Rongeurs

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Elles sont sensibilisées puis exposées à un allergène d'acarien par voie intranasale, ce qui peut provoquer inflammation pulmonaire et difficultés respiratoires, avant une ponction cardiaque terminale sous anesthésie, pour étudier le rôle de la protéine PCSK9 dans l'asthme allergique. Le porteur décrit une grille de points limites déclenchant l'injection de buprénorphine ou la mise à mort. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne permet d'évaluer ce traitement et que seul un modèle murin asthmatique le rend possible.

Objectifs

Ayant déjà débuté un projet sur l’étude de PCSK9 dans l’allergie alimentaire, nous souhaitons continuer cette approche et vérifier l’impact de celle-ci dans un contexte d’asthme allergique. De plus, il n'existe pas de méthodes alternatives d'étude des mécanismes appondis de PCSK9 et de l'allergie respiratoire. Le modèle PCSK9 KO associé à l’allergie respiratoire n'est que peu ou pas décrit dans la littérature. C'est pourquoi un modèle d’allergie respiratoire à l’acarien permettra de se rapprocher de la physiopathologie présente chez l'homme tout en évaluant les effets de l'absence ou non de PCSK9 sur l'inflammation.

Bénéfices attendus

Actuellement, aucun traitement ne permet soigner la cause de l’asthme allergique, de plus, les effets secondaires liés aux corticoïdes sont notables et la désensibilisation n’est pas efficace chez tous les patients. PCSK9 devient une cible de plus en plus privilégiée dans le cadre de maladies inflammatoires, de plus, notre première étude sur le traitement anti-PCSK9 soigne les symptômes de l’allergie alimentaire chez la souris. Étant donné les fortes similitudes entre l’asthme allergique et l’allergie alimentaire, nous pensons que le traitement anti-PCSK9 chez des souris asthmatiques sera bénéfique.

Procédures

Les souris sont soumises à des sensibilisations par voie percutanée ( 4 sensibilisations de 45 minutes), et à des déclenchements par voie intranasale (2 déclanchements de 45 minutes). A la fin du protocole, un prélèvement du sang terminal sera effectué par ponction intracardiaque après anesthésie sous isoflurane.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont une perte de poids, une inflammation pulmonaire ou difficultés respiratoires au moment des challenges intranasaux.

Devenir

A la fin du protocole d'allergie au jour 35 post sensibilisation, toutes le souris seront mises à mort pour analyses. Les souris seront anesthésiées à l’isoflurane et un maximum de sang sera prélevé.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle cellulaire permettant d’évaluer le bénéfice du traitement anti-PCSK9 dans le cadre de l’asthme allergique. Seul un modèle murin asthmatique nous permettra de mesurer l’amélioration des symptômes via ce traitement et comprendre les effets de PCSK9 dans la physiopathologie de l’asthme. Les principes de raffinement et de remplacement contribuent à réduire le nombre d’animaux utilisés tout au long du protocole. Le projet étudiera l’allergie respiratoire dans des modèles déjà établis dans le laboratoire.

Réduction

Le modèle animal utilise a été soigneusement conçu et évalué pour permettre de réduire au maximum le nombre d’animaux du fait de la connaissance et la précision des paramètres observés selon la règle des 3R. Le projet étudiera l'allergie respiratoire dans des modèles déjà établis dans le laboratoire. Un test non paramétrique et non apparié de type Student test, Mann-Whitney ou une analyse de la variance par un test de Bonferroni sera realisé. Une p-value inferieur a 0.05 sera considérée comme significative.

Raffinement

Au cours de la procédure d’induction de l’asthme allergique, les souris sont anesthésiées sous isoflurane. Elles sont surveillées jusqu’à leur réveil. Durant la phase de réveil les souris elles sont placées sur un tapis chauffant afin de limiter l’hypothermie et sont hébergées en groupe dans des cages enrichies par des frisottis ou une petite maison en carton. Une observation quotidienne des souris sera effectuée, et les souris seront pesées 3 fois par semaine ce qui permettra de détecter tout changement de comportement. Si une souffrance de l’animal est détectée et jugée trop importante, alors la souris sera euthanasiée sans délai. Si un seul signe clinique spécifique ou 2 signes notables sont détectés alors le responsable du SBEA et le responsable de l’étude seront prévenus et la souris sera sacrifiée sans délai. Les signes spécifiques et notables sont les suivants : - Notables : Aspects extérieur : Pelage sale, Position recroquevillée à la manipulation Réticent à se déplacer, Zone urogénitale souillée, respiration difficile Évolution pondérale : Perte de poids10% En présence d'un signe notable: administration de buprénorphine à 0,1 mg/kg en sous-cutanée 2 fois/jour.

Choix des espèces

Au cours de cette étude seront utilisées des souris de souche C57/Bl6 et Balb/c. Ces souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire et du métabolisme lipidique du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. Des analyses phénotypiques des populations lymphocytaires et métaboliques seront réalisées. L’utilisation de souris nous donne accès à de nombreux outils immunologiques, notamment les anticorps nécessaires aux marquages ainsi qu'à de nombreux outils de biochimie (ELISA, dosage colorimétrique...). Souris C57/B6 et Balb/c femelles âgées de 5 semaines au début du protocole ce qui correspond à des souris sevrées donc adultes ayant un système immunitaire mature ou quasi-mature.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Des femelles reçoivent un régime déséquilibré autour de la gestation, puis leur descendance subit un transfert de flore intestinale et des tests comportementaux avant d'être tuée pour prélever des tissus, afin de relier alimentation, microbiote et traits autistiques. Le porteur qualifie ces tests comportementaux de non invasifs sans préciser lesquels, et déclare peu d'effets indésirables. Il affirme que l'autisme ne peut être modélisé qu'au niveau de l'"animal entier" exprimant tout son répertoire comportemental.

Objectifs

Les troubles du spectre autistique (TSA) sont des maladies neurodeveloppementale de plus en plus fréquentes, avec une incidence moyenne de près de 1% d’après de récentes études à grande échelle. Les causes de ce trouble sont encore mal identifiées. Le développement de l’autisme pourrait être le résultat d'une combinaison de facteurs environnementaux toxiques et d’une susceptibilité génétique. Parmi les causes environnemantales possibles, l’obésité, conséquence d’un régime alimentaire déséquilibré, est un facteur particulièrement intéressant, puisqu’elle est de plus en plus répandue dans les sociétés occidentales et pourrait ainsi expliquer l’augmentation inquitétante des cas d’autisme dans ces pays. Des études cliniques récentes montrent que les mères souffrant d’obésité ont un risque accru d’avoir un enfant souffrant de TSA. Actuellement il n’existe pas de modèle animal mimant ce facteur de risque, qui permettrait d’en comprendre les mécanismes. Nous avons montré que la descendance de souris gestantes exposées à un régime cafétéria présente une trajectoire développementale altérée ainsi que des symptômes d’autisme à l’âge adulte. La composition de la flore intestinale des ces souris est également altérée. Nous voulons maintenant la contribution du mircobiote intestinal aux altéartions comportementales observées chez les souris exposées au régime cafétéria. Le projet comprendra deux étapes : 1)Exposition de femelles au régime cafétéria une semaine avant l’accouplement et pendant la gestation puis la lactation, 2)Etude comportementale de la descendance avant et après un transfert de flore microbienne entre le groupe exposé au régime cafétéria et le groupe exposé au régime contrôle. L’enjeu de ce projet est d’identifier une nouvelle cause potentielle de développement des troubles autistiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de l’impact du microbiote intestinal sur le développement du phénotype autistique des animaux exposés de manière précoce à un régime déséquilibré.

Procédures

Les animaux seront soumis à un transfert de flore. Ce type d'intervention est en essai clinique chez l'homme pour soulager les patients atteints d'autisme. Les animaux seront soumis à des tests comportementaux ethologique non ivasif. L'ensemble de notre protocole expérimental durera 16 semaines. Les tests comportementaux, que réaliseront auront une durée maximale de 10 minutes.

Impact sur les animaux

Le protocole expérimental ne présente pas d’effet indésirable notoire. Dans une expérirnce précédente, l’exposition au régime cafétéria a conduit à une augmentation de 10-15% du poids des mères, et de moins de 10% chez leur descendance. L’ensemble des tests comportementaux ne génère pas de stress particulier.

Devenir

En fin d'expérience les animaux seront euthanasié dans le but de prélever des tissus et étudier l'impact du transfert de flore au niveau moléculaire

Remplacement

La compréhension des mécanismes causaux de l’autisme et le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traiter nécessitent la mise à disposition de la communauté scientifique de modèles précliniques de cette pathologie. Une étude précise et détaillée du répertoire comportemental des animaux modèles permet de vérifier que ces modèles valident bien le critère de validité d’aspect pour la pathologie autistique, et aussi d’évaluer le cas échéant l’efficacité d’une approche thérapeutique. L’évaluation des effets bénéfiques d’un traitement ne peut être réalisée dans ces modèles qu’au niveau comportemental : en effet, il n’existe pas de marqueur biologique pour l’autisme, dont le diagnostic clinique repose entièrement sur une évaluation comportementale. Cette pathologie ne peut donc être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant toute la variété de son répertoire comportemental.

Réduction

Les effectifs ont été calculés afin de permettre une réduction des effectifs optimisée en maintenant une puissance statistique d’au moins 0.9 pour une taille d’effet f de cohen égale à 0.25 à un seuil de significativité de 0.05.

Raffinement

Nous raffinerons nos expériences en soulageant l’inconfort ou le stress potentiels subis par les animaux tout au long du protocole expérimental, en logeant les souris par groupe sociaux de 2 à 4 individus, en mettant à disposition le matériel nécessaire pour faire un nid (ouate et cabane en carton) et en manipulant quotidiennement les animaux par le même expérimentateur. Pour réduire le nombre d’animaux, nous utiliserons les animaux des deux sexes, nous testerons chaque animal dans différentes tâches et nous utiliserons les tests statistiques adéquats. Nous ne pouvons toutefois pas nous passer du modèle animal car l’autisme est une pathologie complexe qui ne peut être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant tout son répertoire comportemental. Pendant les expériences, nous suivront quotidiennement le bien-être de nos animaux en particulier leurs poids, leur posture. Nous mettrons en place des points limites adaptés afin d’éviter de faire souffrir inutilement les animaux.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux sociaux, chez lesquels des altérations des compétences sociales, symptôme clé de la pathologie autistique, peuvent être aisément étudiées. Par ailleurs, le répertoire comportemental de ces animaux est suffisamment étendu pour compléter cette étude par une évaluation de nombreuses autres réponses comportementales connues pour être affectées par la pathologie autistique . Les déficits comportementaux détectés chez les souris modélisant l’autisme sont suffisamment importants et robustes pour tester la validité d’aspect du modèle et, le cas échéant, permettre de révéler des effets bénéfiques potentiels de composés pharmacologiques. La trajectoire développementale des animaux sera étudiée dès la naissance des animaux. Nous suivrons le développement des animaux jusqu’à l’âge adulte (8-12 semaines), alors que le répertoire comportemental est totalement développé et les éventuels déficits comportementaux fixés.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de niveau modéré. Elles reçoivent une injection puis des séances d'imagerie par bioluminescence de dix minutes par semaine sous anesthésie répétée, avant d'être tuées pour l'analyse histologique du cerveau, afin de mettre au point un modèle de suivi de la protéine aSynucléine impliquée dans la neurodégénérescence. Le porteur présente l'imagerie comme non invasive et justifie ces 360 animaux par la volonté de suivre la maladie dans le temps et de limiter à terme le nombre d'animaux non-humains utilisés. Il indique valider le matériel en culture cellulaire en amont, l'imagerie in vivo ne pouvant selon lui se faire que sur des animaux vivants.

Objectifs

Les modèles de neurodégénérescence induite chez la souris sont bien établis au sein de notre institut. Certains sont basés sur l'injection de virus permettant la surexpression d’une protéine mutée qui forme des agrégats et qui serait une des causes de la mort des neurones dopaminergiques et des problèmes moteurs conséquents. L’accumulation de cette protéine n’est étudiée que post-mortem chez l’animal. L'objectif est la création d’un modèle permettant le suivi au cours du temps de l'évolution du modèle par imagerie, permettant une étude longitudinale tout en limitant le nombre d'animaux pour étudier le modèle.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est le suivi de la mise en place et de l’évolution de la "pathologie" à différents temps et sans sacrifier les animaux, pour ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés dans nos recherches et travailler avec un modèle bien maitrisé temporellement.

Procédures

Les animaux sont soumis à de l'imagerie in vivo : 10 minutes par semaine pendant toute la durée de l'étude, sous anesthésie générale. C'est une technique non invasive et nécessitant juste une injection qui est non douloureuse et se fait sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Ils sont représentés par la répétition de l'anesthésie durant l'imagerie, mais celle-ci est de courte durée (10 minutes maximum) et légère car gazeuse. Et par le transfert entre le site d’hébergement et la plateforme d'imagerie, réalisé par les porteurs du projet.

Devenir

Les animaux sont sacrifiés à la fin de chaque étude afin de réaliser une étude histologique et biochimique du tissu cérébral.

Remplacement

Nous souhaitons améliorer un modèle pathologique afin d’être plus en adéquation avec la réalité de la maladie chez l’humain, nécessitant l’utilisation de modèles animaux robustes. En amont de nos expériences in vivo, le matériel biologique est testé en culture cellulaire afin de valider leur efficacité, de déterminer les concentrations nécessaires et de valider un protocole expérimental correct. L'imagerie in vivo ne peut être réalisée que sur des animaux vivants.

Réduction

Modèle : la souris C57BL6/JR a été choisie car nos études antérieures ont montré une bonne stabilité et reproductivité, permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux pour réaliser ces études. Quant à la souche B6RjTyr c/c, elle représente un atout majeur pour l'imagerie in vivo, du fait de sa dépigmentation cutanée. De plus, le statut sanitaire des animaux étant maîtrisé, la stabilité des modèles est éprouvée. Le développement de modèles avec un suivi en bioluminescence qui est non invasif pour les animaux, permet des études longitudinales et ainsi une diminution du nombre d’animaux utilisés. Ainsi pour ces deux études nous utiliserons : étude 1 : 3 expériences indépendantes x 3 groupes de 10 animaux x 2 souches = 180 souris et dans l'étude 2 : 3 expériences x 3 groupes de 10 souris x 2 souches = 180 souris, il n'y aura pas d'étude statistisque de différences entre les groupes, mais ce nombre nous permet de valider la fiabilité des nos modèles en imagerie.

Raffinement

Acclimatation : une période de deux semaines permet une bonne acclimatation des animaux à leur nouvel environnement. Les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. Formation : une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal.

Choix des espèces

Les modèles de neurodégénérescence induite chez la souris sont bien établis au sein de notre institut. Ces travaux d'étude des maladies neurodégénératives en utilisant la souris comme modèle sont largement décrits dans la littérature ce qui nous donne une base solide pour valider nos résultats. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte qui est compris entre 8 et 12 semaines, car la pathologie étudiée apparait à l'âge adulte chez l'humain.

288 souris, 144 mâles et 144 femelles, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Une myosite est déclenchée par des injections sous anesthésie, puis les souris reçoivent un gavage quotidien pendant sept jours et subissent un test de force musculaire au grip test, avant d'être tuées pour prélever muscles et organes, afin de tester des molécules candidates contre les myopathies inflammatoires. Le porteur indique que l'induction fait perdre environ 30 % de force musculaire sans, selon lui, provoquer de souffrance décrite dans la littérature. Il affirme que ce modèle murin est "indispensable" et qu'aucun système cellulaire ne reproduit les interactions en jeu dans la maladie.

Objectifs

Les myopathies inflammatoires (MI) sont des maladies caractérisées par l’inflammation du muscle squelettique qui conduit à une faiblesse musculaire et une capacité réduite d'exercice, ainsi qu’une baisse de la qualité de vie et une mortalité accrue. Les glucocorticoïdes (GC) sont le traitement de première intention car ils améliorent la sévérité des symptômes, cependant, un traitement chronique provoque des effets indésirables. Même si des médicaments sont disponibles, ils ont une efficacité partielle, un fort taux de rechute et de nombreux effets secondaires. Il est donc nécessaire d'améliorer la prise en charge des patients atteints de MI. Nous avons démontré chez la souris atteinte de myosite que la prednisone, permet de récupérer la force musculaire après 7 jours de traitement. Cet effet thérapeutique passe par l’activation de la voie b adrénergique dans les cellules inflammatoires. De ce fait, l’activation de cette voie pourrait récapituler les effets thérapeutiques de la prednisone en l’absence de ses effets indésirables. Cette stratégie thérapeutique a été testée dans un modèle murin de Myasthénie grave et un essai clinique est actuellement en cours chez l’homme. Nous avons mis en évidence que les fibres musculaires des patients atteints de dermatomyosite (DM), un sous-type de myosite, présentent une augmentation de l’activité du protéasome. De plus, les inhibiteurs du protéasome ont montré une efficacité in vitro, parmi les inhibiteurs du protéasome déjà utilisés pour le traitement d’autres pathologies auto-immunes et du cancer, Ixazomib et KZR-616 sont les mieux tolérés

Bénéfices attendus

Les myopathies inflammatoires (MI) sont caractérisées par l’inflammation du muscle squelettique qui conduit à une faiblesse musculaire et capacité réduite d'exercice, et qui est associées à une baisse de la qualité de vie et à une mortalité accrue par rapport à la population générale et aux patients atteints d’autres maladies chroniques. Les glucocorticoïdes (GC) sont le traitement de première intention dans cette maladie car ils améliorent la sévérité des symptômes, cependant, un traitement chronique provoque des évènements indésirables et les médicaments qui ciblent l’infiltrat inflammatoire ont une efficacité partielle, un fort taux de rechute et nombreux effets secondaires. Il est donc nécessaire d'améliorer la prise en charge des patients atteints de MI. Nous avons précédemment démontré que la fibre musculaire est un acteur à l’origine des MI ainsi qu’une cible thérapeutique des GC et potentiellement d’autres médicaments. Ces données obtenues par des études in vitro, in vivo et chez l’homme ont ouvert des nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients atteints de MI. Notamment, l’activation de la voie b adrénergique et l’inhibition du protéasome dans la fibre musculaire permettront spécifiquement de cibler les mécanismes à l’origine de la maladie. Cela permettra d’améliorer le pronostic d’un groupe de maladies handicapantes et associées à une surmortalité.

Procédures

La myosite expérimentale (ME) sera réalisée, sur chaque souris, par l’injection sous-cutanée au niveau des hanches et les pattes arrière bilatéralement (4 sites d’injections, 3 secondes/injection) d’un polypeptide de la protéine C rapide du muscle squelettique associée à l’injection par voie intra-péritonéale (une seule injection durant 3 secondes) de toxine pertussis. Toutes les injections seront faites sous anesthésie à l’isoflurane le même jour et une seule fois sera suffisante pour induire la maladie. Le délai entre les différentes injections sera compris entre 3 et 10 secondes. Seront générées 288 souris ME (144 males, 144 femelles) afin de permettre l’évaluation des nouvelles molécules pour les deux sexes. Quatorze jours après l’induction de la ME, les souris seront traitées pendant 7 jours par gavage de 100µL quotidien par les molécules candidates, Ces molécules seront administrées dans l’eau de boisson par gavage. Le même volume d’eau de boisson sera administré par gavage aux souris ME non traitées. Pendant cette procédure la souris sera vigile. Les médicaments seront administrés par gavage afin de garantir l’administration de la même quantité dans tous les souris. Chaque gavage induit une contention de 15 secondes par souris, le gavage dure 5 secondes et sera répété pendant les 7 jours de traitement. Au jour 21, 100µL de sang sera prélevé au niveau de la veine faciale (10 secondes maximum), puis les animaux seront mis à mort lors de la même contention et les prélèvements suivants seront alors réalisés : - muscles quadriceps, tibialis antérieur, gastrocnémien : afin d’étudier l’efficacité du traitement ; - foie, rate, cœur : afin d’étudier la tolérance du traitement dans le cas où il y aura des signes de toxicité au bilan dans le sang. La force musculaire sera mesurée au jour 0, 14 et 21 après l’immunisation, en utilisant un test de résistance de la préhension (Grip test). Lors de la mise en place de l’expérimentation, les souris seront différenciées par un marquage au feutre au niveau de la queue afin d’éviter toutes contentions inutiles, la durée du grip-test est de 10 secondes par souris (3 prises de mesures).

Impact sur les animaux

La myosite expérimentale (ME) sera induite sur chaque souris, sous anesthésie à l’isoflurane, par l’injection sous-cutanée au niveau des hanches et les pattes arrière bilatéralement (4 sites d’injections, 3 secondes/injection) d’un polypeptide de la protéine C rapide du muscle squelettique associée à l’injection par voie intra-péritonéale (une seule injection durant 3 secondes) de toxine pertussis. Toutes les injections seront faites le même jour et une seule fois. Le délai entre les différentes injections sera compris entre 3 et 10 secondes. L'Induction de la Myosite entraine une perte de force musculaire entre 14 et 21 jours après l’induction. Quatorze jours après l’induction de la ME, les souris seront traitées pendant 7 jours par gavage de 100µL quotidien par les molécules candidates, Ces molécules seront administrées dans l’eau de boisson par gavage. Le même volume d’eau de boisson sera administré par gavage aux souris ME non traitées. Pendant cette procédure la souris sera vigile.

Devenir

La myosite expérimentale (ME) est induite le jour 0. 14 jours après l'induction de la ME, le traitement est administré pendant 7 jours par gavage dans l’eau de boisson. 21 jours après l'induction de la maladie, les animaux sont mis à mort afin d’étudier l’efficacité des molécules candidates thérapeutiques et leur tolérance par le prélèvement des muscles, du foie, du cœur et de la rate.

Remplacement

Le modèle murin de myosite décrit dans ce projet n’est pas remplaçable et reste indispensable afin d’évaluer la tolérance et l’efficacité des molécules ayant possiblement un effet thérapeutique dans les myosites. En effet, il n’est pas possible actuellement de modéliser au moyen d’un système cellulaire les interactions dynamiques et complexes entre les cellules musculaires, inflammatoires et l'environnement au cours des myopathies inflammatoires. De plus, chez l’homme, il n’est pas éthiquement possible de ne pas traiter les patients avec des glucocorticoïdes malgré leurs effets iatrogènes connus et de tester des autres molécules candidates en l’absence d’études sur des modèles animaux.

Réduction

Pour répondre à la question scientifique posée, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. L’hétérogénéité des résultats des expériences antérieures demande une cohorte de 12 souris (6 mâles, 6 femelles) pour obtenir des résultats statistiquement significatifs De ce fait, 12 souris seront nécessaires pour les analyses histologiques, 12 pour étudier l’expression des gènes et des protéines, 12 souris pour étudier l’activité mitochondriale, 12 souris pour la cytométrie en flux, au total 48 souris. Vu qu’on compare 6 conditions, au total il faut 288 souris. Ce nombre d'animaux nous permettra d'obtenir des conclusions significatives. Les expériences sur les animaux seront stoppées lorsque le niveau de signification statistique est atteint pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisées. Sur la base de notre bibliographie, la question scientifique à laquelle répondra ce protocole n’a jamais été étudiée.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages adaptées agrémentées de nid, en groupes sociaux. Pour minimiser le stress des souris, toutes les injections pour induire la maladie seront faites par des seringues insuliniques et dans le cadre de la même anesthésie. Dans notre projet précédent, nous avons montré que l’induction de la myosite, même en fin d’anesthésie, ne provoque pas de douleur ni de nécrose dans les sites des injections. Cependant, si les souris présentent des rougeurs au niveau des sites d'injection, ou des détresses respiratoires liées à l'anesthésie, ces dernières seront sorties de l'étude. A partir de l’induction de la myosite inflammatoire, une perte de force étant attendue, de la nourriture en gel sera mise à disposition dans la cage afin d’assurer l’alimentation des souris. Les souris feront l’objet d’un suivi quotidien adapté. Le poids, le comportement général, la posture, l’état du pelage, les blessures potentielles seront suivies pendant toute la vie des animaux. En cas de doute, un suivi de poids pourra être mis en place et toute baisse de poids sera notifiée au responsable de projet et au vétérinaire. Nous avons montré que l’induction de la myosite (ME) diminue la force musculaire des souris de 30%, mais n’affecte pas leurs capacités à se nourrir. Cependant, après l’induction de la maladie, de la nourriture gel sera placée tous les jours dans la cage pour assurer leur alimentation même dans des conditions de faible mobilité. La prednisone n’induit pas de signe de souffrance, au contraire, ce traitement ainsi que les molécules candidates, devraient réduire la sévérité des symptômes de la ME. La mise à mort sera faite par des méthodes appropriées et par personnes compétentes pour limiter la souffrance des animaux.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animal la plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants car la composition en termes de type de fibre des muscles squelettiques chez la souris mime celle humaine. De façon concordante, la myosite chez la souris mime la maladie humaine pour la présence d’une diminution de force musculaire, d’inflammation et variabilité de taille des fibres au niveau histologique. Des souris adultes seront utilisées. L’âge adulte selon les répondants varie entre 6 et 20 semaines. L'âge auquel les modèles animaux sont couramment utilisés est de 8 à 12 semaines. De ce fait, l’âge des souris sera de 8 semaines car pour les modèles de maladies auto-immunes la puberté est préférable afin d’avoir un système immunitaire compétent. En effet, la plupart des modèles expérimentaux de myosite présents dans la littérature ont été décrits chez la souris adulte et dans ces modèles, aucune souffrance animale n'a jamais été décrite.

34 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Ils sont vaccinés puis infectés par le SARS-CoV-2 par voie intranasale, avant des écouvillonnages et lavages nasaux répétés sous anesthésie, pour évaluer des composés antiviraux d'une société qui a validé et financé le projet. Le porteur indique que l'infection provoque fièvre, perte de poids et tremblements sans être létale dans ce modèle, puis que tous les animaux sont tués pour prélever leurs organes. Il décrit tantôt un objectif de traitements antiviraux, tantôt de "vaccins", et affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet d'étudier la transmission du virus.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de composés antiviraux dans un modèle de transmission du virus du SARS-CoV-2 entre individus. Les traitements antiviraux utilisés ont montré des résultats intéressants lors d’études in-vitro ou lors d’études précliniques sur d’autres types de virus, encourageant la réalisation d’études d’efficacité en préclinique sur le virus SARS-CoV-2. Ce projet a ainsi fait l'objet d'une évaluation par le comité scientifique de la société fabriquant les traitements et a été approuvé par celui-ci. Ce projet permettra de mettre sur le marché un/des traitement(s) antiviral(aux) contre la COVID 19.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre sur le marché des vaccins contre la COVID 19.

Procédures

Pour limiter au maximum le stress des animaux, l’intégralité des actes décrits ci-dessous seront réalisés sur animaux anesthésiés. Les animaux des groupes tests seront, avant d’être mis en contact avec les animaux infectés au SARS-CoV-2, vaccinés par instillation intranasale à raison d’une administration par animal. Le virus du SARS-CoV-2 étant un virus aéroporté, l’infection des animaux du groupe infecté se fera également par instillation intranasale en dose unique. Enfin, des prélèvements réguliers, d’écouvillonnages oropharyngés et des lavages nasaux, à raison au maximum d’une fois par jour tous les deux jours seront réalisés et ce pendant les 7 jours suivants le contact entre les animaux infectés et non-infectés. Une même anesthésie permettra d'effectuer les 2 prélèvements à la suite évitant ainsi les anesthésies multiples pour un même jour (chaque intervention (infection et prélèvement) ne nécessitant qu'une minute par animal).

Impact sur les animaux

Les animaux vont être infectés au virus du SARS-CoV-2 entrainant l’apparition de signes cliniques des animaux reflétant la réalité clinique (principalement fièvre, perte de poids, pilo-érection et tremblements). Toutefois, il est connu dans la littérature scientifique mais aussi d’après les observations des précédentes études réalisées dans notre établissement utilisant le modèle hamster que, contrairement au modèle murin, l’infection au SARS-CoV-2 dans ce modèle n’est pas léthale. A titre indicatif, nous avons observé qu'une infection induit dans le modèle hamster des pertes de poids de l’ordre 5% avec un retour à la normale (poids avant infection) dans les 5 à 7 jours post-infection. Les animaux vont être manipulés régulièrement pour différents actes (administration des vaccins, pesées, scoring clinique, prélèvements, etc). Ces actes pouvant stresser les animaux et leur infliger des douleurs aussi pour palier à ce cela des mesures de raffinements ont été prévues : les animaux seront manipulés quotidiennement afin de les habituer à la contention et des anesthésies seront systématiquement réalisées pour tous actes invasifs.

Devenir

L’ensemble des animaux utilisés pour ce projet seront euthanasiés à la fin de chaque étude pour pouvoir réaliser des prélèvements d’organes en vue d’analyses anatomopathologiques ou de charges virales.

Remplacement

La transmission d’un virus aéroporté comme le SARS-CoV-2 résulte de plusieurs facteurs tels que la durée et l’intensité d’exposition aux particules infectieuses, la stabilité du virus dans les gouttelettes d’aérosols et de l’infection suivante dans le nouvel hôte. Aussi, il n’existe actuellement aucune méthode alternative permettant d’étudier la transmission d’un virus d’un organisme à l’autre et d’évaluer l’efficacité d’un traitement sur un organisme vivant sans l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

Cette étude a fait l’objet d’une réflexion étayée par des connaissances statistiques et des données de la littérature scientifique afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Toutefois, pour obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant de conclure sur une réelle efficacité des traitements testés, des groupes de 6 animaux seront utilisés. Des études internes menées par la société fabriquant les traitements ont déjà utilisé le ratio de 1 pour 3 dans un modèle de furet pour la grippe avant de déterminer la réplication du virus pour chaque animal sentinelle après le co-hébergement. L’utilisation de ce ratio permettra de mieux simuler une situation naturelle pour laquelle un individu infecté est capable d’infecter un plus grand nombre d’individus non-infectés lors de contacts directs. De plus, en préférant ce ratio de 1 pour 3 à un ratio de 1 pour 1, nous diminuons considérablement le nombre total d’animal à inclure dans l’étude limitant ainsi le nombre et la souffrance des animaux donneurs indexés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés avec un enrichissement approprié à leur besoin et suivant leur âge (exemple : les hamsters de plus petite taille disposeront de plus de litière en fond de cage pour pouvoir accéder plus facilement à l’abreuvement et à la nourriture). Les animaux seront suivis quotidiennement pendant toute la durée de l'étude grâce à une grille d'évaluation appropriée. En cas d'atteinte de points limites préalablement définis sans possible amélioration de l'état de santé des animaux, ils seront euthanasiés pour arrêter toute souffrance excessive. Pour éviter tout stress aux animaux, ils seront systématiquement anesthésiés lors de la réalisation d'actes techniques invasifs. Durant la phase de co-hébergement en surnombre, les animaux seront suivis 2 fois par jour. Les animaux ne seront pas manipulés lors de cette seconde visite mais simplement observés pour éviter de stresser les animaux. Chaque groupe social sera placé avec le minimum d’éléments lui permettant de reproduire son nid, ses briquettes de bois à ronger et un peu de litière provenant de sa cage d’origine afin que les animaux puissent garder leurs repères. En cas de détection de signes d’agressivité des animaux entre eux, des enrichissements supplémentaires seront ajoutés dans les cages. Si les signes d’agressivité persistent, l’animal dominant sera alors isolé du reste du groupe.

Choix des espèces

L’efficacité des composés antiviraux sera évaluée sur la souche de hamster Golden Syrian, qui a été décrit comme un excellent modèle pour une infection au SARS-CoV-2. Contrairement aux modèles murins transgéniques, les hamsters Golden Syrian expriment naturellement un récepteur d’entrée du virus du SARS-CoV-2. Cette expression leur permet d’être infectés à la COVID-19 conduisant au développement de signes cliniques plus proches de ceux observés chez l’Homme. D'après les données de la littérature scientifique, les hamsters utilisés dans le cadre des études SARS-CoV-2 sont généralement âgés de 4 à 10 semaines. Des animaux jeunes adultes (âgés de 7 semaines au moment de l'infection) seront utilisés pour l'étude. Cet âge représente un état physiologique stable pour le hamster, ce qui est adapté aux besoins de l'étude.

193 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une neurochirurgie pour induire dans l'hypothalamus l'expression d'une protéine, et 16 femelles reçoivent en plus un frottis vaginal quotidien pendant cinq semaines, afin d'étudier l'effet de l'hormone IGF1 sur le contrôle cérébral de l'ovulation. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer des hémorragies et une baisse de température, et que les animaux atteignant les points limites sont mis à mort. Il affirme que la reproduction, fonction intégrée, ne peut s'observer que sur un "organisme vivant", ce qui justifierait selon lui le recours au rat.

Objectifs

L'ovulation dépend de l'intégration de facteurs hormonaux, métaboliques, et environnementaux par le cerveau et plus particulièrement par les neurones hypothalamiques à kisspeptine (KP) qui vont orchestrer la sécrétion de la gonadolibérine ou GnRH permettant le pic de l'hormone lutéinisante (LH) à l'origine de l'ovulation. L'objectif est de développer et de mettre en oeuvre une technique permettant d'induire la synthèse d'une proteine dans une région cible du cerveau sur une période de temps étendue (supérieure à 3 semaines) afin d'étudier l'influence de cette proteine sur le contrôle central de l'ovulation.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de deux ordres: le premier consiste en une meilleure compréhension des effets de l' Insulin Growth Factor 1 (IGF1), hormone périphérique, sur le fonctionnement dans le noyau arqué des neurones à KP et plus généralement sur la synchronisation du moment de l'ovulation par l'hypothalamus; le second est la mise au point d'une technique innovante, ne nécessitant pas la mise en oeuvre de bâtiments ayant un niveau de biosécurité élevé, pour induire une proteine dans une région délimitée du cerveau et à un âge déterminé de l'animal ce qui permettra de mieux comprendre sa fonction. Cette technique si elle est validée pourra être déployée chez des espèces animales (telles les espèces de rente) chez lesquelles les outils de génie génétique sont peu disponibles.

Procédures

Tous les animaux (n=193) seront soumis à une neurochirurgie d'une durée moyenne de 15 minutes par animal. Pour ce faire, les animaux seront anesthésiés et leur température corporelle sera maintenue grâce à un tapis chauffant. Parmi ces 193 animaux, 16 femelles auront un suivi de cyclicité par frottis vaginal réalisé pendant cinq semaines à raison d'un frottis quotidien (les femelles vigiles sont maintenues le temps du frottis).

Impact sur les animaux

Effets directs: Toute neurochirurgie peut entrainer des diminutions de la température corporelle et des hémorragies. L'incision de la peau du crâne peut induire une douleur localisée. Effets indirects: Mobilité et hygiène du pelage éventuellement réduites suite à la neurochirurgie, l'induction de la synthèse d'IGF1 pourrait avoir des effets sur le poids de l'animal (perte ou gain). Les effets directs sont de courte durée (

Devenir

Le projet porte sur le cerveau et sur l'analyse anatomique et fonctionnelle d'un traitement in situ constitué par un transfectant et un plasmide. De ce fait, il est nécessaire d'euthanasier tous les rats de ce projet en fin d'expérimentation afin de confirmer la zone d'injection, de mesurer son étendue et de caractériser d'éventuelles lésions tissulaires.

Remplacement

La fonction de reproduction étant une fonction intégrée sous contrôle de l'hypothalamus, elle ne peut s'observer que sur un organisme vivant. Les expériences s'appuieront néanmoins sur les données de la littérature pour choisir les critères expérimentaux les plus pertinents et réduire le nombre de tests.

Réduction

Le choix du nombre d’individus par lot s'appuie sur les données de la littérature et notre expérience antérieure montrant que des résultats exploitables et statistiquement fiables peuvent être obtenus avec des groupes compris entre 5 et 7 animaux selon les données à exploiter. La réalisation successive des expériences (et non en parallèle) permet de réduire le nombre de lots expérimentaux car chaque critère établi sera réutilisé dans l'expérience suivante. La taille des lots a été déterminée en nous basant sur notre expérience antérieure où selon les données quantifiées, la variabilité inter-animale et le test statistique utilisé il faut au minimum 7 animaux/groupe. Nous avons ajouté 1 animal par lot afin de prévenir tout risque lié à la chirurgie.

Raffinement

Les rats seront hébergés par trois en présence d'objets en carton (boites à oeufs, tube). Une semaine d'habituation à la manipulation par l'expérientateur sera prévue pour chaque lot de chaque série d'expérience. Les rats seront anesthésiés lors des chirurgies et recevront un traitement antalgique consécutivement à la neurochirurgie. Les rats recevront une pommade ophtalmique pour conserver une bonne lubrification de l'oeil pendant la chirurgie. La surveillance post-opératoire s'appuiera sur l'observation quotidienne du comportement, de l'apparence physique et du poids corporel. La molécule étudiée est une hormone endogène qui n'est pas connue pour avoir des effets nocifs sur la santé des animaux, de même l'absence de nocivité du transfectant a été établie. Néanmoins, une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée tout au long de l'expérimentation ainsi qu'un suivi de poids bihebdomaire.

Choix des espèces

C’est une espèce de référence pour l'étude du contrôle central de la reproduction utilisée en routine par de nombreux laboratoires. L'intérêt de cette espèce dans le cadre de notre projet est la durée courte des cycles ovariens (4 jours) et la bonne reproductibilité/fiabilité des coordonnées stéréotaxiques pour les approches de neurochirurgie. Les animaux seront sexuellement matures afin d'avoir un axe gonadotrope activé et, dans le cas des femelles une activité de reproduction régulière facilement observable par la réalisation de frottis vaginaux. De plus, les coordonnées stéréotaxiques de l'atlas de référence s'appliquent pour des animaux dont le poids est proche de 280g.