Rongeurs

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses puis une radiothérapie, avant des examens IRM répétés sous anesthésie avec injection d'agents de contraste, et sont tuées pour prélever le cerveau. Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer titubation, léthargie, perte de poids et crises d'épilepsie, la mise à mort intervenant à 15 % de perte de poids ou à l'atteinte d'autres points limites. Il conclut que l'imagerie du petit animal vivant est un maillon "indispensable" pour mettre au point une IRM de la radionécrose transposable à la clinique.

Objectifs

La radiothérapie est une option thérapeutique qui peut engendrer des phénomènes nécrotiques et inflammatoires intenses, appelés radio-nécrose, 6 mois à 2 ans chez près de 25% des patients. Cette radio-nécrose est un effet secondaire de la radiothérapie et limite la précision de l'évaluation de la réponse tumorale à la thérapie. En effet, ces lésions dues aux radiations peuvent être confondues avec la progression tumorale, d'où le terme parfois utilisé « pseudoprogression ». A ce jour, seule l’analyse d’échantillons extraits par biopsie s’avère être totalement fiable pour différencier ces deux phénomènes. Mais la biopsie reste une intervention chirurgicale pouvant présenter certains risques pour le patient et le résultat peut s’avérer peu informatif étant donnée la petite taille de l’échantillon vis-à-vis du volume et de l’hétérogénéité tumorale. Diagnostiquer précisément le plus tôt possible une radionécrose ou une récidive est essentielle afin d’adapter au mieux le traitement. L’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) est une méthode de choix pour la détection de tumeurs cérébrales. Cependant, les techniques d'IRM conventionnelles ne sont toujours pas capables de distinguer la progression tumorale de la radio-nécrose, car les deux présentent la même apparence sur les images IRM. Ainsi actuellement, des séries d’examens IRM incluant l’ensemble de ces nouvelles techniques sont nécessaires pour affiner les pronostics sans pour autant atteindre 100% d’exactitude. L’actuel projet de recherche s'appuie lui sur la relaxométrie IRM. Cette technique permet de quantifier les propriétés tissulaires pour caractériser la microstructure du tissu et ainsi augmenter la spécificité de détection. De plus, pour résoudre le problème spécifique de la différenciation radio-nécrose/progression, ce projet adoptera une approche de pointe pour extraire des informations sur la microstructure du tissu au sein de chaque voxel (pixel en 3D). Ce projet vise à développer des méthodes avancées d’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) pour permettre l'évaluation in vivo non invasive de la réponse à la radiothérapie de gliomes implantés ou de métastases cérébrales chez la souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de cette partie du projet est la proximité et un accès facilité à la plateforme IRM pour des examens réguliers et la possibilité de suivre les animaux quotidiennement. Les bénéfices globaux de ce projet sont: 1) le modèle tumoral suivi d'une session de radiothérapie est représentatif de cas chez l’homme, donc la méthodologie IRM pourra être transférée rapidement; 2) Les données recueillies avec la nouvelle méthode IRM fourniront un point de départ solide pour a) évaluer la possibilité d'éviter les biopsies et b) évaluer plus précocement l'évolution de la maladie; 3) Les résultats de ce projet bénéficieront à long terme aux patients atteints de cancers cérébraux. En effet, nous sommes en cours d’implémentation de ces séquences de relaxométrie multi-compartiment sur une IRM clinique. De nouveaux biomarqueurs permettant de distinguer la récidive tumorale de la nécrose seront développés et mis à disposition via des techniques d'IRM rapides et robustes compatibles avec l'environnement clinique. Cela facilitera le diagnostic et permettra une prescription de traitement adapté. De plus, cela devrait réduire la nécessité d'une biopsie chirurgicale et ainsi limiter les risques pour le patient. Finalement, cette nouvelle technique IRM améliorera le confort des patients (pas d’injection d’agents de contraste, acquisitions rapides, diagnostics plus précis, technique d’imagerie inoffensive).

Procédures

Les 100 animaux seront soumis à une injection de cellules cancéreuses (en une seule fois) puis traités par radiothérapie (session unique) ou pas. Ces procédures seront réalisées sous anesthésie générale. Les animaux seront ensuite transportés dans une autre animalerie d’hébergement, permettant un accès facilité aux instruments d’imagerie. Les animaux seront soumis à une injection d’agents de contraste IRM sous anesthésie générale à chaque examen IRM. Ces examens seront séparés d’au minimum 3 jours. En fin de suivi IRM, ils seront euthanasiés sous analgésie et anesthésie générale pour un prélèvement propre du cerveau en vue de réaliser des examens IRM post-mortem et des coupes histologiques.

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux pourraient induire des effets indésirables sur le comportement de l’animal (titubation, léthargie), sur son apparence (yeux mi-clos, dos vouté), une perte de poids, et des signes neurologiques tels que la tête penchée, tremblements, crises d’épilepsie. La radionécrose tumorale ne devrait pas induire de douleur. En revanche, si une radionécrose du tissu cérébral sain intervient, celle-ci pourrait devenir douloureuse et sera détectée par des modifications du comportement ou de l’apparence physique. De plus, le transport des animaux d’un établissement utilisateur à un autre pourrait induire un stress aux animaux.

Devenir

Les examens IRM n’induisent pas de souffrance donc ces examens peuvent être répétés pour suivre l’évolution de la tumeur et de la radionécrose. Cependant, afin de confirmer la détection de la radionécrose par IRM, les animaux doivent être euthanasiés pour extraire le cerveau et réaliser des études histologiques.

Remplacement

Notre projet est à visée translationnelle. En effet, nous souhaitons développer des séquences IRM permettant un diagnostic plus précoces et fiables de la radionécrose (grâce à l’obtention d’images avec des résolutions spatiales et temporelles plus élevées, et des informations plus quantitatives). L’imagerie du petit animal vivant est donc un maillon indispensable dans ce processus.

Réduction

Les séquences IRM sont déjà développées et ont déjà été évaluées sur des souris saines. Ainsi, seulement des souris pathologiques (portant soit des gliomes soit des métastases cérébrales) seront imagées. Du fait de la non-invasivité de l’imagerie par IRM, les mêmes animaux seront imagés plusieurs fois avec un minimum de trois jours entre chaque examen. De plus, les structures cérébrales contralatérales au gliome serviront de contrôle interne. Cette démarche permet de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire.

Raffinement

Pendant les chirurgies, l'utilisation d'anesthésies gazeuses, la présence d'un tapis chauffant permettant de maintenir la température interne des animaux et le contrôle visuel de la respiration permettent d'assurer un réveil rapide des animaux. Les souris portant des tumeurs ou métastases cérébrales seront étudiées jusqu’à ce que leurs poids aient diminué de 15% ou que les autres points limites soient atteints. Une grille de scorage a été instaurée pour surveiller la santé et le bien-être des animaux, comprenant des signes au niveau du comportement, de la mobilité, de la perte de poids, et de l’apparition de signes neurologiques. Si des signes de mal-être apparaissent, les animaux seront pris en charge par un analgésique. Des points limites ont aussi été instaurés, induisant une euthanasie immédiate. Les animaux seront observés une fois par jour. La fréquence d’observation passera à 2 fois par jours dès le début de la perte de poids (10%). Les souris seront hébergées dans des cages avec un environnement enrichi par des objets (bâtonnets de bois à ronger, matériaux de construction de nid, maisonnette, tubes en carton) contenant de la paille, de la nourriture et de l’eau à volonté.

Choix des espèces

Les souris C57Bl/6N et BalbC sont couramment utilisées dans la littérature, permettant de comparer nos résultats à des études précédentes. De plus, elles possèdent un système immunitaire fonctionnel permettant de mimer la pathologie humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines) car le développement des organes sera terminé.

1 920 rates vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de gravité modérée. Elles subissent des instillations dans la vessie pour induire une cystite, avec brûlures et envies fréquentes d'uriner, puis un gavage ou une administration intravésicale du produit testé, un séjour de 72 heures en cage métabolique et un test de sensibilité à la douleur viscérale. Le projet cherche des alternatives aux antibiotiques contre la cystite récidivante de la femme. Le porteur affirme que l'étude "ne peut se faire que sur des animaux vivants", aucun modèle in vitro ne reproduisant selon lui la fonction vésicale.

Objectifs

La cystite est une infection urinaire localisée au niveau de la vessie. Elle est due, dans 90 % des cas, à une bactérie appelée Escherichia coli (E. Coli) mais d’autres bactéries ou micro-organismes peuvent en être la cause. Cette infection urinaire survient quand la bactérie E. Coli, présente naturellement dans le tube digestif (colon, rectum), pénètre dans l’urètre, puis remonte dans la vessie, et commence à se multiplier. La faible longueur de l'urètre chez la femme explique que la cystite soit plus fréquente chez elle que chez l'homme. Une femme sur deux présente au cours de son existence un ou plusieurs épisodes de cystite aiguë. Deux pics de fréquence sont observés : au début de l’activité sexuelle et après la ménopause. L'infection urinaire est plus grave si elle survient en présence d’anomalies de l’appareil urinaire (présence d’un reflux vésico urétéral, calcul rénal…) mais aussi chez un sujet souffrant d’immunodépression, chez une femme enceinte, chez les personnes âgées de plus de 75 ans et en cas de maladie rénale chronique sévère. En France, chaque année, une femme sur dix est touchée par une cystite ; 20% des femmes ayant eu une infection urinaire auront un nouvel épisode et 30% de celles-ci encore un autre épisode. On parle de cystite récidivante, lorsque le nombre annuel des infections dépasse 3 épisodes. Une fois la crise aiguë passée, on peut envisager une stratégie de prévention des récidives. Une antibiothérapie prophylactique prolongée pendant 6 mois, est souvent utilisée. Toutefois cela peut induire l’émergence de souches bactériennes résistantes aux antibiotiques. Il est donc nécessaire de trouver des alternatives aux antibiotiques, qui devraient être utilisés seulement dans les cas les plus graves.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui le médecin généraliste, en cas de cystite, prescrit généralement un traitement antibiotique de courte durée (en une seule dose ou sur trois ou cinq jours). Toutefois en cas d’infection récidivante, des traitements répétés d'antibiotiques sont souvent utilisés, ce qui contribue fortement à générer une résistance à ces traitements. Il est donc urgent de mettre au point de nouveaux traitements, hors antibiotiques, afin de traiter les cystites récidivantes. Le but ultime de notre projet est de mettre en place un modèle de cystite qui sera utilisé pour tester l’efficacité de nouveaux médicaments ayant un effet anti-inflammatoire, afin de contribuer à réduire l’utilisation d’antibiotiques chez les femmes atteintes de cystite bactérienne.

Procédures

La première intervention sur les rats sera par des instillations intravésicales de la combinaison PS+LPS (une fois/jour pendant 4 jours) sous anesthésie à l'isoflurane. La durée de l'intervention sera de 90 minutes par jour. Chaque rat sera posé sur un tapis chauffant à 37°C afin d’assurer la température corporelle physiologique. Avant chaque instillation par l’urètre, un gel lubricant sera appliqué au niveau de la zone du méat urétral. Afin d’éviter l’assèchement de la cornée pendant l’anesthésie, les yeux seront traités avec un gel oculaire (Lubrithal®). La deuxième intervention consiste à administrer à l'animal le produit test (candidat médicament) ou son solvant, par gavage ou par voie intravésicale. La duréé de l'administration par gavage est de 2 minutes et la durée de l'administration par voie intravésicale est de 10 minutes. Si nécessaire, un échantillon de sang sera prélevé 1 fois par jour pendant 4 jours maximum par la veine de la queue afin de collecter des données de pharmacocinétique. La duréé de cette intevention est de 5 minutes. La troisième intervention concerne le séjour en cages métaboliques pendant 72 heures. La quatrième intervention consiste à réaliser le test de sensibilité à la douleur viscérale. La durée de cette intervention est de 60 minutes.

Impact sur les animaux

La procédure expérimentale décrite dans ce projet a pour but d’induire une inflammation vésicale chez le rat qui puisse mimer la cystite bactérienne. Les symptômes d’une infection urinaire sont le besoin constant d’éliminer de très faibles quantités d’urine. Uriner s’accompagne de sensations de brûlure. La cystite peut parfois s’accompagner d’une fièvre légère, moins de 38°C, et d’un sentiment de malaise. Dans la plupart des cas, les cystites n’entraînent pas de complications. Toutefois, dans les cas les plus graves, l’infection peut remonter et atteindre le rein.

Devenir

A l'issue des 3 premières Procédures tous les animaux seront maintenus en vie. A l'issue de la Procédure finale, tous les animaux seront euthanasiés. La mise à mort est justifiée par le fait que les animaux ont subi plusieurs procédures, induisant une pathologie, et ne pourront pas être réutilisés pour d'autres expérimentations.

Remplacement

Le but de notre étude est de quantifier l’effet de molécules ayant des mécanismes d’actions différents sur la fonction vésicale chez le rat éveillé, donc l’étude ne peut se faire que sur des animaux vivants. En effet, il n’y a pas de modèles in vitro prédictifs de la fonctionnalité vésicale dans sa globalité.

Réduction

Le nombre d'animaux pour chaque groupe expérimental sera de 12, étant donné la variabilité interindividuelle de réponse au Lipopolysaccharide. Le nombre de lots est déterminé en fonction du nombre de doses à tester pour chaque molécule. Le nombre d'animaux est réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisamment robustes et permettant une analyse statistique appropriée. Un calcul de puissance statistique basé sur les données de la littérature nous a montré que l'utilisation de 12 rats par groupe nous permettra de détecter une différence de 25% entre les rats traités avec le solvant et les rats traités avec le candidat médicament. Du point de vue statistique, les groupes expérimentaux (entre 4 et 8 groupes expérimentaux, nombre d'animaux par groupe égal à 12) seront comparés entre eux en utilisant un test statistique standardisé.

Raffinement

Tous les efforts seront mis en place afin de minimiser la douleur, l'angoisse et la souffrance animale. Les animaux seront hébergés 2-4 par cage, en fonction de leur poids corporel, avec des igloos ainsi que des morceaux de bois à grignoter. Les cages sont de type IVC en surpression et sont rangées sur portoirs ventilés. Les animaux seront gavés par un technicien expérimenté. Le jour de l'administration intravésicale de Protamine Sulfate et de LPS, les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane. L'examen quotidien des animaux permettra d'évaluer plusieurs paramètres de santé et bien-être, notamment changement de couleur et d'aspect des poils (poils hérissés), diminution de la prise de boisson et de nourriture, diminution du grooming et de l'activité exploratoire dans la cage, perte de poids. Si la perte de poids sera supérieure à 20 % du poids initial, l'animal sera euthanasié. Dans le cas où un prélèvement de sang serait nécessaire, les animaux seront anésthésiés à l'isoflurane afin de minimiser le stress et la douleur. Pendant le séjour dans les cages métaboliques pendant 72 heures, les animaux auront accès ad libitum à l’eau et à la nourriture. Les animaux seront en contact visuel et olfactif entre eux mais le matériel d’enrichissement au niveau du sol de la cage ne pourra pas être utilisé car il peut interférer avec la collecte des fèces et des urines.

Choix des espèces

Les rats sont utilisés très fréquemment en recherche préclinique pour l’étude de la fonction vésicale. Les paramètres physiologiques et pathologiques liés à la fonction vésicale sont très bien caractérisés chez le rat, ce qui facilite la comparaison des résultats entre différents laboratoires. Les rats seront de souche Wistar ou Sprague-Dawley, car ces souches sont largement utilisées pour les études de la fonction vésicale (nombreuses références bibliographiques). D'autres modèles expérimentaux, notamment chez le chien, le chat et les primates, posent de nombreux problèmes éthiques et d’infrastructures d’hébergement. Les animaux seront utilisés à partir de 9 semaines d'âge (adulte) pour avoir une équivalence chez l'Homme.

671 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de gravité modérée. Elles reçoivent des greffes de cellules cancéreuses par voie sous-cutanée, intraveineuse ou intracardiaque, puis un agent anticancéreux deux fois par jour ou par pompe implantée, avec des tumeurs pouvant s'ulcérer et se nécroser, une perte de poids et des hématomes, pour évaluer une pro-drogue activée dans le microenvironnement tumoral. Le porteur suit la croissance des tumeurs par IRM, la mise à mort étant déclenchée à un score de souffrance défini. Il affirme qu'il est "indispensable" d'utiliser des animaux vivants car le système immunitaire et les tissus environnants seraient nécessaires.

Objectifs

L'agent anticancéreux que nous étudions sont des pro-drogues activables par des enzymes qui libèrent des agents toxiques. En effet, la présence d’activité enzymatique permanente est une caractéristique du microenvironnement des tumeurs. Ces enzymes actives peuvent provenir des cellules tumorales, des cellules infiltrées ou encore des cellules environnant la tumeur. L'agent anticancéreux activé par les enzymes ont un effet toxique qui permettrait de tuer plus spécifiquement les cellules cancéreuses qu’une drogue de chimiothérapie classique qui s’attaque à toute cellule en division indistinctement. L'objectif de ce projet est donc d'évaluer l'effet thérapeutique du nouvel agent anticancéreux sur des modèles de tumeurs et de métastases, non seulement, pour la prévention de formation de tumeurs mais aussi pour le traitement de tumeurs déjà formées.

Bénéfices attendus

Tout d'abord, basées sur nos résultats in vitro, le traitement par le nouvel agent anticancéreux devrait être efficace sur le développement de tumeurs et de métastases. De plus, du fait de sa cible, la dissémination des cellules cancéreuses devrait être réduite, limitant le développement métastatique. Contrairement aux agents chimiothérapeutiques actuels, la toxicité induite par le nouvel agent anticancéreux devraient être ciblée aux cellules tumorales, et induire peu, voire pas du tout, de résistance. Ainsi, du fait de sa spécificité d'action, les effets secondaires obtenus lors de chimio-thérapie classique devraient être absents. Le nouvel agent anticancéreux pourrait être utilisé pour traiter de nombreux cancers solides.

Procédures

Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale. 264 souris seront injectées en sous-cutané avec des cellules cancéreuses (durée de l'intervention: 10min par animal) puis traitées avec l’agent anti-cancéreux soit deux fois par jour par voie intraveineuse, intrapéritonéale, ou intra-tumorale (durée de ces injections: 2-3min par animal), soit en continu grâce à une pompe osmotique implantée en sous-cutanée. Ce traitement sera réalisé jusqu’à ce que l’effet thérapeutique soit observé. 73 souris seront injectées en intra-cardiaque avec des cellules cancéreuses (durée de l'intervention: 10min par animal) puis traitées avec l’agent anti-cancéreux soit en continu grâce à une pompe osmotique implantée en sous-cutanée, soit par des injections intraveineuses ou intra-péritonéales biquotidiennes (durée des injections: 2-3min par animal). Ce traitement sera réalisé jusqu’à ce que l’effet thérapeutique soit observé. 264 souris seront injectées en intraveineux avec des cellules cancéreuses (durée de l'intervention: 10min par animal) puis traitées avec l’agent anti-cancéreux soit en continu grâce à une pompe osmotique implantée en sous-cutanée, soit par des injections intraveineuses ou intra-péritonéales biquotidiennes, soit par des instillations biquotidiennes (durée de ces injections: 2-5min par animal). Ce traitement sera réalisé jusqu’à ce que l’effet thérapeutique soit observé. 70 souris saines seront injectées avec l’agent anti-cancéreux par voie intraveineuse ou intrapéritonéale deux fois par jour (durée de ces injections: 2-3min par animal) pendant la même durée que celle déterminée sur les souris portant des tumeurs ou métastases. Puis les animaux seront soumis à un examen IRM sous anesthésie générale toutes les semaines jusqu’à ce que l’effet thérapeutique soit observé. Lors de cet examen, une injection intraveineuse d'un agent de contraste (durée de l'injection: 1min par animal) sera réalisée.

Impact sur les animaux

Du fait de la haute spécificité de substrats des alkoxyamines, celles-ci ne devraient pas entrainer de nuisance ou d'effets secondaires. Cependant, en théorie une baisse de tension est possible due à la présence des nitroxydes. Selon notre expérience elle n’entraine jamais de séquelle ou de perte d’animaux. Les effets indésirables attendus à cause des modèles tumoraux devraient être détectables au niveau de l’apparence physique (prostration, pilo-érection, chromadacryorrhée), du comportement, de la respiration (respiration rapide/superficielle), d’alimentation (perte de poids), de température corporelle. De plus, les tumeurs sous-cutanées peuvent aussi être sources de nuisances (ulcération, nécrose, difficulté de mobilité). Les instillations intra-trachéales pourraient induire une irritation de la gorge associée à des signes d’inconfort respiratoire (dyspnée, respiration orale). Les injections intraveineuses biquotidiennes pourraient provoquer des hématomes, et une mauvaise perfusion sanguine.

Devenir

Nous souhaitons déterminer si le nouvel agent anti-cancéreux permet de réduire la croissance tumorale ou empécher la formation de métastases. Un suivi longitudinal est donc nécessaire.

Remplacement

Il est indispensable d’utiliser les animaux vivants, car nous souhaitons évaluer l'efficacité thérapeutique d'un nouvel agent anticancéreux sur des tumeurs, dont le micro-environnement inclut des enzymes actives qui proviennent souvent des cellules non tumorales qui infiltrent la tumeur ou des cellules qui entourent la tumeur. Ainsi, le système immunitaire et les tissus normaux environnants sont particulièrement nécessaires pour évaluer leur efficacité.

Réduction

Afin de limiter le nombre d'animaux à utiliser pour ce projet, des expérimentations in vitro ont été réalisées (et seront réalisées) en amont, pour étudier l'effet du nouvel agent anticancéreux sur chacune des cellules cancéreuses en culture. De plus, comme nous avons déterminé que les cellules de fibrosarcomes répondaient au traitement in vitro, nous débuterons nos expérimentations avec ces cellules. Selon les résultats sur ce modèle, le nombre d'animaux nécessaires pour déterminer la concentration optimale et la voie d'injection appropriée pourra être diminué pour les autres modèles de tumeurs primaires et métastases. En effet, nous pourrons réduire le nombre de concentrations à tester ainsi que les voies d'injection, afin de limiter le nombre d'animaux total. L'imagerie par Résonance Magnétique (IRM) permet d'imager l'animal plusieurs fois pour évaluer un traitement (ici pour suivre l’évolution de la croissance tumorale) sans avoir recours à des euthanasies à différents temps au cours du traitement pour réaliser de l'histologie. Cette méthode a été choisie car elle permet de limiter énormément le nombre d'animaux. Nous avons évalué que 3 souris par concentration d’agent anticancéreux suffiront pour déterminer si la molécule entraine un effet thérapeutique. Ensuite, 10 souris par groupe seront utilisées afin de pouvoir comparer les groupes statistiquement.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans un environnement enrichi par des objets contenant de la paille, de la nourriture et de l’eau à volonté. L'utilisation d'anesthésies gazeuses et la présence d'un tapis chauffant permettent d'assurer un réveil rapide des animaux. Du gel ophtalmologique sera appliqué sur les yeux afin de compenser la sécheresse oculaire lors des anesthésies. Afin d'administrer l'agent anticancéreux, nous testerons l'utilisation de pompes osmotiques implantables sous la peau de l'animal et reliées via un cathéter à la veine jugulaire. Ceci permet une administration continue des molécules, et réduira le stress de l'animal comparé à des injections quotidiennes nécessitant une contention voire une anesthésie générale. Une grille de scorage a été établie pour permettre de suivre l’état des animaux deux fois par semaine minimum. Différents critères ont été établis pour évaluer le bien-être tant au niveau de l’apparence physique, du comportement, du poids de corps, de la respiration, de la température corporelle et de signes cliniques au niveau tumoral. Chaque critère est noté sur 3. Si le score total est supérieur à 4, une prise en charge analgésique de l’animal devra être réalisée. Si le score atteint 10, l’animal sera euthanasié dans la journée, après une dernière session IRM. Les souris seront pesées juste avant les procédures de mise en place d'un modèle tumoral, puis deux fois par semaine. Lorsque une perte de poids de 10% sera mesurée (signifiant l’entrée en phase critique), les animaux seront pesés 3 fois par semaine. Lors de ces pesées, les volumes des tumeurs sous-cutanées seront mesurés grâce à un pied à coulisse. Dès les premiers signes de mal-être (score supérieur à 4), les animaux seront pris en charge par un analgésique. Si besoin, une crème sera appliquée pour désinfecter les lésions tumorales; 1 goutte dans l’oeil d’un désinfectant oculaire sera déposée 2 fois par jour en cas de besoin de soins oculaires. Du gel diet sera mis-à-disposition dans les cages dès que les animaux auront perdu 10% de leurs poids initial. Une réhydratation pourra être réalisée grâce à une injection sous-cutanée de glucose 5%. Le nombre d’animaux par cage pourra être réduit pour isoler les animaux les plus affaiblis, et un enrichissement renforcé pourra être appliqué. Des points limites ont été instaurés prenant en compte le modèle tumoral, induisant une euthanasie dans la journée après une dernière session IRM.

Choix des espèces

La souris permet de développer de nombreux modèles tumoraux, dont nous avons l’expertise. Les cellules cancéreuses d'origine murine seront injectées dans des souris possédant un système immunitaire actif. Les souris immunodéficientes seront injectées avec des cellules cancéreuses d'origine humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge jeune adulte (à partir de 10 semaines), car nous souhaitons mimer le développement d'un cancer chez l'homme adulte.

20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de gravité modérée. Immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules humaines de cancer du foie puis des injections répétées d'un peptide cinq jours par semaine pendant environ un mois, avec surveillance de la croissance tumorale et du poids, pour évaluer l'effet antitumoral du peptide. Le projet fait suite à des résultats in vitro montrant une réduction des cellules cancéreuses. Le porteur affirme ne pas disposer d'alternative et juge nécessaire de tester l'effet dans un "système complet", la souris.

Objectifs

Le cancer du foie est selon l’OMS le septième cancer observé en termes d’incidence avec environ 782 000 nouveaux cas mondiaux par an. Malgré les progrès récents en matière de diagnostic et de traitement, ce cancer du foie est fréquemment diagnostiqué à un stade déjà avancé et avec un mauvais pronostic d’évolution. Les modèles animaux de greffes de tumeurs peuvent permettre de mieux comprendre la réponse aux médicaments chez l'Homme et de découvrir de nouveaux traitements anticancéreux. Les cellules hépatiques utilisées dans cette étude sont issues d'un patient atteint d'un cancer du foie. L’injection de ces cellules chez des souris permet ainsi d’étudier l’effet d’immunothérapies sur des cellules humaines. Le but de ce projet est d’analyser si le peptide thérapeutique a un effet anti tumoral chez des souris avec une greffe de cellules de patients atteints de cancer du foie. Ce projet est encouragé par des résulats in vitro précédents qui ont montré que ce peptide réduisait le nombre de cellules du cancer du foie.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer notre compréhension des effets d’un peptide sur une lignée tumorale. Nous pourrons ainsi comprendre sa capacité d'action et l'impact de son injection sur des lignée tumorales connues. C’est un prérequis avant de tester notre stratégie thérapeutique dans différentes conditions expérimentales. Cette connaissance nous permettra à long terme de mettre en place des peptides thérapeutiques permettant de soigner certaines tumeurs du cancer du foie chez l'Homme.

Procédures

Durant cette étude, nous procéderons sur des souris vigiles à : - des injections par voie sous-cutanée (1X à l'age de 10 semaines) (20 animaux) (durée d'une injection : moins d'une minute) - des injections par voie intrapéritonéale (5X/semaine, sur une durée de 1 mois environ (20 animaux) (durée d'une injection : moins d'une minute)

Impact sur les animaux

Ce projet comprend le developpement de tumeurs, ainsi le bien-être des animaux sera surveillé de manière attentive. Le poids des animaux et la croissance tumorale seront ainsi enregistrés tout au long de l’étude. De plus, les injections des cellules et les injections répétées de peptide peuvent également entraîner des nuisances.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des expériences.

Remplacement

Le peptide utilisé dans cette étude a été testé in vitro sur des cellules de cancer du foie et a entrainé la réduction du nombre de cellules cancéreuses. Ces résultats nous encouragent à tester son effet dans une étude chez l’animal pour valider l’effet antitumoral. Actuellement, nous ne disposons pas d'alternative pour la validation de l'efficacité d'un traitement qui stimule le système immunitaire. Nous devons en effet étudier cet effet dans un système complet et compétent, tel que la souris, le système in vitro ne pouvant apporter un même niveau d’information.

Réduction

Les effectifs de 10 animaux par groupe ont été mis en place suite aux prérequis statistiques, permettant, tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés, d'obtenir une réponse statistiquement significative et exploitable. En fonction de la normalité des données (distribution des données en cloche) nous utiliserons les tests statistiques adéquates pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes expérimentaux (traitées avec le peptide vs traitées avec le véhicule).

Raffinement

Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe) permettant une réduction du stress. Par ailleurs, nous avons mis en place les points limites nécessaires, liés au volume des tumeurs portées par les animaux et à l'évolution probable de l'état de santé. Les animaux seront observés quotidiennement pour s'assurer que leur état de santé n'est pas détérioré et nous suivrons à chaque pesée (deux fois par semaine) l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Les tumeurs seront aussi palpées (pour détecter leur présence précoce), leurs volumes seront mesurés 2 fois par semaine et nous observerons aussi leur aspect. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer la mise à mort de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. Le cas échéant, des soins locaux par spray de dermidine(R) seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

La souris constitue un bon modèle pour l'étude en oncologie. Il s'agit d’un mammifère au système immunitaire assez proche de l'Homme qui permet d’utiliser les données générées dans une approche translationnelle valide. Les souris Balb/C nude sont particulièrement utilisées comme souris receveuses de greffe. En effet, le profond déficit immunitaire de ces souris permet la prise de greffe de cellules humaines et offre la possibilité d’étudier l’effet d’immunothérapies avec des cellules humaines chez un hôte murin. Cette lignée ne présente pas de phénotype dommageable. De nombreux outils permettent de caractériser les réponses aux traitements antitumoraux chez la souris. Par ailleurs, ce modèle est facile à manipuler et à héberger et nous disposons d'une bonne connaissance des mécanismes d'actions activés lors de la mise en place de tumeurs. Par ailleurs le cout d’hébergement est faible et la reproduction rapide. Les souris seront utilisées à l’âge de 10 semaines, soit à à un stade correspond à des jeunes adultes, permettant une bonne prise de greffe.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de gravité modérée. Rendues obèses par un régime gras, elles reçoivent un gavage quotidien, des prélèvements sanguins hebdomadaires et des prélèvements de fèces répétés, avec des risques d'irritation du larynx ou de fausse route liés au gavage et des troubles digestifs, pour tester si une bactérie intestinale réduit l'inflammation liée à l'obésité. Le porteur ne détaille aucun test comportemental. Il affirme qu'"il n'existe pas de méthode alternative", le modèle d'obésité alimentaire chez le rongeur étant présenté comme classique.

Objectifs

La littérature scientifique montre que l’obésité d’origine alimentaire est associée à une diminution de la prévalence d’une bactérie particulière du microbiote intestinal humain. De plus, il a été montré que l’obésité d’origine alimentaire provoque une inflammation systémique de bas grade, ou méta-inflammation. De précédentes études menées par une équipe de recherche ont montré que l’administration par gavage d’une souche particulière de cette bactérie permet de réduire la prise de poids de souris nourries par un régime riche en gras. L’objectif de l’étude est de déterminer si l’administration de cette bactérie permet également de réduire l’inflammation induite par l’obésité d’origine alimentaire chez des souris déjà obèses.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence les potentiels effets anti-inflammatoires de Xla1 sur l’inflammation systémique induite par l’obésité. Dans un premier temps, il permettra de déterminer si la prise de Xla1 modifie l’inflammation systémique d’une souris mince. De plus, il permettra de déterminer si, dans un contexte d’obésité, Xla1 permet de réduire l’inflammation systémique ou locale, notamment au niveau du colon.

Procédures

Les souris seront soumises à un régime normal ou riche en graisse pendant 8 semaines. Une partie des souris sera suivi pendant deux semaines, avec pesée journalière, prise de sang hebdomadaire et prélèvement de fèces 4 fois par semaine. Ces souris seront aussi gavées quotidiennement à partir d’une semaine après réception pendant une semaine. Le reste des souris sera suivi pendant 8 semaines, avec pesée journalière, prise de sang hebdomadaire et prélèvement de fèces 4 fois par semaine. Les souris seront aussi gavées quotidiennement à partir d’une semaine après réception pendant 7 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux nourris avec un régime riche en gras pendant 12 semaines peuvent développer des effets indésirables liés à l’obésité. Notamment, un début de diabète entrainant une polyurie et/ou une polydipsie peuvent être observés. Pour le confort des animaux, la litière pourra être changée plus régulièrement et de l’eau sera à disposition ad libitum. La procédure de gavage peut entrainer des irritations du larynx ou des risques de fausse route pendant l’administration. La prise du traitement par Xla1 ou le véhicule peut entrainer des modifications du confort digestif des animaux, avec possibles diarrhées/constipations ou maux de ventre. Enfin, des saignements peuvent être observés à la suite des prises de sang.

Devenir

150 animaux sont inclus dans la procédure 1. Ces animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale : une partie 2 semaines après réception, une autre 8 semaines après réception.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à ce projet car la prévention de l'obésité d'origine alimentaire (DIO) chez le rongeur est le modèle classique pour étudier l'effet des médicaments anti-obésité. De plus, il est nécessaire d’effectuer ces expériences sur des souris déjà obèses afin d’observer un état inflammatoire induit par l’obésité et ainsi déterminer l’efficacité de Xla1 sur l’inflammation. Des expériences in vitro préliminaires ont conforté les résultats observés mais la confirmation de ces résultats sur un organisme complexe est nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé grâce à des expériences préliminaires : ces expériences ont montré que 10 animaux par groupes permettaient de réaliser des tests statistiques robustes (ANOVA) notamment sur le dosage de l’IL-6. De plus, le nombre d’animaux à sacrifier en début d’expérience a été réduit par 2 : les animaux n’ayant subi aucun traitement, la variabilité entre les souris sera réduite et permettra un test statistique robuste malgré un échantillon réduit. L’expérience sera répétée 3 fois pour confirmer les résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être (en groupe). Notamment, pour leur confort, les animaux obèses seront hébergés par 2 ou 3 maximum, et les animaux minces par 5. Les cages seront agrémentées d’un milieu enrichi avec des tunnels en carton, dômes et bâtonnets permettant la création de nids afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Les prises de sang submandibulaires seront réalisées sur des animaux vigiles. Pour leur confort et réduire le stress, les tentatives de piqûres seront réduites au minimum (deux tentatives maximum). L'inconfort et la souffrance seront limités grâce à l'utilisation d'un tableau de score, permettant l'établissement de points limites et la mise en place de mesures adaptées aux événements rencontrés (ex. injection d'anti-inflammatoire, utilisation de crème cicatrisantes, enrichissement des cages, adaptation de la nourriture).

Choix des espèces

Nous utiliserons les souris C57Bl/6 pour cette expérimentation. Le comportement alimentaire, la balance énergétique et le métabolisme glucidique et lipidique sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. De plus, ces souris possèdent un système immunitaire fonctionnel permettant d’étudier les effets de l’inflammation induite par l’obésité. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 18 et 20 semaines) car le développement des organes sera terminé. De plus, il est nécessaire que les souris soient au moins nourries 12 semaines avec un régime riche en gras afin de pouvoir observer l’établissement de l’inflammation induite par l’obésité. Chez le fournisseur, après 6 semaines de croissance, les souris seront donc nourries au moins 12 semaines avec un régime riche en gras. Les souris contrôles seront sélectionnées parmi la fratrie des souris obèses et seront nourries à partir de 6 semaines et pendant la même durée que les souris obèses avec une alimentation standard. Toutes les souris seront donc âgées de 18 à 20 semaines lors de leur réception et du début de la procédure.

338 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de gravité modérée. Chaque souris reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau puis jusqu'à cinq injections de virus oncolytiques, avec des douleurs liées aux injections et à la croissance des tumeurs, la mise à mort intervenant à 20 % de perte de poids. Le projet teste des virus porteurs de protéines chimériques contre le cancer. Le porteur indique disposer de cultures 3D, sphéroïdes et puces microfluidiques, pour une partie de ses expériences, mais juge "l'organisme entier" nécessaire pour évaluer les effets immunitaires.

Objectifs

Les virus oncolytiques sont de nouveaux agents thérapeutiques dont les développements récents participent à l'essor des traitements par immunothérapie. Ces virus présentent 3 modes d’actions principaux, à savoir la capacité à 1) tuer directement les cellules tumorales, 2) induire une réponse immunitaire anti-tumorale et 3) vectoriser des protéines thérapeutiques qui seront uniquement produites dans le microenvironnement tumoral par les cellules cancéreuses infectées. Cette dernière propriété fait actuellement l’objet de nombreuses recherches au niveau international mais des questions importantes demeurent quant aux transgènes thérapeutiques à utiliser et aux conditions dans lesquelles ils doivent être administrés in vivo. Notre projet vise ainsi à étudier, chez la souris immunocompétente, les effets thérapeutiques de virus oncolytiques contenant un nouveau type de transgène codant pour des protéines chimériques qui cibleront plusieurs mécanismes immunitaires au sein du microenvironnement tumoral. Ces protéines chimériques, qui ont été développées dans notre laboratoire, comportent 3 domaines fonctionnels (inhibition des points de contrôle immunitaire, présentation antigénique, co-stimulation) et donnent des résultats très encourageants in vitro. Cependant, l’évaluation de ces différents mécanismes dans une optique de transfert vers la clinique requiert le passage dans des modèles animaux vivants qui reproduisent de façon pertinente la physiologie des tumeurs et les réponses immunitaires systémiques associées.

Bénéfices attendus

Les efforts réalisés pour comprendre la biologie des tumeurs ainsi que l’amélioration continuelle des traitements tels que la chimiothérapie, la radiothérapie, et plus récemment l’immunothérapie ont déjà permis d’augmenter la survie des patients atteints de cancers. Cependant, dans de nombreux cas ces traitements présentent une efficacité limitée. De nouvelles molécules thérapeutiques potentiellement très efficaces nécessitent une vectorisation appropriée pour profiter de leur efficacité tout en limitant les effets secondaires. Il a ainsi été montré qu’une vectorisation appropriée des agents anti-cancéreux permettait de diminuer la morbidité associée au traitement mais aussi d’en améliorer l’efficacité et de limiter l’établissement d’une résistance dans les cellules tumorales. Ce type de stratégie thérapeutique est d’autant plus intéressant dans le cas de cancers très agressifs pour lesquels nous ne disposons pas encore d’options thérapeutiques satisfaisantes. L’utilisation de virus oncolytiques injectés par voie systémique pour vectoriser des molécules au sein même des tumeurs est une approche innovante destinée à répondre à ces problématiques. En créant de nouvelles protéines chimériques très actives et en les combinant au potentiel de vectorisation des virus oncolytiques, nous espérons pouvoir apporter des réponses thérapeutiques à des problèmes actuels en cancérologie.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections sous-cutanées de cellules tumorales puis à des injections intraveineuses, intra-péritonéales et/ou intra-tumorales répétées de traitements. Chaque injection durera une trentaine de secondes, à raison d'un maximum de 5 injections (1 challenge + 4 traitements) par animal.

Impact sur les animaux

Nous avons préalablement pu vérifier que l’injection de virus oncolytiques aux doses prévues n’entraîne pas de morbidité particulière ou de douleur chez les animaux. Concernant la protéine thérapeutique ScFv-OVA-dm41BBL, nous n’avons pour le moment pas de données in vivo. Les données de la littérature sur les différents domaines protéiques qui la composent suggèrent que des effets secondaires auto-immuns pourraient être observés. Une attention particulière sera apportée au suivi de ces effets éventuels (peau, intestin et foie notamment). Chacune des procédures nécessitera la réalisation d'injections intraveineuse, intra-péritonéales et/ou intra-tumorales qui peuvent être à l'origine d'une douleur légère et générer un stress modéré et ponctuel chez les animaux. Dans toutes les procédures, l'établissement et la croissance des tumeurs pourra aussi générer des douleurs qui seront détectées précocement grâce aux points limites préalablement établis pour chaque procédure.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Notre laboratoire a développé au cours des dernières années des systèmes de culture in vitro complexes (sphéroïdes, puces microfluidiques) qui nous permettent de nous affranchir de l'utilisation d'animaux pour une majorité de nos expériences. L'approche sur organisme entier nous permet cependant d’évaluer l’effet thérapeutique des virus et de leurs transgènes mais également les effets toxiques potentiels sur divers tissus tels que le compartiment hématopoïétique par exemple. Une telle complexité n’est malheureusement pas encore reproductible in vitro. Dans la mesure où nous souhaitons étudier le ciblage in vivo des cellules tumorales dans un environnement complexe après administration des virus oncolytiques en intraveineux, comme c’est le cas en clinique, ces expériences nécessitent d’être réalisées sur l’animal. Nous avons déjà validé la spécificité de nos virus sur un large panel de lignées cellulaires, en 2D et en 3D. Cependant, ces expériences ne permettent pas de présumer de la biodistribution réelle et des effets systémiques de nos traitements une fois injectés dans un organisme, en particulier les effets immunitaires.

Réduction

Les différents paramètres mesurés seront comparés par des tests statistiques adaptés aux très petits échantillons (n

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages ventilées (5 souris maximum par cage) en milieu enrichi (copeaux de litière, lambeaux de papier) dans des salles à température et hygrométrie contrôlées. Les litières sont changées chaque semaine par le personnel qualifié de l’animalerie. Toutes les procédures prévues dans ce projet sont de classe légère à modérée. L’utilisation d’antalgiques morphiniques n’est pas envisagée car les animaux seront immédiatement euthanasiés en cas d’absence de réponse au traitement ou d’atteinte d’un point limite. Des points limites adaptés à l’espèce utilisée ont été prévus pour chaque procédure. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel zootechnique et les expérimentateurs. En cas d’atteinte d’un des points limites suivants un signalement sera fait au responsable de la SBEA ainsi qu’au responsable de l’étude ou à son suppléant. Les animaux seront alors euthanasiés directement afin de prévenir toute douleur au stade le plus précoce possible et d’éviter la collecte de données altérées en raison d’un stress chez les animaux. •Critères cliniques : - Mauvais état du pelage (diminution du toilettage, poil ébouriffé, perte excessive de poils, plaies) - Faciès contracté et position anormale des vibrisses - Yeux clos et larmoyant - Gonflement abdominal pouvant être causé par l’accumulation de liquide d’ascites en raison des tumeurs - Fèces liquides ou absence de fèces •Critères comportementaux : - Position recourbée (dos voûté, prostration) - Diminution de la mobilité interférant avec l’activité de base de l’animal (alimentation, toilettage) - Réduction de l’activité, isolement - Signes de stress (hyper-sensibilité aux bruits, agressivité, stéréotypie) •Critères zootechniques - Perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids initial de l’animal ou comparativement au poids moyen des individus soumis au même protocole expérimental

Choix des espèces

L’objectif principal étant d’évaluer les effets immunitaires de nos nouvelles molécules chimériques et de leur vectorisation par des virus oncolytiques, l’utilisation de souris immunocompétentes et de modèles tumoraux syngéniques est essentielle. L’implantation sous-cutanée des cellules tumorales se justifie par le suivi facilité de la croissance tumorale et la comparaison avec les données de la littérature qui utilisent des approches similaires. Nous utiliserons des animaux âgés de 7 à 10 semaines (jeunes adultes). Le stade de développement est justifié par la nécessité d'avoir des animaux adultes ayant un système immunitaire mature.