Rongeurs
Evaluation de l’impact d’un Nanoprimer sur la biodisponibilité des vecteurs viraux AAV dans un modèle de la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intraveineuses de vecteurs viraux et d'un Nanoprimer dans la veine caudale, puis des prélèvements sanguins hebdomadaires pendant un à trois mois, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. L'objectif est d'évaluer un produit censé réduire les doses de vecteurs de thérapie génique et leur toxicité pour le foie. Le porteur affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas la complexité des interactions in vivo.
Objectifs
La thérapie génique consiste à introduire un gène « médicament » dans des cellules pour traiter une maladie. Pour véhiculer ce gène, les vecteurs viraux, et en particulier les virus adéno-associés (AAVr) constituent des outils de choix comme en atteste la commercialisation de trois produits de thérapie génique utilisant les vecteurs AAV (Luxturna®, Glybera® et Zolgensma®). Une seule injection d’AAVr permet une expression à long terme du gène thérapeutique. Cependant, l’administration de l’AAV par voie intraveineuse (IV) peut induire une élimination rapide du gène « médicament » par le foie. Pour compenser cette élimination, de fortes doses de vecteurs sont nécessaires afin de toucher les tissus cibles comme les muscles squelettiques, le cœur, les poumons etc…). Par ailleurs, il a été rapporté que chez les patients que ces fortes doses de vecteur peuvent induire des effets indésirables liés à une toxicité dans le foie. Cette toxicité a entraîné dans certains cas la suspension des essais cliniques. Dans cette étude, nous proposons de tester un Nanoprimer® (Curadigm) en combinaison avec notre vecteur AAV pour d’une part diminuer son élimination par le foie et favoriser l’atteinte de tissus-cibles tels que les muscles squelettiques et d’autre part, prévenir l’hépatotoxicité liée à la forte concentration du vecteur après son injection. L’objectif scientifique de ce projet est de développer une stratégie pour diminuer les doses de vecteur de thérapie génique injecté et prévenir une éventuelle hépatotoxicité.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de développer une stratégie pour diminuer les doses de vecteur de thérapie génique injecté et prévenir une éventuelle hépatotoxicité et permettre ainsi d’améliorer les traitements de thérapie génique à l’aide d’AAVr.
Procédures
Les souris seront injectées en IV dans la veine caudale avec dans un premier temps 100 µl de PBS ou d’AAV. Selon les groupes d’animaux, 150µl de Nanoprimer seront injectés 10 minutes après l’injection d’AAV puis à J+2 et J+5. Pour ces injections, les souris seront placées dans un tunnel de contention. Pour limiter le désagrément de la piqûre, un anesthésique local de type crème EMLA sera appliqué juste avant la procédure. Un prélèvement sanguin sera réalisé la semaine avant les injections puis toutes les semaines jusqu’à l’euthanasie pour les animaux suivis pendant 1 mois. Pour les souris suivies pendant 3 mois, les prélèvements seront espacés tous les 15 jours au bout du premier mois et ce jusqu’à la fin du protocole. Le prélèvement n’excédera pas la quantité recommandée par animal par semaine soit 7.5% du volume sanguin total. Les animaux seront anesthésiés dans une cage à induction, puis transférés sur une planche chauffante équipée d’un masque anesthésique. Le sang sera prélevé au niveau de la veine jugulaire par du personnel compétent pratiquant ce geste en routine. Conformément à la réglementation, la mise à mort des animaux sera réalisée sur des souris isolées visuellement et phoniquement du reste des animaux. Les animaux en attente, resteront dans leur cage et salle d’hébergement. Afin de réaliser des études post mortem, les animaux subiront une anesthésie gazeuse préalable suivie d’une décapitation qui sera systématiquement réalisée par du personnel compétent pratiquant cette technique en routine.
Impact sur les animaux
Les vecteurs AAV et le Nanoprimer ont tous déjà été administrés chez la souris à des doses supérieures ou égales à ce qui est envisagé dans ce projet, sans observation de signe clinique notable. L’injection en intra veineuse dans la veine caudale engendre une légère douleur due à la piqure. Pour limiter le désagrément, un anesthésique local de type crème EMLA sera appliqué juste avant la procédure. Pour le prélèvement sanguin, la souris sera sous anesthésie gazeuse et ne pourra donc pas ressentir de douleur. Une légère douleur au point de prélèvement due à la piqure peut être ressenti après le réveil. Pour l’euthanasie, les souris seront sous anesthésie gazeuse que ce soit pour la dislocation des cervicales ou la décapitation
Devenir
Mise à mort pour prélèvement d'organes pour des études post mortem.
Remplacement
Les modèles in vitro ne peuvent s'approcher de la complexité des interactions entre le vecteur et l’environnement biologique in vivo et rendent donc difficile la reproductibilité de ces résultats in vivo. L’utilisation de la souris est donc justifiée pour évaluer ces différents paramètres.
Réduction
Dans le contexte de cette étude pilote, le nombre d’animaux est réduit au strict minimum pour avoir suffisamment de données pour une suite ou non de ce projet. En première intention, 110 souris réparties sur 11 groupes seront utilisées pour tester le Nanoprimer et l’AAV8 avec deux doses différentes. Selon les résultats obtenus, des analyses supplémentaires pourraient être étendues à d’autres sérotypes d’AAV cliniquement pertinents comme l’AAV9. Dans ce cas, 4 groupes représentant un total de 40 souris supplémentaires seraient injectés.
Raffinement
Le bien-être animal et le raffinement des procédures passera par de bonnes conditions d’hébergements, un suivi quotidien des animaux, l’instauration de points limites pertinents et précoces ainsi que la mise en place de mesures adaptées (anesthésie, analgésie etc.).
Choix des espèces
Dans la majorité des études de thérapie génique, une espèce mammifère est requise pour avoir une pertinence clinique. L'utilisation de la souris est justifiée à la fois par la possibilité de constituer des groupes suffisamment larges pour effectuer des analyses statistiques. Par ailleurs, l’utilisation de souris est justifiée par la disponibilité de nombreux modèles murins transgéniques mimant des pathologies pouvant être traitées par thérapie génique. La preuve de concept de l’utilisation du nanoprimer co-injecté avec le vecteur de thérapie génique pourra être étendu à différents modèles de maladies. Notre étude sera réalisée sur de jeunes adultes d’environ 8 à 12 semaines.
Etude de la réponse mémoire à Staphylococcus aureus dans des modèles murins de psoriasis, de dermatite atopique et d’eczéma allergique de contact
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des applications cutanées répétées de la bactérie Staphylococcus aureus, d'imiquimod, de calcipotriol et de l'allergène DNFB, ainsi que des injections de toxine diphtérique, pour induire psoriasis, dermatite atopique et eczéma de contact, avec un risque de nécrose cutanée. L'objectif est d'étudier la réponse immunitaire mémoire de la peau. Le porteur affirme que cette réponse tissulaire ne peut être remplacée par des modèles in vitro.
Objectifs
Staphylococcus aureus (S. aureus) est une bactérie colonisant la peau des patients atteints de dermatite atopique (DA) et de psoriasis (Pso). Des données cliniques montrent que S. aureus aggrave la DA, mais il n’y a pas d’évidence pour le Pso. La compréhension des mécanismes par lesquels la bactérie aggrave une inflammation cutanée plutôt qu’une autre permet de définir de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblées sur ces mécanismes. Des résultats préliminaires obtenus dans un modèle murin montrent qu'une souche de S. aureus isolée de patients atteints de DA, est capable d’induire une inflammation cutanée de type DA, ainsi qu’une infiltration de lymphocytes T. D’autres résultats montrent que la réponse mémoire à S. aureus diffère dans des modèles sans inflammation cutanée préalable, des modèles de Pso ou de DA. Mais le rôle des lymphocytes T induits par S. aureus dans ces modèles est actuellement inconnu. Un modèle d'eczéma allergique de contact (EAC), fort pourvoyeur de lymphocytes T, sera également inclus. L’objectif principal du projet est de caractériser la réponse mémoire à S. aureus dans les différentes conditions d’inflammation cutanée (DA, Pso ou EAC) afin de trouver de nouveaux mécanismes par lesquels S. aureus est capable d’aggraver la DA. Les objectifs des procédures sont : (i) caractériser l’infiltration de lymphocytes T induite par S. aureus dans des modèles de Pso, de DA et d’EAC ; (ii) caractériser le rôle de l’infiltration de lymphocytes T dans la réponse d’hypersensibilité à S. aureus et son rôle protecteur lors d’une réexposition à la bactérie.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objet l’étude des mécanismes impliqués dans la dermatite atopique (DA), une maladie complexe touchant jusqu’à 20% des enfants dans les pays occidentaux. Les bénéfices attendus sont multiples. 1. Comprendre l’interaction entre colonisation cutanée à S. aureus et réponse immunitaire cutanée ; 2. Corréler la qualité de la barrière cutanée (normale, inflammée type 2, 17 ou 1) et la réponse mémoire cutanée à S. aureus ; 3. Comprendre les mécanismes par lesquels S. aureus aggrave la DA. Ces analyses mécanistiques s’intrègrent dans la réflexion actuellement menée sur les thérapeutiques à développer pour traiter et/ou prévenir la DA chez l’homme. La compréhension des mécanismes par lesquels S. aureus pourrait aggraver une inflammation cutanée, selon la qualité de la barrière cutanée, devrait ouvrir des opportunités thérapeutiques ciblant 1. S. aureus et ses toxines, 2. le microbiote cutané commensal et 3. la réponse immunitaire cutanée à S. aureus. Ainsi ces données alimenteront la réflexion sur l’utilisation des inhibiteurs de toxines de S. aureus, la restauration de la barrière cutanée par l’utilisation d’émollients éventuellement associés à l’application de bactéries commensales ou de pré/probiotiques et l’utilisation de traitements ciblés sur les lymphocytes T résidents mémoires.
Procédures
Application de Staphylococcus aureus à J0, J2, J6 et J8 pour induire une réponse primaire (4 applications) et éventuellement une application à J60 (1 application). Durée 5 secondes par face. Application quotidienne de 10 µl d’imiquimod de J0 à J3 et J6 à J8 (7 applications). Durée 5 secondes par face. Application de 12.5 µl de calcipotriol par face d’oreille, à J0, J2, J6 et J8 (4 applications). Durée 5 secondes par face. Application de 5 µl/face d’oreille de DNFB 0.13% à J0, J2, J6 et J8 (4 applications). Durée 5 secondes par face. Injection intrapéritonéale d'un mélange dilué de kétamine et xylazine à J0, J2, J6 et J8 pour induire une réponse primaire (4 injections) et éventuellement une injection à J60 (1 injection). Durée de l'injection 5 secondes. Injection de toxine diphtérique diluée à J56 et J59, et J66 (3 injections). Durée de l'injection 5 secondes. Mesure de l'épaisseur quotidienne des oreilles. Durée de la mesure 3 secondes par oreille. Sédation par isoflurane 3,5% pendant 30 secondes. Pesée dans une boîte adaptée, durée 5 secondes par souris.
Impact sur les animaux
Les procédures mises en place ne devraient pas donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l'état général des animaux, toutefois les animaux sont surveillés 5 jours par semaine et tout animal qui présenterait des signes physiologiques anormaux (souris prostrées ou encore apparition de nécrose cutanée) suite à l’application cutanée des composés, serait mis à mort.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort et certains organes sont utilisés pour analyse de la reponse immunitaire
Remplacement
L’utilisation de modèles in vivo, animaux, ne peut être remplacée par d’autres modèles. Il s’agit d’une caractéristique de la biologie cutanée : nous analysons la réponse immunitaire tissulaire, et non systémique. Ainsi les modèles in vitro, s’ils tendent à être optimisés, ne permettent pas d’analyser la réponse mémoire tissulaire. Par ailleurs, les modèles humains ne sont pas développés pour cette thématique, limités par le nombre de prélèvements réalisables. Il n’existe pas d’autre modèle expérimental de DA, de Pso ou d'EAC avec colonisation cutanée par S. aureus. Les modèles de peau reconstruite, de plus en plus utilisés en biologie de la peau, ne permettent pas l’inclusion et la stabilité de cellules immunitaires de type lymphocytes T ; l’analyse en phase mémoire est actuellement impossible. Par ailleurs, l’étude des lymphocytes T résidents mémoires se fait nécessairement au sein d’un complexe immun cutané qui n’est aujourd’hui pas modélisé dans ces peaux reconstruites. Au niveau humain, isoler les mécanismes immunitaires induits par S. aureus chez des patients atteints de DA (ou d’autres pathologies cutanées) est évidemment impossible. Les méthodes d’exposition aux bactéries (type patch-tests) ne sont pas développées et sont limitées par le nombre de biopsies réalisables chez l’Homme.
Réduction
L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes.
Raffinement
Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l'animalerie, une période d'acclimation d'une semaine sera respectée avant le debut de la procédeure expérimentale, et les souris seront maintenues entre 4 et 5 souris par cage, afin de les maintenir au maximum en groupe social. Dans le cadre de ce projet, les animaux seront anesthésiés pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress ou une douleur pour l’animal. Des points limites bien définis et suffisamment précoces et prédictifs pour prévenir tout stress et toute douleur de l’animal ont été mis en place. L’observation des animaux sera effectuée 5jours/7 et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Les soins et les procédures seront réalisées par du personnel qualifié. Le poids des animaux sera egalement suivi tout au long de l'experience, et si des animaux perdaient du poids (+ de 5% de leur poids), des croquettes humides seraient mises dans le fond de la cage.
Choix des espèces
L’espèce souris est un modèle très utilisé en pathologie immunologique telle que l’allergie et autres inflammation cutanée en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de cytokines inflammatoires ou encore l’induction de des différentes populations de lymphocytes mémoires. De plus, l’utilisation de ce modèle, couramment employé dans ce domaine, nous permettra de discuter nos résultats par rapport aux données existantes de la littérature. Les souris entrent dans les procédures à 8-10 semaines, âge auquel les souris présentent un système immunitaire suffisamment mature pour effectuer une sensibilisation efficace.
Essai d’efficacité d’une nouvelle thérapeutique de la maladie de Menkès (EU 2/2), Avenant au projet
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 30 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des souris porteuses de la mutation de la maladie de Menkès reçoivent des injections sous-cutanées cinq jours sur sept jusqu'à l'âge de 56 jours et subissent sept tests neurocomportementaux, les animaux non traités pouvant mourir de rupture d'anévrisme aortique. L'objectif est de tester un transporteur synthétique de cuivre présenté comme un futur médicament pour les enfants atteints. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire" d'étudier l'efficacité chez l'animal vivant.
Objectifs
La maladie de Menkès est une maladie rare causée par un défaut de transporteur de cuivre (ATP7A) au niveau des barrières intestinales, placentaires et cérébrales causant alors de nombreuses altérations des fonctions biologiques et un décès dans les premières années de vie. Les traitements actuels sont inefficaces et le devenir des enfants atteints reste extrêmement pauvre. Dans le contexte de cette maladie, l’obstacle du passage au niveau des barrières intestinales et cérébrales est responsable de la pathologie. Le développement et l’étude des nanoparticules ont montré qu’elles avaient une capacité de diffusion inter et intracellulaire augmentée grâce à leur faible taille leur permettant alors de traverser la barrière hématoencéphalique. Dans ce cas l’utilisation d’un transporteur synthétique de cuivre serait une solution thérapeutique. Dans un projet précèdent, nous avons démontré son passage cérébral par l’augmentation de la quantité de cuivre dans le cerveau de souris malades traitées avec le « médicament ». Ces premières études ont montré la tolérance au transporteur ayant permis de déterminer la dose et le rythme optimal d’injection. Le but de ce projet est alors d’optimiser les effets de l’administration répétées chez les souris atteintes sur la biodisponibilité du cuivre et la restauration des fonctions altérées des animaux malades. L’objet de cet avenant porte sur l’ajout d’un groupe d’étude composé de 10 animaux atteints traitées avec du cuivre-histidine, traitement actuel inefficace de la maladie. En effet, bien que le cuivre-histidine restaure une concentration normale de cuivre dans le sang, ce dernier n’atteint pas le cerveau et ne permet donc pas de restaurer les atteintes neurologiques. Nous voulons donc montrer que notre traitement expérimental sera plus efficace que le traitement actuel de la maladie.
Bénéfices attendus
Chez les animaux malades traités avec le transporteur synthétique de cuivre : 1) Restauration des fonctions altérées 2) Restaurations des fonctions neurologiques principales, 3) Amélioration de la survie, 4) Restaurations des atteintes squelettiques observés. L'objectif de ce projet est de produire un médicament capable de soigner des enfants atteints de la maladie et qui ont une espérance de vie très réduite.
Procédures
1/Injections sous cutanées répétées de médicament ou placebo 5 jours sur 7 à partir de J5 et ce jusqu’à la fin du protocole à J56. 2/Tests neurocomportementaux au nombre de 7 allant de J3 à J56
Impact sur les animaux
Chez les animaux malades non traités avec le « médicament » : défauts de croissance et difficultés d'alimentation, risque de mort des animaux non traités par rupture/anévrismes aortiques. Chez les animaux malades traités avec le « médicament », une toxicité liée au produit peut apparaitre mais cela n'a encore jamais été observé dans les études que nous menons depuis juillet 2020. Des études de recherche de toxicité sur cellules de foie sont en cours.
Devenir
L’ensemble des animaux du protocole (60 animaux) seront gardés en vie après chaque procédure et ce jusqu’à la fin du protocole (fixé à J56 d’âge) afin de suivre l’évolution des animaux malades en réponse au traitement médicamenteux. L’âge de survie des animaux mutants non traités ou traités avec un placebo est comprise entre 3 et 5 semaines d’âge. En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et tous les organes d'intérêt seront rapidement prélevés et conditionnés afin de réaliser des analyses biochimiques, enzymologiques et anatomopathologiques.
Remplacement
Il est nécessaire d’étudier l’efficacité du transporteur synthétique du cuivre (TSC) sur des animaux vivants car l’objectif principal de l’étude est de montrer que ce traitement permet une pénétration du cuivre au niveau cérébral et une restauration des fonctions cérébrales liées aux cuproprotéines cérébrales. Le seul traitement actuel (administration parentérale d’histidinate de cuivre) permet de traiter les tissus non neurologiques des patients, donc sans effet sur le cerveau. L’intérêt majeur du TSC réside donc dans sa capacité à franchir la barrière hémato-encéphalique ce qui conduit à l’hypothèse qu’il pourra restaurer ainsi les fonctions cérébrales des sujets atteints. Les études préliminaires ont montré un dosage du cuivre plasmatique en hausse chez les animaux traités à l’aide du TSC ainsi qu’une accumulation de cuivre au niveau cérébral par colorations à la rhodanine (analyse laboratoire Anatomopathologie, CHRU Nancy-Brabois). Il n’existe pas d’alternative d’approche in vitro car le projet porte sur l’étude de l’allongement de la durée de vie et l’amélioration du comportement de l’animal porteur de la maladie de Menkès en fonction de la réponse au traitement.
Réduction
L’étude comportementale portera sur 60 souris de laboratoire, réparties en 6 groupes de 10 mâles dont 2 groupes de 10 souris saines et 4 groupes de 10 souris malades. Cette cohorte de 60 souris mâles sera étudiée et mise à mort une fois les tests comportementaux terminés, à l’âge de 2 mois. L’étude sera réalisée avant 2 mois si les points limites sont atteints avant cette échéance. Il s'agit du nombre d'animaux nécessaires pour mener à bien cette étude afin d’obtenir une puissance statistique suffisante. Au final, 40 mâles hémizygotes et 20 mâles de type sauvage seront issus des accouplements de 40 femelles hétérozygotes à 40 mâles de type sauvage, et 20 femelles de type sauvage à 20 mâles de type sauvage, cela afin de garantir une indépendance totale des échantillons (en se basant sur l’unité indépendante correspondant à la portée). Ainsi environ 420 animaux seront générés dans le contexte de cette étude mais seuls les mâles hémizygotes ou de type sauvage seront mobilisés pour le protocole expérimental. Les animaux surnuméraires de type sauvage et ne subissant aucun traitement, seront attribués à d’autres projet après accord du vétérinaire référent
Raffinement
Les procédures expérimentales auront lieu au sein de l'animalerie, dans un environnement sécurisant pour les souris. Ces 2 procédures comprennent 1/ la gestion de la lignée mutante qui présente un phénotype dommageable pour l’animal et 2/ l’injection du transporteur synthétique du cuivre par piqure sous-cutanée et répétée 5 fois par semaine, associée à 7 séries de tests comportementaux, puis une mise à mort des animaux pour prélèvement des organes. Une procédure d’estimation et suppression de la douleur est mise en place : différents éléments visuels chez l’animal sont évalués afin d’établir un score qui permet d’anticiper et d’éviter d’atteindre les points limites déterminés au préalable, et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, yeux et abdomen creux). Plus globalement, les animaux malades non traités subiront comme les autres l'ensemble des procédures expérimentales mais ils seront surveillés avec encore plus d'attention afin d'anticiper au mieux les points limites.
Choix des espèces
La souris ATP7AMoblo est le seul modèle de mutation spontanée permettant une étude de cette maladie génétique. D’autre part, ce choix se justifie par la possibilité de faire des liens avec d’autres modèles transgéniques murins concernant d’autres maladies métaboliques. Nous focaliserons l’étude sur les souriceaux durant la lactation des souris mères et jusqu’au-delà du sevrage, à J56, correspondant à la fin du dernier test comportemental. En effet, durant cette période nous pourrons évaluer l’efficacité du traitement sur l’évolution de l’activité neurocomportementale des animaux en réponse au traitement médicamenteux.
Thérapie cellulaire dans un modèle de dégénérescence rétinienne le rat RCS
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
186 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des rats porteurs d'une dégénérescence rétinienne reçoivent une greffe de cellules par chirurgie oculaire, sous immunosuppresseur, puis des tests comportementaux d'acuité visuelle par optométrie et boîte clair-obscur, avant d'être tués au CO2 pour prélever les yeux. Le projet teste une thérapie cellulaire dérivée de cellules souches humaines. Le porteur affirme qu'aucune méthode substitutive ne permet de mesurer l'acuité visuelle.
Objectifs
L’objectif principal du projet est de transplanter différentes populations cellulaires dérivées de cellules souches pluripotentes induites humaines (hCSPi) obtenues à partir de sujets sains (sans pathologie oculaire) chez le rat RCS (Royal College of Surgeons). Nous pourrons ainsi évaluer l’impact de la transplantation de ces différentes populations sur la survie des photorécepteurs de l’hôte et l’amélioration de l’acuité visuelle. Le rat RCS est un modèle de dégénérescence rétinienne dû à une mutation spontanée responsable de la mort des photorécepteurs (cellules photosensibles de la rétine). Cette mutation va donc induire une cécité qui débute vers 18 jours post-natal et qui sera totale au 3 mois de vie de l'animal. En résumé, dans ce projet nous souhaitons étudier (1) la survie et l'intégration (2) l'effet thérapeutique de la transplantation de différentes populations cellulaires dans un modèle de dégénérescence rétinienne par des anaylses comportementales et histochimiques réalisées à différentes temps post-transplantations : 3, 7 et 13 semaines.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet de thérapie cellulaire est de restaurer l'acuité visuelle ou ralentir la dégénérescence grâce à la transplantation de différentes populations de cellules rétiniennes chez le rat RCS. Des précédentes études ont démontré l'inocuité et la survie du transplant lors de transplantation de cellules de l'épithélium pigmentaire chez ce modèle. Aussi, une amélioration de l'acuité visuelle suite à une transplantation de ce type cellulaire a été décrite chez ce modèle animal. Cependant, de nombreuses hypothèses suggèrent que la transplantation d'un seul type cellulaire dans l'espace sous-rétinien n'est pas optimale dans le but d'une restauration visuelle. Ainsi, nous proposons de réaliser une transplantation multicellulaire avec l'obtention in vitro de mini-rétine. L'hypothése de notre étude est que (1) les différents transplants (unicellulaire et multicellulaire) vont survivre et s'intégrer (2) l'amélioration visuelle engendrée par la thérapie cellulaire sera supérieure dans le cas d'une transplantation multicellulaire en comparaison avec une transplantation unicellulaire. Il est à noter que la transplantation de mini-rétine dérivées d’hCSPi n’a jamais été réalisée dans ce modèle, rendant ce projet innovant. Chez l'Homme, la thérapie cellulaire et l’utilisation des cellules souches est une approche thérapeutique prometteuse dans le cadre de nombreuses maladies dégénératives telles que les dystrophies rétiniennes. À l’heure actuelle, la majorité des essais cliniques ont mis en évidence la faisabilité et l’innocuité de l’utilisation des cellules souches. Malgré des résultats encourageants, ces approches doivent être améliorées afin d’optimiser la récupération de l’acuité visuelle.
Procédures
Aucun prélèvement sur animaux vigiles ne sera réalisé. En revanche, les animaux seront soumis à 1 procédure expérimentale dont la gravité est estimée modérée. Les animaux (2 lots de 3 animaux pour l'étude pilote, 4 lots de 30 animaux dans l'étude principale) recevront une transplantation de différentes populations rétiniennes sous traitement anesthésique, antalgique et anti-inflammatoire. La durée de la chirurgie est estimée à 30 minutes. Afin de limiter le risque de rejet du greffon, les animaux seront sous traitement immunosuppresseur. Afin de mesurer le bénéfice de cette thérapie cellulaire, l'acuité visuelle de l'ensemble des animaux de l'étude principale sera testée grâce à 2 tests comportementaux réalisés à 3, 7 et 13 semaines post-tranplantation. Le premier test est un test d’optométrie, qui durera 1 minute / œil. Le deuxième test (light dark-box) permet de tester l’acuité visuelle globale des rongeurs grâce à leur instinct photophobique. Il sera réalisé pendant 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuissances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont : hémorragie oculaire non maitrisable lors de la greffe, opacité de la cornée persistante, stress et photophobie des animaux lors des tests comportementaux lié au changement d’environnement (durée courte de 1 à 5 min).
Devenir
L’objectif du projet est d’évaluer l’effet de la transplantation de populations rétiniennes sur l’acuité visuelle. A l’issue des tests comportementaux permettant de mesurer l'acuité visuelle, les animaux seront euthanasiés par inhalation de CO2 afin de récupérer les yeux pour des analyses anatomiques et histochimiques ultérieures : à 3 semaines post-transplantation pour tous les sous-lots 1, à 7 semaines post-transplantation pour tous les sous-lots 2, à 13 semaines post-transplantation pour tous les sous-lots 3.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de valider l’utilisation de cellules rétiniennes dérivées de cellules souches pluripotentes induites dans le cadre d’une thérapie cellulaire. Cela nécessite au préalable une approche dans un modèle animal avant de pouvoir être transposer à l'Homme à des fins thérapeutiques. Il ne peut pas être envisager l’utilisation d’une méthode substitutive puisque que nous devons ici mesurer l’acuité visuelle.
Réduction
Pour l'étude pilote, 2 lots de 3 animaux recevront une transplantation afin de valider la procédure chirugicale. Afin de diminuer le nombre d’animaux, les tests comportementaux et les analyses post-mortem seront réalisés sur l’ensemble des animaux. Les tests comportementaux seront réalisés de façon longitudinale afin que chaque animal soit son propre contrôle (mesures répétées à plusieurs temps). Le nombre d’animaux utilisé a été statistiquement défini selon la loi de Cochran. La réduction du nombre d’animaux nécessaires à l’expérimentation a été calculé en s’assurant d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour garantir la qualité statistique des données et ainsi empêcher la reproduction de ces expérimentations. Ainsi, nous nous sommes basés sur un niveau de confiance déduit de 95% (z) avec une marge d’erreur de 5% (d). La proportion estimative de la population ayant la caractéristique étant inconnue, elle a été définie à 0,5 (p). Ainsi, suivant ce calcul (nombre d’animaux =(z)2/4d2 quand p=0.5), 180 animaux seront utilisés pour l'étude principale : 10 animaux multiplié par 3 cinétiques temporelles et 6 conditions expérimentales soit n = 10 x 3 x 6 = 180 animaux.
Raffinement
Les méthodes expérimentales utilisées dans cette étude sont validées, reproductibles et classiquement retrouvées en laboratoire. Conformément à la règle des 3R, différents dispositifs seront mis en place afin de réduire au maximum la souffrance, la douleur et l’angoisse des animaux. Ainsi, une grille de scoring du bien-être des animaux sera remplie tous les jours afin de détecter le plus précocement possible le point limite et de diminuer ou éviter toute souffrance animale. Ainsi, cela engendrera la mise en place d'un traitement antalgique. En cas d'atteinte d'un point limite terminal, la souffrance sera arrêtée immédiatement par la mise à mort de l'animal. De plus, les animaux seront observés tous les jours afin de mettre en évidence des signes de détresse (stéréotypie, hyper toilettage, oreilles positionnées en arrières et moins rosées). De plus, suite à la transplantation, l’absence d’hémorragie oculaire ou/et d’opacité de la cornée seront vérifiées quotidiennement pendant 7 jours puis de façon hebdomadaire. Pour un raffinement maximum, les rongeurs seront maintenus dans un environnement de statut sanitaire contrôlé et dans des conditions de température et d’hygrométrie réglementaires. Ils seront hébergés par groupe de deux, dans des conditions d’élevage standardisées (litière propre, au calme, cycle lumière/obscurité 12 heures) avec accès à un bâton de bois, leur permettant d’assouvir leur besoin naturel de rongeur. Par ailleurs, de la veille de la transplantation jusqu'à la mise à mort, les animaux seront immunodéficients par traitement à la cyclosporine A : ainsi ils seront hébergés en portoir ventilé permettant le maintien d'un statut sanitaire en adéquation avec l'immunité réduite. De plus, les tests comportementaux utilisés dans ce projet, ne nécessiteront pas d’intervention directe de l’expérimentateur. Une étude pilote sera réalisée sur deux lots de 3 animaux (lot 1 : rats RCS transplantés avec une population multicellulaire, lot 2 : rats RCS transplantés avec une population unicellulaire) afin de vérifier que le transplant est présent au niveau de l'hôte 3 semaines post transplantation et confirmer ainsi la procédure chirurgicale.
Choix des espèces
Le rats RCS est un modèle largement décrit dans de nombreuses études précliniques des pathologies rétiniennes. En effet, ce modèle de dégénérescence rétinienne précoce est l'un des 2 modèles les plus utilisés en ophtalmologie dans le monde (plus de 900 publications à ce jour), notamment pour tester de nouvelles approches thérapeutiques pour restaurer la fonction visuelle. Cette espèce animale présente une mutation spontanée responsable d’une incapacité pour les cellules rétiniennes à phagocyter les segments externes du photorécepteur entraînant l'accumulation de débris du segment externe et, par la suite, la dégénérescence des photorécepteurs. La cécité débute vers le 18ème jour post-natal et est totale environ 3 mois après la naissance. Par ces caractéristiques, l’utilisation d’une telle espèce animale est pertinente et justifiée pour tester la capacité des transplantations sous rétiniennes sur la restauration visuelle. Des rats Long Evans seront utilisés comme animaux contrôle (dont l’acuité visuelle n’est pas affectée). Les LE sont des rats pigmentés (comme les rats RCS) possédant une bonne acuité visuelle. Chez le rat RCS, le nombre de photorécepteurs commence à diminuer à 18 jours post-natal, de façon continue et progressive jusqu’à l’âge de 3 mois (cécité totale). Dans cette étude, nous souhaitons réaliser des transplantations à 22 jours post-natal, période précoce de la dégénérescence, qui est représentatif de la fenêtre temporelle qui serait utilisée dans le cas d’une transplantation chez l’Homme (phase précoce et diagnostique de la maladie).
Etude du rôle d’une protéine dans la réaction inflammatoire.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
150 souris vont être utilisées, 90 opérées puis tuées sans réveil et 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une laparotomie avec exposition de l'intestin et microscopie sous anesthésie sans réveil, l'autre une inflammation intestinale induite par un agent chimique dans l'eau de boisson, pouvant provoquer douleurs, perte de poids et saignements. L'objectif relève de la recherche fondamentale sur le rôle d'une protéine dans l'inflammation. Le porteur affirme que ce processus ne se reproduit que dans un "organisme vivant complet".
Objectifs
L'objectif principal de notre projet est de comprendre l'implication de notre protéine d'interet dans des processus inflammatoires. Pour cela, voici nos différents objectifs : 1- Analyser le rôle de notre protéine d'intérêt au sein des plaquettes qui sont des constituants du sang . Notre protéine est exprimée de manière importante au niveau des plaquettes, cellules intéragissant fortement avec un type de globule blanc, les neutrophiles, lors de l'inflammation. 2- Analyser le rôle de protéine d'intérêt au sein des neutrophiles. Après avoir démontré pour la première fois dans notre laboratoire que les neutrophiles expriment cette protéine d'intérêt, nous voulons savoir quel est son rôle spécifique sur ces cellules. 3- Analyser le rôle de cette protéine dans un modèle murin d'inflammation aigue de l'intestin induite par une substance chimique . Nous souhaitons déterminer si notre protéine d'intérêt a une action sur le développement de l'inflammation chez ces souris.
Bénéfices attendus
Des résultats précédents montrent une diminution significative du recrutement des neutrophiles chez des souris ne présentant pas du tout notre protéine d'interet par rapport aux souris n'ayant subi aucun traitement. Toutefois,cette protéine étant présente dans presque toutes les cellules de l'organisme, nous ne connaissons pas l'origine cellulaire impliquée dans ce phénomène. Nous attendons donc de ce projet une meilleure compréhension de l'implication spécifique de la protéine synthétisée par les plaquettes et par les neutrophiles. Par ailleurs, ce projet nous permettra de comprendre le rôle de notre protéine d'intérêt dans un contexte pathologique de maladie inflammatoire ( la maladie inflammatoire de l'intestin) et de l'envisager à long terme comme une cible thérapeutique potentielle.
Procédures
- Pour les expériences de microscopie sur l'animal vivant, nous réalisons une laparotomie (ouverture chirurgicale de l'abdomen) sous anesthésie générale et analgésie. Puis nous procédons à une exposition du mésentère ( intestin des souris) et à une induction de l’inflammation par un dépôt localisé d'une goutte d'un agent qui induit le recrutement des neutrophiles. Nous injectons de la Rhodamine, un composé permettant de visualiser les neutrophiles par une injection par voie veineuse. L’animal est maintenu anesthésié et installé sur une plaque chauffante pendant toute la procédure. A la fin de l’expérience ( Durée totale = 30 min : 10 min de préparation de l’animal + 20 min de passage au microscope), nous procédons à l'euthanasie des animaux. - Pour les expériences d’inflammation de l’intestin, nous diluerons un agent chimique qui induit une inflammation de l'intestin dans l’eau de boisson des souris et nous traiterons les souris pendant 5 Jours. Les biberons seront changés tous les 2 jours. Au bout des cinq jours, un prélèvement de sang sera fait après anesthésie et analgésie par voie chirurgicale et les animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Les souris pour lesquelles nous induisons une inflammation de l'intestin peuvent présenter des douleurs importantes, perte de poids et saignements intestinaux.
Devenir
- Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure. En ce qui concerne les souris pour lesquelles nous avons induit une inflammation de l’intestin, nous les euthanasierons à J5 post traitement afin de prélever les intestins et de pouvoir analyser l'inflammation.
Remplacement
Les résultats que nous avons précédemment obtenus montrent que le recrutement des neutrophiles est moins important en absence totale de notre protéine d'interet. Ces résultats prometteurs doivent être réalisés sur des souris qui ne présentent pas cette protéine spécifiquement sur les plaquettes ou sur les neutrophiles. Le recrutement des neutrophiles étant un processus complexe se faisant à partir de la moelle et impliquant de nombreux acteurs, cela n'est pas reproductible autrement que sur un organisme vivant complet .
Réduction
Nous limitons le nombre d'animaux au strict nécessaire permettant d'arriver à des tests statistiquement significatifs.
Raffinement
Les souris seront maintenues avec leurs congénères, dans des cages comportant de l’enrichissement et seront surveillées quotidiennement. Tous les protocoles sont réalisés sous anesthésie et avec une analgésie adaptée. Nous avons établi une grille d'évaluation du score clinique qui permet de mettre en place des actions pour soulager l'altération du bien-être des animaux. Les animaux sont ainsi suivis avec soin et des points limites bien définis permettent d'éviter toute souffrance animale. Ainsi, l’apparition de signes de douleur sera soit traitée par analgésie, soit aura pour conséquence la mise à mort des animaux en cas de score trop élevé .
Choix des espèces
Les souris sont les plus adaptées pour étudier notre protéine d'interet en raison de la ressemblance entre cette protéine humaine et la celle de souris et de la disponibilité des souris n'ayant pas cette protéine spécifiquement dans les plaquettes ou dans les neutrophiles. Ce modèle murin est plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants. Les souris seront utilisées entre 10 et 12 semaines. Les souris ont à ce stade atteint une maturité sexuelle mais restent assez jeunes pour analyser comme il se doit des phénomènes inflammatoires qui peuvent être favorisés par l'âge.
Etude des fonctions d’un nouveau gène dans le développement et la régénération musculaire chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
662 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des souris génétiquement modifiées reçoivent des injections de tamoxifène pour inactiver un gène, puis une injection de cardiotoxine, un venin de serpent, dans un muscle de la patte pour provoquer une lésion et suivre la régénération, avec des tests d'activité locomotrice. L'objectif relève de la recherche fondamentale sur le rôle d'un gène dans le muscle. Le porteur affirme que ces interactions cellulaires complexes exigent l'"organisme entier".
Objectifs
Notre projet vise à caractériser le rôle d'un gène x dans la formation et le maintien de la cellule musculaire pour améliorer la compréhension de certaines pathologies du muscle strié squelettique et permettre l’établissement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nous savons que ce gène a une fonction cellulaire importante dans la régulation de l'activité métabolique dans le système nerveux. Compte tenu de l'importance de la consommation d’énergie cellulaire par les cellules musculaires, nous pouvons émettre l'hypothèse que ce gene joue un role potentiellement important dans le developpement ou la reparation musculaire. Ce projet vise à tester cette hypothèse.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de mieux comprendre les mécanismes fondamentaux impliques dans le développement et la régénération des muscles squelettiques. Les gènes impliques dans ces mécanismes sont généralement impliques dans des maladies du système neuromusculaire comme par exemple les myopathies. Ils peuvent également fournir des cibles pour l'identification de biomarqueurs ou de pistes thérapeutiques potentielles.
Procédures
Des injections d'une molecule (le tamoxifene) seront realisées pour inactiver le gène x pendant 4 jours consecutifs. Une injection d'une toxine extraite du venin de serpent (la cardiotoxine) entrainera une lesion dans un muscle de la patte (posterieur) pour suivre les mécanismes de regeneration musculaire. Des tests d'exploration de l'activite locomotrice, non invasifs, peuvent entrainer un stress lie a la contention et manipulation.
Impact sur les animaux
La création d'une nouvelle lignée peut entrainer des phénotypes persistant toute la vie de l'animal. Sur la base des phénotypes observes pour des gènes proches, nous nous attendons à des perturbations de croissance et des perturbations locomotrices. Leur caractérisation est un des objectifs de ce projet. Les tests de comportement proposés dans la procedure 2 nécessitent la manipulation des animaux mais n'induisent pas de nuisances autres que le stress lie à la manipulation. L'étude de la régénération musculaire nécessite l'injection d'une toxine (cardiotoxine) dans le muscle tibialis anterior, induisant une lésion musculaire limitée a ce muscle.
Devenir
Les animaux proviennent de lignées génétiquement modifiées et ne pourront donc pas être placés hors de l'animalerie. En fin d'expérience il sera procédé à la mise à mort des animaux pour prélever des tissus.
Remplacement
Le recours à l’animal, et notamment aux modèles transgéniques, permet d’identifier le rôle de certains gènes dans les processus de remodelage et de dégénérescence tissulaire. Ces modèles offrent la possibilité de réaliser des analyses de tissus, voire de l’organisme entier et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Par ailleurs la physiologie et l’homéostasie du système neuromusculaire implique des interactions complexes entre différent types cellulaires (motoneurones, myofibres, tissus conjonctif, macrophages…) qui ne peuvent à l’heure actuelle pas être reproduits in vitro.
Réduction
Le projet étant réalisé en partenariat entre deux équipes de recherche, chaque fois que ce sera possible les expériences seront réalisées par plusieurs expérimentateurs et dans la mesure du possible, nous procéderons à des prélèvements multiples sur le même individu. Les accouplements seront optimisés afin de produire strictement le nombre nécessaire de souris. Les analyses statistiques précédentes de l'équipe permettent d'ajuster le nombre d'animaux requis au minimum.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans les conditions standard d’hébergement et l’environnement sera enrichi. Lors des différentes procédures, un suivi régulier des animaux sera réalisé et pour toute manipulation susceptible d’entrainer du stress ou de la douleur, nous aurons recours systématiquement aux techniques d’analgésie et d’anesthésie.
Choix des espèces
Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'homme dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin permet des explorations moléculaires, cellulaires, tissulaires et fonctionnelles (évaluation de la fonction contractile du muscle). Certains travaux ont montré que les étapes de la myogenèse, après induction d’une inflammation, sont identiques chez la souris et chez l'homme, rendant pertinent ce modèle pour l'investigation physiopathologique du muscle qui est impossible à réaliser chez l'homme. Ce projet concerne le développement et l’homéostasie du système neuromusculaire chez des animaux adultes. Chez la souris, le muscle termine sa croissance aux alentours de 5 semaines. Les animaux seront considérés comme adultes à partir de 8 semaines, âge auquel les procédures seront initiées. Les tests de fonction motrice seront réalisés sur des souris de 12 semaines, soit 4 semaines après l'inactivation du gène X, ce délai permettant potentiellement l’apparition de déficits fonctionnels. Dans une optique de réduction du nombre de portées générées, les cohortes pourront néanmoins inclure des animaux jusqu’à l’âge de 5 mois (20 semaines), s’il manquait quelques animaux par génotype. Selon la littérature, il n’y a pas de différence liée à un phénotype de vieillissement chez des souris entre 12 et 20 semaines, les animaux seront donc essentiellement comparables.
Essai d’une thérapie combinée cellulaire et optogénétique pour le remplacement de photorécepteurs chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
295 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des rats immunodéficients porteurs d'une dégénérescence rétinienne reçoivent une greffe de cellules sous la rétine par chirurgie oculaire, puis des examens d'imagerie et d'électrorétinographie sous anesthésie et des tests visuels, avant d'être tués pour analyser la rétine. L'objectif est de tester une thérapie combinée cellulaire et optogénétique censée restaurer la vision. Le porteur affirme que cette évaluation "ne peut être réalisée que chez l'animal".
Objectifs
Ce projet a pour objectif de valider le potentiel de restauration visuelle de cellules rétiniennes appelées photorécepteurs rendues artificiellement sensibles à la lumière grâce à la présence d’une protéine microbienne. Ces photorécepteurs sont obtenus in vitro à partir de cellules souches humaines appelées cellules iPS suivant une méthode établie dans notre équipe. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer dans un modèle de rats présentant une dégénération de la rétine similaire à celle observée chez l’homme et immunodéficient, le potentiel thérapeutique de ces cellules. Nos études précédentes ont montré la nécessité de sélectionner une population homogène de cellules à transplanter et permis de valider un système de sélection des photorécepteurs par tri magnétique. Nos premières études de transplantation dans un modèle murin de dégénération de la rétine, ont démontré que ces cellules survivent dans la rétine, peuvent devenir des photorécepteurs (cellules rétiniennes) matures, et se connecter aux autres neurones de la rétine de l'hôte. En revanche, aucune amélioration significative de la vision n’a pu être observée. La maturation de ces cellules greffées en photorécepteurs fonctionnels restant un obstacle, nous avons combiné notre approche de thérapie cellulaire avec l’optogénétique, dans le but de conférer artificiellement aux cellules transplantables une sensibilité à la lumière. L’objectif de ce projet est donc de tester le potentiel de restauration visuelle de ces cellules modifiées après transplantation dans une modèle de perte visuelle liée à une dégénérescence des photorécepteurs.
Bénéfices attendus
Les travaux de thérapie cellulaire humaines de ces dernières années utilisant des photorécepteurs dérivés de cellules souches pluripotentes ont permis d’établir sa faisabilité en termes de survie et d’intégration dans le tissus hôte des cellules transplantées. En revanche, la plupart des études témoignent d’une absence ou d’une faible récupération fonctionnelle, liée notamment à un défaut de maturation des cellules transplantées. L’approche proposée ici vise à contourner cet obstacle à l’aide de cellules rendues photosensibles artificiellement par une approche d’optogénétique qui devrait permettre d’observer une récupération fonctionnelle beaucoup plus importante.
Procédures
Trois groupes d’animaux subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale qui consiste en l’injection intraoculaire (sous la rétine) de deux types de cellules différentes (2 groupes) en suspensions ou de solution tampon(1 groupe) ; cette opération dure 15 à 20 minutes. Cet opération n’est réalisée qu’une seule fois. Tous les animaux feront l’objet d’un examen par imagerie permettant l’observation de l’anatomie et la structure de la rétine (tomographie par cohérence optique) et d’un examen électrophysiologique (Electrorétinogramme) qui permette l’étude de la fonction de ce tissu; ces examens qui nécessitent l’immobilité de l’animal se fera sous anesthésie générale ; Les examens d’imagerie ont une durée de 10 à 15 minutes; l’électrorétinogramme a une durée de 30 minutes environ. Ces examens seront réalisé une fois par mois (maximum de 6 fois pour les animaux gardés le plus longtemps) Les animaux réaliseront également des tests comportementaux à l’état vigil sans contrainte particulière. ces tests de la fonction visuelle sont rapides (5 à 10 minutes environ). Ces examens seront réalisés une fois par mois (maximum de 6 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux vivants.
Impact sur les animaux
Très peu d’effets indésirables sont attendus pour ce projet. Les nuisances ou effets indésirables possibles de l’étape chirurgicale consistant en la transplantation cellulaire dans l’espace sous-rétinien sont une douleur oculaire et péri-oculaire dans une courte période post-opératoire. Les procédures post-opératoire (tests visuels, imagerie) n’ont pas d’effets indésirables avérés. Dans de rares cas, une inflammation anormale de l’œil peut être observée en post-opératoire.
Devenir
A la suite de chacune des procédures, les animaux sont euthanasiés pour permettre des analyses histologiques ou fonctionnelles (électrophysiologiques) des tissus (rétine). Ces explorations sont nécessaires pour évaluer le bénéfice de la transplantation au cœur du projet et le devenir des cellules transplantées (intégration au tissus de l’hôte, etc…).
Remplacement
Le projet consiste à évaluer la capacité d’une greffe de cellules à permettre une récupération fonctionnelle visuelle. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro. Ce projet ne peut être réalisé que chez l’animal.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les transplantations seront réalisées dans un seul œil ; l’œil controlatéral servira de contrôle évitant d’utiliser d’autres animaux dans ce but. Par ailleurs, la majorité des actes peuvent être réalisés sur les mêmes animaux permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total d’animaux pour cette étude est de 295 réparti en trois groupes distincts. Nous avons réduit le nombre d’animaux par groupe au minimum requis en tenant compte de la variabilité plus importantes des mesures effectuées (en raison d’un taux d’échec évalué à 20-30% (chirurgie, rejet de greffe, opacification du cristallin, etc..). Cet effectif a été déterminé à l’aide d’un calcul de puissance permettant une analyse statistiquement robuste et ainsi l’interprétation fiable des données obtenues.
Raffinement
L’alopécie précoce des animaux de phénotype « Nude » peut se traduire par une petite accumulation de poils sous la paupière, source d’irritation oculaire et potentielle source d’infection locale si elle n’est pas traitée. Les procédures prévoient une surveillance accrue de ces animaux et un nettoyage des yeux au sérum physiologique en cas de besoin. Les procédures utilisées comportent plusieurs tests comportementaux qui n’ont pas d’effets indésirables avérés ou documentés et ne génèrent pas de douleur avérée. Les actes, test ou examen (imagerie, ERG) qui nécessitent l’immobilité complète de l’animal sont réalisées sous anesthésie générale pour éviter tout stress de l’animal qui pourrait être provoqué par une contention stricte. le risque d’une légère irritation de la surface oculaire ne pouvant pas être totalement exclue, les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue pendant les 24h suivant les différents actes (réveil post-anesthésie, état de la surface oculaire après les électrorétinogrammes, signe d’inflammation, etc…). Le geste chirurgical, qui peut générer une nuisance ou douleur temporaire est géré en pré et post-opératoire par un traitement analgésique (Buprénorphine puis AINS longue durée (métacam). Les animaux sont élevés en cages de stabulation avec enrichissement pour toute la durée du protocole (bâton à ronger, lambeaux de papier kraft), nourriture et abreuvement à volonté. De manière plus spécifique, tout signe extérieur d’inflammation oculaire sera recherché (gonflement, paupière fermée, grattage) suite au geste chirurgical et examens d’imagerie ; les signes de comportement anormal signe de souffrance seront recherché (réaction violente à la manipulation ; vocalisation) Les points limites sont : Une perte de poids supérieure ou égale à 20% Apparence : Traces de blessures importantes ; tout signe d’inflammation ou d’infection de l’œil avec une fermeture prolongée de l’oeil ou augmentation du volume de l’oeil opéré (x2) ou abcès et écoulement ; l'observation d'un de ces points limites entraînera l’euthanasie immédiate de l’animal par inhalation de CO2 et élongation cervicale.
Choix des espèces
Le rat est une espèce couramment utilisée dans les études précliniques. Ce choix permettra une comparaison des résultats obtenus avec ceux de la littérature. La taille de l’animal rend le geste technique (transplantation sous-rétinienne) moins difficile que chez la souris par exemple, ce qui réduira significativement le risque d’échec de la procédure et donc le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Nous utiliserons une lignée particulière, chez laquelle le système immunitaire est altéré, Ce modèle permet l’étude de xénogreffes (greffe entre donneur et hôte d'espèces différentes) sur le long-terme en réduisant drastiquement le rejet des cellules transplantées normalement provoqué par une forte réponse immunitaire (xénogreffe). Il permet également d’éviter les traitements anti-rejets potentiellement toxiques à long terme ; Les animaux sont inclus dans l’étude à l’âge de 3 mois, stade auquel la dégénérescence de la rétine est effective et l’ensemble des procédures s’étalera sur une durée de 6 mois (étude jusqu'à 6 mois post-transplantation) donc jusqu’à un âge maximal de 9 mois.
Développement d’un traitement (dispositif médical) contre l’obésité par stimulation bioélectronique du système sympathique chez le rat.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
730 rats vont être utilisés, 630 opérés puis tués sans réveil et 100 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, chaque animal subit une chirurgie pouvant durer quatre heures, avec laparotomie, pose d'un ballonnet gastrique, laminectomie puis trois heures de stimulation et d'enregistrement nerveux. L'objectif est de développer un dispositif médical contre l'obésité par stimulation du système nerveux sympathique, en vue d'un développement clinique. Le porteur affirme qu'"il n'existe aucune méthode in vitro validée" et que l'obésité impose l'étude d'un organisme vivant.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de développer un traitement (dispositif médical) contre l’obésité par stimulation bioélectronique du système nerveux chez le rat. Il existe de nombreux arguments et données scientifiques en faveur de l’existence d’une neuromodulation du système nerveux pour traiter l’obésité. En effet, les signaux acheminés par le système nerveux semblent jouer un rôle important dans la prise alimentaire. Les traitements actuels ne permettent pas de lutter efficacement contre l’obésité. En effet, les traitements les plus efficaces sont les approches chirurgicales lourdes comme la réduction de l’estomac, la technique du court-circuit des aliments, visent à limiter le volume de l’estomac pour réduire les prises alimentaires. Cependant, ces traitements sont très invasifs et entraînent de nombreux effets indésirables (troubles digestifs, vomissement…) chez l’humain. Le développement d’un dispositif médical, permettant par électrostimulation du système nerveux la régulation de la prise alimentaire, pourrait être un outil très prometteur pour lutter contre l’obésité. Un dispositif similaire d’électrostimulation a déjà été approuvé en 2014 par l'Agence fédérale américaine des produits alimentaires et des médicaments pour le traitement de douleurs dorsales réfractaires à la chirurgie.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels ne permettent pas de lutter efficacement contre l’obésité. Les traitements les plus efficaces sont des traitements lourds (chirurgie de l'obésité), engendrant de nombreux effets secondaires. Par conséquent, le développement de traitements moins invasifs, plus efficaces et sans effets secondaires pourraient apporter des solutions plus satisfaisantes pour les patients souffrant d’obésité.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule procédure chirurgicale qui n’excèdera pas 4h afin de réaliser les stimulations/enregistrements du système nerveux. Les durées sont : - injection de l'analgésie 30 secondes, -l'anesthésie à l'isoflurane 5 minutes, chimique injection 30 secondes - laparatomie et identification des nerfs cibles 20 minutes, - pose d'un ballonnet gastrique 20 minutes - laminectomie 20 minutes - stimulation et enregistrement 3h Au préalable une mise à jeun entre 14h et 20h pourra être effectuée pour les animaux de la procédure 1. Les animaux ne seront pas réveillés et seront euthanasiés à la fin de la procédure.
Impact sur les animaux
Les 2 procédures de ce projet décrivent des actes chirurgicaux. Les animaux seront soumis à une seule procédure chirurgicale, un certain niveau de douleur est attendu nécessitant des protocoles d’anesthésie / analgésie adaptés à l’espèce de façon à limiter au maximum la douleur. La chirurgie et les stimulations/enregistrements seront menés dans le respect de la règle des 3R.
Devenir
Les procédures comportent des chirurgies lourdes et invasives, il n’est pas envisagé de réveiller les animaux. Ils seront tous mis à mort dès la fin de la procédure expérimentale.
Remplacement
Il n’existe aucune méthode in vitro validée scientifiquement ou test in vitro connu qui offrirait une alternative à l’expérimentation animale pour répondre aux questions adressées dans ce projet. Le phénomène d’obésité ne peut être étudié correctement in vitro car il s’agit d’un phénomène complexe et doit donc être étudié chez l’animal, intégrant l'ensemble de la biologie d'un organisme vivant. L’utilisation d’un modèle expérimental in vivo est donc un prérequis à la phase de développement clinique. Nos expérimentations au sein de la société, même si elles nécessitent l’utilisation d’animaux, sont pratiquées avec un souci permanent de réduction du nombre d’animaux et de bien-être pour les animaux en expérimentation. Toutes les expériences sont réalisées dans le respect éthique de la règle des 3 R.
Réduction
Le nombre de rat a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables grâce à l’utilisation de tests statistiques.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué quotidiennement sans exception (Week-ends & jours fériés) par le personnel de l’établissement utilisateur. A la fin de la période d’acclimatation, les animaux seront observés 2 fois par semaine minimum par les expérimentateurs pour suivre l’état de santé général. Des points limites ont été établis afin d’anticiper toute dégradation de l’état de santé général des animaux et, le cas échéant, d’appliquer des protocoles de soins adaptés selon la fiche annexée à ce projet. Dans le cas où la santé de l’animal serait dégradée après 48h, une mise à mort sera réalisée immédiatement sur décision du directeur d’étude /ou du vétérinaire désigné. Lors des expérimentations, réalisées par du personnel compétent et qualifié, les animaux seront sous anesthésie et analgésie.
Choix des espèces
L’espèce rat sera utilisée en raison des données scientifiques démontrant une implication du système nerveux sympathique dans la prise alimentaire sur ce modèle. Ce modèle sera par la suite transposé à l’humain. Utilisation d’animaux adultes car l’objectif est le développement d’un dispositif médical pour les sujets adultes (≥ 8 semaines)
Etude de polluants atmosphériques sur l’homéostasie intestinale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
14 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 6 480 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des polluants par voie intranasale, des séjours en chambre d'inhalation jusqu'à quatre heures par jour, des administrations intrarectales, par gavage et dans l'eau de boisson, dans des modèles de maladies inflammatoires de l'intestin et de cancer colorectal qui provoquent inflammations et lésions du côlon. L'objectif est d'étudier l'effet des polluants atmosphériques sur l'intestin. Le porteur affirme que ces processus complexes ne peuvent être modélisés in vitro.
Objectifs
L'Organisation mondiale de la santé a identifié la pollution de l'air comme le plus grand risque pour la santé environnementale du 21e siècle (OMS, 2020). La surmortalité mondiale due à l'ensemble de la pollution de l'air ambiant est estimée à 8,8 (7,11-10,41) millions de décès par an, avec une perte d'espérance de vie de 2,9 (2,3-3,5) ans, un facteur supérieur à celui du tabagisme (Lelieveld et al., 2020). Géographiquement, la mortalité due à la pollution de l'air est dominée par l'Asie de l'Est (35 %) et l'Asie du Sud (32 %), suivies de l'Afrique (11 %) et de l'Europe (9 %). Les fractions correspondantes pour les années de vie perdues sont respectivement de 29 %, 36 %, 17 % et 6 %. Les polluants atmosphériques favorisent le développement de maladies respiratoires et cardiovasculaires, et de nouvelles études montrent qu’ils impactent également les tissus intestinaux. L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact des polluants atmosphériques dans 2 types de pathologies intestinales humaines : les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin et le cancer colorectal.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont une meilleure compréhension des effets de la pollution atmosphérique sur la santé intestinale, et donc la mise en évidence de facteurs permettant de limiter ces dommages.
Procédures
Les animaux seront soumis Procédure 1: administration intranasale sous anesthésie (durée variable : 1 seule fois ou maximum 3 fois par semaine pendant 2 semaines). Procédure 2: maintien en chambre d'inhalation pendant une durée maximale de 4heures par jour. Procédure 3: 1 administration intrarectale d'un composé. Procédure 4: administration d'un composé dans l'eau de boisson pendant pendant maximum 9 jours. Procédure 5: administration d'un composé dans l'eau de boisson pendant 5 jours. Procédure 6: 1 administration d'un composé par gavage. Procédure 7: 1 administration intrapéritonéale d'un composé. Procédure 8:1 administration intrapéritonéale d'un composé et 3 fois 1 administration d'un composé dans l'eau de boisson pendant 5 jours
Impact sur les animaux
Les modèles de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin et de cancer colorectal miment certains aspects de ces pathologies et entrainent des inflammations et des dommages du colon ou de l'intestin grêle.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour pouvoir analyser le niveau d'inflammation et/ou de cancer des tissus intestinaux.
Remplacement
Les processus physiopathologiques complexes des maladies inflammatoires chronqies de l'intestin et du cancer colorectal faisant intervenir les voies aériennes, les voies digestives, la sphère ORL, l'alimentation, le système immunitaire muqueux et sytémique , la flore intestinale, etc, ne peuvent pas être modélisés in vitro. Mais dès que possible, les mécanismes mis en jeu seront étudiés dans des modèles plus simples telles que des cultures cellulaires in vitro afin de satisfaire à la règle du remplacement.
Réduction
La souris est l’espèce utilisée depuis de nombreuses années pour modéliser les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin et le cancer colorectal. Ces modèles sont bien décrits et leur bonne connaissance au niveau de la littérature scientifique et au niveau des expérimentateurs de notre laboratoire permet d’éviter les étapes de mise au point expérimentale et de minimiser les aléas expérimentaux, ce qui contribue à réduire le nombre d’animaux nécessaires. Le nombre de souris utilisées par groupe expérimental a été réduit au minimum nécessaire pour obtenir des conclusions statistiquement significatives et donc publiables. Les effectifs seront déterminés et les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Pour réduire l’angoisse, les procédures classiques seront appliquées : pas de bruit inutile et stressant, phase d’acclimatation pour tout changement d’environnement, enrichissement, application des procédures pour le nombre de souris par cage. Des anesthésies générales seront pratiquées quand les procédures sont douloureuses ou stressantes. Afin de palier à d'éventuels problèmes anormaux survenant au cours des expérimentations, des points limites ont été définis.
Choix des espèces
La souris est l’espèce utilisée depuis de nombreuses années pour modéliser les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin et le cancer colorectal. Ces modèles sont bien décrits et leur bonne connaissance au niveau de la littérature scientifique et au niveau des expérimentateurs de notre laboratoire permet d’éviter les étapes de mise au point expérimentale et de minimiser les aléas expérimentaux, ce qui contribue à réduire le nombre d’animaux nécessaires. Pour l'étude des effets suite à une exposition prénatale, les expositions seront réalisées sur la mère pendant la deuxième et troisième semaine de gestation, et les effets seront étudiés sur la descendance après induction des procédures pathologiques 3 à 8. Pour l'étude des effets suite à une exposition adulte, les expositions seront réalisées sur souris agées de 8 semaines
Lipiodol et Hystérosalpingographie
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Rats : 300
Lapins : 500
1 000 souris, rats et lapins vont être utilisés dans des procédures couvrant tous les niveaux de souffrance, du plus léger au plus sévère, la plupart tués à l'issue et 120 réutilisés dans d'autres procédures. Ils subissent des accouplements, une synchronisation hormonale, des frottis vaginaux répétés, l'administration intra-utérine d'un produit de contraste par voie basse ou chirurgicale et une induction d'endométriose. L'objectif est de comprendre comment le Lipiodol, un produit de contraste iodé, améliore la fertilité féminine. Le porteur affirme que ce mécanisme ne peut s'étudier in vitro et conclut à une "nécessité" du recours à l'animal.
Objectifs
L'hystérosalpingographie est un examen radiographique (aux rayons X) de l’utérus et des trompes utérines généralement indiqué dans les bilans de d’infertilité féminine afin de vérifier la perméabilité des trompes de Fallope et la normalité de la cavité utérine. Elle consiste en une instillation de produit de contraste iodé (radio opaque) dans l’utérus et les trompes via une canule accolée au col de l'utérus. L'absence de passage du produit de contraste depuis les trompes de Fallope dans la cavité péritonéale signe une obstruction tubaire. Cette obstruction tubaire rend compte d’une infertilité féminine dans environ 35% des cas. Des travaux cliniques ont montré que l’hystérosalpingographie, quand elle est réalisée au moyen de l’injection d’une huile iodée, le Lipiodol, se traduit par une augmentation de la fertilité par rapport à la même technique réalisée au moyen de produits de contraste iodés hydrosolubles. Le mécanisme de cet effet n’est pas connu. Il existe quelques hypothèses dans la littérature. L’objet de ce projet est l’élucidation de ce mécanisme et des éventuelles conséquences endocrinologues (thyroïdiennes notamment) de l'administration d'un produit iodé ou huileux.
Bénéfices attendus
Les différentes études de ce projet seront réalisées dans le but de comprendre le rôle du Lipiodol dans l’amélioration de la fertilité et son mode d’action. Plusieurs hypothèses seront isolées et testées afin de connaître précisément le mécanisme du Lipiodol. Si un mécanisme est identifié, des essais cliniques pourront être lancés afin de confirmer l’effet en clinique. L’utilisation du Lipiodol pourra alors être revue et adaptée au mieux, pour les patientes chez lesquelles un effet pourrait être observé. En effet selon le mécanisme, il est possible que la totalité des causes d’infertilité féminines ne soit compatible avec une amélioration de la fertilité par l’administration du Lipiodol. Les patientes présentant un trouble de la fertilité pourraient donc par la suite bénéficier d’une meilleure prise en charge aboutissant à une augmentation des taux de grossesses, et évitant le recours aux procédures les plus invasives (fécondation in vitro ou autre).
Procédures
Imagerie RX, IRM ou échographie (15 minutes environ), accouplement, synchronisation du cycle œstral par supplémentation hormonale (une injection en vigile), frottis vaginal (2 minutes, en vigile): pourra être répété au cours de l’étude, avec un temps de récupération adapté entre chaque procédure. Administration intra-utérine d’un produit de contraste par voies basses ou chirurgie : une fois (1 heure au plus) puis suivi de quelques semaines par imagerie (15 minutes environ), sauf en cas de mise au point ou d’intérêt scientifique de répéter l’administration Induction d’endométriose : une chirurgie (1 heure environ), puis suivi clinique de quelques semaines.
Impact sur les animaux
Les procédures d’imagerie RX, IRM ou échographie, d’accouplement, de synchronisation ou d’identification par frottis vaginal du cycle oestral sont légères. Les nuisances attendues sur les animaux suite à ces procédures sont un potentiel inconfort au réveil dû à la durée de l’anesthésie ou lors de l’injection pour les procédures le nécessitant, ou du stress lors des contentions. La mise sous lampe chauffante ou sur tapis chauffant pendant les procédures d’anesthésie sera mis en place afin de maintenir la température corporelle, ainsi qu’au réveil. La procédure d’administration d’un produit par instillation intra-utérine, peut induire un inconfort gynécologique de l’animal, une irritation ou inflammation locale suite à l’insertion des cathéters, à la dilatation des trompes par l’injection du produit, ou à son écoulement. La procédure d’administration intra-utérine d'un produit par une procédure chirurgicale, et la procédure d’induction d’un modèle d’endométriose impliquent une chirurgie sous conditions stériles suivie d’une suture. Malgré la prise en charge analgésique post-opératoire, une démangeaison et/ou une douleur peuvent se manifester au niveau de la suture à cause de la tension des tissus et la cicatrisation. Une moindre activité et prise de nourriture peuvent être observées pendant quelques jours, suite à la chirurgie et l’anesthésie. Une collerette pourra être placée sur l’animal s’il touche trop leur plaie, et une hydratation pourra être envisagée au cas par cas si besoin. Les animaux seront surveillés quotidiennement et une prise en charge adaptée à chaque observation sera mise en place.
Devenir
En dehors des phases de mises au point, les animaux sont réveillés à l'issue de toutes les procédures. Les animaux seront suivis à leur réveil, plusieurs fois par semaine, pour évaluer leur état. En cas d'atteinte des points limites, une dernière procédure d'imagerie peut être effectuée sous anesthésie. A l’issue d’une étude (succession de plusieurs procédures), une mise à mort peut être réalisée sous anesthésie profonde à des fins d’analyse histologique ou de dosage, afin par exemple de caractériser la biodistribution et le mode d’action des produits testés.
Remplacement
La fertilité est le résultat de multiple processus complexes et interconnectés. Le mécanisme d’action du Lipiodol sur la fertilité est inconnu. L’étude de son effet est alors difficilement réalisable sur des modèles simplifiés in vitro. De plus, le Lipiodol n'est pas soluble dans les milieux de culture. Il semble donc nécessaire d'effectuer des études in vivo plus proche de la pratique clinique afin de mieux comprendre les effets induits par la présence de Lipiodol. Le recours au modèle animal apparaît donc comme une nécessité, au moins pour une partie des études. L’une des hypothèses mécanistiques de l’effet pro-fertilisant du Lipiodol est l’effet mécanique, par un meilleur débouchage des trompes, un effet viscosité du produit ou autre. Afin de remplacer le recours à des animaux, l’étude de cette hypothèse sera faite uniquement in vitro. Des études de cultures cellulaires in vitro pourront aussi être effectuées en complément afin d'étudier par exemple plus en détails la réponse immunologique sur un certain type cellulaire.
Réduction
Analyse bibliographique préclinique en amont pour ne pas refaire ce qui a déjà été fait, identifier les pistes à suivre, les erreurs à éviter, et faciliter les phases de mise au point. Macro-analyse de la littérature clinique pour en tirer les produits et donc paramètres qui semblent corréler avec les résultats de fertilité (guide vers une hypothèse mécanistique plutôt qu’une autre), et les pathologies répondant le mieux à l’amélioration de la fertilité après HSG (modèle le plus adapté). Recherche et contact d’équipes à contacter spécialistes dans les différents domaines (HSG clinique et préclinique, endométriose, fertilité et PMA) pour nous guider dans nos recherches (aide technique, pertinence des études, modèles, paramètres à suivre). Réutilisation des animaux pour les mises au point : - Lorsque cela est possible, premiers essais sur animaux post-mortem ou sans réveil d’animaux qui doivent être euthanasiés dans d’autres projets - Lors des étapes suivantes de mise au point, avec réveil, réutilisation d’un animal plusieurs fois si pertinent (échec précédent, non interférence avec les paramètres évalués) et procédure légère ou modérée - Un délai de 14 jours sera respecté avant réutilisation afin de permettre à l’animal de récupérer pour les HSG Lapins. Pour les souris, l’essai du passage du col et éventuellement l’injection vigile intra-utérine et contrôle par imagerie pourra être réalisé jusqu’à 3 fois par semaine, suivi d’un repos de 7 jours si une réutilisation pour le même usage est envisagée. Pour le protocole de synchronisation oestral des souris, un délai de 2 semaines sera respecté entre 2 administrations hormonales. Réutilisation des animaux au sein des études : - un échec de procédure légère ou modérée (par exemple échec d’administration intra-utérine d’un produit par voie naturelle) mènera à la réutilisation de l’animal pour un second essai, après temps de récupération nécessaire, à condition que les points limites ne soient pas atteints et si le protocole d’étude le permet. - suivi longitudinal de la distribution du produit en imagerie sur un même animal plutôt que par dosage sur prélèvement, pour réduire le nombre d’animaux en étude. - Les animaux dont l’euthanasie n’est pas nécessaire pour la finalité de l’étude pourront être réutilisés pour des mises au point de techniques/modèles, dans un autre projet, pour la formation, le prélèvement de matrices pour mises au point de techniques d'analyses.
Raffinement
Surveillance et relevé quotidien de l’état clinique, pesée régulière et scoring adapté à chaque protocole afin de quantifier l’état clinique, envisager un traitement et déterminer un score « point limite ». Enrichissement des cages d’hébergement : • Balle et bâtons en bois à ronger (lapins) • Bâtons à ronger, tubes en plexiglass pour l’abri, frisures de papier kraft pour le nid (rongeurs en groupes sociaux). Système de maintien de la température et monitoring de paramètres physiologiques lors des anesthésies. Anesthésie et analgésie : •Chez la Souris, l’administration intrautérine sera idéalement vigile en simple contention, comme cela est fait dans le cadre de l’insémination artificielle. La mise au point sera réalisée en premier lieu sous anesthésie gazeuse. Une habituation des animaux à la contention sera réalisée avant le début de la procédure afin de réduire le stress. •Chez la Ratte, si l’administration par voies naturelles est possible, elle se fera sous anesthésie gazeuse. •Dans les deux cas, si des signes de gêne ou de douleur apparaissent, une administration d’antispasmodique ou d'analgésique sera mise en place en curatif et/ou en préventif selon la fréquence d’observation de ces symptômes et la durée d’action de ces médicaments. •Chez la Lapine, la procédure sera réalisée sous anesthésie gazeuse de préférence, après administration d’un mélange d'un analgésique, d'un myorelaxant et sédatif, et d'un tranquillisant et sédatif. Une fois endormie, un antispasmodique sera administré afin de faciliter l’accès aux trompes en réduisant les spasmes tubaires. L’ensemble de cette médication devrait assurer le bon déroulement de la procédure et limiter les lésions éventuelles du tissu. Pour l’administration du produit par voie chirurgicale, ou chirurgie en vue de l’induction d’un modèle d’endométriose, une analgésie sera réalisée en pré-opératoire ainsi qu’en post-opératoire. Une nouvelle administration sera effectuée ultérieurement en cas de signe de souffrance les jours qui suivent. Mise en place d’une alimentation adaptée post chirurgie : •chez la Lapine, gel hydratant, quartiers de pommes, foin •chez le Rongeur, pellets placés dans la sciure plutôt qu’en hauteur, gels hydratants, friandises.
Choix des espèces
Notre espèce de choix est le Rat car c’est l’animal qui est classiquement utilisé dans les études de fertilité (réglementaires). De plus, des études de biodistribution et de toxicité à visée réglementaire seront effectuées sur cette espèce. Cela nous permettra de comparer certains résultats et d’être complémentaire à ces travaux destinés aux Autorités de Santé. Si la mise au point du modèle n’est techniquement pas possible chez le Rat, nous pourrons effectuer des études chez la Souris ou le Lapin, comme cela a aussi pu être fait dans la littérature. Ce sont également des espèces utilisées dans le domaine de l’étude de la reproduction. Les animaux seront des jeunes adultes, idéalement sexuellement matures. Pour les rats : 8-16 semaines. Pour les souris : 7-14 semaines. Pour les lapins : 3-8 mois. Pour la génération F1 : de la naissance jusqu’au sevrage.
Analyse de la contribution des macrophages lors du développement du réseau vasculaire lymphatique oculaire de la souris.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
136 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux nouveau-nés reçoivent une injection sous-palpébrale dans chaque œil, sous analgésie par le froid sur de la glace, avec un risque de rejet par la mère au retour au nid, avant d'être tués pour disséquer leurs yeux. L'objectif relève de la recherche fondamentale sur le rôle des macrophages dans le développement du réseau lymphatique de l'œil. Le porteur affirme qu'"aucune alternative in vitro ou in silico n'existe" et que l'approche in vivo est nécessaire.
Objectifs
Les vaisseaux lymphatiques sont complémentaires des vaisseaux sanguins. Ils jouent un rôle important dans l’évacuation des déchets ainsi que la surveillance immunitaire au sein des organes et tissus. Ils transportent les cellules immunitaires et participent à l’activation de la réponse immunitaire. Une place de plus en plus importante du réseau vasculaire lymphatique apparaît dans le cadre des atteintes et troubles oculaires. La formation de nouveaux vaisseaux lymphatiques (lymphangiogenèse) a ainsi été observée dans les pathologies inflammatoires de l’œil (syndrome de l’œil sec, allergies oculaires, etc..). L’implication de ces vaisseaux dans le drainage de l’humeur aqueuse de l’œil et la régulation de la pression intraoculaire, facteur de risque majeur associé au développement du glaucome, a été également proposée. Une contribution de macrophages (cellules immunitaires impliquées dans la défense de l’organisme contre les substances étrangères ou les agents pathogènes) dans la lymphangiogenèse associée à plusieurs situations pathologiques a été décrite chez l’homme. L’objectif de ce programme est d’analyser si les macrophages peuvent également contribuer de façon directe et/ou indirecte à la formation du réseau lymphatique au cours des étapes précoces du développement. La compréhension et caractérisation des mécanismes impliqués dans le développement et la formation des vaisseaux lymphatiques oculaires est nécessaire pour élaborer des stratégies thérapeutiques ciblant ces vaisseaux lymphatiques.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de définir si les macrophages exercent un rôle majeur au cours du développement du réseau lymphatique de l’oeil dans le modèle d’étude murin. Ils permettront d’appréhender en particulier si les macrophages peuvent constituer une source alternative de cellules endothéliales lymphatiques, cellules qui tapissent les vaisseaux lymphatiques. Comme indiqué précédemment, ces nouvelles connaissances permettront de mieux cibler la formation des vaisseaux lymphatiques lors de l’élaboration de stratégies thérapeutiques visant à interférer avec la formation de ces vaisseaux dans les pathologies oculaires.
Procédures
Injection sous-palpébrale (1 seule injection par œil de durée limitée : 5 à 10 secondes)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus concernent : -la douleur qui pourrait être ressentie lors de la piqure pour l’injection, malgrè l’analgésie par le froid qui sera pratiquée ; -le rejet potentiel par la mère après retour dans le nid ; -le stress lié à la manipulation des souriceaux ainsi qu’à la variation des températures se produisant lors de l’analgésie par le froid
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés dans la procédure décrite sera euthanasié afin de pouvoir procéder aux analyses des conséquences du traitement sur les macrophages et les vaisseaux lymphatiques oculaires après prélèvement et dissection des yeux.
Remplacement
Aucune alternative in vitro ou in silico n’existe à ce jour. Ces études fondamentales qui concernent le développement des vaisseaux lymphatiques nécessitent une approche in vivo. L’objectif du projet étant d’analyser ce développement après l’administration d’un traitement visant à supprimer les macrophages pour analyser leur contribution, ce traitement doit être au préalable réalisé et avoir produit ses effets avant d’euthanasier les animaux pour en analyser les conséquences.
Réduction
La molécule utilisée pour détruire sélectivement les macrophages, a une action effective seulement 24h post-administration voire quelques jours post-administration selon le tissu et le mode d’administration utilisé. C’est pourquoi l’euthanasie des animaux pour caractériser le réseau lymphatique nouvellement formé sera réalisée à Jour 2, Jour 3, Jour 5 et Jour 7 après l’injection, période au cours de laquelle se développe ce réseau vasculaire. Afin de tenir compte du principe de réduction du nombre d’animaux utilisés tout en évitant de compromettre l’obtention de résultats statistiquement significatifs, il sera utilisé un test statistique pour le traitement des données limitant le nombre de répétitions des expériences. Dans ce contexte, la prise en compte des résultats obtenus antérieurement permet de définir un nombre d’échantillons nécessaires à 8 yeux par groupe d’étude. Par ailleurs, l’œil des animaux étudiés se trouvant fermé aux âges considérés, les 2 yeux de chaque animal seront utilisés, lorsque justifié par l’expérience, dans le but de limiter le nombre d’animaux utilisés. De plus, le nombre d’animaux utilisés pourra être revu à la baisse à l’issue des résultats obtenus lors de la première série de traitement au cours de l’expérience de déplétion des macrophages, en privilégiant l’un des stades de développement proposés (jour 2, jour 3, jour 5 ou jour 7) pour la suite de l’étude.
Raffinement
La douleur potentielle de la piqure sera atténuée par l’analgésie par le froid en positionnant l’animal nouveau-né sur la glace avant la piqure. L’injection est réalisée à température ambiante sous loupe binoculaire permettant de visualiser avec précision le geste effectué. La finalisation du réchauffement du nouveau-né, débutée lors de la manipulation, est obtenue en plaçant celui-ci 2 à 3 minutes sur un tapis chauffant à 37°C avant son retour le plus rapidement possible dans le nid auprès de la mère. Il sera veillé à enduire le corps du nouveau-né avec une goutte d’urine de la mère pour éviter tout risque de rejet
Choix des espèces
Les souris utilisées dans ce projet sont des souris C57BL6/J sauvages. Ce modèle murin est bien caractérisé pour la distribution et le développement du réseau vasculaire lymphatique de la surface de l’oeil. Plusieurs études ont également montré de nombreuses similitudes du modèle souris avec le modèle humain pour la caractérisation des atteintes et troubles oculaires, notamment concernant la formation des vaisseaux ainsi que pour les voies et mécanismes de régulation de la pression intraoculaire. Les animaux utilisés seront des nouveau-nés : Injection à Jour 0 (jour de la naissance) ; Euthanasie à Jour 1 ou Jour 2, Jour 3, Jour 5 et Jour 7 après la naissance, selon l’expérience considérée. Les données de la littérature ainsi que nos observations montrent que les étapes précoces du développement du réseau vasculaire lymphatique de surface de l’œil de la souris C57BL6/J se déroulent au cours des premiers jours après la naissance (entre Jour 0 et Jour 7 après la naissance).
Etude de pharmacocinétique : prélèvements répétés de sang chez le rat lors d’une infusion intraveineuse d’un candidat médicament
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
480 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'implantation de cathéter vasculaire, des infusions intraveineuses et jusqu'à huit prélèvements sanguins sur 24 heures, parfois par ponction cardiaque terminale sous anesthésie, pour établir le profil pharmacocinétique de candidats médicaments. Le porteur agit comme prestataire de services et réalise ces études pour des clients de l'industrie pharmaceutique. Sur le remplacement, il affirme que les méthodes in vitro et la modélisation restent limitées et que l'évaluation in vivo demeure "incontournable".
Objectifs
Au cours du développement préclinique, un grand nombre d’études sont effectuées afin d’évaluer l’efficacité et l’innocuité des candidats médicaments. Les études pharmacocinétiques, qui sont menées en parallèle, permettent d’étudier le devenir du composé dans un organisme vivant. Classiquement, il s’agit de caractériser son absorption, sa distribution dans l’organisme, son métabolisme (c’est-à-dire comment l’organisme procède à sa transformation) et enfin son élimination. Les données collectées dans le cadre de ces études permettent notamment d’affiner les doses et par conséquent de contribuer à la détermination de fenêtres/marges thérapeutiques, qui matérialisent la zone de concentrations permettant d’observer une efficacité tout en limitant la survenue d’effets secondaires/toxiques. En tant que prestataire de services pour l’industrie pharmaceutique, nous proposons à nos clients de réaliser la phase expérimentale de leurs études pharmacocinétiques. Ce projet a donc pour objectif de fournir à nos clients des échantillons de sang prélevés chez le rongeur (rat ou souris) et dont l’analyse permettra de connaître les variations de concentration plasmatique des candidats médicaments au cours du temps après une administration sous forme d’infusion intraveineuse, voie d’administration rencontrée lors de protocoles expérimentaux aigues réalisés au cours de procédures chirurgicales. Ainsi, ces études pharmacocinétiques permettront de mieux définir les doses à utiliser dans d’autres projets.
Bénéfices attendus
Les échantillons de sang collectés seront traités et les plasmas ou sérums obtenus seront analysés par nos clients afin d’établir le profil pharmacocinétique de leur candidat médicament et de déterminer les doses qui permettront d’obtenir un effet optimal avec des effets secondaires maitrisés.
Procédures
Les animaux seront soumis à des administrations par voie intra-péritonéale et sous-cutanée. Des prélèvements répétés de sang seront réalisés soit sur animal vigile via la veine de la queue, soit sur animal anesthésié par ponction directe de la veine jugulaire. Certains prélèvements pourront être réalisés en terminal par ponction intracardiaque sur animal anesthésié. Ces prélèvements seront réalisés le plus souvent pendant les 24h avec un maximum de 8 prélèvements sur cette période, mais ils pourront également être étalés sur 72h. Les animaux subiront des chirurgies d’implantation de cathéters vasculaires suivies d’une infusion des composés à tester. La durée de la chirurgie est d’environ 10-15 minutes. Les durées d’infusions n’excèderont pas 2 heures (1 heure si réveil de l’animal).
Impact sur les animaux
L’administration des anesthésiques et analgésiques nécessitera que les animaux soient maintenus en contention et les injections impliqueront l’introduction d’une aiguille. Afin d’effectuer l’infusion intraveineuse des composés, un cathéter sera implanté dans une veine au cours d’une chirurgie réalisée sous anesthésie générale. Des prélèvements de sang seront réalisés, impliquant parfois des ponctions directes dans les vaisseaux à l’aide d’une aiguille ou d’une lancette. Ces prélèvements pourront nécessiter également d’anesthésier les animaux et ce de façon répétée. Dans le cadre de prélèvements multiples, jusqu’à 8 prélèvements pourront être réalisés sur 24h. Lorsque des volumes importants de sang seront nécessaires, le prélèvement pourra être réalisé en intracardiaque de façon terminale sous anesthésie générale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure 1.
Remplacement
Si des méthodes d’extrapolation in vivo des effets observés in vitro sont de plus en plus utilisées, comme la modélisation pharmacocinétique à fondement physiologique, ces approches présentent malgré tout encore certaines limites, notamment la difficulté à paramétrer certains processus mis en jeu en particulier pour les phases d’absorption et d’excrétion. Ces approches ne constituent qu’une aide à la caractérisation des interactions pharmacocinétiques, et l’évaluation in vivo du devenir d’un composé dans un organisme vivant reste incontournable
Réduction
Toutes les mesures seront prises pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet tout en prenant en compte les besoins de nos clients (volumes de sang, nombre de points de prélèvements, de voies d’administrations et de doses à tester nécessaires). Chaque animal pourra être son propre contrôle, et le recours à des prélèvements répétés au cours du temps sur le même animal permet également de limiter le N total par étude. Aucune analyse statistique sera réalisée dans ce projet.
Raffinement
L’ensemble des expérimentations seront effectuées par un personnel compétent, formé et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement grâce à une grille de score. Des points limites précis et spécifiques sont également préalablement établis afin de s’assurer que toute douleur/souffrance éventuelle des animaux pourra être détectée et prise en charge rapidement. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie appropriée. Les prélèvements sanguins ainsi que les volumes d’administration seront réalisés selon les recommandations éthiques. Après chaque prélèvement, une injection de sérum physiologique sera réalisée (volume équivalent injecté directement dans la voie veineuse ou 3 fois le volume prélevé injecté en sous cutané) afin de compenser la perte de volémie. La chirurgie nécessaire pour l’implantation du cathéter sera réalisée en conditions aseptiques, et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue (minimum 2 fois par jour) en phase post-opératoire.
Choix des espèces
Le développement préclinique de nouveaux composés fait usage de nombreux modèles animaux de pathologies. Les études pharmacocinétiques permettent d’étudier le devenir du composé dans un organisme vivant (absorption, distribution métabolisme et élimination). Ainsi, en vue de réalisation d’études précliniques d’efficacité chez les rongeurs, les connaissances des données pharmacocinétiques pour un nouveau composé représentent des informations clé au regard de sa biodisponibilité selon la dose administrée, la voie d’administration utilisées, l’impact de l‘anesthésie, l’espèce d’intérêt, …. Les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont des rats de tous âges, mâles ou femelles, soit environ 150 à 600g L’âge, la souche et le sexe des animaux dépendra du protocole à réaliser, des objectifs de l’étude et des candidats médicaments à tester.