Rongeurs

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux chirurgies à une semaine d'intervalle pour l'ablation de cinq sixièmes des reins, puis un régime riche en phosphate pendant dix semaines afin d'installer une insuffisance rénale chronique avec calcifications vasculaires. Le porteur décrit une hypertension attendue chez 75 à 80 % des animaux opérés et précise que les prélèvements sont terminaux. Il présente ce projet comme un préliminaire "indispensable" à l'étude des mécanismes de la maladie et affirme que l'expérimentation sur animal entier est "indispensable" pour une pathologie systémique.

Objectifs

Un taux élevé de phosphate (Pi) sérique est associée au développement de calcifications vasculaires (CV) chez les personnes atteintes d'insuffisance rénale chronique (IRC) et dans la population générale, et peut être une situation potentiellement mortelle. En effet, l’IRC aboutit à une hyperphosphatémie qui déclenche la calcification de la paroi des vaisseaux, ce qui entraîne une rigidification du système vasculaire et contribue au développement des maladies cardiovasculaires. Des études sur la population ont montré que plus la fonction rénale est altérée plus les risques de mortalité sont élevés. Cependant, bien que le rôle des niveaux élevés de Pi dans le développement des CV est largement reconnu, son mode d'action est encore inconnu et ne peut donc pas être ciblé de manière appropriée. L'objectif global de notre projet de recherche est de découvrir les mécanismes d'action du Pi qui entraînent le développement des CV dans le contexte de l'IRC, et d'identifier des cibles thérapeutiques putatives capables de contrecarrer ses effets délétères. Les modèles animaux décrits dans la littérature ne sont pas adaptés à la question scientifique que nous posons. Ainsi, la première étape qui fait l’objet de cette demande d'autorisation, consiste à optimiser la mise au point d’un modèle de souris présentant une insuffisance rénale chronique avec CV associées. L’IRC sera induite par ablation de 5/6ème des reins, technique que le chirurgien impliqué dans ce projet maitrise parfaitement. Pour favoriser l’apparition de calcifications vasculaires, les souris ayant subi cette ablation seront soumises à un régime riche en phosphate pendant 10 semaines. L'apparitions des CV sera évaluée par coloration spécifique des arches aortiques prélevés à partir de nos modèles.

Bénéfices attendus

Ce projet est un préliminaire indispensable permettant d’établir un modèle de souris optimisé pour pouvoir par la suite évaluer les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables des effets toxiques de l’hyperphosphatémie chez les patients en IRC. Les connaissances sur les mécanismes responsables de l’évolution de cette pathologie et la gestion de l'IRC ont considérablement augmenté, et le contrôle du niveau de phosphate dans le sang à tous les stades de l'IRC est considéré comme l'un des aspects les plus importants pour améliorer les résultats cliniques de l'IRC. En effet, un taux élevé de Pi sérique est le plus important facteur de risque associé à la CV dans la population générale. Pour faire face à la toxicité du Pi et à ses conséquences sur les risques cardiovasculaires, la compréhension des actions moléculaires et cellulaires du Pi est d'une importance capitale. Elle permettra de contrôler les effets néfastes de la toxicité du Pi et de proposer des recommandations diététiques au niveau sociétal. Cela aura de grandes implications sociales et économiques en matière de bien-être et de vieillissement en bonne santé.

Procédures

Deux chirurgies à une semaine d'intervalle sont nécessaires pour induire l'IRC chez la souris. Deux prélèvements de 2-3 gouttes de sang, avant la chirurgie 1 (2-3 gouttes de sang à partir de la veine de la joue) et en fin de procédure expérimentale (prélèvement terminal sans réveil), seront réalisés.

Impact sur les animaux

L’insuffisance rénale chronique induite par néphrectomie des 5/6 est bien tolérée chez la souris. L’expérience du chirurgien en charge de l’opération porte sur plusieurs centaines d’animaux, sans mortalité observée dans les 3 mois suivant la chirurgie. Les niveaux d’insuffisance rénale obtenus par néphrectomie des 5/6 restent modérées grâce à l’hypertrophie de la portion résiduelle de rein. En effet la concentration plasmatique d’urée (un marqueur classique de la fonction rénale) est de 5-6 mmol/L chez les souris contrôle et de 18-25 mmol/L chez les souris néphrectomisée. Pour faire le parallèle avec la clinique humaine, nous avons par le passé mesuré la clairance de la créatinine chez ces animaux et pu grader l’insuffisance rénale comme correspondant à un stade 3-4 en clinique humaine (stades pour lesquels les stratégies de suppléance rénale ne sont pas encore mises en oeuvre). Les principales manifestations cliniques de l’insuffisance rénale chronique sont une hypertension artérielle qui survient chez 75 -80% des animaux néphrectomisés et une protéinurie. La supplémentation de l’eau de boisson des animaux néphrectomisés avec du bicarbonate de sodium (80 mM) permet d'empêcher les acidoses.

Devenir

des prélèvements terminaux sans réveil pour tous les animaux sont nécessaires pour évaluer l'apparition des calcifications vasculaires dans ce modèle.

Remplacement

S’agissant d’une maladie systémique (insuffisance rénale chronique), l’expérimentation sur animal entier est indispensable pour évaluer le rôle des différents organes impliqués dans cette pathologie

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude (72 souris) a été calculé au plus juste afin d’offrir la puissance statistique maximum. Pour calculer la taille des groupes et les analyses de puissance statistique, nous avons utilisé l'outil G*Power (erreur de type I = 0,05)

Raffinement

Le protocole chirurgical sera réalisé sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane offrant à la fois une bonne sécurité et un bon confort anesthésique. Un protocole d’analgésie (associant anesthésie locale per-opératoire et l’usage de dérivés morphiniques) et un système d'évaluation du bien être et de la douleur permettra, de prévenir et de contrôler efficacement les douleurs post-opératoires. Les conditions d'hébergement sont adaptées aux besoins des souris (regroupement par 5 souris maximum, température, enrichissement du milieu de vie avec du frisotis permettant aux souris de se fabriquer un nid)

Choix des espèces

Nous avons choisi de mettre en place ce modèle d’étude chez la souris car nous utiliserons dans un deuxième temps des souris génétiquement modifiées, toutes sur fond génétiques C56BL/6, pour des gènes importants pour l’homéostasie phosphocalcique afin de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires des effets du Pi dans l’IRC avec CV associées. Des souris adultes de 20 semaines seront utilisées pour pouvoir confronter nos résultats avec d'autres modèles décrits dans la littérature.

240 souris dites humanisées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des cellules immunitaires humaines puis un vecteur de thérapie génique AAV, avec prélèvements sanguins hebdomadaires à la jugulaire pendant douze semaines, injections répétées de LPS, pompes implantées chirurgicalement sous le dos et anticorps injectés trois fois par semaine. Le porteur indique que les souris sont mises à mort par décapitation ou pentobarbital après un prélèvement terminal de sang et d'organes. Il affirme que les méthodes in vitro ou in silico ne rendent pas compte de la réponse immunitaire dans son ensemble et conclut que l'emploi d'un organisme vivant est "nécessaire".

Objectifs

La thérapie génique consiste à introduire un gène thérapeutique dans des cellules pour traiter une maladie. Pour véhiculer ce gène, les vecteurs viraux, et en particulier les virus adéno-associés (AAVr) constituent des outils de choix. Une seule injection d’AAVr permet une expression à long terme du gène thérapeutique. Néanmoins, malgré de récents succès, un des facteurs majeurs pouvant limiter l’efficacité du transfert de gène est la réponse immunitaire dirigée contre ce vecteur. Cette réponse immune délétère s'explique, en partie, par le fait que les humains sont naturellement infectés au cours de leur vie par des virus AAV sauvages. Au laboratoire, nous avons récemment développé un modèle animal pour mimer la réponse préexistante anti-AAV. Ce modèle semble reproduire la réponse immune anti-AAV observée chez l’humain. La génération de ce modèle animal ouvre un champ d’applications important pour aider au développement de médicaments de thérapie génique innovants plus efficaces et plus sûrs sur le plan immunologique pour prévenir un rejet du transfert de gène. Ainsi, fort de ces constats, nous proposons de tester, dans notre modèle de souris humanisées, 2 stratégies pour moduler la réponse immunitaire anti-AAV préexistante et ainsi prévenir le rejet lié au transfert de gène. La première stratégie consistera à utiliser l’interleukine 34 (IL-34) pour favoriser l’émergence de cellules immunitaires impliqués naturellement dans la modulation des réponses immunitaires. Dans la seconde stratégie, un anticorps anti- CD45RC sera utilisé pour moduler l’action des cellules exprimant fortement le marqueur CD45RC. L’objectif scientifique de ce nouveau projet est de développer une stratégie pour moduler la réponse immune préexistante dirigée contre le vecteur de thérapie génique.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer une méthode pour prévenir la réponse immunitaire anti-vecteur et permettre ainsi d’améliorer les traitements de thérapie génique à l’aide d’AAVr.

Procédures

Un prélèvement sanguin par semaine sera réalisé pendant 12 semaines. Les animaux seront anesthésiés et le sang sera prélevé au niveau de la jugulaire. La durée totale d’intervention est estimée à environ 3 mn. Chaque animal sera injecté 2 fois en intraveineuse dans la veine caudale sous anesthésie gazeuse. L’une pour l’injection d’AAVr à J 0, l’autre pour les cellules immunitaires humaines à J+1. La durée totale d’intervention est d’environ 5 mn. Les animaux recevront 3 injections en intra-péritonéale de LPS à J+1, J+2, J+3 après l’injection IV du vecteur. Une injection en IP se fait en moins d’une minute. Des injections IP d’IL-15 seront réalisées 2 fois par semaine pendant les 12 semaines de suivi du projet. Pour les animaux inclus dans la première stratégie d’immunomodulation. 48h avant injection de l’AAVr, des pompes Alzet rechargeables-iPrecio seront placées chirurgicalement sous la peau du dos des souris permettant de diffuser de l’IL-34 sur plusieurs jours. Le temps d’anesthésie, de préparation du champ opératoire et de la chirurgie est d’environ 30 mn. La recharge en IL-34, s’effectuera tous les 15 jours après palpation de l’orifice de la pompe rechargeable à travers la peau. La recharge s’effectue en moins de deux minute. Pour les animaux inclus dans la deuxième stratégie d’immunomodulation B, l’anticorps anti-CD45RC ou l’anticorps contrôle seront injectés par voie intraveineuse dans la veine caudale 3 fois par semaine pendant 4 semaines. Compte tenu de la fréquence, les animaux ne seront pas anesthésiés. Les souris seront placées dans un tunnel de contention pendant 2 minutes le temps de l’injection. En cas de stress marqué, dû à la répétition des procédures, les animaux seront anesthésiés en gazeuse.

Impact sur les animaux

Les différents produits ont tous déjà été administrés chez la souris à des doses supérieures ou égales à ce qui est envisagé dans ce projet, sans observation de signe clinique notable. L’utilisation de seringue à insuline équipée d’une petite aiguille de 30 G permet de limiter le désagrément de la piqûre. L’installation d’une pompe rechargeable-iPrecio nécessite une petite chirurgie pour la placer en sous-cutanée. L’animal sera sous analgésie en pré et post opératoire pendant 24h. Au-delà, aucune douleur n’est attendue.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie après chaque procédure et ce jusqu’à la fin du protocole (entre 1 et 3 mois maximum post-injection selon les réponses aux stratégies d’immunomodulations), jour de l’euthanasie et de la réalisation des prélèvements de tissus et d’organes. En ce qui concerne les animaux des différents groupes expérimentaux, notre protocole requiert un prélèvement terminal d'une grande quantité de sang sur lequel s'appuiera certaines analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques, mais également pour éliminer la plus grande majorité de sang des organes ou tissus tels que le foie, le cœur, la rate, les poumons, le cerveau, les reins ou encore les muscles squelettiques qui seront prélevés pour analyses. Les animaux subiront donc une anesthésie gazeuse préalable (isoflurane : induction 5%) suivie d’une décapitation qui sera systématiquement réalisée par du personnel compétent pratiquant cette technique en routine. Tous les animaux sont concernés par cette procédure exceptés les animaux inclus qui entrent dans le cadre de la procédure de perfusion du foie pour isolement des cellules. Dans le présent cas, le sang ne sera pas récupéré après perfusion hépatique, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane et mis à mort par injection de pentobarbital (Euthasol vet à la dose de 140 mg/kg en IV ou IC).

Remplacement

L'utilisation de méthodes alternatives tels que des techniques in vitro ou in silico ne permettent pas de rendre compte de la réponse immunitaire dans son ensemble, l'emploi d'un organisme vivant est donc nécessaire. La souris est un modèle de choix par sa petite taille, ses performances de reproduction et sa durée de vie. Jusqu’à présent aucun modèle animal n’a pu prédire une réponse immune préexistante contre le vecteur AAV car la plupart ne sont pas des hôtes naturels de l’AAV. Néanmoins, dans plusieurs essais cliniques cette réponse a été mise en évidence et a conduit à la perte de l’efficacité du traitement. Le récent développement d’un modèle de souris humanisées nous a permis de reproduire cette immunité préexistante en laboratoire. Ce modèle animal pourra nous permettre de développer des stratégies pour moduler la réponse immune et permettre le maintien de l’expression du gène thérapeutique à long terme.

Réduction

Chez l’humain, l’intensité de la réponse immune est variable, ainsi pour que les résultats soient statistiquement interprétables nous envisageons au maximum d’injecter les cellules de 10 donneurs humains. Au maximum, 240 animaux seront utilisés dans le projet. Si la variabilité de réponse est faible entre les donneurs et donc que les résultats sont statistiquement interprétables avant d’atteindre les 10 donneurs, le protocole sera arrêté pour ne pas mettre à mort des animaux supplémentaires. Ce nombre a été calculé statistiquement et permet de réduire le nombre d'animaux au maximum tout en obtenant des résultats probants.

Raffinement

Le souci du bien-être animal passera par : (i) De bonnes conditions d’hébergements. Par exemple pour les cages comportant plus de 2 souris, une bonne quantité de frisottis en carton est ajouté dans chaque cage pour enrichir l’environnement des animaux. Pour les cages comportant moins de 3 animaux, en plus des frisottis, est ajouté un igloo en cellulose. Des petits morceaux de bois à ronger sont distribués. Les litières sont changées 2 fois par semaine. Un suivi régulier des animaux, chaque cage est inspectée quotidiennement pour vérifier que les animaux se portent bien ainsi que pour contrôler le niveau de nourriture et d’eau. (ii)L’instauration de points limites pertinents et précoces. La détermination des points limites se basera sur la grille d'évaluation ci-dessous, adaptée aux procédures envisagées. En cas de 3 signes cliniques notables ou 1 signe clinique sévère, l'euthanasie sera décidée. -Signes cliniques notables : lésion sans effraction cutanée, agitation, hypomobilité, hyperréactivité, résistance à la manipulation, stéréotypie, poil piqué, gonflement abdominal, perte de 10% à 20% du poids, diminution ou absence de prise de nourriture/d'eau... -Signes cliniques sévères : lésion sévère, saignement incontrôlable, akinésie, convulsions, respiration difficile ou suffocation, absence de fèces ou fèces liquides, déshydratation, perte >20% du poids, douleur à la palpation… (iii)La mise en place de mesures adaptées (anesthésie, analgésie ou mise à mort par des méthodes reconnues).

Choix des espèces

Dans la majorité des études de thérapie génique ou d'immunologie, une espèce mammifère est requise pour avoir une pertinence clinique. L'utilisation de la souris est justifiée à la fois par l'existence de plusieurs modèles murins humanisés ainsi que par la possibilité de constituer des groupes suffisamment larges pour effectuer des analyses statistiques. Le modèle murin (NOD/SCID/HLA-A2) est couramment utilisé en transfert adoptif de cellules humaines, car il permet une bonne survie des cellules transférées. L'expression de l'allèle du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I HLA-A2.1 est indispensable car les cellules humaines transférées ont un répertoire restreint à cet allèle. La preuve de concept de modélisation de la réponse immune anti-AAV préexistante étant faite chez la souris NSG HLA A2, le développement de stratégies d’immunomodulation dans ce modèle est privilégié. Les souris seront injectées entre 6 et 14 semaines d’âge. À ce stade, les tissus de soutien et les niches nécessaires au support et à la survie de transfert adoptif de cellules sont suffisamment développés pour permettre le succès du transfert adoptif.

240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une pompe osmotique est implantée sous la peau par chirurgie, puis les rats subissent pendant cinq jours des prélèvements sanguins quotidiens représentant 3,5 à 7 % de leur volume sanguin et des injections sous-cutanées, pour tester de nouvelles molécules contre l'hyponatrémie. Le porteur affirme avoir déjà prouvé l'efficacité de sa molécule brevetée et renvoie au conditionnel l'intérêt pour les patients, avec moins d'effets indésirables que le Tolvaptan. Sur le remplacement, il indique qu'il serait "nécessaire" de démontrer l'efficacité chez l'animal avant l'Homme et retient le rat comme modèle reconnu par la communauté internationale.

Objectifs

L’hyponatrémie, c’est-à-dire la diminution de la concentration de sodium du sang, est une pathologie fréquente, en particulier en hospitalisation. C’est un problème de santé publique puisqu’elle augmente la mortalité quelle que soit la pathologie responsable. Le Tolvaptan est un médicament, utilisé en clinique chez l’Homme dans cette pathologie. Toutefois, son utilisation est limitée, notamment du fait d’un risque de correction trop rapide de l’hyponatrémie et d’une toxicité au niveau du foie. Il paraît donc nécessaire de rechercher de nouvelles options thérapeutiques. Une nouvelle molécule a été développée dans notre laboratoire. Cette molécule est plus sélective et plus puissante que le Tolvaptan. De plus, cette molécule est moins toxique pour le foie. Nous avons déjà prouvé l’efficacité de notre molécule chez l’animal contre cette pathologie par de premières expériences. Nous voudrions maintenant valider chez le rongeur des versions de cette molécule optimisées en laboratoire et brevetées en 2021.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer l’effet, chez le rat, de nouvelles molécules pour traiter l’hyponatrémie qui devraient présenter moins d’effets indésirables que les traitements actuels, afin d’envisager une utilisation de ces produits chez l’Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale courte (d’une durée d’environ 10 minutes) pour mettre en place une pompe osmotique sous-cutanée. Les animaux vont être placés en cage individuelle permettant de recueillir les urines et les fèces pendant 5 jours. Pendant ces 5 jours, les animaux vont être soumis à des prélèvements sanguins (d’une durée d’environ 3 minutes) quotidiens d’un volume de sang correspondant à environ 3.5-7% de leur volume sanguin total chaque jour. Pendant les 3 derniers jours, les animaux vont être injectés quotidiennement par voie sous-cutanée (d’une durée inférieure à une minute).

Impact sur les animaux

La mise en place du modèle d’hyponatrémie nécessitera l’administration continue sous-cutanée par pompe osmotique d’une molécule, l’apport d’une nourriture semi-liquide et l’hébergement dans des cages spéciales permettant de récupérer les urines. Les effets indésirables relatifs à l’implantation de la pompe osmotique sous-cutanée sont potentiellement une douleur relative à la chirurgie, une infection et/ou une mauvaise cicatrisation au niveau du site chirurgical. Ces effets débuteront lors de la chirurgie et dureront au maximum 2 jours. Les effets indésirables relatifs à l’apport d’une nourriture semi-liquide et à l’hébergement dans des cages spéciales sont potentiellement un stress pour les animaux. Ces effets dureront au maximum 5 jours. Le traitement par les molécules candidates nécessitera des injections sous-cutanées quotidiennes. Les effets indésirables relatifs au geste quotidien d’injections sous-cutanées sont potentiellement une douleur au niveau du site d’injection et un stress lié à la contention des animaux. Ces effets dureront au maximum 5 jours. Les dosages de la natrémie nécessiteront des prélèvement sanguins quotidiens. Les effets indésirables relatifs à ces prélèvements quotidiens sont potentiellement une douleur et une hypovolémie. Ces effets dureront au maximum 5 jours.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés au CO2 à la fin de la procédure afin de réaliser une autopsie.

Remplacement

L’objet de ce travail est d’étudier l’efficacité de nouveaux composés, jamais administrés chez l’Homme. Il existe donc un objectif clinique à court terme. Les expériences in vitro ont déjà été réalisées afin de valider l’affinité et la sélectivité des molécules pour leur cible. Avant d’évaluer l’effet de ces produits chez l’Homme, il est nécessaire de démontrer leur efficacité chez l’animal. Le modèle expérimental que nous avons choisi constitue un modèle pathologique fiable qui a déjà été utilisé pour développer des traitements chez l’Homme dans l’hyponatrémie.

Réduction

Nous allons réaliser notre étude sur un modèle déjà publié et bien décrit dans la littérature, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour la mise au point du modèle. Afin de limiter le nombre d’animaux, nous avons calculé le nombre d’animaux nécessaire par groupe via l’utilisation d’un test statistique. Pour réduire le nombre d’animaux, les doses de molécules thérapeutiques qui vont être étudiées ont été sélectionnées grâce à des études in vitro et in vivo antérieures. De plus, les résultats des expériences seront analysés au fur et à mesure afin de modifier si besoin les doses de produit utilisées et donc ne pas utiliser inutilement des animaux. Au total, 240 animaux au maximum seront utilisés pour ce projet.

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés en groupes dans un milieu enrichi pendant au minimum 8 jours. Une surveillance quotidienne des animaux par des personnes habilitées et formées sera effectuée. Afin de diminuer la douleur occasionnée par les chirurgies, des analgésiques injectables par voie sous-cutanée seront délivrés. Pendant toute chirurgie, les animaux seront maintenus à 37°C, leur rythme respiratoire sera observé avec attention, et ils seront réhydratés. À leur réveil, les animaux seront remis dans une cage propre dans un milieu enrichi et étroitement surveillés pendant au moins 48h. Pour réduire ou supprimer la douleur et le stress relatifs aux prélèvements et administrations sous-cutanées quotidiens, une pommade analgésique sera appliquée sur le site d’injection, 10 minutes avant la piqûre. La localisation du site d’injection variera quotidiennement et les injections seront réalisées dans une pièce au calme sans passage. Les animaux devront être placés dans des cages spéciales permettant le recueil de leurs urines au cours du temps. Le temps passé dans ces cages sera réduit au minimum (5 jours) et une observation quotidienne de tous les animaux sera réalisée. Pour réduire ou supprimer la douleur et le stress relatifs aux prélèvements quotidiens, les animaux seront anesthésiés.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce préalablement utilisée pour des expérimentations in vitro, ex vivo et in vivo dans le laboratoire pour tester l’effet des antagonistes des récepteurs à la vasopressine sur différents paramètres rénaux et cardiovasculaires. Conserver la même espèce animale permet d’éviter de renouveler certaines expériences et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. De plus, le modèle utilisé correspond à ceux préalablement décrits dans la littérature pour évaluer l’effet des traitements dans l’hyponatrémie. Il s’agit du modèle reconnu par la communauté internationale comme le plus adapté aux pathologies humaines. Les rats utilisés dans ce projet seront à un stade de développement similaire à celui utilisé dans les protocoles de la littérature, c’est-à-dire des rats âgés de plus de 6 semaines. Cela permettra la comparaison des résultats expérimentaux obtenus aux données de la littérature.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est implantée sous la peau, puis elles reçoivent par voie intraveineuse des formulations d'un photosensibilisateur avant prélèvement de sang et d'organes après mise à mort, pour comparer la diffusion de deux formes liposomales au produit de référence. Le porteur indique que les souris maintenues à l'obscurité jusqu'à 48 heures subissent un stress, la lumière étant évitée pour prévenir la photosensibilisation. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne peut être maintenu assez longtemps pour étudier cette diffusion dans l'"organisme entier".

Objectifs

La thérapie photodynamique est un traitement employé en cancérologie pour éradiquer les tumeurs de petite taille accessibles à la lumière. Le principe repose sur l’activation, en présence d’oxygène et de lumière, d’une molécule appelée photosensibilisateur qui se localise préférentiellement dans la tumeur. La meta-tétra(hydroxyphényl)-chlorine (mTHPC) connue sous le nom de Foscan® est approuvée en clinique pour le traitement alternatif à la chirurgie des tumeurs des voies aéro-digestives supérieures mais étant peu soluble dans l’eau, elle persiste longtemps au niveau du site d’injection, freinant sa distribution aux organes et notamment à la tumeur, et entrainant des problèmes de photosensibilisation cutanée. Les objectifs de ce projet sont d’étudier le devenir au cours du temps dans le sang (pharmacocinétique) et la biodistribution au niveau tissulaire et intratumoral par imagerie de fluorescence de 2 nouvelles formulations liposomales à base de mTHPC en comparaison avec le Foscan® comme référence, administrés par voie intraveineuse chez la souris après induction d’une tumeur sous-cutanée. Lorsque la taille de la tumeur aura atteint le volume requis, les souris recevront par voie intraveineuse l’une des deux formulations liposomales ou le Foscan®. Les prélèvements de sang réalisés sous anesthésie, d’organes (peau, muscle, foie, reins, cœur, poumons et intestins) et de tumeurs réalisés après la mise à mort des animaux, seront effectués à différents temps après injection des 2 nouvelles formulations liposomales à base de mTHPC ou du Foscan®, avec 5 souris par temps de prélèvement et par produit injecté.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet va permettre d’évaluer la pharmacocinétique et la biodistribution tissulaire et intratumorale de 2 nouvelles formulations liposomales à base de mTHPC en comparaison avec le foscan®, composé à base de mTHPC utilisé en clinique. Le Foscan® est en effet utilisé pour le traitement alternatif à la chirurgie des tumeurs des voies aéro-digestives supérieures mais étant peu soluble dans l’eau, il persiste longtemps au niveau du site d’injection, freinant sa distribution aux organes et notamment à la tumeur, et entrainant des problèmes de photosensibilisation cutanée. Les 2 nouvelles formulations liposomales à base de mTHPC développées devraient permettre une meilleure diffusion dans l’organisme au cours du temps afin de mieux cibler la tumeur et de limiter son accès aux organes, notamment au niveau de la peau pour limiter les problèmes de photosensibilisation cutanée. Les données issues de ce projet permettront d’envisager des études cliniques chez l’Homme avec l’une et/ou l’autre des 2 nouvelles formulations liposomales à base de mTHPC testées.

Procédures

Les 180 souris nécessaires à la réalisation de ce projet seront soumises à l’induction d’une tumeur sous-cutanée par injection d’une suspension de cellules tumorales effectuée une seule fois en moins d’une minute et sous anesthésie générale. Un suivi de la croissance tumorale sera effectué par mesure tous les 2 jours sur animal vigile de la taille de la tumeur, à l’aide d’un pied à coulisse, mesure effectuée en moins d’une minute. Une injection intraveineuse de formulations liposomales à évaluer ou du produit de référence utilisé (Foscan®) sera effectuée sous anesthésie générale sur les 180 souris, une seule fois et en une minute environ, lorsque la tumeur aura atteint un volume défini (350 à 400 mm3), à la dose de 0,3 mg/kg pour 105 souris, et à la dose de 7,0 mg/kg pour 75 souris. Un prélèvement de sang de 0,5 ml sera effectué sur 105 des 180 souris par prélèvement intracardiaque sous anesthésie générale effectué une seule fois et en une minute environ, avant leur mise à mort, afin d’étudier le devenir au cours du temps dans le sang des formulations liposomales injectées par rapport à celui du composé de référence (Foscan®), puis d’étudier leur distribution dans différents organes et la tumeur qui seront prélevés après la mise à mort. Une injection intracardiaque d’un produit de contraste permettant de visualiser les vaisseaux sanguins au niveau de la tumeur sera effectuée sur 75 des 180 souris, une seule fois et en une minute environ, sous anesthésie générale, 7 minutes avant leur mise à mort.

Impact sur les animaux

Un stress des animaux utilisés dans ce projet sera induit par le placement à l’obscurité après la réalisation de l’injection intraveineuse de formulations liposomales à base de mTHPC ou de Foscan® jusqu’à leur mise à mort, rendu nécessaire afin d’éviter les problèmes de photosensibilisation cutanée. Ce stress induit concernera les animaux qui seront mis à mort aux temps prolongés de la cinétique réalisée, correspondant donc aux temps 18 heures, 24 heures et 48 heures, soit 45 des 105 souris utilisées pour la partie pharmacocinétique et biodistribution tissulaire, et 30 des 45 souris utilisées pour la partie biodistribution intratumorale. Les autres animaux qui seront mis à mort aux temps courts de la cinétique réalisée, entre 30 minutes et 6 heures, le seront au cours du cycle normal jour/nuit auquel ils sont soumis. Pour ces raisons, et le fait également d’induire une tumeur sous-cutanée, de réaliser des injections de produits, sous anesthésies générales répétées mais de courte durée, la procédure expérimentale a été classée en sévérité modérée.

Devenir

A l’issue de l’unique procédure expérimentale, après ou non réalisation d’un prélèvement de sang, les souris seront mises à mort afin de permettre le prélèvement d’organes et de la tumeur, et de pouvoir ainsi réaliser un ensemble d’analyses permettant d’étudier la distribution au cours du temps des formulations liposomales et du produit de référence (Foscan®) qui auront été préalablement injectés.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro (culture de cellules) ou ex vivo (organes isolés) qui ne pourraient d’ailleurs pas être maintenus dans un état physiologique pendant une durée prolongée, afin d’étudier la diffusion dans l’organisme entier au cours du temps (pharmacocinétique) et dans des organes cibles (biodistribution) de composés injectés par voie générale. L’étude de la distribution intratumorale de molécules d’intérêt est nécessaire pour optimiser l’intervalle de temps entre l’injection et l’irradiation lumineuse (IDL = Intervalle Drogue-Lumière). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études antérieures, pour certaines publiées, ayant permis d’ajuster les temps de cinétique de prélèvements et montrer que 5 animaux par temps de prélèvement et par groupe de traitement était nécessaire et suffisant. D’autre part, l’objectif étant de comparer 2 nouvelles formulations liposomales à base de mTHPC au Foscan®, il n’est pas nécessaire d’utiliser de groupe d’animaux témoins recevant une formulation liposomale neutre, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les injections sous-cutanée de cellules tumorales et intraveineuse de formulations liposomales à base de mTHPC et de Foscan®, ainsi que le prélèvement sanguin, seront effectués sous anesthésie générale. Les souris seront observées quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré tous les 2 jours, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal atteint ou de 15% entre 2 pesées est observée, ou si des signes de toxicité des traitements, de déshydratation, de prostration prolongée, de non réponse à l’activité externe ou des modifications de leur comportement sont observés (difficultés à se déplacer, cachexie, vocalises, convulsions…), elles seront mis à mort dans des conditions éthiques. Une attention toute particulière sera portée aux animaux qui seront maintenus dans l’obscurité et mis à mort aux temps prolongés de la cinétique, 18 heures, 24 heures et 48 heures après injection des formulations liposomales à base de mTHPC et de Foscan®. Des boules de coton seront placées dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière

Choix des espèces

La souris Nude, présentant un système immunitaire déficient, est le modèle animal le plus approprié pour des études en cancérologie expérimentale, très utilisée et largement décrite dans la littérature scientifique, permettant d’injecter chez l’animal des cellules tumorales d’origine humaine sans risque de rejet. D’autre part, les études de pharmacocinétique et de distribution tissulaire et intratumorale sont principalement réalisées chez la souris car sa petite taille nécessite d’utiliser moins de composé à évaluer, composé dont le coût de développement peut être très important. Les animaux seront de jeunes souris âgées de 8-9 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 9-10 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge moyen de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études de pharmacocinétique et de biodistribution, et de souris utilisées lors d’études précédentes menées dans notre laboratoire selon le même protocole expérimental et ayant donné des résultats probants.

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent chaque jour du D-galactose par voie intrapéritonéale pendant huit semaines pour induire un vieillissement accéléré, avec prélèvements sanguins, traitements et mesures cutanées, avant mise à mort pour analyse des tissus. Le porteur indique des effets indésirables possibles des molécules testées, perte de poids et irritations cutanées. Sur le remplacement, il affirme que le modèle animal est "incontournable" et qu'aucun modèle in vitro ne rend compte du vieillissement de l'"organisme entier".

Objectifs

À l’échelle mondiale, la proportion de personnes âgées de 60 ans et plus est en constante augmentation depuis plusieurs années. En France, d’après les projections de l’Institut national de la statistique et des études économiques (Insee), un individu sur trois aura 60 ans et plus en 2050 (ils étaient un sur cinq en 2005). Accompagner ce vieillissement de la population est donc devenu un enjeu de santé publique mais aussi socio-économique. Ces dernières décennies, de nombreux modèles animaux de vieillissement ont été développés. Dans ce projet, on utilisera un modèle murin de vieillissement accéléré induit par le D-galactose avec pour objectif d'évaluer l'efficacité de nouvelles approches à visée thérapeutique. Le D-galactose est un nutriment physiologique, il s'agit d'un sucre réducteur qui, lorsqu'il est administré en excès chez la souris, contribue à la génération d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), à un dysfonctionnement mitochondrial, à la formation excessive de produits glyqués et est associé à de l'inflammation et à un déclin progressif des capacités cognitives. Ces changements miment le processus de vieillissement dans différents tissus et organes incluant le cerveau, le coeur, les poumons,le foie, les reins, le système reproducteur, la peau, les os, les muscles squelettiques, la réponse immunitaire et dans le sérum. Ainsi, ce modèle présente des caractéristiques mimant la senescence du vieillisement naturel et est adapté à l'évaluation d'efficacité de nouvelles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le vieillissement est un processus physiologique qui intervient chez tous les êtres vivants. Il correspond à un déclin qui altère, à l’échelle moléculaire et cellulaire, les capacités fonctionnelles de l’individu et ses possibilités d’adaptation face à un évènement aigu auquel il est confronté (une maladie, un stress). Dans le contexte biologique, le vieillissement se caractérise par l’accumulation d’évènements qui détériorent les fonctions des organes, et par une augmentation, avec le temps, des risques de décès ou de développer des maladies (cancer, diabète, troubles cardiovasculaires ou cérébraux, etc.). La recherche biologique sur le vieillissement s’intéresse, par définition, à l’étude de cette accumulation d’innombrables évènements inévitables qui apparaissent au cours de la période comprise entre la conception et le décès de l’individu. Il est donc important d'avoir un modèle préclinique prédictif du vieillissement afin d'évaluer de nouvelles thérapeutiques dans le but d'appréhender le vieillissement de manière à "vieillir mieux".

Procédures

Les animaux seront administrés quotidiennement par voie intrapéritonéale (durée d'intervention

Impact sur les animaux

Dans la littérature, il n'y a pas d'effet indésirable décrit pour ce modèle de vieillissement accéléré. Des effets indésirables peuvent être observés lors de l'administration des molécules thérapeutiques : mauvaise tolérance pouvant entraîner une perte de poids, irritation en cas d'application topique...

Devenir

A l'issue de la procédure tous les animaux seront mis à mort afin de prévlever les tissus et réaliser des analyses ex vivo (histologie, dosages de cytokines, dosages enzymatiques...) pour l'évaluation d'efficacité des traitements testés.

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux est incontournable afin d’étudier les mécanismes du vieillissement, mais aussi afin d’améliorer la compréhension des processus impliqués dans la survenue des syndromes de vieillissement accéléré. Il est indispensable d'améliorer les connaissances sur le vieillissement et les pathologies qui y sont associées. La complexité du vieillissement physiologique repose en fait sur la globalité de son impact : il intéresse l’ensemble des organes ; il est modulé par des facteurs qui peuvent être internes (c’est-à-dire physiologiques) mais aussi externes (environnementaux). Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro ou mathématique capable de prendre en compte la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du vieillissement. L’utilisation de modèles murins déjà établis dans la littérature et décrits pour leur pertinence dans ce domaine de la recherche biomédicale est une étape nécessaire pour valider l’efficacité thérapeutique et la tolérance de nouvelles molécules ou thérapies candidates en clinique humaine.

Réduction

La stratégie d'expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées (étude longitudinale). Cette approche expérimentale permet d'appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées (ANOVA) et permet d'avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle car une observation est réalisée avant d'initier les phases de traitement. Le nombre d'animaux sera de 8 par groupe (groupe d'animaux traités avec excipient de la molécule à tester ou la molécule à tester). Ce nombre est le minimum pour avoir une significativité acceptable avec une variation de 15%, une puissance de 70% et une différence à souligner de 20% entre groupes témoins et tests comparativement à l'approche classique. Cette approche permet donc de réduire le nombre d'animaux de 50% au moins. Des analyses post mortem sur les tissus seront réalisées (histologie/immunohistologie/ PCR/ cytométrie et approches "omiques") afin d'obtenir le plus d'informations possibles relatives à l'efficacité des molécules administrées sur les animaux.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement par l’expérimentateur afin de s'assurer de leur bien-être (alimentation, boisson, comportement...). Plusieurs sources d’enrichissement dans la cage (tunnel, igloo, cotons,bâtonnets de bois) permettront d'améliorer leur environnement et leur confort d'hébergement. Leur poids sera évalué au 2 fois par semaine, cette mesure aidera à déceler une quelconque souffrance et/ou détresse. De la nourriture humidifiée ou du gel diététique pourra être ajouté dans leur cage. Au moindre signe de déshydratation, les animaux recevront une injection intra-péritonéale de sérum physiologique (20mL/kg). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien-Etre Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : - Défaut d'alimentation et /ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation; - Perte de poids >20% du poids normal maintenue sur 72h; - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger; - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative - Complication au site d'injection (présence de plaie, douleur...) Si un de ces points limites est atteint, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Les rongeurs se sont rapidement imposés au cours du temps comme des modèles fondamentaux dans la recherche biomédicale. L’essentiel de la littérature est obtenue chez ces deux espèces pour diverses raisons (i) scientifiques, les mécanismes moléculaires et cellulaires décrits dans ces espèces sont retrouvés chez l’homme et (ii) pour un intérêt pratique (faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de manipulation et très bonne adaptation aux conditions expérimentales) ; l’intérêt majeur étant en premier lieu, l’historique de la connaissance de ces animaux, chez lesquels l’essentiel des traitements utilisés en clinique humaine aujourd’hui ont été évalués et validés. Des animaux adultes de plus de 8 semaines d'ages seront utilisés dans ce projet (cf Parameshwaran K et al, Rejuventation Research, 2010).

432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un régime riche en sel leur induit une hypertension, puis elles reçoivent des molécules dans l'eau de boisson, des injections intraveineuses ou intrapéritonéales et des échographies cardiaques sous anesthésie, pour tester l'effet antihypertenseur des polyamines. Le porteur indique que l'hypertension induite provoque un stress et un inconfort, et que tous les animaux sont euthanasiés pour prélever leurs organes. Sur le remplacement, il affirme que le recours aux animaux vivants est "indispensable" car l'hypertension ne peut être reproduite in vitro.

Objectifs

L’hypertension artérielle est une maladie chronique, parmi les plus fréquentes en France. Cette pathologie est caractérisée par une pression anormalement élevée du sang dans les vaisseaux sanguins. Elle constitue, lorsqu’elle n’est pas contrôlée, l’une des principales causes de complications cardiovasculaires, cérébrovasculaires ou neurodégénératives (infarctus du myocarde, AVC…). A ce jour, pour normaliser la pression artérielle, les traitements thérapeutiques impliquent des mesures hygiéno-diététiques seules ou associées à certains médicaments. Nous avons montré que l'apport alimentaire en polyamines est inversement proportionnel aux niveaux de pression artérielle chez l'homme. De plus, les animaux traités avec les polyamines (dans l'eau de boisson) sont moins sensibles à l'hypertension. Dans ce projet, nous allons poursuivre ces observations et étudier si les effets antihypertenseurs des polyamines dépendent de l'induction de l'autophagie ou d'autres mécanismes moléculaires en utilisant un modèle murin d'hypertension, induite par un régime riche en sel, cliniquement pertinent.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique pour traiter l’hypertension artérielle, qui est le principal facteur de risque évitable de maladies cardiovasculaires et de mortalité chez les hommes et les femmes. En effet, l'hypertension artérielle systolique est à l'origine de plus de 10 millions de décès et touche au moins 874 millions de patients dans le monde. De plus, cette pathologie représente un défi majeur pour la santé publique étant la plus coûteuse de toutes les maladies cardiovasculaires.

Procédures

Tous les animaux du projet seront soumis une seule fois à l’induction de l’hypertension via un régime riche en sel (régime suivi pour environ 20 jours). Tous les animaux recevront 2 molécules administrées dans l’eau de boisson (4 semaines). 144 animaux recevront 1 injection i.p. et 144 animaux recevront 1 injection i.v. (animaux vigiles). La durée des injections i.p. et i.v. sont de quelques secondes. 144 animaux seront soumis à un prélèvement sanguin (quelques secondes). Tous les animaux seront soumis à la mesure hebdomadaire de la pression artérielle (animal vigile) (environ 20 min). Tous les animaux seront soumis (3 fois) à l’examen d’échocardiographie sous anesthésie (30 min par examen). L'échocardiographie et la mesure de la pression artérielle sont les méthodes de diagnostic les plus utilisées en cardiologie chez l’homme. Ces pratiques de routine ne sont pas invasives.

Impact sur les animaux

L’hypertension, qui est induite, est modérée. Elle va cependant provoquer un stress et un inconfort chez la souris. Les injections intra-péritonéales et intraveineuses ne provoquent pas de symptômes majeurs et seront effectués sur l’animal vigile.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, les conséquences et les effets sur l’organisme de l’hypertension artérielle vu sa complexité.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 432 souris. Sur la base de notre expérience précédente, nous avons effectué un calcul de la taille de l'échantillon de 12 souris par groupe afin d'atteindre une puissance statistique. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs tests statistiques seront utilisés pour comparer les divers groupes de traitements.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie des animaux, utilisation de tapis chauffantes...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 12 semaines car l'âge a un impact sur la production neuronale de neurotransmetteurs et du métabolisme.