Impact sur les animaux
- Cathéter et Fibre optique : gène, risque d'infection ou de démangeaisons - Auto-administration : La prise de drogue chronique (bien que volontaire) peut causer un stress modéré chez certains rats, ce qui est attendu car, comme chez l’Homme, un état « addict » chez le rat peut être associé à un état émotionnel négatif. Cet état peut se révéler par le poil hérissé, par une certaine irritabilité et agressivité envers l’expérimentateur. Dans la plupart des cas, cet état est transitoire et l’état du pelage et les niveaux d’agressivité reviennent à la normale après quelques semaines. - Isolement : Les animaux sont hébergés individuellement pendant toute la durée de l’auto-administration et jusqu’à la fin de la procédure ce qui peut causer un stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de procéder à des analyses moléculaires et histologiques sur le cerveau.
Remplacement
Ce type de recherche, visant à comprendre les bases d'un processus psychobiologique, peut-être uniquement mené sur un animal vivant. En effet, nous étudions les bases comportementales et neurobiologiques impliquées dans le phénomène de rechute. L’étude de ce processus nécessite d’enregistrer l’activité des neurones in vivo, chez l’animal lors du comportement, ce qui implique d’utiliser des modèles d’animaux vivants. Il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.
Réduction
Des études statistiques préalables ont permis de définir les effectifs nécessaires à la réalisation de ce projet de façon à mettre en évidence des différences significatives tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles, en ayant recours à des analyses statistiques. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe sera de 18. Deux animaux par lot sont ajoutés en anticipation de possibles pertes liées à la complexité du geste des procédures chirurgicales (la veine peut céder lors de l’insertion du cathéter), à l’expression des virus et/ou à un mauvais placement de la fibre optique. Ainsi 20 animaux par lot, seront nécessaires à notre étude. 18 lots seront nécessaires pour le projet, soit 360 animaux maximum.
Raffinement
Nous avons planifié ce projet en gardant à l'esprit la nécessité de réduire et de soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse des animaux. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal, et pendant la chirurgie le recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques, pendant laquelle l’animal sera placé sur un tapis chauffant pour assurer le maintien de sa température corporelle. Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick de papier ou pièce de bois à ronger ou tunnel) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Avant le début des sessions d’entrainement à l’auto-administration, les animaux auront une période d’habituation aux cages et seront placés dans les cages d’auto-administration pendant 2 jours, 1 heure par jour. Les animaux seront également habitués à être connectés par leur système de fibre optique avant le test de rechute et d’enregistrement. En cas d’atteinte de points limites, des actions correctives sont prises sans délai. Les manipulations sont réalisées par des expérimentateurs formés et compétents à l’expérimentation animale et à la chirurgie.
Choix des espèces
Le rat est, avec la souris, l’animal le plus utilisé pour l’étude de la motivation dans les modèles animaux, car ses réponses neuronales sont proches des réponses neuronales observées chez l'Homme. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est à dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus afin de modéliser au mieux la variabilité inter-individuelle humaine dans le développement d’une addiction. Pour notre étude, le rat est le modèle le plus approprié car il peut s’auto-administrer toutes les drogues, comme l’Homme. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet afin de limiter le risque de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rats en phase d’adolescence (juvéniles).