Rongeurs

Les 100 souris de ce projet sont rendues porteuses de tumeurs cérébrales, par implantation de cellules cancéreuses dans le cerveau pour 50 d'entre elles et par injection dans une veine pour les 50 autres. Ces souris C57Bl/6 et BalbC adultes sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, puis irradiées en une seule séance sous anesthésie générale, ou laissées sans irradiation comme témoins. Transférées dans un autre établissement pour des IRM répétées à quatre jours d'intervalle au moins, elles peuvent présenter titubation, léthargie, tête penchée, tremblements et crises d'épilepsie, et sont toutes tuées à la fin du projet pour comparer les images à des coupes histologiques. Les souris porteuses de tumeurs sont étudiées jusqu'à ce qu'elles perdent 15 % de leur poids ou atteignent un autre point limite, et des signes de souffrance entraînent soit leur mise à mort, soit un analgésique.

Objectifs

Chaque année, environ 65 000 européens sont diagnostiqués avec une tumeur cérébrale primitive. La radiothérapie est une option thérapeutique établie en association avec une chimiothérapie ou une résection chirurgicale. Même si son efficacité a largement été prouvée, la radiothérapie peut cependant engendrer des phénomènes nécrotiques et inflammatoires intenses, appelés radio-nécrose, 6 mois à 2 ans chez près de 25% des patients. Cette radio-nécrose est un effet secondaire de la radiothérapie et limite la précision de l'évaluation de la réponse tumorale à la thérapie. En effet, ces lésions dues aux radiations peuvent être confondues avec la progression tumorale, d'où le terme parfois utilisé « pseudoprogression ». A ce jour, seule l’analyse d’échantillons extraits par biopsie s’avère être totalement fiable pour différencier ces deux phénomènes. Mais la biopsie reste une intervention chirurgicale pouvant présenter certains risques pour le patient et le résultat peut s’avérer peu informatif étant donnée la petite taille de l’échantillon vis-à-vis du volume et de l’hétérogénéité tumorale. Diagnostiquer précisément le plus tôt possible une radionécrose ou une récidive est essentielle afin d’adapter au mieux le traitement. En effet, la progression tumorale et la radio-nécrose ont des approches thérapeutiques et des pronostics différents : des sessions supplémentaires de radiothérapie peuvent être bénéfiques pour les patients présentant une récidive de la maladie, alors qu'elles sont contre-indiquées lors de présence de radionécrose. Par conséquent, des biomarqueurs spécifiques et sensibles sont nécessaires pour différencier le plus tôt possible les deux effets. Ce projet vise à développer des méthodes avancées d’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) pour permettre l'évaluation in vivo non invasive de la réponse à la radiothérapie. Ainsi, l’objectif de cette demande est de développer un modèle de radionécrose chez la souris portant un gliome.

Bénéfices attendus

Ce modèle est représentatif de cas chez l’homme, donc la méthodologie IRM pourra être transférée rapidement - une seule session de radiothérapie permettra un stress amoindri des animaux que plusieurs sessions.

Procédures

Un premier groupe de 50 animaux sera soumis à une implantation de cellules cancéreuses dans le cerveau (en une seule fois) puis traités par radiothérapie (session unique) ou pas. Un deuxième groupe de 50 animaux sera soumis à une injection de cellules cancéreuses en intraveineux (en une seule fois) puis traités par radiothérapie (session unique) ou pas. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux pourraient induire des effets indésirables sur le comportement de l’animal (titubation, léthargie), sur son apparence (yeux mi-clos, dos vouté), une perte de poids, et des signes neurologiques tels que la tête penchée, tremblements, crises d’épilepsie. La radionécrose tumorale ne devrait pas induire de douleur. En revanche, si une radionécrose du tissu cérébral sain intervient, celle-ci pourrait devenir douloureuse et sera détectée par des modifications du comportement ou de l’apparence physique . De plus, le transport des animaux d’un établissement utilisateur à un autre pourrait induire un stress aux animaux.

Devenir

A l’issue de la radiothérapie (ou pas pour les contrôles), les animaux seront transférés à un autre établissement utilisateur pour les héberger à proximité d’une plateforme d’imagerie pour leur suivi par IRM. A la fin du projet, les animaux seront euthanasiés afin de confirmer les résultats IRM avec des coupes histologiques.

Remplacement

Notre projet est à visée translationnelle. En effet, nous souhaitons développer des séquences IRM permettant un diagnostic précoce et fiable de la radionécrose. L’imagerie du petit animal vivant est donc un maillon indispensable dans ce processus.

Réduction

Du fait de la non-invasivité de l’imagerie par IRM, les mêmes animaux seront imagés plusieurs fois avec un minimum de quatre jours entre chaque examen. Cette démarche permet de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire.

Raffinement

Pendant les chirurgies, l'utilisation d'anesthésies gazeuses par isoflurane, la présence d'un tapis chauffant permettant de maintenir la température interne des animaux et le contrôle visuel de la respiration permettent d'assurer un réveil rapide des animaux. Au cours du suivi post-opératoire, les souris portant des tumeurs ou métastases cérébrales seront étudiées jusqu’à ce que leurs poids aient diminué de 15% ou que les autres points limites soient atteints. Des points limites ont été instaurés pour surveiller la santé et le bien-être des animaux. Si des signes de souffrance apparaissent, les animaux seront soit euthanasiés soit pris en charge par un analgésique. Les animaux seront observés au réveil pour une recherche de signes cliniques de la douleur. Les animaux sont observés 2 fois par jour pendant les 3 jours suivant les chirurgies puis 1 fois par jour. La fréquence repassera à 2 fois par jours en cas de début de perte de poids (10%).

Choix des espèces

Les souris C57Bl/6 et BalbC seront utilisées car couramment utilisées dans la littérature, et permettant ainsi de comparer nos résultats avec des études précédentes. De plus, elles possèdent un système immunitaire fonctionnel permettant de mimer la pathologie humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines) car le développement des organes sera terminé.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont implantées dans le foie après incision de l'abdomen, sur des souriceaux âgés de neuf jours pour reproduire un cancer du très jeune enfant, puis elles reçoivent deux médicaments et un suivi de la tumeur par imagerie. Le porteur affirme que les effets indésirables sont "proches de zéro" grâce à l'anesthésie et à l'absence de toxicité observée chez la souris adulte, alors que le modèle reproduit une dissémination tumorale vers les poumons. Il indique qu'aucun système in vitro ne reconstitue la complexité tumorale et juge indispensable cette souche de souris immunodéprimée.

Objectifs

L’hépatoblastome est le cancer primaire du foie le plus fréquent chez l’enfant de moins de 5 ans. Le traitement de référence utilise une chimiothérapie à base de cisplatine, un médicament qui tue très efficacement les cellules tumorales mais reste très toxique pour les enfants. Un modèle juvénile de cancer du foie chez la souris a été mis au point récemment. Nous souhaitons maintenant tester l’efficacité d’une nouvelle thérapie de deux médicaments dans le traitement de ce cancer pédiatrique à l’aide de ce modèle.

Bénéfices attendus

Montrer que ces cellules d’hépatoblastome répondent à une chimiothérapie à base de deux composés et donc que le modèle est pertinent pour tester de futurs médicaments. Disposer d’un modèle juvénile pour étudier les mécanismes à l’origine de ce cancer pédiatrique.

Procédures

Implantation de cellules tumorales dans le foie après incision de la peau au niveau ventrale (durée : 10 min). Points de sutures au niveau ventrale (durée : 5 min). Administration de médicaments 2 fois par semaine (durée : 2 min par jour d’injection). Mesure de la tumeur par imagerie à bioluminescence 3 fois par semaine (durée : 15 min par mesure). Pesée des souris deux fois par semaine (durée : 1 min).

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet sont de classe modérée. Elles prévoient la greffe de cellules tumorales dans le foie. Les souris seront également manipulées afin de mesurer la croissance des tumeurs par bioimagerie. Toutes les manipulations des animaux sont réalisées sous anesthésie générale et les yeux des animaux sont protégés avec de la pommade vit A. Les effets indésirables sont donc proches de zéro. Il n’y a pas de risque particulier lié au développement de la tumeur qui se fera dans une partie localisée du foie. Le modèle reproduit la dissémination des cellules tumorales dans les poumons comme cela est observé chez les patients. Celles-ci sont 10 fois plus petites en taille que la tumeur hépatique d’origine. Des analyses précédentes dans un modèle de souris adulte montrent l’absence de toxicité de cette combinaison de drogues ou de chaque drogue utilisé seule.

Devenir

Les 80 souris de ce projet seront euthanasiées afin de procéder au prélèvement des tissus tumoraux et à leur analyse pas des approches moléculaires et histologiques.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude, l’hépatoblastome. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris (souris immunodéficience, NOD/LtSz-scid IL2R gamma, NSG). Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiments stromales et tumorales en action in vivo chez la souris.

Réduction

Le nombre d’animaux et l’analyse des résultats sont déterminés à l’aide de tests statistiques adaptés. Pour renforcer la puissance statistique de nos données, nous prévoyons de réaliser l’expérience deux fois. Si les résultats de nos analyses sont convaincants dès la première série d’expérience, celle-ci ne sera pas reconduite.

Raffinement

Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux. Les souris seront hébergées en animalerie A2, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Ces animaux sont hébergés en cages de type 2L à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Le score limite est de 12. Au-delà, l’animal est euthanasié sans attendre. En tenant compte de ces points limites adaptés et conformément au paragraphe 3 de l’annexe VIII de la directive 2010/63 CE, nous proposons comme classement pour l’ensemble de nos procédures le degré modéré. Les critères prépondérants ainsi que les mesures conservatoires en fonction du score de cette grille sont détaillés dans les procédures. Il n’existe pas de méthode alternative à celle de réaliser une incision de la peau ventrale et d’implanter les cellules tumorales directement dans le foie pour mettre en place ce modèle orthotopique de tumeur du foie chez le souriceau. Les animaux seront manipulés sous anesthésie gazeuse et après intervention chirurgicale, ils seront traités pas des antalgiques. Les expérimentateurs de l’Animalerie ont toutes les compétences et les formations requises pour réaliser les procédures chirurgicales et les manipulations des animaux prévues dans ce projet.

Choix des espèces

- La souche de souris NSG est appliquée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer la maladie étudiée. - Afin de mimer l’apparition du cancer du foie chez des enfants très jeunes, l’implantation des cellules tumorales se fera sur des souris âgées de 9 jours - La capacité d’extrapoler les résultats. - L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. - L’existence des équipements nécessaires à l’étude. - La pertinence des installations de l’Animalerie.

804 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le parasite Giardia puis gavées quotidiennement pendant douze jours, une partie étant des souriceaux non sevrés séparés de leur mère à chaque manipulation, pour tester des probiotiques destinés d'abord à un usage vétérinaire chez le chien. Le porteur décrit un objectif de commercialisation par un partenaire industriel et une application humaine à plus long terme, et indique que l'infection reste asymptomatique et auto-résolutive chez la souris. Il affirme qu'il est "nécessaire" de vérifier in vivo l'efficacité observée in vitro, aucun modèle ne reproduisant selon lui les interactions hôte-parasite-microbiote.

Objectifs

Giardia est un parasite de l’intestin de nombreuses espèces de mammifères dont l’Homme. Il est à l’origine d’infections intestinales souvent chroniques se traduisant par des diarrhées et parfois des signes de malabsorption. Le nombre croissant de cas de giardiose liés à la contamination de l’eau potable, aux effets secondaires des traitements, ainsi qu'à l’émergence de souches résistantes aux médicaments, font de la giardiose un sujet d’actualité de plus en plus préoccupant qui nécessite le développement de traitements alternatifs. Nous avons établi que la microflore et certains probiotiques, comme les bactéries probiotiques Lactobacillus johnsonii, jouent un rôle important dans la protection contre cette parasitose. Des résultats obtenus, in vitro et in vivo, montrent que ces bactéries agissent en produisant des composés toxiques pour le parasite, permettant de réduire les signes de la maladie. Une souche de L. johnsonii a également fait l’objet d’un essai clinique chez le chiot où nous avons pu confirmer ses propriétés anti-Giardia. A partir de ces résultats très encourageants, nous avons obtenus au laboratoire 4 nouvelles souches de probiotiques présentant des propriétés anti-Giardia augmentées comparativement à la souche d’origine in vitro. Afin de déterminer quelle souche sera utilisée sur l’espèce hôte cible (le chien), mais aussi afin d’étudier in situ dans l’intestin les mécanismes à l’origine de ces effets, il est nécessaire de valider les résultats obtenus sur ces différentes souches in vitro, par des essais in vivo d’infection à Giardia sur des modèles rongeurs. Nos objectifs sont la commercialisation par notre partenaire industriel de ce nouveau probiotique chez le chien, d’ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement de la giardiose basées sur l'utilisation de probiotiques ou de molécules actives.

Bénéfices attendus

La majorité des traitements humains ou vétérinaires actuels font appel à l’emploi d’antibiotiques, qui non seulement provoquent d’importants effets secondaires, mais sont également de moins en moins efficaces dû à l’émergence de souches résistantes à ces médicaments. Ce contexte préoccupant nécessite le développement de traitements alternatifs novateurs, et nécessite également des avancées majeures dans la compréhension des interactions hôte/Giardia/microbiote qui seront à la base de nombreuses thérapies innovantes. Giardia est un parasite ayant une prévalence importante dans l’industrie de l’élevage en Europe et dans le monde. La diminution de l’utilisation des antibiotiques dans l’ensemble des traitements des animaux est un sujet de très haute importance étant donné l’apparition de nombreuses souches résistantes. Le développement de ce type de traitement alternatif est donc capital, en particulier dans ce type d’industrie. La réduction de souches résistantes aux antibiotiques ainsi que la diminution des traces d’antibiotiques dans l’alimentation humaine et vétérinaire est au cœur des enjeux sociétaux et environnementaux actuels et pour le futur. Ce projet permettra à court terme le développement et la mise sur le marché vétérinaire de probiotiques anti-Giardia, puis à plus long terme une application chez l’humain. Ceci pourrait permettre un développement de l’éventail thérapeutique, une amélioration de la prise en charge et du traitement de la maladie, pour in fine une amélioration de la qualité de vie des individus concernés. Il permettra également l’avancement des connaissances fondamentales dans l’application de souches probiotiques produisant des composants toxiques pour le parasite, en particulier dans leur action synergique avec le microbiote. Le microbiote est au centre de découvertes majeures dans l’application à la médecine vétérinaire et humaine depuis 20 ans. Ce projet vise à en comprendre les mécanismes clés, ce qui permettrait d’identifier de nouveaux axes de recherche fondamentaux ou appliqués.

Procédures

Au cours des études et pour l’ensemble des animaux rentrant en procédures, les interventions seront : - Prise de poids et gavage quotidiens pendant 12 jours maximum (5 min maximum par animal) - Deux gavages quotidiens espacés d’une demi-journée : 1 fois - Prélèvement sanguin : 1 fois juste avant la mise à mort - Mise à mort

Impact sur les animaux

L’infection à Giardia duodenalis est asymptomatique et auto-résolutive en une dizaine de jours chez la souris. Les potentiels effets indésirables seront les erreurs de gavage (fausse route avec passage de la sonde dans la trachée, détectable par présence de sang sur la sonde). Dans ce cas nous procéderons à l’euthanasie immédiate des animaux concernés. Chez les jeunes souriceaux, un stress est engendré lors des gavages et pesées journalières, mais il est également dû à la séparation de sa mère, qui a lieu durant ces différents gestes. Les souriceaux seront manipulés avec des gants imbibés de l’urine et fèces de la mère afin de réduire le risque de rejet et/ou cannibalisme de la mère.

Devenir

A l’issue de l’ensemble des procédures, les animaux seront euthanasiés afin de procéder au prélèvement des différents organes nécessaires à la quantification de la giardiose et aux traitements des données expérimentales.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est nécessaire pour confirmer les observations faites in vitro. En effet, le test in vitro ne permet d’apprécier que l’efficacité du surnageant de culture bactérienne sur Giardia. Il est donc nécessaire de vérifier l’efficacité de ces stratégies thérapeutiques dans des conditions physiologiques. De plus, il n’existe pas de modèle in vitro envisageable qui permet l’étude des interactions hôte/Giardia/microbiote. L’ensemble des souches de probiotiques qui seront administrées in vivo auront fait l’objet d’études préliminaires in vitro et seront le fruit d’une première sélection visant à ne garder que les souches ayant un réel intérêt anti-Giardia. Préalablement, l’activité transcriptionnelle, la quantité de protéine produite, ainsi que la capacité de ces protéines à hydrolyser les acides biliaires conjugués ont été étudiées afin de sélectionner uniquement des souches ayant un fort potentiel in vivo. Pour chaque formulation, des études de faisabilité, de stabilité de l’activité sont réalisées. Ainsi les formulations qui seront étudiées in vivo seront également issues d’un processus de sélection afin de limiter le nombre de groupes et donc le nombre d’animaux entrant dans cette étude.

Réduction

Pour la procédure sur souriceaux non sevrés, le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour mesurer l’efficacité d’un traitement et comparer les traitements entre eux. Afin de déterminer le nombre d’animaux que nous utiliserons au cours de ces études, nous nous appuyons sur l’expérience de collègues ayant déjà utilisé ce modèle. De plus il a déjà été montré et validé par 2 publications que 12 animaux par groupe séparés en 2 lot de 6 animaux étaient suffisants. Pour le modèle de souris âgés de 3 semaines, une publication récente a démontré que 16 animaux par groupe séparés en 2 sous-groupes de 8 animaux étaient suffisants.

Raffinement

Un suivi journalier du bien-être des animaux sera effectué via un cahier de suivi rempli quotidiennement. Les gavages intragastriques des animaux seront pratiqués par des expérimentateurs formés et entrainés. La présence d’une procédure d’entrainement spécifique permettra un raffinement des autres procédures présentes dans le projet. Un enrichissement de milieu sera mis en place pour améliorer les conditions d’hébergement des souris : ajout de cellulose déchiquetée et bâton à ronger. Une attention particulière sera faite pour réduire au minimum les temps de séparation mère-souriceaux dus aux gavages ou aux autres manipulations. Les souriceaux seront manipulés avec des gants imbibés de l’urine et fèces de la mère afin de réduire le risque de rejet et/ou cannibalisme de la mère. L’établissement de points limites s’appuyant sur des paramètres objectifs facilement quantifiables (poids, mobilité) sera mis en place afin d’éviter efficacement tout état de souffrance aux animaux.

Choix des espèces

Deux espèces de Rongeurs sont utilisées pour les études expérimentales de la giardiose : la souris et la gerbille de Mongolie qui est beaucoup plus difficile à manipuler et très sensible au stress et qui n’est utilisée que lorsque le modèle souris ne peut pas être utilisé notamment pour étudier la giardiose chronique. Les modèles souris sont des modèles reproductibles. Ils correspondent aux modèles les plus utilisés pour tester des traitements contre la giardiose. L’infection par Giardia n’est possible que chez le souriceau avant sevrage et jusqu’à l’âge de 4 semaines. Après cet âge, l’infection est inconstante ou nécessite un traitement préalable des animaux (immunosuppression ou antibiothérapie pour détruire la flore digestive). La variabilité de l’infection est plus faible avant sevrage.

577 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, une injection de cellules souches et deux irradiations sur animal non anesthésié maintenu en boîte, ainsi que des prélèvements sanguins rétro-orbitaires répétés, pour étudier la production de cellules immunitaires infiltrant les tumeurs. Le porteur indique que les souris développent des tumeurs mammaires. Il affirme que ni la modélisation ni les systèmes in vitro ne remplacent la souris, présentée comme "indispensable".

Objectifs

Les cellules dendritiques sont des cellules phagocytaires qui jouent un rôle clef dans l’initiation des défenses immunitaires contre les tumeurs. En effet, les cellules dendritiques des tissus capturent les cellules tumorales et présentent les antigenes tumoraux aux lymphocytes T pour déclencher la réponse immunitaire. Les monocytes quant à eux sont les précurseurs directs d’une autre population de cellules phagocytaires appelée macrophages et qui, au contraire des cellules dendritiques, peuvent inhiber la réponse immunitaire anti-tumorale. Un enjeu primordial de la recherche contre le cancer est de mieux comprendre les interactions moléculaires et cellulaires entre la tumeur et les cellules phagocytaires qui l’infiltrent. En particulier, dans le cadre des thérapies anti-cancéreuses, nous souhaitons 1) augmenter la quantité des cellules dendritiques favorables aux réponses immunitaires dirigées contre le cancer ; et 2) diminuer la production des macrophages qui favorisent la croissance tumorale. Cela est possible en étudiant les mécanismes de production de ces cellules qui ont lieu dans la moelle osseuse à partir des cellules souches dites hématopoétiques (HSC). Dans ce projet, nous étudierons les mécanismes moléculaires et cellulaires qui permettent aux HSC de la moelle osseuse de produire des cellules dendritiques et des macrophages lors du développement tumoral.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes de production des cellules dendritiques et des macrophages et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant d’inhiber la production des macrophages et d’augmenter la production de cellules dendritiques. En parallèle, nous nous interresserons aussi aux mécanismes par lesquels les macrophages inhibent les réponses immunitaires dans la tumeur. Nous développerons des stratégies pour bloquer l’effet inhibiteur des macrophages. En conclusion, ce projet nous permettra de mettre en lumière les mécanismes tumoraux qui activent la production des macrophages. Cela nous permettra de mieux les cibler dans le cadre d’interventions thérapeutiques visant à augmenter les réponses immunitaires contre les cancers.

Procédures

1- Injection de cellules tumorales par voie sous-cutanée : La contention de l’animal et l’injection durent maximum 30 secondes. Cette intervention aura lieu 1 fois au début de la procédure 2- Injection de cellules souches hématopoïétiques par voie intraveineuse rétro-orbitale La contention de l’animal et l’injection durent maximum 30 secondes. Cette intervention aura lieu 1 fois au début de la procédure 3- Irradiation L’irradiation dure au maximum 5 minutes durant lesquelles les animaux (non anesthésié) sont disposés dans une boite en plexiglass prévu à cet effet. Cette intervention aura lieu 2 fois au début de la procédure 4- Prélèvement sanguin par voie rétro-orbitale La contention de l’animal et le prélèvement durent maximum 30 secondes. Cette intervention aura lieu : 1 fois à 8 semaines au cours de la procédure 3 5 fois au cours de la procédure 4 (à 2 semaines, 4 semaines, 8 semaines, 12 semaines, 16 semaines)

Impact sur les animaux

Les souris développeront des tumeurs mammaires.

Devenir

Mise à mort

Remplacement

La production des cellules dendritiques et des monocytes/macrophages a été étudiée chez la souris in vitro et in vivo dans des situations non-pathologiques ou d’infection par des pathogènes. Cependant les mécanismes de production des cellules dendritiques et des monocytes/macrophages lors du développement tumoral restent mal connus. Ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro ne permettent d’étudier la production et la circulation des cellules phagocytaires (cellules dendritiques et monocytes/macrophages) dans le sang et les mécanismes de leur entrée et leur différenciation dans les tumeurs. La souris reste donc un modèle indispensable pour le projet et permettra de tester de nouvelles thérapies anti-cancéreuses ciblant les cellules phagocytaires.

Réduction

les résultats attendus à l’issue de ce projet n’ont pas été publiés à ce jour dans la littérature scientifique. Le nombre d’animaux utilisés pour mener à bien ce projet a été réduit au minimum pour chaque modèle tout en assurant des résultats statisquement interprétables.

Raffinement

La lignée de souris utilisée développe des tumeurs mammaires très progressivement sur 5 mois. Les animaux seront suivis régulièrement afin d’assurer leur bien-être et pour suivre les éventuels signes de souffrance ou de stress. Des soins supports tels les aliments gélifiés et la ré-hydratation seront introduits dans les cages en cas de souffrance. Les expérimentations seront arrêtées avant l’atteinte des points limites définis.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées pour la recherche en onco-immunologie et en therapeutique du cancer car la connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques d’intérêt ainsi qu’un grand nombre de modèles de tumeurs transplantées. De plus, la grande homologie avec l’Homme permet d’envisager de transposer les résultats obtenus chez la souris vers des applications cliniques Les souris seront utilisées à l'âge adulte afin qu’elles aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, cet âge est adapté pour générer des modèles de tumeurs par la greffe de lignées de cellules tumorales. Enfin, l'âge adulte permet d'étudier un système immunitaire mature.

576 souris nude vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome uvéal humain, puis des injections d'inhibiteurs trois fois par semaine jusqu'à soixante-dix jours, pour tester des molécules contre ce cancer de l'œil. Le porteur indique que la croissance tumorale peut provoquer poils hérissés, dos voûté, perte de poids et nécroses cutanées. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit des interactions physiologiques aussi complexes.

Objectifs

Le mélanome uvéal (MU), est le cancer intra-oculaire primaire le plus fréquent chez l’adulte. Malgré un traitement réussi des tumeurs primaires, les métastases se développent chez 50% des patients principalement au foie. Les MU métastatiques sont hautement réfractaires aux traitements existants. 80% des patients meurent en moins d’un an. Il y a donc un besoin urgent de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la pathogénie du MU et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et traitements efficaces pour améliorer la survie des patients. Dans ce but, par le biais d’une méthode innovante, l’équipe a identifié plusieurs candidats intéressants dont l’inhibition diminue la prolifération et la survie des cellules de MU. L’objectif du projet est maintenant d’évaluer in vivo chez la souris, l’efficacité des molécules ciblant les gènes candidats identifiés qui ont montré leur efficacité in vitro sur l’inhibition de la prolifération et la migration des cellules de MU.

Bénéfices attendus

Ce projet va nous permettre de tester in vivo l’effet des deux inhibiteurs ciblant nos deux gènes d’intérêt ainsi que les molécules pharmacologiques ciblant les effecteurs de nos gènes candidats. Ces molécules seront définies ultérieurement en fonction des cibles identifiées suites à des analyses approfondies qui sont en cours de réalisation, sur la croissance tumorale sous cutanée du mélanome uvéal. Ces validations sont indispensables pour envisager un développement clinique de nos agents en association avec les thérapies ciblées ou les immuno-thérapies.

Procédures

Une injection de cellules en sous cutanée au niveau du flanc gauche sur souris vigile, une fois la tumeur formé (100mm3), les souris seront injectées en intra-péritonéale par les différents composés (inhibiteurs) 3 fois par semaine jusqu’à 70 jours maximum après début du traitement.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Ces effets indésirables pourront être causés soit par la croissance de la tumeur, soit par l’injection des drogues thérapeutiques. La croissance de la tumeur pourra entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance (poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, prostration), ainsi que des altérations visibles de la peau (nécrose, rougeur, infection). L’injection des drogues pourra également entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations local au site d’injection (rougeur, infection, nécrose).

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés.

Remplacement

En termes de remplacement, il n'est pas possible de s'affranchir de l'utilisation de souris car il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro qui permettent de reproduire des interactions physiologiques aussi complexes. Des études in vitro ont été réalisées pour nos deux gènes d’intérêt et seront réalisées dans un premier temps pour définir l’efficacité des 2 autres molécules dans l’induction de la mort ou l’arrêt de la prolifération des cellules de mélanome uvéal. Ainsi, in vitro, nous avons défini la concentration des molécules à utiliser ainsi que leurs effets et nous ferons de même pour les autres cibles. De plus, pour les expériences in vivo nous nous baserons aussi sur les concentrations rapportées pour ces drogues dans la littérature.

Réduction

En termes de réduction, le nombre d'animaux nécessaire à cette étude a été déterminé à l'aide d'un test de puissance statistique dans le cas où la différence de moyenne de chaque groupe est supérieure au moins d’un quart à notre écart type et une puissance de 0.9 et un risque de 0.01. Pour la réalisation de ce projet, il faudra 576 souris. L'utilisation de ces animaux sera optimisée en prélevant les tumeurs/métastases et organes (tels que le foie, la rate, les poumons) pour des analyses histologiques et biochimiques.

Raffinement

En termes de raffinement, les souris évoluent dans un milieu enrichi et sont hébergées en portoirs ventilés à plusieurs par cage et seront observées trois fois par semaine selon la procédure par les demandeurs du projet afin de prendre en charge tout signe de douleur, de stress ou d’inconfort. Les manipulateurs sont en possession du niveau opérateur ou concepteur qui permet d’avoir une bonne vision et une excellente capacité à détecter les problèmes de santé, stress ou malaise. Le suivi est fait par des méthodes non invasives (mesure des tumeurs sous-cutanée au pied à coulisse, pesée des animaux régulières). Des points limites précis sont définis dans chaque procédure. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum grâce à un suivi longitudinal précis et quantifiable par imagerie.

Choix des espèces

La souris est un mammifère ayant de similitudes génétiques avec l’homme. De plus, elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction bien connu, une faible taille ce qui permet d’avoir des conditions d’hébergement plus faciles. Nous utiliserons un modèle de souris Nude. Grâce à un système immunitaire très faible, la souris nude pourra recevoir des cellules humaines sans risque de rejet. D’autre part, ce modèle de souris est commercialisé et bien établi, d’importantes études ont déjà été réalisées à partir de ce modèle. Les souris sont utilisées au stade adulte (7 semaines) et sont des femelles. Elles sont commandées à 6 semaines, puis l’expérience commence après une semaine d’acclimatation. La croissance tumorale est optimale à cet âge-là pour la souris nude, et ceci est scientifiquement cohérent avec les expériences déjà faites dans l’équipe et les données de la littérature.

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès l'âge de quinze jours, elles reçoivent une injection d'un agent génotoxique qui provoque un cancer du foie, puis à douze mois des traitements pharmacologiques, pour évaluer leur effet sur un carcinome hépatocellulaire avancé. Le porteur indique qu'à ce stade toutes les souris présentent des tumeurs hépatiques. Il affirme qu'aucune méthode ne permet de remplacer l'étude de la progression tumorale in vivo.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer le potentiel thérapeutique de molécules pharmacologiques dans le carcinome hépatocellulaire. Pour cela, nous utiliserons un modèle murin de cancer du foie qui sera induit par administration d'un produit chimique, le N-nitrosodiéthylamine (DEN), à des souris âgées de 15 jours. Dans ce modèle, les souris développent des tumeurs hépatiques à partir de 9-10 mois. Nous étudierons l'effet de molécules pharmacologiques, un inhibiteur du stress du réticulum endoplasmique (InhRE) et/ou un inhibiteur multikinase (Sorafenib), sur la progression du carcinome hépatocellulaire à 12 mois. L'inhibiteur du stress du réticulum endoplasmique (InhRE) a donné des résultats prometteurs dans un modèle murin précliniqiue de cancer du sein triplement négatif (Logue SE, et al. Nat Commun. 2018 Aug 15;9(1):3267). Il sera administré seul ou en combinaison avec le Sorafenib qui est un inhibiteur multikinase et qui est administré chez les patients en seconde ligne de traitement.

Bénéfices attendus

Les études proposées dans ce projet permettront de déterminer l'efficacité anti-tumorale de l'inhibiteur du stress du réticulum endoplasmique (InhRE) administré seul ou en combinaison avec le Sorafénib sur la progression du cancer du foie à un stade avancé pour après pouvoir les utiliser chez l'homme.

Procédures

Les souris seront soumises à une injection unique de dihétylnitrosamine (DEN) ou son diluant (NaCl) en ip 15 jours après la naissance ; deux injections par semaine d'inhibiteur du stress du réticulum endoplasmique ou son diluant (Kolliphor) à 12 mois pour une durée de 4 semaines ; une administration de Sorafénib 5 fois par semaine à 12 mois pour une durée de 4 semaines.

Impact sur les animaux

L'administration de N-nitrosodiéthylamine (DEN) favorise le développement de tumeurs hépatiques. A 12 mois, les souris présentent une hépatomégalie liée au développement tumoral. L'administration d'InhRE n'est pas associé à un effet secondaire connu.

Devenir

Les animaix seront euthanasiés à la fin des procédures afin de faire un prélèvement de sang et du foie pour étudier les effets de l'inhibiteur du stress du réticulum endoplasmique seul ou en combinaison avec le Sorafénib sur la progression du cancer du foie.

Remplacement

Nous avons recours à des animaux car il n’y a pas de méthodes alternatives. En effet, il n’existe aucun moyen de remplacer une telle étude dans laquelle nous étudions la progression tumorale.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats.

Raffinement

Nous effectuerons un suivi quotidien des souris tout au long du protocole en observant leur comportement et les indices pouvant suggérer une douleur. Si nous observons une douleur chez un animal, cela entraînerait son euthanasie anticipée. Par ailleurs, les animaux sont hébergés en présence de papier kraft et de carrées de coton pour faire le nid, ainsi que des maisonnettes et des dômes en cellulose.

Choix des espèces

La souris est l’espèce couramment utilisée dans ce protocole de carcinogenèse hépatique et pour étudier l'effet de molécules avec un potentiel anti-cancéreux. Pour le modèle d'induction d'un carcinome hépatocellulaire, le protocole consiste en une injection unique de N-nitrosodiéthylamine (DEN), un agent génotoxique, à 25 mg/kg ou son diluant (NaCl) à des souriceaux mâles âgés de 15 jours. En effet, la forte prolifération des hépatocytes à ce stade permet d'induire des mutations dans des cellules en prolifération ce qui permettra le développement de tumeurs hépatiques. Les effets de l'inhibiteur du stress du réticulum endoplasmique (InhRE 30 ug/g) administré seul ou en combinaison avec le Sorafénib (30 ug/g) sur la progression du cancer du foie seront étudiés chez les souris agées de 12 mois car le carcinome hépatocellulaire est diagnostiqué chez l'homme à un stade avancé. A ce stade, 100 % des animaux présentent des tumeurs hépatiques à un stade avancé qui est le stade auquel le cancer du foie est majoritairement diagnostiqué. De plus, à ce stade, la survie des animaux est proche de 100%.

18 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont inoculés avec le parasite Trypanosoma lewisi puis subissent des prélèvements sanguins quotidiens pendant six semaines et un prélèvement terminal, pour produire des parasites et des sérums de référence destinés à un test de dépistage. Le porteur indique que ce parasite, commensal du rat, présente une faible virulence. Il affirme que le recours au rat est "incontournable" pour produire les parasites en quantité.

Objectifs

Trypanosoma lewisi (T.lewisi), parasite hébergé par le rat, est transmis par une puce qui, via ses fécès, peut infecter le rat ou l’homme, surtout les enfants (par grattage au point de piqûre ou par ingestion de boisson contaminée). Souvent sans autre symptôme que la fièvre, cette infection peut être bénigne, nécessiter un traitement, ou être mortelle. A ce jour, l’Inde est le pays où le plus grand nombre d’infections à T. lewisi a été observé et confirmé, le dernier datant de décembre 2021. Les conditions sanitaires dans des pays à très fortes démographies facilitent le contact rat/homme dans les habitations précaires. Cette pathologie est très peu connue et sa prévalence de fait certainement sous-estimée. Compte-tenu du très grand nombre d’individus exposés, il est indispensable de disposer d’un test de dépistage sensible, spécifique et surtout utilisable sur le terrain. Sachant qu’un individu infecté par T. lewisi va produire des anticorps circulants dirigés contre le parasite, la présence de ces anticorps peut être détectée dans le sang ou le sérum humain par un test d’agglutination sur carte avec des trypanosomes préalablement colorés. Ce type de test, appelé CATT (Card Agglutination Trypanosomiasis Test), a fait ses preuves pour le dépistage sérologique de terrain de la maladie du sommeil ou Trypanosomiase humaine africaine. Le test CATT est facile d’utilisation et le résultat est obtenu en 5 minutes. Ce nouveau test CATT/T. lewisi consistera en un dépôt sur une carte d’une goutte de sang ou de plasma/sérum dilué, à laquelle sera mélangée une goutte d’antigènes de T. lewisi (trypanosomes colorés). S'il y a présence d'anticorps chez l’hôte, ces derniers agglutineront les parasites, ce qui sera visible à l’œil nu. En cas de résultat positif, la détection directe des parasites dans le sang de l’hôte, qui nécessite d’autres types de tests beaucoup plus lourds et longs à réaliser, sera effectuée comme diagnostic de confirmation. L’objectif in fine du présent projet est le développement d’un test CATT/T. lewisi qui nécessite 1/ la production d’antigènes du parasite T. lewisi pour la détection des anticorps ; cette étape consiste en la production de trypanosomes en quantité sur rongeurs de laboratoire, 2/ la production de sérums de référence positifs et négatifs pour l’étape de validation du test CATT/T. lewisi ; ces sérums seront obtenus à partir de rats infectés et non infectés.

Bénéfices attendus

La mise à disposition d’un test de dépistage sérologique rapide et utilisable sur le terrain va faciliter le travail des équipes médicales, compte-tenu du grand nombre de personnes à tester (exemple de l’Inde). Seules les personnes séropositives feront par la suite l’objet de tests supplémentaires pour mettre en évidence la présence du parasite T. lewisi. Après son évaluation ce test sera mis à disposition de toutes les équipes médicales des pays concernés par les infections humaines à T. lewisi (en Afrique ou en Asie). Cela permettra d’évaluer, pour la première fois, l’importance réelle de cette infection que de nombreux scientifiques pensent sous-estimée, et très certainement de sauver des vies, en particulier chez les catégories d’individus jeunes et/ou immunodéprimés, souvent atteints d’autres pathologies.

Procédures

Prélèvement (durée: 1 minute) sous anesthésie de 1ml de sang à T0 puis 1 fois par semaine durant 3 semaines sur 18 rats. Inoculation (durée: 30 secondes) sous anesthésie de parasites T. lewisi sur 18 rats puis collecte (durée: 30 secondes) sous anesthésie d’1 goutte de sang à la queue quotidiennement durant 6 semaines maximum et un prélèvement sanguin terminal (durée: 2 minutes) sous anesthésie profonde sera ensuite réalisée. Prélèvement (durée: 1 minute) sous anesthésie de 1ml de sang 1 fois par semaine durant 6 semaines maximum sur 9 rats.

Impact sur les animaux

L’infection à Trypanosoma lewisi chez le rat peut induire des effets indésirables (augmentation ou perte de poids, une légère perte de mobilité, le poil hérissé) qui ne sont pas systématiques. Néanmoins cette souche de parasite ne présente pas une virulence élevée, puisque T. lewisi est considéré comme un commensal du rat (portage sain).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour récolter leur sang qui contient les parasites en vue de leur purification, et de la collecte des sérums de référence.

Remplacement

Pour produire un très grand nombre de trypanosomes et obtenir des sérums de référence positifs et négatifs, le recours au rat est incontournable. En cas de succès de la mise au point de ce test CATT/T. lewisi et dans le cadre d’une production de ces parasites à plus grande échelle, nous envisageons une adaptation de ces parasites à la culture in vitro.

Réduction

Le nombre de rats est limité à 6 par essai de mise au point car nous avons calculé que les quantités de parasites et de sérums négatifs et positifs récoltés seront suffisants pour la mise au point du test. Ces mêmes 6 rats permettront de produire les sérums de référence négatifs avant l’inoculation des parasites, puis les parasites et les sérums de référence positifs ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Une fois infectés, les animaux feront l’objet d’une observation quotidienne afin d’évaluer un changement de comportement anormal. Si les animaux présentent un changement d’apparence physique tel que le poil hérissé pendant plus de 3 jours, avec un aspect général moribond, un état de prostration, ou s’ils ne s’alimentent plus ou si la perte de poids excède 15%., seront euthanasiés sans délai. Le poids de l’animal est relevé à chaque estimation de la parasitémie. Enfin, les animaux seront maintenus en groupe de 2 ou 3 et des mesures d’enrichissement du milieu destinées à améliorer les conditions de vie et à réduire le stress des rongeurs seront mises en place : utilisation de tunnels et/ou carrés de cellulose. Un tapis chauffant est utilisé lors des anesthésies afin de compenser la chute de température interne des animaux.

Choix des espèces

Les rats étant très susceptibles à l’infection par T. lewisi (parasite commensal), ils permettent d’obtenir de fortes parasitémies sous un volume sanguin important. Leur utilisation permet d’obtenir des trypanosomes en quantité suffisante pour la fabrication du test CATT/ T. lewisi. Les rats sont utilisés au stade adulte (300g) afin de permettre de collecter de plus grands volumes de sang pour constitution des sérums de référence et au prélèvement sanguin terminal.

1600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie de deux heures induisant une ischémie-reperfusion du foie, puis plusieurs injections, pour tester une molécule contre les lésions hépatiques après chirurgie ou transplantation. Le porteur qualifie de modérées les douleurs abdominales dues au clamp vasculaire et affirme que l'animal vit normalement. Il conclut qu'il est impossible de reproduire in vitro la complexité de l'ischémie-reperfusion hépatique.

Objectifs

L’hépatite ischémique est une lésion du foie induite par un apport insuffisant de sang ou d’oxygène, induisant la mort des cellules hépatiques. Il a été démontré que la neutralisation d’une protéine libérée par les cellules et les organes et qui est impliquée dans un réflexe primitif de la faim induisait l'activation du flux autophagique dans des modèles de toxicité chronique du foie. Sur la base de ces observations, l’objectif de ce projet est de déterminer si l'inhibition de cette protéine peut prévenir ou traiter l’hépatite ischémique chez des modèles murins appropriés.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique pour palier à l'ischémie-reperfusion hépatique, qui survient après une chirurgie ou une transplantation du foie et qui influence considérablement le pronostic de la fonction hépatique.

Procédures

Tous les animaux du projet seront soumis une seule fois à une chirurgie induisant l'ischémie-reperfusion hépatique (durée environ 2h/souris). L’acte chirurgical sera réalisé sous anesthésie et analgésie. Les animaux recevront 2, 4, 6 ou 8 injections sous-cutanées (animal vigile). Tous les traitements seront administrés par voie intra-péritonéale, les animaux recevront 2, 4, ou 5 injections (animaux vigiles). La durée des injections sous-cutanées et intra-péritonéales est de quelques secondes.

Impact sur les animaux

Tous les animaux du projet seront soumis à une chirurgie induisant l'ischémie-reperfusion hépatique. Aucun autre effet indésirable n’est attendu en dehors de ceux connus et causés par cette induction. Les douleurs abdominales dues au clamp vasculaire seront modérées car les procédures n’excéderont pas 72h. L’animal vit normalement (ses mouvements et sa respiration ne sont pas impactées). Les injections intra-péritonéales et sous-cutanées (animal vigile) ne provoquent pas de symptômes majeurs autre que la douleur de piqure de l’aiguille.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, les conséquences et les effets sur l’organisme de l'ischémie-reperfusion hépatique vu sa complexité.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 1600 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Les tests statistiques utilisés seront des tests « LogRank » pour la survie, et des tests « Anova » pour comparer les divers groupes de traitements.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie/analgésie des animaux, utilisation de lampes chauffantes...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés entre 7 et 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Selon les procédures, les animaux seront utilisés entre 7 et 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.