Rongeurs

1 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées d'antigènes ou d'ARNm et des prélèvements sanguins, avant d'être tuées pour prélever leurs organes lymphoïdes, afin de produire des anticorps monoclonaux destinés aux programmes d'une société. Le porteur indique que les injections répétées peuvent provoquer une détresse modérée, des réactions inflammatoires et, en intramusculaire, une nécrose musculaire ou une inflammation des nerfs. Il revendique une qualité "souvent supérieure" des anticorps dérivés d'animaux et affirme qu'aucune méthode alternative n'est possible pour les hybridomes murins.

Objectifs

Le projet a pour objectif d’immuniser des souris avec un antigène et/ou de l’ARNm afin d’obtenir des anticorps monoclonaux qui pourront potentiellement être sélectionnés au sein des programmes de la société. Ces anticorps pourront devenir des candidats médicaments pour de la thérapie humaine ou des outils pour développer les méthodes analytiques nécessaires à un projet scientifique.

Bénéfices attendus

Ces dernières années, les anticorps monoclonaux sont devenus de plus en plus importants dans de nombreux domaines et particulièrement dans celui de la thérapie humaine. Ces molécules émergent de plus en plus dans le domaine de l’immuno-oncologie afin de traiter les patients atteints de nombreux types de cancer différents. Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont la génération d’outils de développement de méthodes analytiques, nécessaires à un projet scientifique ainsi celle de potentiels candidats médicaments pour de la thérapie humaine.

Procédures

Ce projet comporte 3 procédures expérimentales correspondant chacune à une stratégie d’immunisation spécifique. Un même animal ne pourra pas être impliqué dans plusieurs procédures. Les animaux seront, donc, soumis à une seule procédure comportant plusieurs étapes/interventions. Des échantillons de sang seront prélevés, sous anesthésie gazeuse associée à une analgésie locale, au cours de chacune des procédures. Les animaux recevront également un nombre d’injection variables d’antigène et/ou d’ARNm, en fonction de la stratégie sélectionnée. En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever différents organes lymphoïdes. Typiquement, les interventions seront réalisées entre 1 et 2 fois toutes les 2 semaines pendant 4 ou 8 semaines. Cependant, la durée maximale de chacune des procédures est de 6 mois pour permettre la réalisation d’un protocole « retardé ». Chacune des interventions réalisées est de courte durée (≤10 minutes).

Impact sur les animaux

La majorité des souris subiront des injections répétées pouvant générer une légère douleur lors de leur réalisation. Cependant, celles-ci étant répétées, il y aura des effets cumulatifs, ce qui pourrait entraîner une détresse modérée chez ces souris. L’injection d’antigène ou d’ARNm peut provoquer des réactions inflammatoires importantes, notamment, durant les 2-5 jours suivant l’injection. Ces dernières peuvent, dans certains cas, se traduire par une perte de poids, une diminution de la mobilité, une réduction de la réactivité aux stimuli verbaux et sensoriels et/ou un pelage ébouriffé. De par la faible masse musculaire de la souris, l’injection intramusculaire peut, parfois, causer une nécrose musculaire ou une inflammation des nerfs.

Devenir

À la fin de l’étude, les animaux présentant la meilleure activité contre l’antigène d’intérêt seront euthanasiés pour la collecte d’organes lymphoïdes. Ces derniers permettront, par la suite, la génération des anticorps monoclonaux. Les animaux non-prélevés seront, quant à eux, euthanasiés afin de limiter les nuisances sur leur bien-être et éviter tout effet indésirable à long-terme.

Remplacement

In vivo, les anticorps monoclonaux sont des molécules complexes qui font intervenir de multiples étapes permettant une sélection des plus efficaces. Le principal avantage des anticorps dérivés d’animaux par immunisation est donc leur qualité, souvent supérieure à ceux non-dérivés d'animaux (ex : phage display). Ces derniers nécessitent, également, des coûts et des délais de génération beaucoup plus importants. De plus, leur qualité pour les phases de développement non clinique d’anticorps thérapeutiques peut poser des difficultés supplémentaires. Par ailleurs, dans le cas où la production d’anticorps nécessite le développement d’hybridomes murins, il n’est pas possible d’utiliser de méthode alternative.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux qui seront utilisés a été calculé afin d’optimiser les chances d’obtenir au minimum un anticorps d’intérêt, par stratégie d’immunisation. Dans le cas où les technologies, réalisées à partir des organes lymphoïdes des souris sélectionnées, ne permettront pas d’obtenir d’anticorps de qualité ou possédant les caractéristiques désirées, un protocole retardé pourra être réalisé sur les animaux immunisés restant. Les animaux utilisés seront généralement issus de lignées consanguines.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 5 jours sera respectée à la réception des animaux. Les animaux seront hébergés de 2 à 5 par cage avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où un animal devrait être maintenu seul dans sa cage, un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale (gazeuse) associée à un analgésique local et les volumes ainsi que les fréquences de prélèvement suivront les recommandations du CEEA et de la SBEA. L’utilisation d’aiguilles de diamètre adapté au type d’injection à réaliser et le plus petit possible seront utilisées afin de limiter la douleur lors des injections. L’évolution pondérale, l’aspect général et le comportement des animaux (apparence, plaie/traumatisme, excrétion) seront suivis une fois par semaine. En post-injection d’antigène ou d’ARNm, période durant laquelle l’animal peut perdre du poids ou présenter des signes physiologiques marqués de détresse, les animaux seront pesés quotidiennement. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que le poids de l’animal ne diminue plus sur 2 pesées successives et que celui-ci ne présente plus d’éventuels signes physiologiques de détresse aiguë (hypomobilité/hyporéactivité, respiration accélérée/ralentie, etc.). Pour limiter l’impact de l’injection et faciliter la récupération des animaux, un gel aqueux enrichi en nutriments sera, également, mis en place en pré et post-injection durant la totalité de cette période. Dans le cas d’injection intramusculaire, une surveillance accrue du site d’injection et de la motricité du membre de l’animal sera, également, effectuée. Après cette période, la fréquence d’observation et de pesée des animaux sera de nouveau réduite à 1 fois/semaine. Elle pourra, cependant, être augmentée en cas de nouvelle dégradation de l’état de l’animal. Des points limites spécifiques relatifs à une perte de poids trop importante et/ou un aspect général/comportement très dégradé seront des critères pouvant justifier l’euthanasie des animaux.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme animal est basé sur la bonne connaissance de son système immunitaire et sa capacité à générer des réponses antigéniques efficaces permettant d’obtenir des lymphocytes B exprimant des anticorps spécifiques de haute affinité. De plus, sa petite taille, sa grande fécondité et son coût de production et d’entretien relativement peu élevés en font un animal de choix. Le développement de nombreuses souches consanguines a, également, permis d’obtenir des lots d’animaux génétiquement très similaires, facilitant ainsi les études comparatives. Les animaux utilisés auront préférentiellement un âge compris entre 6 et 8 semaines. En effet, il a été décrit que la souris développait une réponse immunitaire plus forte contre les antigènes externes à cet âge.

26 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par un paludisme murin (Plasmodium berghei), reçoivent des composés par gavage et subissent des prélèvements sanguins répétés à la queue puis un prélèvement rétro-orbitaire terminal, pour tester des molécules dérivées des Phenmiazines. Le porteur indique qu'une parasitémie élevée peut provoquer une anémie, une perte de mobilité et une perte de poids. Les retombées en clinique humaine restent renvoyées au conditionnel, et le remplacement est écarté au motif qu'il n'existerait "pas de solution viable" hors modèle animal.

Objectifs

importantes dans le fonctionnement du parasite responsable du paludisme. Ces iinhibiteurs appartiennent à la famille des Phenmiazine[1-3].Le projet comprant également l’évaluation de la cytotoxicité dans le but d’un essai préclinique. Les tests visant à évaluer l’efficacité antipaludique in vitro contre Plasmdium spp ont permis d’isoler les composés ayant les meilleures activités. L’ensemble de ces démarches prises ensemble nous amènent à analyser l’efficacité antipaludique de ces molécules dans un système de paludisme murin qui est la base des essais pré-clinique dans la recherche de thérapie expérimentale. Les données collectées permettront de déterminer si des tests cliniques plus poussés peuvent être poursuivis. Par ailleurs les Phenmiazines seraient un atout dans la lutte antipaludique en raison de la diminution des thérapies efficaces et de la résistance croissante aux antipaludiques de la part de Plasmodium falciparum. Elles seraient également un atout chimique car elles n'appartiennent à aucune des familles chimiques antipaludiques déjà recommandées par l'OMS

Bénéfices attendus

A court termes, les bénéfices attendus résident dans la confirmation des résultats in vitro. Une évaluation de la quantité de molécules candidates restantes dans le sang après injection totale est un point important de l'évaluation in vivo pour savoir si ces molécules sont plus ou moins éliminées pendant l'infection. Ce projet permettrait également de mettre en évidence l'efficacité de nouvelles molécules dans la thérapeutique antipaludique. A plus long terme, ceci apporterait une nouvelle famille chimique antipaludique dont le mécanisme reste à approfondir. Si les résultats venaient à se confirmer, ce serait l’opportunité de développer un principe actif sur la base structurale de ces molécules, et un potentiel médicament avec des paramètres pharmacocinétiques compatibles Le but étant de mettre au point des composés efficaces en clinique humaine contre le paludisme, alors que l’arsenal des thérapies utiles et efficaces diminue rapidement.

Procédures

Procédure [1] 2 souris : prélèvement veineux à la queue - tous les 3 jours pendant 10 jours+ A 7% de parasitémie, 1 anesthésie et 1 prélèvement rétro orbitaire - totalité du sang prélevé et euthanasie (durée 30 minutes) - Procédure [2] 24 souris : prélèvement veineux à la queue - tous les 2 jours à compter de J2 (post infection) pendant 30 jours + pesée tous les 2 jours à compter de J1 (post infection) pendant 30 jours - Jour de l'euthanasie injection de bleu Evans en ip 50 µL à 50mg/kg, incubation 1h maximum puis anesthésie et dislocation cervicale. Cocktail kétamine xylasine pour des souris de 18g : 100 mg/kg de Kétamine et 10 mg/kg de xylazine. Les nuisances correspondent à des contentions, des piqures au niveau de la queue pour prélèvement, des injections intrapéritonéales et l’ingestion (per os) de médicaments candidats pour l’expérience. Dans le modèle de paludisme murin, les souris auront des parasitémies qui à taux élevé (>75%) peuvent entrainer une anémie donc une perte de mobilité et une perte de poids transitoire

Impact sur les animaux

Les molécules évaluées sont des molécules qui ont déjà été testées sur des souris pour la cytotoxicité. Les doses utilisées sont en dessous du seuil de toxicité obtenues lors de notre étude in vivo. L'infection par Plasmodium berghei conduit à la mort chez les BALB/c pour des parasitémies supérieures à 80% néanmoins le choix de ce modèle réside également sur le fait que ces souris résistent très bien à des parasitémies élevées en affichant un tableau clinique facile à suivre.

Devenir

Procédure [1] 2 souris euthanasiées par dislocation cervicale après réalisation du prélèvement rétro orbitaire sous anesthésie. La récupération de la totalité du sang infecté ne permet pas de maintenir la souris en vie. Ce sang est important pour infecter les souris de la procédure 2 et maintenir notre souche de paludisme murin. Procédure [2] 24 souris euthanasiées par dislocation cervicale après anesthésie. L'euthanasie des souris permet de récupérer rapidement les organes (cerveau, cœur, foie, poumons, reins, rate) des souris et le sang afin de doser les médicaments présents dans les tissus, mener les études de protéomique et d'histologie nécessaires à l'étude des dommages tissulaires liées à l'infection. Les souris ayant été déjà traitées et infectées, il est difficile de les réinfecter en raison d'une résistance à la réinfection manuelle et une réactivité du système immunitaire. Il est difficile de les réutiliser pour un essai similaire de pharmacothérapie, les souris ayant pris du poids et de l’âge ce qui limite également la possibilité de réinfection [16-19]

Remplacement

Pour ce projet, il n’existe pas de solution viable de remplacement pour le moment. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques est justifiée par la complexité de la pathologie étudiée, le paludisme. Cette infection parasitaire touche les hématies et l’augmentation de la parasitémie entraine un tableau clinique complexe au niveau des différents organes en raison de l’anémie progressive et l’inflammation croissante liées à l’infection. Ces mécanismes ne peuvent pas être d’étudié dans des systèmes in vitro, ou des bioréacteurs élaborés.

Réduction

La réduction fait partie de notre stratégie d'étude. Elle repose sur une étude bibliographique pour connaitre les dernières études pharmacologiques et antipaludiques en paludisme simple. Le calcul du nombre de sujets dans des groupes de même effectif est donné par une formule mathématique, pour mettre en évidence une différence statistiquement significative entre les deux groupes avec un risque de première espèce alpha égal à 5% et une puissance de 80% est donné par la formule suivante, dans le cadre d’un test bilatéral et avec des effectifs égaux dans les deux groupes.

Raffinement

Le bien-être des animaux est un point important dans notre projet puisqu’ il est évalué dans notre grille de score. Des abris, des éléments à ronger seront fournis (l’enrichissement), et la présence de nids réalisés par les souris est vérifiée tout comme leur capacité de fouissement (expression du caractère naturel de l’animal). Les animaux seront hébergés en conditions standard d’animalerie, avec de l’eau et de la nourriture ad libitum. Ils bénéficieront d’une période de stabulation de 5 jours post livraison dans l’animalerie de l’IHU, puis d’une période de 7 jours pendant laquelle les animaux seront familiarisés quotidiennement à la manipulation par les expérimentateurs. Entre la livraison et l’expérience, les animaux seront placés dans des cages garantissant la surface réglementaire pour chaque souris. Les éventuels signes de souffrance seront systématiquement recherchés et évalués

Choix des espèces

Le modèle murin (Mus musculus) est choisi car il est un support idéal pour l'infection par Plasmodium berghei. Il permet l'étude d'un paludisme proche de celui de l'Homme. Il est d'autant plus pertinent car la souche de paludisme murine a un cycle plus rapide que celle infectant l'Homme. Cette caractéristique est très utile dans une étude d'efficacité antipaludique ou pharmacologique pour confronter l'activité antipaludique d'un candidat face un parasite se multipliant rapidement. Nous retenons les souris BALB/C pour cette étude en raison de leur capacité à résister à des parasitémies élevées (entre 60 à 70%) et afficher un tableau clinique facile à suivre. La simplicité et l'efficacité du modèle BALB/c+Plasmodium berghei en font un support pertinent pour notre étude d'efficacité antipaludique. Les souris BALB/c seront des individus adultes âgés de 8 à 9 semaines à l’arrivée dans l’animalerie mais de 10 à 11 semaines au début des expériences. Cela est dû à la phase de stabulation et d’habituation a la manipulation. Cet âge est compatible avec les procédures expérimentales du projet. Cet âge correspond également à la maturité sexuelle (adulte) mais aussi au début de maturité du système immunitaire.

421 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une à deux greffes tumorales, quatre injections de médicaments, des prises de sang et une séance d'imagerie sous anesthésie pouvant durer deux heures. Le porteur indique qu'il n'est pas possible de traduire in vitro la réponse aux immunomodulateurs et travaille sur des souris immunocompétentes porteuses de tumeurs. Le projet évalue l'injection locale d'un anticorps anticancéreux et met en avant une dose dix fois moindre qu'en voie systémique.

Objectifs

L'immunothérapie a modifié de façon considérable la prise en charge thérapeutique de plusieurs types de cancers. Cependant le taux de réponse reste majoritairement inférieur à 25-30% en monothérapie. Des résultats obtenus lors d'une expérience in vivo précédente mettent en évidence cette variabilité interindividuelle chez la souris. L’administration loco-régionale d’agents immunomodulateurs permet la diminution des toxicités, l’augmentation des taux de réponse du fait d’une meilleure pénétration des anticorps au sein de la tumeur et de son microenvironnement. Enfin, la dose efficace en administration locale est d'environ 10 fois inférieure à celle injectée par voie systémique ce qui représente un avantage économique non négligeable. Plusieurs études évaluant l’administration intratumorale d’agents immunomodulateurs (virus oncolytiques, anticorps ou protéines activatrices de l’immunité, inhibiteurs des checkpoint immunitaires) sont en cours avec des résultats attendus dans les mois à venir, et déjà des observations encourageantes rapportées.

Bénéfices attendus

L’administration loco-régionale d’agents immunomodulateurs permet la diminution des toxicités, l’augmentation des taux de réponse du fait d’une meilleure pénétration des anticorps au sein de la tumeur et de son microenvironnement. Enfin, la dose efficace en administration locale est d'environ 10 fois inférieure à celle injectée par voie systémique ce qui représente un avantage non négligeable.

Procédures

Greffes de tumeurs (1 ou 2 par souris, suivant les procédures, durée 15 minutes), injections de médicaments (4 par souris, durée 1-3 minutes), prises de sang (n=3, durée 5-10 minutes). Séances d'imagerie confocale sous anesthésie: 1 par animal, durée de 30 à 120 minutes.

Impact sur les animaux

Nuisances liées à la présence de tumeurs en sous-cutanée, injections de produits en intra-veineuse et séances d'imagerie sous anesthésie.

Devenir

La mise à mort des animaux greffés et traités permettra de faire des analyses post-mortem sur de nombreux tissus.

Remplacement

Le traitement par immunothérapie implique une interaction forte entre cellules tumorales et cellules immunitaires. Actuellement, il n'est pas possible de traduire complètement la réponse aux immunomodulateurs in vitro. Afin de mimer le plus possible les conditions physiopathologiques humaines, nous explorerons l'activité de nos formulations chez des souris immunocompétentes et porteuses de tumeurs murines.

Réduction

Pour étudier l'efficacité des différents traitement anti-tumoraux, la croissance tumorale sera suivie après implantation des cellules. Les critères d’analyse de l’activité anti-tumorale seront le pourcentage d’inhibition tumorale à un temps défini, le délai de croissance tumorale comparé au groupe contrôle, le nombre de régression partielle ou complète et le nombre de survivants sans tumeur. Chaque expérimentation reposera sur une randomisation des souris afin d'homogénéiser les groupes et d’éviter l'impact environnemental, s'assurant ainsi de la fiabilité des résultats. Un pourcentage d'inhibition de la croissance tumorale (comparé au control) supérieur à 40% sera considéré comme efficace (risque alpha 0,1-puissance 0,8). Le nombre d'animaux a été déterminé statistiquement.

Raffinement

Toutes les injections seront réalisées sous anesthésie générale ou locale. Les points limite seront strictement appliqués. Si des signes de stress ou de douleur étaient observés un analgésique sera administré et/ou un enrichissement différent sera ajouté dans la cage.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé en oncologie notamment du fait de l'existence de souches dont le système immunitaire a été très largement caractérisé. D'après notre expérience passée, nous avons pu observer que nos lignées de cellules tumorales murines se développent bien chez la souris et de nombreuses études en immunothérapie ont montré de très bons résultats dans ce modèle. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte correspondant à un développement optimal du système immunitaire.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie obstruant complètement le canal biliaire pour induire une fibrose hépatique, puis des injections quotidiennes pendant trois semaines. Le porteur indique des douleurs de laparotomie et des risques d'infection ou de rupture de suture. Il affirme qu'il est impossible de reproduire in vitro les effets de la fibrose hépatique sur l'organisme et retient la souris comme le modèle dont la génétique est la mieux connue.

Objectifs

La fibrose hépatique est définie comme la production et l'accumulation excessive de la matrice extracellulaire (ECM) dans le foie. La fibrose hépatique peut être causée par une multitude de différents stimuli et les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la fibrose impliquent un programme très orchestré de changements moléculaires et cellulaires. En particulier, les modifications anatomiques et fonctionnelles de l'intégrité des tissus du foie sont consécutives à l’amplification des signaux inflammatoires. La fibrogènese hépatique est un problème clinique dans le monde entier. L’objectif de ce projet est de déterminer si l'inhibition d’une protéine, impliquée dans le métabolisme des acides gras et libérée par le foie, peut prévenir la fibrose hépatique induite par la cholestase obstructive.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique pour palier à la fibrose hépatique, qui impact la fonction hépatique et qui est un problème clinique majeur car peut être causée par une multitude de différents stimuli toxiques.

Procédures

Tous les animaux du projet seront soumis une seule fois à une chirurgie induisant l'obstruction complète du canal biliaire (durée environ 30 minutes/souris). L’acte chirurgical sera réalisé sous anesthésie et analgésie (avec un suivi analgésique post-opératoire de 2 jours). Tous les animaux recevront des injections (quelques secondes) sous-cutanées (animal vigile). L’expérience n’excédera pas 3 semaines (à partir de la chirurgie). Tous les traitements seront administrés par voie intra-péritonéale (au maximum 1 fois par jour, tous les jours, quelques secondes).

Impact sur les animaux

La procédure de ce projet n’excédera pas 3 semaines. Tous les animaux du projet seront soumis à une chirurgie induisant l'obstruction complète du canal biliaire. Aucun autre effet indésirable n’est attendu en dehors de ceux connus et causés par cette induction. Une douleur due à la laparotomie pourra apparaitre chez la souris. Des infections ou des ruptures de sutures pourraient survenir. La fibrose sera induite mais à ce stade les douleurs seront modérées. Le mouvement des souris et leur respiration ne seront pas impactés. Les injections n’induisent pas de douleurs à l’animal autre que la piqûre de l’aiguille et peuvent induire un stress dû à la contention.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, les conséquences et les effets sur l’organisme de la fibrose hépatique vu sa complexité.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 600 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs tests statistiques seront utilisés pour les analyses pour comparer les divers groupes de traitements.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie/analgésie des animaux, utilisation de tapis et lampes chauffantes, ...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Selon les procédures, les animaux seront utilisés entre 7 et 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris nude immunodéprimées reçoivent une xénogreffe de chondrosarcome humain sous la peau, puis des injections de traitement et des mesures de la tumeur deux fois par semaine pendant douze semaines. Le porteur indique que les cultures cellulaires ne reproduisent pas le microenvironnement tumoral et affirme vouloir confirmer in vivo des molécules déjà repérées in vitro. Le projet vise à repositionner des médicaments contre ce cancer des os rare.

Objectifs

Les chondrosarcomes sont des tumeurs osseuses rares qui produisent une matrice cartilagineuse. Ces tumeurs touchent principalement les adultes et sont potentiellement fatales. Elles sont considérées comme résistantes à la radiothérapie et aux chimiothérapies conventionnelles. De ce fait, leur traitement a peu évolué au cours des 40 dernières années. Il repose sur la chirurgie et peut conduire à l’amputation d’un membre du patient. De plus, les options thérapeutiques sont limitées si la tumeur est localisée dans des zones sensibles non résecables telles que la tête et le cou ou le pelvis, ou si la tumeur métastase. C’est pourquoi il est nécessaire d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des patients atteints de chondrosarcomes. Nous avons montré in vitro que des molécules ciblant la voie de l’adénosine réduisent la croissance tumorale et induisent la mort par apoptose dans les chondrosarcomes humains. L’objectif de ce projet est d’évaluer les capacités anti-tumorales de quatre de ces molécules ciblant la voie de l’adénosine dans un modèle hétérotopique de chondrosarcome humain chez la souris immunodéprimée.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité anti-tumorale de quatre molécules ciblant la voie de l’adénosine dans un modèle animal de chondrosarcome humain. Ainsi, nous identifierons si le ciblage de la voie de l’adénosine pourrait devenir une nouvelle approche thérapeutique pour le chondrosarcome, un cancer des os chimio- et radio-résistant de pronostic potentiellement sévère. Cette information est cruciale pour le développement clinique de cette thérapie qui pourrait à terme améliorer la prise en charge des patients atteints de chondrosarcome.

Procédures

Les gestes suivants seront réalisés sur l’ensemble des animaux (total 288) : - une implantation de xénogreffe en sous-cutané au niveau du flanc (moins de 2 minutes), sous anesthésie générale et analgésie - une mesure du volume tumoral à l’aide d’un pied à coulisse (moins de 2 minutes), 2 fois par semaine pendant 12 semaines, sous anesthésie générale - une injection du traitement (la molécule testée ou son véhicule) en intrapéritonéal (moins de 2 minutes), 2 à 4 fois par semaine pendant 12 semaines - un suivi pondéral (pesée, moins de 2 minutes), 2 fois par semaine pendant toute la durée de la procédure (estimée selon notre expérience, à 6 semaines pour le développement tumoral puis 12 semaines de suivi du volume tumoral)

Impact sur les animaux

D’après notre expérience et la littérature, nous ne nous attendons pas à une perte de poids, ni à une gêne lors du déplacement de l’animal, ni à des modifications du comportement, ni à des douleurs spécifiques excepté au moment de l’injection des cellules tumorales. Pour diminuer la douleur, une analgésie sera administrée lors de l’implantation des tumeurs.

Devenir

La procédure est de classe de sévérité modérée, ce qui justifie la mise à mort des animaux à l’issue de la procédure.

Remplacement

Les expériences réalisées in vitro sur des cultures de cellules ne permettent pas de modéliser l’ensemble du micro-environnement cellulaire, connu pour modifier le comportement des cellules et affecter leur réponse aux traitements. C’est pourquoi après avoir mis en évidence in vitro des molécules aux propriétés anti-tumorales, nous souhaitons confirmer ces propriétés in vivo, sur un modèle murin plus proche de la pathologie humaine, afin de faire la preuve de concept de l’efficacité des drogues utilisées en vue de proposer d’éventuels repositionnements de médicaments actuellement utilisés pour le traitement d’autres tumeurs ou maladies.

Réduction

Nous considérons que la molécule testée a un effet anti-tumoral si elle entraine une baisse de volume tumoral d’au moins 20 % en moyenne par rapport au groupe contrôle. Pour cela, le nombre d’animaux par groupe peut être réduit à 12.

Raffinement

Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux durant toute la durée de la procédure, un suivi individuel et régulier sera effectué afin d’évaluer l’état général des souris. Les implantations de xénogreffes seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Les mesures de volume tumoral seront également réalisées sous anesthésie générale. De plus, si la souris présente une perte de poids importante, les traitements seront arrêtés une à deux semaines le temps que les signes cliniques disparaissent. Si les signes cliniques perdurent, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Afin de permettre l’implantation des xénogreffes et le développement tumoral, des souris immunodéprimées (nude) seront utilisées. Les chondrosarcomes humains touchent principalement les adultes. Aussi, d’après notre expérience et les données de la littérature, des souris à un stade adulte seront utilisées.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, non pour produire des connaissances mais pour former des étudiants de master. Chaque binôme opère une souris en chirurgie stéréotaxique afin d'injecter un traceur dans le cerveau, l'animal étant ensuite tué et son cerveau prélevé. Le porteur décrit la stéréotaxie comme une compétence "essentielle" à la poursuite du cursus et à l'insertion professionnelle. Il justifie le nombre d'animaux par le nombre d'étudiants, une souris pour deux.

Objectifs

L’objectif du projet est de former les étudiant.e.s aux techniques de stéréotaxie et de neuroanatomie qui sont primordiales pour leur formation en Neurosciences. La stéréotaxie est une technique largement utilisée dans les laboratoires de Neurosciences permettant de localiser précisément des régions cérébrales sur un animal anesthésié comme la souris. Cette localisation est calculée à l’aide de coordonnées données par un atlas des régions du cerveau. Ces coordonnées sont ensuite reportées sur l’appareil stéréotaxique afin de localiser la région sur le cerveau de l’animal. Cette localisation sert à injecter un traceur dans une région cérébrale d’intérêt. Les techniques neuroanatomiques permettent de visualiser ce traceur et donc les réseaux neuronaux d’intérêt dans le cerveau de souris. De ce fait, cette étude pourra être réalisée uniquement sur l’animal entier et vivant afin de visualiser la progression d'un traceur injecté dans la structure cérébrale d’intérêt. La technique de visualisation qui sera utilisée est une technique largement utilisée dans les laboratoires publics et privés dans le domaine des neurosciences pour mettre en évidence les connexions neuronales entre différentes structures cérébrales. L'acquisition de ces compétences techniques est donc essentielle pour permettre aux étudiants la poursuite de leur cursus universitaire et pour l’apprentissage de leur futur métier.

Bénéfices attendus

La stéréotaxie est une technique d’expertise utilisée en laboratoire de recherche dans le cadre d’études neuroanatomiques, électrophysiologiques ou de le cadre du développement de stratégies thérapeutiques dans les pathologies du cerveau (principalement maladies neurodégénératives ou cancer). La technique de visualisation anatomique qui sera utilisée est une technique largement utilisée dans les laboratoires publics et privés dans le domaine des neurosciences pour mettre en évidence les connexions neuronales entre différentes structures cérébrales. Les étudiants de Master pourront donc acquérir ces compétences techniques importantes à la poursuite de ce cursus universitaire et à leur insertion dans le monde professionnel.

Procédures

Chaque animal subira une procédure chirurgicale stéréotaxique (20 min) et sera pesé 2 fois (2 min).

Impact sur les animaux

- léger inconfort lié à la procédure chirurgicale, minimisé par l'administration d'antalgique - léger stress lié à la pesée individuelle des animaux

Devenir

A l’issue de la procédure les animaux seront euthanasiés. Le cerveau sera ensuite prélevé afin d’en identifier les réseaux neuronaux d’intérêt.

Remplacement

L’objectif du projet est de caractériser anatomiquement des réseaux neuronaux dans le cerveau de souris. De ce fait, cette étude pourra être réalisée uniquement sur l’animal entier et vivant afin de visualiser la progression d'un traceur injecté dans la structure cérébrale d’intérêt.

Réduction

Toutes nos études utilisent des méthodes expérimentales validées et utilisées dans notre laboratoire. Nous nous affranchirons ainsi des étapes de mise au point qui auraient nécessité l’utilisation d’un plus grand nombre d’animaux. Cette étude sera conduite par un enseignant formé à l’expérimentation animale et à la chirurgie. Le nombre d'animaux utilisé est déterminé par le nombre d'étudiants participant à cet enseignement. Nous avons réduit le nombre d’animaux à 1 animal pour 2 étudiants. C’est le nombre minimum pour assurer un enseignement efficace et exécuter l’expérimentation dans de bonnes conditions. Compte tenu du nombre d’étudiants dans la formation (20 étudiants par an), pour réaliser ces travaux pratiques, nous diminuerons le nombre de souris à 1 pour 2 étudiants soit : 20/2=10 souris par an, soit 40 souris pour la totalité du projet (4 ans).

Raffinement

Nous prendrons des mesures pour réduire la douleur, la souffrance et/ou l’angoisse des animaux par l’administration de produits anesthésiants et/ou antalgique/analgésiant. L’angoisse des animaux sera réduite car la chirurgie sera réalisée par un enseignant formé à l’expérimentation et à la chirurgie animales et compétent pour réaliser ces gestes de manière sûre, rapide et efficace. Chaque groupe d’étudiants sera encadré par l’enseignant à tour de rôle. Durant les travaux pratiques, afin de réduire le stress des animaux, ceux-ci seront hébergés dans une salle de classe sans passage d’étudiants ou de personnel et mitoyenne à celle des étudiants. Les souris de souche SWISS seront utilisées car cette souche est relativement calme et modérément sensible au stress ce qui en fait un modèle pertinent pour la formation des étudiants. La chirurgie aura lieu dans un espace dédié en fond de salle sans passage d’étudiants ou de personnel. Le bien-être des animaux sera pris en compte à chaque étape par une surveillance pendant la chirurgie : l’apport d’enrichissement spécifique aux rongeurs dans le milieu et le recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale seront mis en place. L’hypothermie des animaux sera limitée par l’utilisation d’une couverture chauffante reliée à une sonde rectale ce qui permettra de contrôler la température corporelle de l’animal pendant la chirurgie par le groupe d’étudiants concerné. Immédiatement après la chirurgie, les animaux seront surveillés par le groupe d’étudiants concerné puis quotidiennement par l’enseignant encadrant. Les animaux seront hébergés en groupe de deux avec accès à la nourriture et à l’eau ad libitum et à un enrichissement (papier de nidification) leur permettant de se cacher et d’enrichir leur milieu de vie.

Choix des espèces

Les souris de souche SWISS seront utilisées car cette souche est relativement calme et modérément sensible au stress ce qui en fait un modèle pertinent pour la formation des étudiants. Les animaux utilisés seront des souris adultes (âgées de 8 semaines). L'injection du traceur se fait grâce à un équipement adapté à la souris adulte. De plus, le cerveau adulte étant plus gros cela permet de réaliser plus de coupes à partir d'un animal donc d’avoir plus de matériel d’analyse par animal et ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés.