Rongeurs
Evaluation préclinique de nouvelles molécules thérapeutiques pour le traitement des maladies inflammatoires de l’intestin chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 600
8 400 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation intestinale leur est induite par un agent chimique, une bactérie ou des cellules, puis des composés leur sont administrés jusqu'à six semaines, parfois via une minipompe implantée sous la peau, pour évaluer des candidats médicaments contre les maladies inflammatoires de l'intestin. Le porteur indique que les animaux développeront diarrhée, sang dans les selles et perte de poids. Il qualifie le recours au modèle animal d'"indispensable" pour une vue globale de la maladie que les modèles in vitro ne donneraient pas.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI), telles que la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, sont des troubles caractérisés par une inflammation de la paroi d’une partie du tube digestif, source de lésions destructrices. Ces maladies sont caractérisées par une forte migration de cellules inflammatoires de types granulocytes au niveau de la paroi du tube digestif. L’augmentation et la dérégulation du recrutement des granulocytes et leur sur-activation contribuent à la chronicité et à l’amplification de la maladie. Notre programme de recherche vise à découvrir des molécules qui agissent via des mécanismes d’action innovants et qui peuvent ainsi représenter des options thérapeutiques pour tous les patients atteints de MICI. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et approuvées in vitro. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro
Bénéfices attendus
A terme, ce projet permettra de de tester et développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de MICI.
Procédures
Dans ce projet, nous utiliserons des modèles d’inflammation de l’intestin chez le rat et la souris afin de tester l’efficacité de nos composés. Ces modèles seront induits par un agent chimique ou par le gavage d’une bactérie ou par l’injection de cellules inflammatoires une à deux fois par étude. Certains de ces modèles utiliseront des souris génétiquement modifiées ne présentant pas de phénotype dommageable. Les composés seront administrés pendant 6 semaines maximum. Un prélévement sanguin sera également effectué une fois pendant l'étude pour suivre la pharmacocinétique des composés testés. Une minipompe pourra être implantée en sous cutané pour une administration continue pendant 4 semaines.
Impact sur les animaux
Les animaux developperont les signes cliniques des MICI qui se caractérisent par une diahrrée, du sang dans les fèces et de la perte de poids.
Devenir
Tous les animaux dans les procédures recevront une sédation préalable par inhalation d’isoflurane et seront mis à mort avec la méthode adaptées à l'espèce. Les tissus seront collectés pour analyse de l'impacte de nos composés sur la physiopathologie de la maladie.
Remplacement
L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro. L'utilisation de modèles animals est indispensable pour avoir une vue globale de la physiopathologie de la maladie ainsi que la pharmacocinétique des composées sur l'ensemble des organes ce que ne permet pas les modèles in vitro.
Réduction
Nous utilisons des modèles établis dans la littérature que nous utilisons en routine dans notre établissement utilisateur depuis 5 ans. Une analyse statistique rétrospective a permis de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe pour obtenir pour chaque paramètre étudié. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.
Raffinement
Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude et leur environnement sera enrichi. Afin de pallier l'inconfort lié aux procédures, un programme d'anesthésie et d'analgésie sera envisagé. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance journalière et des points limites précoces et spécifiques aux modèles ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Les différents modèles seront mis au point, sur la base de la littérature existante et en s’appuyant sur l’expertise du fournisseur. Nous avons souhaité nous appuyer sur de la bibliographie solide et sur des modèles déjà bien documentés afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour les mises au point. En accord avec la littérature pour les différents modèles, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés à visée anti-inflammatoire, sur un système immunitaire mature
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
184 souris vont être utilisées, 120 tuées à l'issue et 64 réutilisées ou écartées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues prédiabétiques par un régime riche en graisses, elles subissent des gavages quotidiens pendant quatre semaines et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec coupure de la queue et injections, pour évaluer des bactéries et un métabolite comme futur complément alimentaire. Le porteur indique un stress lié à l'isolement en cage individuelle et aux contentions répétées, et fixe une perte de poids de 20 % comme point limite. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne simule les interactions entre organes et conclut au recours à la souris.
Objectifs
Des résultats préliminaires obtenus dans notre laboratoire ont mis en évidence un effet anti-hyperglycémiant de souches bactériennes commensales du groupe Streptococcus salivarius inactivées par la chaleur, et d’un métabolite dérivé de la sérine (sécrété par les bactéries et les plantes) dans un modèle murin de prédiabète (définit pas une glycémie à jeun > 1.26g/L) induit par un régime riche en graisse. L’objectif de notre projet est de déterminer les mécanismes par lesquels ces souches bactériennes naturellement présentes dans l’intestin et ce métabolite exercent cet effet anti-hyperglycémiant dans un modèle de souris pré-diabètique . Le prédiabète désigne une glycémie, c'est-à-dire un taux de sucre dans le sang, plus élevée que la normale. Il est réversible s’il est traité avant son évolution vers le diabète qui lui est un état irréversible. Pour ce faire, plusieurs souches bactériennes ainsi que ce métabolite dérivé de la sérine seront administrées à un modèle de souris rendues prédiabétiques via un régime riche en graisse.
Bénéfices attendus
L’objectif final de ces recherches est de déterminer si les bactéries commensales étudiées et le métabolite bactérien dérivé de la sérine permettent la réversion du prédiabète c’est à dire de réduire l’intolérance au glucose et l’insulino-résistance induites par des régimes déséquilibrés. Si tel est le cas, ceux-ci pourraient servir de traitements pour prévenir le développement du diabète de type 2 chez l’homme. En effet, ce projet de maturation vise à developper un complément alimentaire, pour l’homme, à partir des bactéries et/ou de ce métabolite.
Procédures
Les animaux seront soumis à une contention régulière nécessaire lors des gavages quotidiens (quelques secondes) sur une période de 4 semaines et au cours des tests de tolérance au glucose et de tolérance à l’insuline. Pour ces deux tests (réalisés deux fois sur chaque animaux) les souris subiront une petite coupure à l’extrémité de la queue (incision : 1 seconde) et massage de la queue pour récupérer la goutte de sang (quelques secondes) et à une piqûre (5 secondes) lors de l’injection de l’insuline en intrapéritonéal . Un prélèvement de sang à la veine submandibulaire sera réalisé une fois sur animaux vigiles en fin de procédure 2 avant l’euthanasie. Ce prélèvement dure 10-15 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à un stress de par leur placement en cage individuelle tout au long de la procédure et à un stress au cours de la contention nécessaire lors des gavages, des prélèvements et des injections quotidiens sur une période de 4 semaines D’après les résultats préliminaires du laboratoire, le gavage des souris avec ces différents composés tests, n’induit pas de perte de poids ni d’effets négatifs sur les souris. La prise de poids associée au régime riche en graisses et la période de jeune necessaire au test de tolérance oral au glucose (OGTT) et au test de tolérance à l'insuline (ITT) génèreront des stress faibles à modérés.
Devenir
En procédure 1 environ 64 souris non répondeuses au régime seront euthanasiées ou mutualisées et 120 souris seront utilisées pour la procédure 2. A la fin de la procédure 2 les 120 souris seront euthanasiées pour prélèvement d’organes.
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler les interactions inter-organes impliqués dans le contrôle de l’homéostasie glucidique d’un individu. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données phénotypiques (poids, prise alimentaire) et biologiques obtenues à partir du sang (glycémie), des tissus endocrines (stimulation de la sécrétion d’insuline) et intestinaux (tissus producteurs d’incrétine) ainsi que des organes impliqués dans la régulation de cette homéostasie glucidique (foie et muscle).
Réduction
Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental, car d’après les études déjà menées au laboratoire, nous estimons que ce nombre est nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter, un bâton à ronger et d'un abri en propylène rouge. Les animaux seront surveillés deux fois par semaine (surveillance visuelle) au moment de la mesure du poids et le prise alimenaire mesurée (par pesée de l’aliment) une fois par semaine. Une perte de poids dépassant 20 % du poids initial de l’animal sera considérée comme un point limite. De même des comportements atypiques de type poil hérissé, prostration, absence de toilettage ou léthargie pendant plus de trois jours ou stéréotypie seront également considérés comme des points limite entrainant l’arrêt précoce du protocole sur les animaux concernés et leur euthanasie . Au moment du test de tolérance oral au glucose (OGTT) et du test de tolérance à l'insuline (ITT), les animaux seront placés dans la salle d’expérimentation (differente de celle d’élevage) 1h avant le test afin de limiter le stress dû à un environnement nouveau.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes riches en énergie en raison de ses réponses reproductibles. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal et ce travail fait suite à des travaux conduits depuis 2018 sur ce modèle. Nous avons choisi de travailler sur des animauxde 8-12 semaines d’âge afin de travailler sur des animaux adultes ayant un microbiote stabilisé et car nos données préliminaires ont été réalisées sur des animaux du même âge.
Validation d’un nouvel outil diagnostic et thérapeutique pour le traitement des microthromboses dans l’accident vasculaire cérébral ischémique.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par perfusion intracardiaque, dans des procédures classées en niveau de souffrance sévère. Elles subissent trois modèles d'accident vasculaire cérébral ischémique puis un suivi par IRM, pour tester un agent de contraste censé diagnostiquer et traiter les microcaillots. Le porteur indique que ces modèles peuvent provoquer des douleurs postopératoires, des déficits moteurs et cognitifs et une perte de poids, les souris perdant plus de 20 % de leur poids ou dépassant un score de douleur défini étant alors tuées. Il répète que les procédures ont un caractère de "stricte nécessité" et ne peuvent pas être remplacées par des méthodes sans animaux vivants.
Objectifs
L’enjeu de ce projet est d’améliorer la prise en charge des microthrombi (petits caillots sanguins) résiduels dans les accidents vasculaires cérébraux (AVC) de type ischémique. Pour cela, nous avons développé un nouvel agent de contraste (PHySIOMICS). Ce dernier, peut être combiné à différentes molécules et semble doté de propriétés anti-inflammatoires. Ainsi, dans un premier temps, nous combinerons cet agent de contraste à des molécules favorisant la thrombolyse des thrombi (par exemple l’activateur tissulaire du plasminogène). Ensuite, nous évaluerons l’effet des PHySIOMICS sur la réponse inflammatoire associée dans le parenchyme cérébral. Nous développerons ainsi un outil théranostique qui vectorisera un traitement thérapeutique spécifiquement au niveau des microthrombi tout en assurant leur diagnostic. L’IRM moléculaire permettra de suivre l’apport thérapeutique des PHySIOMICS couplés ou non sur le traitement des microthrombi chez la souris.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va permettre des recherches translationnelles ou appliquées menées pour le diagnostic et le traitement des AVC chez l'homme. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude d’un potentiel traitement ischémique et inflammatoire ainsi que la caractérisation de l'inflammation cérébrale doit s’effectuer sur des modèles in vivo.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 modèles d'AVC ischémique différents, le modèle thrombine d'une durée moyenne de 30 minutes et 1 fois par animal (cf procédure 1); le modèle chlorure de fer (application d'une compresse imbibée de chlorure de fer sur l'artère cérébrale moyenne permettant la formation d'un caillot) d'une durée moyenne de 30 minutes et 1 fois par animal (cf procédure 2); le modèle sténoses en tandem : c'est à dire la formation de plaques d'athérome au niveau de l'artère carotide commune puis les faire migrer au niveau du parenchyme pour une durée moyenne de 30 minutes et 1 fois par animal (cf procédure 3) et 1 modèle de neuro-inflammation d'une durée moyenne de 20 minutes (cf procédure 4). Tous les animaux auront un suivi à l'IRM d'une durée moyenne de 45 minutes à J0 (après avoir induit un AVC ischémique (procédure 1 à 3) ou une neuroinflammation (procédure 4)) et un second suivi allant de 6h à 7 jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient : *Pour le modèle thrombine (cf procédure 1): - perte de poids - douleurs post opératoires - stress - déficits fonctionnels et/ou cognitifs. Pour le modèle chlorure de fer (cf procédure 2): - perte de poids - douleurs post opératoires - stress – déficits fonctionnels et/ou cognitifs. *Pour le modèle de sténose en tandem (cf procédure 3): - diabète – douleurs post opératoires - stress - déficits fonctionnels et/ou cognitifs. *Pour le modèle de neuroinflammation (cf procédure 4) : - diabète - douleurs post opératoires - stress - déficits fonctionnels et/ou cognitifs. *Pour le suivi à l'IRM : -stress. Tous les animaux auront un suivi attentif et régulier par l’expérimentateur et le personnel animalier qualifié (prise journalière du poids des animaux, observations des animaux dans la cage en s’assurant de leur bien-être (grimace scale, prise alimentaire et boisson).
Devenir
Les animaux issus des procédures d'AVC ishcémique et de neuroinflammation seront mis à mort par perfusion intra-cardiaque afin de prélever les organes.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement d’une pathologie humaine grave touchant une part importante de la population. De plus, les méthodes in vitro de ce projet aident à la réduction du nombre d’animaux. La technique des microfluidiques nous permettra l’étude de la fixation des PHySIOMICS couplés au TPA et/ou la NAC aux caillots et de visualiser leur dégradation. Ainsi l’efficacité de ce couplage sera déjà évaluée et validée avant d’avoir recours aux animaux limitant ainsi leurs nombres.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans chaque phase du projet, le minimum d'animaux a été prévu afin d'arriver à des résultats qui soient en adéquations avec les tests statistiques prévus lors de ce projet. Le nombre d’animaux pour chaque étude a été défini à partir d’une analyse de puissance et de nos données sur le modèle.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement sont utilisés pendant tout le projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes. Le bien-être des animaux est contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permet de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveillance du poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 20% est observée par rapport au poids initial et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (grimace scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel utilisé dans cette procédure expérimentale est neuf (pour les consommables, comme les seringues et aiguilles) ou soigneusement nettoyé et désinfecté pour les réutilisables (pinces métalliques).
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine de l’inflammation cérébrale et les caractéristiques de la pathologie sont donc bien connus. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l'inflammation cérébrale. Le stade de développement des animaux est de 8 semaines pour les souris des procédures 1; 2 et 4 pour un poids compris entre 35 et 40g. Ce choix a été fait fait suivant les données de la litérrature employant les mêmes modèles expérimentaux. Enfin, pour la procédure 3, le modèle d'AVC ischémique sténose en tandem sera réalisé sur des souris de 12 semaines car il est nécessaire d'induire un régime de "high-fat diet" pendant 6 semaines (après sevrage qui est à 6 seamines) afin d'obtenir des animaux diabétiques.
Caractérisation des effets de l’invalidation spécifique dans le foie ou l’intestin du récepteur PXR sur le phénotype métabolique des souris mâles et femelles nourries avec un régime standard ou riche en gras et en sucres
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles sont soumises à un régime riche en gras et en sucres, à des prélèvements sanguins répétés à la queue puis terminaux à l'œil, et pour les femelles à une ovariectomie et à la pose d'un implant d'estrogènes, pour étudier le rôle du récepteur PXR dans la résistance à l'obésité. Le porteur décrit des effets modérés et transitoires liés aux chirurgies, aux jeûnes et aux gavages. Il affirme que les mécanismes en jeu sont trop multifactoriels pour être reproduits en culture cellulaire ou in silico.
Objectifs
L’obésité et les maladies métaboliques associées comme le diabète de type 2 sont en pleine expansion et il est important d’en comprendre les mécanismes pour proposer des solutions thérapeutiques efficaces. L’obésité entraîne des modifications du fonctionnement du foie et de l’intestin. Ces 2 organes qui communiquent activement sont essentiels à la bonne santé de l’organisme, par exemple pour s’opposer à l’accumulation des lipides dans le foie (maladie du foie gras ou stéatose hépatique) et maintenir un bon équilibre de la flore intestinale. Il a été montré que le récepteur PXR essentiellement produit par le foie et l’intestin jouait un rôle important. En effet, si des souris sont soumises à une diète riche en sucres et en gras alors elles prennent du poids, le foie accumule des lipides (stéatose) et la flore intestinale est déséquilibrée entraînant une inflammation. En revanche, si les souris n’expriment plus PXR dans aucun tissu (manipulation génétique) et qu’elles sont nourries avec une nourriture riche en gras et en sucres, elles ne prennent pas de poids, le foie n’est pas stéatosé et il n’y a pas d’inflammation intestinale. On parle de résistance à l’obésité qui est observée chez les mâles davantage que chez les femelles, suggérant un effet dépendant des estrogènes. L’objectif original est de comprendre les mécanismes reliant l’expression de PXR dans le foie et l’intestin et la résistance à l’obésité chez les mâles et les femelles. Les modalités techniques reposent sur des études de chirurgie et de nutrition pour étudier l'expression des gènes. Un total maximal de 384 souris sera utilisé sur 5 ans. Chaque souris sera suivie individuellement afin de collecter un maximum de données biologiques et limiter la quantité totale de souris pour l’obtention de données statistiques fiables et interprétables.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre le rôle de PXR présent dans les hépatocytes (foie) et les cellules intestinales dans l'observation de la résistance à l’obésité chez les souris présentant une absence complète d’expression de PXR et le rôle des estrogènes de par la réalisation à la fois de l’ovariectomie bilatérale et de la supplémentation en estradiol. Les analyses d’expression de gènes sur les tissus métaboliques d’intérêt (foie, intestin, tissu adipeux) viseront à comprendre les mécanismes de compensation et les cibles. En effet, le foie et l’intestin expriment de nombreux récepteurs dont certains ont des fonctions qui se recoupent et l’absence de PXR pourrait être compensée par une expression plus importante d’autres récepteurs et ceci pourrait être différent selon les sexes. Ce travail pourra déboucher sur la réalisation d’autres projets impliquant une exposition à des polluants alimentaires puisque PXR outre sa fonction dans les mécanismes pouvant entraîner une obésité est également impliqué dans l'assimilation des médicaments et des polluants alimentaires.
Procédures
Dans les 3 procédures, les interventions sont nutritionnelles (exposition à un régime riche en gras et en sucres). Dans les 3 procédures, les interventions incluent des prélèvements sur des animaux vigiles après mise à jeun de 6 heures. Il s’agit de prélèvements de sang à la queue afin de suivre l’état métabolique de la souris comme le taux de sucre dans le sang ou des lipides en réponse à une injection soit de glucose (sucre) "ou d’insuline" (modification avril 2022), ou en réponse à un gavage d’huile. Les tests métaboliques sont espacés d’une semaine. La durée totale des tests est de 90 minutes avec 5 prélèvements pour les mesures de sucre dans le sang et de 4h avec 4 prélèvements pour le dosage des lipides. Les interventions incluent également le prélèvement terminal de sang à l’œil (après dépôt d’un analgésique). Chaque prélèvement en lui-même ne dure que quelques secondes. Les interventions sont également chirurgicales dans les 2éme et 3éme procédures qui ne concernent que les femelles. Il y a anesthésie profonde puis ovariectomie (les ovaires sont enlevés) ou pseudo-opération (l’animal est ouvert mais les ovaires ne sont pas enlevés) ; puis réalisation de 4 points de suture par souris. L’opération de l’animal anesthésié est de moins de 5 minutes. Dans la procédure 3, 3 semaines après l’ovariectomie, les femelles sont à nouveau anesthésiées pour la pose d’un implant contenant des estrogènes ou de l’huile. Ces implants sont glissés sous la peau (petite incision au niveau du coup entre les épaules) après anesthésie profonde. L’intervention avec les 2 points de suture à la fin dure moins de 5 minutes par souris.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont de classe modérée. Ils sont transitoires. Il peut s'agir d'un inconfort transitoire en suite des actes de chirurgie (ouverture du flanc, suture des plans musculaires et cutanés) jusqu'à cicatrisation. Il peut s'agir de la mise à jeun ( limitée à 6h) n'ayant pas de conséquence sur l'état général. Cela peut aussi concerner les gavages (contention maitrisée), les injections intra-péritonéales de glucose "ou d'insuline" (modification avril 2022) et l'incision très fine au niveau de la queue (pour récupération limitée de sang).
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux sont mis à mort après anesthésie.
Remplacement
Le travail sur l’animal permet de démontrer un effet causal, direct ou indirect, de la non-expression de PXR et de l’interaction avec l’alimentation hypercalorique sur les paramètres métaboliques étudiés. De plus, ce projet s’intéresse à la dépendance des effets avec le sexe en comparant mâles et femelles. En conséquence, ce projet implique trop de mécanismes susceptibles d’interagir en même temps, les conséquences sont multifactorielles et ne peuvent donc pas être remplacées par des cultures cellulaires ou in silico.
Réduction
Le projet est original au sens où il n’a encore jamais été mené. Le nombre de souris est calculé au plus juste pour offrir la puissance statistique maximale. Dans chaque procédure en lien avec l’obtention à la fois de souris sauvages et invalidées spécifiquement pour PXR dans le foie ou l’intestin, les études sont réalisées avec un nombre minimal de 6 souris et maximal de 12 souris par groupe. Plusieurs considérations sont sous-jacentes. (1) L’utilisation à la fois des mâles et des femelles élimine la phase de mise à mort des femelles. Il n’y a pas en effet de modification du sex-ratio à la naissance pour ces lignées. (2) il est impossible de travailler correctement avec plus de 48 animaux en parallèle que ce soit pour la réalisation des tests métaboliques ou la mise à mort et les prélèvements post-mortem. Les animaux étant mis à jeun 6 h avant la mise à mort, un nombre maximal de 12 souris peuvent être mis à mort et disséqués par après-midi. (3) Si les observations sont statistiquement significatives avec un n=6, alors seulement 6 souris par groupe expérimental seront utilisées. Enfin, les procédures qui ne requièrent que des femelles seront développées autant que faire se peut en même temps que les procédures développées au laboratoire sur les souris mâles de ces mêmes lignées afin d’éviter les reproductions inutiles de ces souris.
Raffinement
Pour la réalisation des tests métaboliques qui nécessitent soit une incision à la queue pour la mesure de la glycémie, une injection de glucose, dinsuline ou un gavage de lipides, les points limites concernent la possibilité d'un stress/anxiété ou douleur liés au geste. Ils sont limités car pratiqués par du personnel compétent. De plus, les animaux sont mis dans une cage et les tests sont réalisés dans une pièce calme. "Lors de la réalisation du test de sensibilité à l’insuline, il peut arriver qu’une souris soit en hypoglycémie (baisse trop importante du taux de sucre dans le sang). Dans ces conditions, une injection de glucose est immédiatement réalisée et la souris est installée sur un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie (froid)." (modification avril 2022). Pour les opérations chirurgicales, les opérations se font le matin, pour démarrer une surveillance en début d’après-midi. L’anesthésie est profonde. Les 2 flancs sont rasés sur une petite surface pour éviter l’introduction de poils dans la plaie puis désinfectés. Après l’enlèvement des ovaires, la fermeture des plans musculaire puis cutané sont refermés l’un après l’autre à l’aide d’un fil résorbable (4 points au total). Pour les maintenir au chaud jusqu’à leur réveil, les souris seront déposées à raison de 3 à 4 souris par cage avec de la sciure propre, sur des carrés de coton préalablement stérilisés et recouvertes d’autres carrés de coton.
Choix des espèces
La physiologie de la souris est « proche » de celle de l’homme. Le projet vise à étudier le rôle de PXR en particulier dans le foie et l’intestin. La génération de souris n’exprimant pas PXR dans le foie ou l’intestin est donc le modèle optimal pour répondre à l’objectif. Ces souris sont de fond génétique C57Bl6J qui est propice à l’étude de l’obésité (prise de poids, diabète, désordres métaboliques, stéatose hépatique) qui mime la mise en place et le développement des désordres métaboliques chez l’homme dans sa globalité. Les animaux utilisés sont juvéniles de sorte à étudier le développement jusqu'au stade adulte.
Rôle de la protéine BIN1 et du transport vésiculaire pour le maintien des tubules T dans l’infarctus myocardique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
336 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue sous anesthésie profonde pour prélever leurs tissus cardiaques. Chacune est intubée, a le thorax ouvert et subit trente minutes de ligature d'une artère coronaire pour provoquer un infarctus, puis passe environ 24 heures isolée sur un tapis chauffant. Le porteur compte 25 % de mortalité liée à l'infarctus et forme ses groupes en conséquence, 15 souris pour en garder 12, afin d'étudier le rôle de la protéine BIN1 dans le maintien des tubules T des cellules du cœur et l'effet de BIN1 ou d'immunosuppresseurs administrés. Pour justifier l'espèce, il écrit que "La souris est un excellent modèle pour la maladie humaine, car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme".
Objectifs
L’objectif de notre projet est d'éclaircir les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant la formation de tubules T des cardiomyocytes dans l’infarctus myocardique. En particulier, nous cherchons à déterminer si BIN1 et le transport vésiculaire ont un effet protecteur sur le maintien des tubules T et la contractilité cardiaque. Nous utiliserons un modèle d'ischémie-reperfusion myocardique chez la souris nous permettant d'étudier l’organisation des tubules T, les taux de BIN1 et de ses partenaires, ainsi que l'effet de l’administration exogène de BIN1 et d’immunosuppresseurs (dexaméthasone, DEX, et rapamycine, RAP) sur la taille de l'infarctus.
Bénéfices attendus
L’infarctus du myocarde (IM) aigu est aujourd’hui une cause majeure de mortalité et morbidité dans le monde. Lors d’un IM, l’occlusion d’une artère coronaire irrigant le cœur prive les cellules musculaires cardiaques (cardiomyocytes) d’oxygène, entrainant une dégradation de ces cellules et une diminution de leur contractilité. En particulier, les invaginations transversales membranaires ou tubules T des cardiomyocytes, essentielles à la contraction au niveau cellulaire, sont altérées. Cependant, ces mécanismes sont pour le moment encore mal compris. En étudiant les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la régulation du réseau de tubules T cardiaques, notre projet permettra de mieux comprendre comment les tubules T sont générés et dégradés, et de déterminer les acteurs clés de ces processus. Il sera ainsi possible de contrecarrer la dégradation des tubules T et de restaurer la contractilité cardiaque en régulant la concentration des acteurs clés. Pendant la durée de ce projet, nous espérons pouvoir identifier les conditions permettant la maintenance des tubules T des cardiomyocytes dans un modèle murin d’ischémie-reperfusion, ainsi qu’une amélioration de la contractilité cardiaque. L’étude de l’administration exogène de BIN1 et d’immunosuppresseurs nous mettrons également sur la voie de futur traitements possibles chez les patients pour maintenir la contractilité cardiaque dans les zones les plus affectées après un IM.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'ischémie/reperfusion myocardique (ligature coronaire). La durée totale de l'intervention chirurgicale est de 60 min, dont 15 min entre l'intubation oro-trachéale et l'accès au coeur, 30 min de ligature coronaire, et 15 min pour la fermeture du thorax. Un prélèvement sanguin terminal de 150 µl sera également effectué au moment du sacrifice des animaux (procédure 1).
Impact sur les animaux
Notre objectif est d’offrir aux animaux la meilleure qualité de vie possible et de garantir que toute nuisance ou souffrance due aux procédures scientifiques soit détectée et réduite le plus rapidement possible. Les nuisances ou effets indésirables suite à l'anesthésie et la chirurgie sont l'hypotension, le refroidissement et la perte de poids. Avant utilisation, une période d’acclimatation d’au moins 7 jours sera respectée après réception des animaux. Pour éviter tout stress, les animaux seront hébergés selon la règlementation en vigueur, dans des cages aux normes suivant leur âge et leur poids en groupe social au sein de l’animalerie en leur mettant à disposition un enrichissement du milieu par des jouets (cabanes, tunnels, papier, coton pour la confection de nids). Avant procédure, une surveillance quotidienne des animaux (observation de l’état général) sera réalisée par le personnel de l’animalerie soignant les animaux, et leur poids sera suivi de façon hebdomadaire par le personnel réalisant les procédures chirurgicales. Après la chirurgie, les animaux seront gardés sous surveillance dans une cage sur tapis chauffant avec enrichissement, eau et nourriture gélifiée en plus de l’alimentation habituelle. Cette surveillance, où l’animal est isolé, dure approximativement 24h, puis les animaux retrouvent leur hébergement en groupe social avec enrichissement, en conservant autant que possible les groupes formés afin de maintenir la stabilité hiérarchique établie. Pendant tout le protocole expérimental, les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel ayant réalisé la procédure chirurgicale grâce à la grille de score des points limites (fiche d’observation, voir annexe) qui est mise en place pour évaluer l’état de l’animal après la chirurgie et mettre en évidence un éventuel point limite. En cas de souffrance de l’animal selon le score obtenu à l’aide de la grille d’évaluation, une nouvelle injection d’antalgique (buprénorphine 0.1mg/Kg) sera réalisée. Au cours de la procédure, la décision de garder les souris en vie sera prise par le responsable du projet en concertation avec le vétérinaire référent et la structure de bien-être animal (SBEA). La mise à mort sera réalisée par un protocole adapté en vue des prélèvements post-mortem.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux sous anesthésie profonde (kétamine/xylazine) pour récupérer les tissus cardiaques pour les analyses de protéines et ARN, pour l'analyse de la taille d'infarctus et l'isolement des cardiomyocytes.
Remplacement
Le remplacement d'animaux ne sera pas possible dans cette etude, car il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative ni de modélisation possible de l'ischémie-reperfusion myocardique
Réduction
Dans le respect de la règle des 3R, nous réduirons le nombre d'animaux à maximum 12 animaux + 25% de mortalité liée à l'infarctus, soir 15 souris par groupe. Ce nombre est basé sur notre expérience. C’est le nombre minimal qui permet d’assurer la robustesse des résultats pour évaluer au mieux les effets de l'ischémie reperfusion myocardique sur , sans qu’il soit excessif en terme d’animaux a inclure. Seules les expériences indispensables seront réalisées et il n’y aura pas de répétition inutile d’expérience.
Raffinement
Nous raffineros cette étude par un hébergement des animaux selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les animaux sont élevés avec une attention particulière (passage d’animalier minimum 2 fois/jour). Les manipulations sont réduites au minimum afin de limiter le stress des animaux. La souffrance de l’animal sera réduite au maximum ou supprimée par l’utilisation d’anesthésique (cocktail kétamine 100mg/Kg /Xylazine 10mg/Kg i.p.) avant la chirurgie et d’analgésique (Buprénorphine 0.05mg/Kg) aux doses appropriées avant la chirurgie, une deuxième injection de Buprénorphine (0.05mg/Kg) est réalisée 6h après le réveil puis une troisième injection 14h après la seconde injection.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour la maladie humaine, car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme. 3 mois (jeunes adultes) pour éviter la sensibilité accrue à l'ischémie liée au vieillissement.
Création de lignées transgéniques murines pour des gènes impliqués dans l’infertilité humaine
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
960 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et 90 réutilisées, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Les femelles reçoivent des stimulations hormonales puis sont tuées pour prélever leurs ovocytes, les mâles subissent une vasectomie chirurgicale et les femelles pseudo-gestantes une réimplantation embryonnaire, pour créer des lignées reproduisant des mutations liées à l'infertilité humaine. Le porteur indique que la préhension, les chirurgies et la mise à mort génèrent du stress et que les lignées au phénotype dommageable seront euthanasiées. Il affirme qu'aucune culture in vitro ne permet d'obtenir des gamètes matures et conclut au recours à la souris.
Objectifs
L'infertilité touche 186 millions de personnes dans le monde (48 millions de couple) et représente donc un problème de santé majeur. Cette infertilité peut etre causée par une déficience au niveau des gamètes aussi bien chez l'homme que chez la femme. Trouver les gènes causals impliqués dans cette infertilité est donc une nécessité afin de pouvoir mieux comprendre leurs mécanismes d'action et proposer des thérapies. L'étude de cohortes de patient(e)s infertiles permet de pointer des gènes potentiellements impliqués. L'objectif de notre étude est donc de générer des animaux déficients pour ces gènes ou reproduisant les mutations identifées afin de valider les gènes candidats.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de générer des souris déficientes pour les gènes identifiés par séquencage exomique des cohortes de patient(e)s infertiles et donc de valider les gènes candidats. A court terme, les gènes pourront être utilisés comme facteurs diagnostiques. A plus long terme, selon le phénotype occassionné, une thérapie ciblée pourra être proposée au patient.
Procédures
Injection pour les stimulations hormonales (2 par souris femelles). Chirurgie sur les males pour la vasectomisation (30 minutes par souris, une chirurgie par souris). Chirurgie pour la réimplantation embryonnaire dans les femelles pseudo-gestantes (20 minutes par souris, 1 par souris).
Impact sur les animaux
Stress au moment de la préhension pour les injections et pour la mise à mort. Stress engendré par la chirurgie, meme si réalisée sous analgésie et anesthésie. Les males vasectomisés et les femelles réimplantées pourront perdre du poids et une inflammation pourra apparaitre au niveau de la plaie.
Devenir
La récupération des gamètes pour l'injection intra-cytoplasmiques de sperme nécessite la mise à mort des femelles. Après vasectomisation, les males sont utilisés pendant plusieurs mois. Suite à l'implantation embryonnaire, les souris pseudo-gestantes donnent naissance aux petits avant d'etre mises à mort ou gardés en vie pour allaitement ou test par les utilisateurs. Si des animaux présentent un phénotype dommageable, nous déciderons soit d'euthanasier la lignée.
Remplacement
L'étude de la fertilité nécessite l'utilisation d'animaux reproduisant les phénotypes observés chez l'homme. Il est donc compliqué de les remplacer. Il n'existe aucun système de culture in vitro permettant d'obtenir des gamètes matures et fécondables (femelle) ou fécondantes (male).
Réduction
Les gamètes femelles utilisées pour l'injection intra-cytoplasmique de spermatozoide sont récupérées suite à la stimulation hormonale des souris, ce qui permet de récupérer un grand nombre d'ovocytes, et donc de réduire le nombre de souris femelles. les males vasectomisés seront utilisés pour générer des femelles peudo-gestantes pendant 1 an.
Raffinement
Les souris seront placées en conditions de température régulée, nourriture et eau ad libitum. Les animaux seront maintenus le moins de temps possible afin d'injecter les hormones nécessaires à la stimulation ovarienne et aux injections d'analgésiant/anesthésiant. La mise à mort des animaux sera effectuée dans une pièce différente de celle de l'hébergement. La chirurgie des mâles est réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Les femelles ont leurs ovocytes prélevés après euthanasie. Suite à la chirurgie, en cas d'inflammation de la plaie, un traitement antibiotique sera mis en place.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour générer des animaux transgéniques. Les souris femelles seront utilisées dès 3 semaines pré-puberts et pas au delà de 12 semaines pour la récupération d'ovocytes. En effet, après 12 semaines, les souris répondent moins bien à la stimuation hormonale et le nombre d'ovocytes récoltés décroit. Les femelles pseudo-gestantes devront avoir eu une portée avant utilisation, donc entre 5 et 12 semaines. Les souris males seront vasectomisés à maturité sexuelle vers 9-10 semaines.
Développement d’un modèle d’arthrite chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
990 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent dans l'articulation de la cheville une ou deux injections de cristaux d'urate ou de carraghénine pour déclencher une crise de goutte, puis le composé à tester, la douleur étant mesurée par le test de von Frey, pour évaluer de nouveaux candidats médicaments d'un partenaire industriel. Le porteur indique que l'arthrite induite peut provoquer une inflammation locale douloureuse, un défaut de toilettage et une baisse de la prise alimentaire. Il affirme que la culture cellulaire ne peut pas explorer ces mécanismes et que la preuve d'efficacité exige un "organisme entier", et revendique le rat comme le plus petit animal permettant une injection articulaire fiable.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de développer un modèle d’arthrite chez le rat afin de tester de futurs candidats médicaments dans la prise en charge de cette pathologie. Dans cette étude, nous évaluerons la pharmacocinétique d’un nouveau traitement dans un modèle d’inflammation aiguë de l'articulation de la cheville. Ce travail cherche à améliorer le traitement des arthrites, en particulier de la crise de goutte, une maladie inflammatoire touchant les articulations. Les crises, souvent très douloureuses, se caractérisent par un échauffement et un gonflement de l'articulation et peuvent durer plusieurs jours. La complexité de ces maladies, dont la composante est multicellulaire, nécessite de pouvoir faire la preuve de concept et d’efficacité dans un organisme entier comme l’animal. Cette étude se fosalise sur le développement de nouvelles formes d’administration d’un principe actif en utilisant des techniques de délivrance locale prolongée du médicament. Nous utiliserons un modèle d’inflammation goutteuse induite par des cristaux d’urate (Monosodium Urate MSU) ou de la carraghénine chez le rat. Un seul inducteur de l'inflammation (MSU ou carraghénine) sera utilisé par étude mais ces 2 agents inflammatoires pourront être testés lors d'études indépendantes. La pharmacocinétique du traitement administré sera déterminée de manière locale (niveau articulaire) mais également de manière systémique (sang). La douleur sera évaluée grâce au test de von Frey. L’utilisation du rat est tout indiquée dans cette étude, et se fera en accord avec la règle des 3R. Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au maximum afin de permettre des analyses statistiques solides. Des points limites destinés à limiter l'inconfort des rats seront mis en place dans chaque expérience et tous les animaux seront pesés et leur comportement surveillé afin de veiller à leur bien-être. Ce projet de recherche nécessitera l'utilisation de 99 rats par étude (15 rats pour l’étude pilote et 84 rats pour l’étude principale). A raison de deux études par an, nous utiliserons 990 rats pour la durée totale du projet. Les procédures expérimentales décrites dans ce protocole étant classées à un grade sévère, elles feront l'objet d'une évaluation rétrospective.
Bénéfices attendus
L'objectif de ce projet est d'évaluer de nouveaux candidats médicament dans le processus inflammatoire de l'arthrite afin d'améliorer la prise en charge des patients et de les traiter de manière durable.
Procédures
Les animaux recevront une ou deux (selon la demande du partenaire industriel) injections intra-articulaire dans l'articulation de la cheville pour induire l'arthrite et une injection intra-articulaire avec le composé à tester. Les injections intra-articulaires durent 30 secondes et se font sous anesthésie isoflurane. Pour évaluer la douleur, les animaux seront soumis à un test qui consiste à appliquer de manière successive des filaments au niveau de la patte de l’animal. Les animaux sont acclimatés au set-up durant 30 minutes suivi par le test de Von Frey pendant 15 minutes. Enfin, sur animal euthanasié, un prélèvement en point final de sang sera effectué au niveau caudal. Un lavage intra-articulaire, et un prélèvement d'organes auront lieu après euthanasie de l'animal pour histologie, analyse cellulaire, moléculaire et fonctionnelle ex-vivo. L'ensemble de ces prélèvement se feront dans les 5 minutes suivant la mise à mort de l'animal.
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables induits par un modèle d'arthrite chez le rat sont le développement d'une réaction inflammatoire au niveau local, une douleur locale pouvant entraîner un manque de toilette (poils ébouriffés), un comportement altéré (vivacité réduite) et une diminution de la prise alimentaire si l'animal a des difficultés à se redresser sur ses pattes. C'est pourquoi les rats seront surveillés quotidiennement post-induction pendant toute la durée de l'étude. L'aspect général et le poids des rats seront évalués post-induction sous la forme d’un score prédictif de la douleur. Des granulés seront déposés dans la cage pour faciliter la prise alimentaire des animaux.
Devenir
A l'issue de l'ensemble du projet les animaux seront mis à mort dans le but d'étudier l'effet et la pharmacocinétique du composé testé sur l'inflammation et la résolution de l'inflammation.
Remplacement
Le remplacement de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible dans ce modèle. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de l'inflammation sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche substitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents pour permettre une recherche fondamentale et appliquée sur l’inflammation tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.
Réduction
Nous avons une approche en deux temps pour bien définir les meilleures conditions d’expérimentation. Une expérience préliminaire permettra de valider le modèle d’arthrite induite. L’étude principale ne sera conduite seulement si les résultats de cette étude pilote confirment la robustesse du modèle permettant ainsi de réduire le nombre de groupes et donc le nombre d’animaux. Le nombre de rats nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour pouvoir interpréter et valider les résultats d’expérience. Le nombre de 8 animaux par condition test correspond à la quantité minimale nécessaire pour cet objectif.
Raffinement
Les rats seront hébergés selon les conditions de la réglementation 2010/63, à raison de 3 animaux par cage maximum, en unités ventilées. Un cycle jour/nuit de 12h/24 est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante à 22°C. Leur environnement sera enrichi (tunnel, buchette) afin d'éveiller leurs sens, leur curiosité, leur activité physique. Les animaux seront pesés et leur aspect général sera suivi quotidiennement et reporté sur une feuille clinique par les animaliers et les expérimentateurs. L’atteinte d’un point limite défini dans la procédure avant la fin de l’expérimentation entrainera l'euthanasie de l'animal. Des granulés seront déposés dans la cage pour faciliter la prise alimentaire des animaux. Enfin, l'ensemble des injections intra-articulaires se feront sous anesthésie isoflurane 3%.
Choix des espèces
Le rat a été choisi car c’est le plus petit animal chez qui il est fiable d’injecter des volumes bien définis et ceux à deux reprises dans un site anatomique aussi précis qu’une articulation. Des rats de 250 à 300g seront utilisés, soit environ 6 à 7 semaines afin d'avoir des sujets adultes avec un système immunitaire mature pour se conformer à l’objectif de l’étude visant à appliquer ces futurs composés sur une population adulte.
Etude de l’implication de la perte des cellules murales vasculaires dans les maladies des petits vaisseaux cérébraux chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
848 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par exsanguination et perfusion intracardiaque, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès la naissance elles reçoivent des injections intragastriques, puis subissent une restriction alimentaire ramenant leur poids à 85 % pendant deux mois et des tests d'équilibre, d'attention et de flexibilité comportementale, pour clarifier le rôle des cellules murales dans les maladies des petits vaisseaux cérébraux. Le porteur reconnaît que la manipulation des nouveau-nés peut provoquer leur cannibalisme par la mère et que la perte de cellules murales peut entraîner lésions cérébrales, troubles moteurs et mort prématurée, tout en qualifiant ces lésions de très bien tolérées. Il affirme ne pas pouvoir substituer au modèle animal une approche in vitro ou informatique.
Objectifs
Les vaisseaux sanguins sont des conduits qui transportent le sang dans l'organisme. Ils sont schématiquement constitués de l'intérieur vers l'extérieur d'une monocouche interne de cellules endothéliales en contact avec le sang et d'une ou plusieurs couches de cellules murales permettant la contraction ou la dilatation du vaisseau. Dans le cerveau, il existe au moins 3 grands types de vaisseaux: les artères/artérioles, les capillaires et les veines. Les cellules endothéliales et les cellules murales présentent des caractéristiques moléculaires, histologiques et fonctionnelles qui différent en fonction du type de vaisseau. Les maladies des petits vaisseaux cérébraux sont définies par la présence de lésions structurales ou fonctionnelles des cellules endothéliales ou des cellules murales. Elles sont responsables chez l'homme d'environ un tiers des accidents vasculaires cérébraux, de lésions de la substance blanche diffuse, de microsaignements, d'une atrophie cérébrale et sont une cause majeure de déclin cognif. IL n'existe à ce jour aucun traitement spécifique pour ces maladies, une des raisons étant que les mécanismes physiopathogéniques de ces maladies sont encore très mal connus. Des données de la littérature suggèrent que la perte des cellules murales joue un rôle important dans le déterminisme de ces maladies mais il existe des données contradictoires quant à l'implication des cellules murales des artères versus celles des capillaires. L'objectif de ce projet est de clarifier l'implication des cellules murales de ces différents types de vaisseaux cérébraux dans les différentes manifestations cliniques des maladies des petits vaisseaux cérébraux chez la souris.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet de recherche fondamentale permettront de clarifier de façon définitive le rôle respectif de la perte des cellules murales des artères, des capillaires et des veines dans la symptomatologie des maladies des petits vaisseaux cérébraux. S'il s'avère comme nous le pensons que la perte des cellules murales des artères joue un rôle déterminant dans ces maladies, nos résultats conduiront à une ré-orientation des travaux de recherche dans ce domaine et à l'exploration de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
3 injections intragastriques quotidiennes après la naissance (durée 10 min/injection). Restriction alimentaire visant à réduire le poids à 85% du poids initial d’une durée maximale de 2 mois, de l’âge de 4 à 6 mois et de l’âge de 10 à 12 mois. Tests de comportement d'une durée de 5 min à 1 heure / jour pendant 2 mois, de l’âge de 4 à 6 mois et de l’âge de 10 à 12 mois. 1 injection intraveineuse 6 heures avant la mise à mort (durée de l'injection 10 min). Mise à mort par exsanguination et perfusion intracardiaque (durée 30 min).
Impact sur les animaux
La manipulation des nouveaux nés en vue de la réalisation des injections intragastriques de tamoxifène pourrait conduire au cannibalisme par la mère mais ceci peut être très largement évité en soupoudrant les souriceaux de sciure de la cage après leur manipulation. La perte des cellules murales des vaisseaux peut conduire à des lésions histologiques du cerveau, des troubles moteurs et la mort prématurée de la souris mais dans notre expérience ces lésions sont extraordinairement bien tolérées chez la souris car d'apparition très progressive. La restriction alimentaire pourrait conduire à une perte de poids supérieure à celle souhaitée (environ 85% du poids original) mais pour prévenir celà les souris seront pesées tous les jours.
Devenir
mise à mort par exsanguination et perfusion transcardiaque de fixateurs. La perfusion intracardiaque de fixateurs permet de fixer le cerveau in situ avant son prélèvement et donc de préserver la morphologie des tissus et des vaisseaux du cerveau , ce qui est indispensable dans notre projet.
Remplacement
La complexité des interactions vaisseaux –cerveau- débit sanguin fait qu’il est fondamental d’étudier ces anomalies sur l’animal vivant, soumis à l’ensemble des systèmes régulateurs, de façon parfaitement intégrée. De plus, la complexité de ces interactions fait qu’on ne sait pas modéliser correctement ce système in vitro. Pour ces raisons, nous ne pouvons pas substituer au modèle animal un modèle in vitro ou computationnel.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux, seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées. Les mêmes animaux seront utilisés pour étudier différents aspects de la symptomatologie des maladies des petits vaisseaux cérébraux. Plus spécifiquement, les mêmes animaux seront utilisés pour examiner l’équilibre et la cognition de l’âge de 2 à 12 mois et la présence de lésions des vaisseaux et du cerveau à 12 mois. Comme il n’est pas recommandé de réaliser chez la même souris 2 tests cognitifs distincts qui requièrent plusieurs semaines d’apprentissage et que les modalités de conservation du cerveau prélevé après la mise à mort pour l’analyse des lésions en histologie et en immunohistochimie sont très différentes de celles requises pour l’étude en IRM qui requière le prélèvement de la tête entière, nous utiliserons une première série d’animaux chez lesquels seront analysés les processus attentionnels et les lésions du cerveau en IRM et une deuxième série d’animaux chez lesquels seront analysés la flexibilité comportementale et les lésions du cerveau en immunohistochimie. De plus, les analyses en histologie et en IRM seront réalisées de façon séquentielle. Nous commencerons pour chaque modèle par l’analyse des souris de 12 mois. L’analyse des souris âgées de 6 mois ne sera effectuée que si nous détectons des lésions à 12 mois ; idem pour les souris âgées de 2 mois qui ne seront analysées que si nous détectons des lésions à 6 mois. Nous ne pouvons pas fournir de calcul de puissance puisque les souris avec les génotypes décrits dans cette saisine n’ont encore jamais été explorées avec les tests proposés dans cette saisine. En revanche, nous avons calculé la taille des échantillons en nous basant sur des jeux de données collectées au cours d’expériences précédentes similaires mais avec des souris de génotype différent. 10 Males et 10 femelles par groupe sont suffisants pour détecter la présence de lésions en histologie ou en IRM. 20 males et 20 femelles par groupe sont suffisants pour détecter la présence de troubles de l’équilibre ou de la cognition.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe sociaux dans des cages enrichies afin d’éviter le stress lié à l’isolement. Les injections intragastriques sont réalisées, entre jour 1 à 3 après la naissance quand l’estomac des souriceaux est facilement identifiable du fait de sa couleur blanchâtre et avant l’apparition de la pigmentation de la peau. La restriction alimentaire, nécessaire pour la réalisation de certains tests du comportement, aura pour objectif d’obtenir une réduction du poids de la souris de 15% par rapport à son poids initial. Elle sera étroitement surveillée par la pesée quotidienne de la souris et l’apport de nourriture sera adapté individuellement afin de maintenir le poids à 85% du poids initial. La durée de la restriction alimentaire n’excédera pas 2 mois et ne sera renouvelée au maximum qu’une fois. Les injections intraveineuses seront réalisées sous analgésie. La mise à mort sera effectuée sous analgésie et anesthésie générale profonde. Nous veillerons au bienêtre des animaux en mettant en place une grille de score et en utilisant des points limites adaptés, un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de souffrance. Tout signe de douleur, souffrance, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé au préalable avec des analgésiques.
Choix des espèces
La souris est un animal vertébré chez lequel, d'une part, l'organisation du système vasculaire cérébral est assez proche de l'homme et d'autre part les manipulations génétiques sont aujourd’hui réalisables. Ces manipulations génétiques sont indispensables pour la réalisation de ce projet. Elles permettront de déléter des populations spécifiques de cellules murales vasculaires. La majorité des animaux utilisés seront des souris jeunes âgées de 2 mois à souris âgées de 12 mois car il est nécessaire de pouvoir analyser la progression des lésions au cours de la maladie. Un nombre limité d'animaux seront analysées à l’âge de 18 jours afin de valider le modèle expérimental.
Comprendre le rôle de MKP1 dans les troubles de l’humeur induits par le stress et la douleur chronique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Elles subissent une chirurgie ou des séances de stress répété allant jusqu'à une heure par jour pendant 21 jours, suivies de tests comportementaux dont le porteur ne précise pas la nature, pour évaluer le rôle d'une protéine dans la dépression. Le porteur indique que les symptômes anxiodépressifs et la sensibilité mécanique induits ne seront pas soulagés parce qu'ils sont l'objet de l'étude. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne peut reproduire ce modèle intégré et conclut au recours à la souris.
Objectifs
Affectant approximativement entre 8% et 20% de la population mondiale, la dépression est l’un des plus grands enjeux de ce siècle en matière de santé publique. Récemment, plusieurs études chez l’Homme et chez l’animal ont suggéré que la protéine MKP1 pourrait jouer un rôle dans la dépression. Grâce à ce projet, nous pourrons évaluer l’implication de cette protéine dans le développement de la dépression dans les deux sexes dans différents modèles de dépression et déterminer si cette protéine pourrait être une cible thérapeutique intéressante pour de futurs traitements personnalisés des troubles dépressifs.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est double : 1) étudier l’implication de la protéine MKP1 dans l’établissement de la dépression dans 3 modèles de dépression d’étiologies différentes et 2) comparer le rôle de cette protéine chez les mâles et les femelles, qui ne sont pas égaux face au développement de symptômes dépressifs. A l’issue de ce projet, nous serons en mesure de déterminer si MKP1 est impliqué dans le développement de la dépression quel que soit les facteurs conduisant à cette pathologie. De plus, nous pourrons déterminer si MKP1 est un mécanisme commun dans le développement de la dépression à la fois chez les mâles et les femelles. Cette avancée pourrait permettre de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques de la dépression, potentiellement différentes chez le mâle et la femelle et selon l’origine des symptômes dépressifs.
Procédures
Les animaux seront uniquement soumis à l'induction du modèle et aux différents tests comportementaux. Un groupe d'animaux subira une procédure chirurgicale de 15min + 4 tests comportementaux (répartis sur 2 semaines), un autre groupe subira 1h de stress par jour sur 21 jours + 5 tests comportementaux (3 de 5 min, 1 de 6 min et 1 de 24h) et un dernier groupe subira 10 min de stress par jour sur 5 jours + 3 tests comportementaux ( 2 de 5 min chacun, 1 de 10 min).
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent développer des symptômes anxiodépressifs que nous ne pouvons pas soulager puisqu’il s’agit de l’objet de l’étude. À la suite de la procédure chirurgicale, les animaux présenteront une sensibilité mécanique qui ne peut être soulagée puisqu'il s'agit de l'objet de l'étude, ainsi qu'une légère difficulté de déplacement qui disparaitra en 48-72h.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort, afin de prélever leur cerveau pour effectuer les analyses moléculaires d'intérêt.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress et la douleur chronique chez l’animal, comme modèles de pathologie psychiatrique humaine, est un processus intégré et repose sur l’observation du comportement de l’animal vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par modèle et condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Pour cela, nous réalisons plusieurs types d’études sur la même cohorte d’animaux. Les expériences seront également réalisées par petit groupes d’animaux afin qu’elles puissent être stoppées dès l’obtention de résultats statistiquement fiables et robustes. Ainsi, le nombre d'animaux indiqué par groupe ne correspond pas au nombre total d’animaux réellement utilisés mais à un nombre maximum.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cage collective afin de respecter leurs besoins sociaux. Les chirurgies sont effectuées sous anesthésie générale et analgésie (sans que l'animal ne ressente de la douleur). En post-chirurgie, les animaux seront quotidiennement surveillés afin de contrôler leur bien-être et de mettre en place une analgésie si besoin. A chaque étape de l'étude, nous avons établi des points limites nous permettant de soustraire l'animal à la souffrance. Si de nouvelles approches bénéfiques pour le bien-être de l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la Structure chargée du bien-être animal de l’institut pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Les modèles utilisés ne sont caractérisés que chez la souris, c'est pourquoi nous utilisons cette espèce. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (critères: début des procédures à au moins 7 semaines, poids supérieur à 20g pour les mâles et 15g pour les femelles). En se référant aux précédentes expériences réalisées au laboratoire, nous ne réaliserons pas ces modèles sur des souris âgées de plus de 6 mois.
Etude de l’impact de l’âge et du déclin des tissus adipeux sur les flux métaboliques à l’échelle de l’organisme EU1/2
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
972 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles sont soumises à des régimes gras, à des restrictions alimentaires ou à des températures de 4 à 30 °C, reçoivent des substrats marqués et subissent une chirurgie d'une à deux heures pour poser un cathéter veineux. Le porteur indique que les effets attendus sont une perte de poids et des douleurs liées à la chirurgie. Il affirme que le recours à l'animal reste "indispensable" pour étudier les échanges de métabolites entre organes au cours du vieillissement.
Objectifs
Avec l'augmentation de l'espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes afin qu'elles puissent être autonomes le plus longtemps possible représente un enjeu majeur de santé publique. Le vieillissement se caractérise par une diminution de la capacité de l’organisme à répondre aux facteurs de stress auquel il est soumis et à maintenir l'homéostasie. L’altération du métabolisme cellulaire, tissulaire et de l’organisme entier serait un des facteurs déterminants dans les pertes de fonction liées à l’âge. L’homéostasie énergétique est un état d’équilibre dynamique entre les dépenses et les apports d’énergie, qui est fondamental pour le maintien de la stabilité du milieu intérieur d’un organisme et des constantes vitales. Le contrôle de l’homéostasie énergétique repose sur la coopération métabolique entre plusieurs organes ce qui permet à l’organisme de s’adapter aux différents stress métaboliques auquel il est soumis toute au long de la vie. Cependant, des arguments de la littérature suggèrent que cette coopération métabolique est altérée avec l’âge et que ceci pourrait contribuer à la mise en place de désordres métaboliques. Parmi les organes impliqués dans le maintien de l’homéostasie énergétique et impactés de manière précoce au cours du vieillissement, les tissus adipeux (blancs, bruns, beiges), dont la complexité cellulaire, l’hétérogénéité et la plasticité sont aujourd’hui de mieux en mieux décrits, jouent un rôle déterminant. Nous pensons que le déclin de ces tissus adipeux au cours de l’âge pourrait contribuer à la perte de la flexibilité métabolique de l’organisme et pourrait induire une modification des flux métaboliques à l’échelle de l’organisme. Cette redistribution des flux métaboliques pourrait avoir des conséquences notables sur le métabolisme et le fonctionnement de différents organes, ainsi que sur l’homéostasie énergétique de l’organisme entier. Afin de caractériser ces flux de substrats in vivo, nous utiliserons des approches de traçage isotopique. Ceci correspond à l’injection chez la souris de substrats marqués par des isotopes lourds stables non radioactifs (13C, 15N, 2H, etc…). L’analyse de l’incorporation des carbones C13 par exemple dans les différents organes sera réalisée par des approches de spectrométrie de masse et de résonance magnétique nucléaire (RMN). Ceci permettra de déterminer le devenir métabolique du substrat injecté et de calculer les flux de métabolites à l’échelle de l’organisme.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’obtenir des données de métabolomique et de fluxomique à l’échelle de l’organisme dans un contexte de vieillissement et d’établir une cartographie des flux métaboliques au sein de différents organes au cours de l’âge. Il permettra également d’étudier le rôle des tissus adipeux dans les modifications des flux métaboliques systémiques. Ces données permettront de mieux comprendre les processus métaboliques qui contribuent à la perte de flexibilité métabolique de l’organisme au cours l’âge et de mettre en évidence des biomarqueurs et/ou des cibles thérapeutiques d’intérêt afin de vieillir en bonne santé.
Procédures
Les souris seront soit soumises à une régime riche en graisse pendant 10 semaines, soit soumises à un régime riche en graisse (10 semaines) suivi d'un accès restreint dans le temps à la nourriture pendant 2 mois, soit hébergées à une température de 30°C pendant 2 mois, soit hébergées à une température de 4°C pendant 10 jours puis des substrats leur seront injectés à l'aide d'une seringue sous forme de bolus (injection unique en intrapéritonéal ou en intraveineux au niveau de la veine caudale) ou par perfusion lente pendant 3 heures. Pendant la perfusion nous procéderons à des prélèvements sanguins réguliers au niveau de la queue (20 à 30 secondes par prélèvement) sans dépasser un volume de 200μl pour une souris de 25g. Les souris perfusées subiront au préalable une chirurgie (1 à 2 heures d'intervention) sous anesthésie et traitement analgésique afin de poser un cathéter au niveau d'une veine et relier ce cathéter à un dispositif positionné sur le dos.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables potentiel seront une perte de poids et des douleurs lièes à la chirurgie réalisée pour poser un cathéter au niveau d'une veine.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort au terme de chaque procédure afin de prélever le sang, les organes et tissus.
Remplacement
Notre projet consiste à étudier les flux de substrats entre différents tissus. Bien qu'un volet de notre projet ait déjà été réalisé sur des cellules cultivées, aucune technique de remplacement du modèle animal n’existe à ce jour. Il s'agit d'une étude intégrée à l'échelle de l'organisme impliquant des échanges de métabolites entre différents tissus ayant des spécificités bien distinctes. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche.
Réduction
Au regard de la bibliographie, 6 souris par condition pour des études de devenir de substrats marqués sont classiquement utilisées. Les tissus et organes prélevés seront utilisés non seulement pour étudier le devenir de ces substrats au sein des tissus et organes mais aussi pour des analyses d'expression des gènes et biochimiques (mesures d’activités enzymatiques par exemple). Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus (lyophilisation, pulvérisation) qui nous permettront, à partir de la même poudre, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet.
Raffinement
Une surveillance des souris sera réalisée tous les jours au cours des différentes procédures par les personnels de la zootechnie et 2 fois par semaine par une personne impliquée sur le projet, ceci permettant de mettre à mort les animaux ou de les écarter du protocole en cas de comportements anormaux ou de souffrance. Les points limites sont : perte de poids rapide (20% en quelques jours), prostration, poil hirsute, dos rond, ou tout autre signe clinique, jugé par le technicien expérimenté, comme indiquant un état de souffrance. Chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience. Pour les procédures impliquant la pose d'un cathéter, un protocole médicamenteux (solution réhydratante, analgésique et anti-inflammatoire) sera mis en place avant, pendant et après l'opération afin d'éviter la perte de poids et les douleurs. De plus le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage après l'opération grâce à un dispositif empêchant les souris d'abimer le cathéter ou de s'automutiler. Nous enrichirons également l’environnement de toutes les souris, favorisant le bien-être de l’animal.
Choix des espèces
Nous avons décidé de travailler sur la souris puisque cette espèce présente des souches possédant des profils métaboliques différents et qui nous paraissent tout à fait appropriées pour le développement du projet scientifique. La souris représente l'espèce animale pour laquelle l’exploration fonctionnelle métabolique est la plus aboutie. Nous avons aussi une grande expertise dans la manipulation de cette espèce et aussi l’accès à des modèles génétiques de souris invalidées pour des transporteurs de métabolites ou des enzymes clés du métabolisme. Enfin, nous travaillons sur le vieillissement, la souris permet de réduire le temps d'expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (1 à 3 ans) comparée au Rat (2 à 3.5 ans) ou au cobaye (4 à 8 ans). Pour cette étude, nous utiliserons uniquement des souris mâles (des résultats d’expériences préliminaires n’ont pas montré de différences significatives entre les deux sexes) à différents âges (2, 12 et 24 mois correspondant aux âges jeune, adulte, âgé) afin de caractériser les flux métaboliques au cours du vieillissement. Pour les approches nutritionnelles (régime riche en graisse et restriction calorique), elles seront réalisées chez des souris de 2 et de 12 mois, afin de déterminer si l’âge affecte la plasticité métabolique et la redistribution des flux métabolique suite à ces stress. Il en sera de même pour les souris exposées au froid. La thermo-neutralité sera réalisée uniquement sur des souris de 2 mois pour minimiser le nombre d’animaux.
Système Nerveux Central- Evaluation de l’activité cérébrale par mesures électrophysiologiques.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 660
810 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Ils subissent une chirurgie de une à deux heures pour implanter des électrodes dans le cerveau, puis reçoivent des substances dont l'activité électrique cérébrale est enregistrée, une partie étant tuée en fin d'étude et d'autres réutilisées. Le porteur indique que l'implantation peut causer douleurs, infections de la plaie et troubles du transit, et que les animaux sont isolés après l'opération. Il précise que ces études sont "principalement réalisées pour des clients du secteur privé pharmaceutique".
Objectifs
D’un point de vue scientifique: le projet consiste en l'utilisation de techniques permettant de tester l'innocuité et l'efficacité de substances pharmacologiques en développement sur l'activité cérébrale chez le rongeur. L'activité électrique cérébrale peut être évaluée sur un animal anesthésié ou vigile en fonction des tests/modèles utilisés. Les études sont principalement réalisées pour des clients du secteur privé pharmaceutique. Ces études sont validées par les directeurs d'étude et la direction du site d'essai. D’un point de vue réglementaire, les études sur l'évaluation de l'activité cérébrale ne font par partie des études réglementaires selon les recommandations de l'ICHS7a pour évaluer la sécurité d'un nouveau candidat médicament. Néanmoins, ces études d'électrophysiologie peuvent compléter le dossier lorsque des effets adverses sont observés sur le comportement de l'animal.
Bénéfices attendus
La recherche de nouvelles thérapies est indispensable pour améliorer les conditions ainsi que l’espérance de vie des patients atteints de maladies neurologiques. A l'heure actuelle, il n'existe pas de traitements curatifs pour lutter contre la maladie d'Alzheimer. La recherche de substances améliorant les performances cognitives reste une priorité. Des efforts de recherche sont également réalisés pour trouver de nouvelles thérapies dans le cas des maladies psychiatriques, des troubles du sommeil ou des migraines/céphalées. Les traitements actuels ne sont pas suffisamment actifs ou induisent de forts effets secondaires chez les patients. L'innocuité de nouveaux candidats médicaments sur le système nerveux central peut également être évaluée par des mesures électrophysiologiques.
Procédures
L'enregistrement de l'activité cérébrale chez l'animal vigile nécessite une intervention chirurgicale sous anesthésie générale (entre 1h30 et 2h de chirurgie par animal) afin de placer des électrodes épidurales ou dans des régions cérébrales situées en profondeur (procédure pour mesurer l'électroencéphalogramme et le rythme circadien). Une période de récupération d'environ 2 semaines est nécessaire suite à la chirurgie. Pour les tests, les animaux sont administrés par voie orale ou par voie systémique (en standard, par voie intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutanée). Chaque addministration est réalisée en bolus sur quelques secondes. Un transmetteur est placé sur la tête des rats et l'implant est activé chez la souris. Le modèle de propagation d'ondes dépolarisantes est réalisé sur animal anesthésié. L'animal est donc placé sous anesthésie gazeuse pendant toute la durée du test puis ce dernier est euthanasié.
Impact sur les animaux
Des douleurs peuvent être liées à l'implantation d'électrodes au niveau cérébrale. Suite à la chirurgie, les animaux sont isolés pour protéger le connecteur semi-externe incluant les électrodes. Les animaux peuvent perdre du poids ou une plaie peut se former au niveau de l’implant en raison d'une infection post-chirurgicale. Dans certains cas, on peut observer le gonflement de l'abdomen lié à un ralentissement du transit intestinal/constipation post-chirurgicale.
Devenir
Les rongeurs peuvent être réutilisés pour une seconde étude pour les tests sur la mesure d'activité cérébrale ou de veille-sommeil. Pour la propagation d'ondes dépolarisantes, les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque expérience car il n'est pas possible d'assurer une récupération et de bonnes conditions de vie des rongeurs après la chirurgie nécessaire aux études.
Remplacement
Des modèles alternatifs ont été développés au laboratoire mais ne permettent qu'une modélisation partielle de la maladie. Par exemple, l'effet de traitements sur la mémoire peut être évalué sur des tranches cérébrales afin de limiter le nombre d'animaux utilisés et sélectionner les meilleurs candidats médicaments. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux) permettant ainsi l’observation des effets de substances pharmacologiques sur l'activité cérébrale d'un réseau neuronal complet (encéphale) et sur des tests cognitifs.
Réduction
Dans ce projet, les animaux seront réutilisés plusieurs fois afin de limiter leur nombre pour une même étude. Les analyses statistiques sont également affinées pour utiliser le nombre minimum d'animaux. Pour la mesure de l'activité cérébrale par bandes de fréquence, chaque animal est testé en situation contrôle puis suite à l'administration d'un traitement. Les données appariés sont comparés avec un test de Wilcoxon. Pour le test de veille-sommeil et la propagation d'ondes dépolarisantes, les données sont analysées par un test de Student apparié. Des prélèvements de sang ou d'organes peuvent être également ajoutés pour compléter les analyses et éviter l'utilisation d'autres animaux.
Raffinement
Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la souffrance chez l'animal. Une analgésie est assurée avant le début de la chirurgie et pendant les 48 heures après l'opération pour les procédures avec une implantation d'électrodes intra-cérébrales. Une substance analgésique locale est également appliquée sur le crâne de l'animal pour limiter la douleur. Enfin, un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement de l'oeil. Lors de la chirurgie, la surface du cerveau peut être endommagée lorsque le crâne est percé et induire une hémorragie. Si l'hémorragie ne cesse pas après l'application de tampons absorbants, l'animal sera euthanasié. Pour les 2 procédures avec réveil, les animaux vont être pesés suite à la chirurgie pour évaluer leur récupération. Un rat montrant une perte de poids supérieure à 15%, le poil hérissé ou encore le manque de toilettage sera euthanasié. Au niveau de l'implant, une plaie peut se former. Dans ce cas, l’animal est désinfecté quotidiennement avec une solution antiseptique. Un antibiotique peut être administré, le cas échéant. La chirurgie peut entrainer le gonflement de l'abdomen, lié à un ralentissement du transit intestinal/constipation. De l'huile naturelle (huile de maïs par exemple) peut être administrée pendant plusieurs jours, une à 2 fois par jour, pour limiter la douleur chez l'animal et éviter l'occlusion intestinale. Dans certains modèles, l'enregistrement de l'électroencéphalogramme permet de compléter l'analyse comportementale et raffiner le modèle. L'enregistrement des signaux est réalisé par télémétrie (transmission de signaux entre un transmetteur et un receveur) ce qui permet à l'animal de ne pas être attaché à un câble pendant les mesures. Les conditions d'hébergement sont également optimisées avec la présence d'un enrichissement adapté (bois à ronger par exemple). Les animaux isolés sont hébergés dans des cages transparentes leur permettant de voir leurs congénères.
Choix des espèces
Les études de mesure de l'activité électrique cérébrale sont effectuées chez le rongeur (souris ou rat) car ces modèles sont translationnels. Les substances mises sur le marché pour traiter les troubles psychiatriques ou du sommeil ont été découverts en utilisant des modèles chez le rongeur. Les rongeurs (rats, souris) sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique. Ces procédures décrites dans ce projet peuvent être utilisées de façon longitudinale sur des rongeurs sevrés (âgés de 3 semaines) jusqu'à l'âge adulte.
Etude de molécules pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux dans le modèle d’ischémie thrombotique chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 552 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur provoque un AVC par application de chlorure de fer sur une artère cérébrale, suivi d'une IRM sous anesthésie, de tests comportementaux non détaillés et d'une ponction cardiaque terminale. Le porteur indique que le modèle entraîne un déficit sensorimoteur et des lésions cérébrales, avec pertes d'équilibre et faiblesse musculaire possibles. Il juge "indispensable" de développer de nouvelles stratégies face à un traitement actuel inefficace sur les caillots riches en plaquettes.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de tester quatre stratégies thérapeutiques dont leurs mécanismes d’action est susceptible d’agir sur différentes phases de l’AVC : la phase aigüe (24h) pour limiter la lésion et la phase inflammatoire qui s’installe les jours suivants. L’effet de nos quatre stratégies thérapeutiques seront évalués en utilisant un modèle d’AVC thrombotique chez la souris par administration intrapéritonéale (i.p), par administration intra veineuse ou bien par voie orale (per-os), pour chaque traitement. Nous chercherons également à comparer l’effet de ces stratégies thérapeutiques à 3 doses différentes afin de déterminer laquelle permet d’obtenir une réduction du déficit moteur ainsi que du volume lésionnel.
Bénéfices attendus
L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Cependant, le tPA n’a aucune efficacité sur un caillot riche en plaquettes. Ainsi, il parait indispensable de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes visant à traiter efficacement cette pathologie. L’objectif de ce projet est de tester quatre stratégies thérapeutiques par 3 voies d’administrations différentes afin d’étudier la diminution des volumes lésionnels ainsi que l’augmentation de la récupération fonctionnelle après un AVC. Ces stratégies thérapeutiques sons susceptibles d’agir sur la lyse d’un caillot riche en plaquettes. Nous utiliserons donc un modèle d’infarctus cérébral thrombotique qui reproduit au mieux la physiopathologie de l’AVC permettant une meilleure transposabilité des résultats obtenus vers la clinique.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin de pouvoir appliquer une solution de chlorure de fer (FeCl3 ; 20 %), provoquant ainsi l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (ACM). Cet acte chirugical durera 20 minutes. La pose d’un cathéter en veine caudale sera nécessaire pour l’infusion des traitements. Une moyenne de 5 minutes est à prévoir pour cette pose. A J+1, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 11 minutes et suiveront une série de test comportementaux s'étalant de J+1 à J+14 post AVC. Un total de 56 minutes est prévu pour l'ensemble des tests comportementaux. Enfin, à la fin du projet, un prélèvement de sang par ponction cardiaque sera réalisé avant perfusion permettant la fixation du cerveau avant prélèvement. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes minutes pour les différents prélèvements. Les procédures douloureuse (chirurgie, perfusion) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie.
Impact sur les animaux
Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion. Néanmoins, le modèle utilisé ici affecte une région du cerveau ne causant pas d’effets délétères sur le long terme : l’animal peut continuer à s’alimenter, s’abreuver ou encore se fabriquer un nid.Nous pouvons nous attendre à déceler sur certains animaux des signes de complications et de détresse postchirurgicales tels qu'une absence de réaction aux stimuli, une inactivité de l'animal dans sa cage ou encore une perte de poids suite à un arrêt de la prise alimentaire. Les situations précédemment citées définissent nos points limite à appliquer pour ce projet. Nous surveillerons à ce qu'ils ne soient pas dépassés. Aucune nuisances n'est attendues concernant l'administration des traitements, les test comportementaux ainsi que pour l'examen IRM.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.
Remplacement
Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo qui fait suite aux nombreuses validations réalisées in vitro, et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que de tester ces stratégies thérapeutiques chez l'animal. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que la souris est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, la souris est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. D’un point de vue statistique, nous avons déterminé que le nombre idéal d’animaux par groupe est de 12. En effet, ce nombre est reconnu pour réduire au maximum le nombre d’individus, tout en conservant la pertinence scientifique et la significativité statistique.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les souris seront en groupes sociaux avec plusieurs enrichissements, auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique administrée 15 minutes avant incision. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. Pour limiter les douleurs liées aux barres d’oreilles au niveau du conduit auditif, une anesthésie locale est appliquée. La température corporelle de l’animal est maintenue à 37.5 ± 0.5°C grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée, et une couverture isothermique sur son dos limite les pertes de chaleur. Chaque site d’incision de peau fait appel à une tonte préalable du pelage, à une désinfection et enfin l’application d’une analgésie locale. Lors de la phase de réveil,de l'oxygène sera administré pour permettre une meilleure récupération post-opératoire. Les animaux seront placés dans une cage individuelle chauffée à 28°C pendant 2 heures avant d’être remis en cage par 5. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, nous constaterons un dépassement des points limites précédemment fixés, l’animal sera mis à mort. Enfin, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant les jours suivants l’opération. Il pèsera chaque animal et veillera à ce que les points limites ne soient pas dépassés.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la protection, la perfusion cérébrale ainsi que le devenir des lésions induites par un AVC thrombotique. Les animaux utilisés seront âgés de 10 semaines soit un poids de 35g pour les SWISS et de 25g pour les C57BL6J. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.