Rongeurs

465 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des instillations intranasales d'un produit bactérien sous anesthésie, un transfert de cellules lymphoïdes et des injections d'une neurotoxine pour dénerver le poumon, avant prélèvement pulmonaire, pour étudier la formation de structures lymphoïdes tertiaires. Le porteur indique que les instillations peuvent provoquer une gêne respiratoire et fixe la mise à mort à une perte de poids de 20 pour cent. Il affirme qu'aucune approche in vitro ne permet de provoquer ces structures.

Objectifs

Le projet vise à élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la formation des structures lymphoïdes tertiaires en conditions inflammatoires. La présence de ces structures a en effet été corrélée à un bon pronostic dans de nombreux types de tumeurs solides, et notamment dans les cancers du poumon non à petites cellules. Nous souhaitons étudier le rôle de cellules lymphoïdes innées dans la néogenèse de ces structures. L'étude des voies de signalisation à l'origine de l'induction de ces structures dans les poumons pourrait permettre à l'avenir leur manipulation à des fins thérapeutiques, avec l'identification de molécules candidates jouant un rôle dans leur néogenèse. L'expérimentation sera réalisée en utilisant un modèle inflammatoire visant à induire ces structures pulmonaires. Les objectifs principaux de ce projet sont : 1 – d'étudier la population de cellules lymphoïdes innées au cours de l'inflammation induite par un produit bactérien, par l'analyse cinétique des différents compartiments cellulaires des poumons de ces souris ; 2 - d'étudier la néogenèse des structures lymphoïdes tertiaires et la présence des cellules lymphoïdes innées pulmonaires au cours de l'inflammation, en présence ou absence de fibres nerveuses ; 3 - de transférer des cellules lymphoïdes innées pulmonaires chez des souris naïves ou ayant reçu un traitement avec une faible dose du produit bactérien, afin d'étudier la capacité des cellules transférées à induire ces structures en conditions non ou faiblement inflammatoires.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d'élucider les mécanismes sous-jacents à la formation des structures lymphoïdes tertiaires, et plus particulièrement d'évaluer le rôle des cellules ILC3 dans ces processus. Pour cela, l'utilisation de souris rapportrices RORgt-EGFP dans lesquelles nos cellules d'intérêt expriment l'EGFP, représente un outil pour étudier cette population mais aussi pour les purifier en vue de réaliser des tests fonctionnels. Ce projet vise donc à mieux comprendre le processus de formation des TLS, et étudier la cible thérapeutique que pourraient représenter des ILC3 pulmonaires dans différentes maladies. Induire des TLS chez les patients cancéreux ouvrirait la voie à de nouvelles possibilités thérapeutiques tous stades de la tumeur confondus, et pourrait ainsi contribuer à allonger la survie de ces patients, même lorsqu'ils sont inopérables.

Procédures

- Instillations intranasales : 5 instillations par voie intranasale (lent dépôt de 14 µL/narine de chaque souris maintenue verticalement ; durée totale environ 2-3 minutes/souris en fonction du rythme respiratoire) de NaCl 0,9% ou de LPS à des animaux préalablement anesthésiés. - Transfert adoptif d'ILC3 pulmonaires par voie intraveineuse : injection dans la veine de la queue de 100 µL de suspension cellulaire (1000 cellules en PBS 1X stérile) sur souris vigile, sous lampe chauffante et placée brièvement dans un dispositif de contention lors de l'injection (durée totale environ 1 minute, chauffage préalable environ 5-10 min). Cette intervention n'est réalisée qu'une fois par animal. - Injections de 6-OHDA par voie intrapéritonéale : Sur animal vigile, injection de 200 µL de NaCl 0,9% ou de 6-OHDA resuspendue en NaCl (100mg/kg puis une deuxième injection à 250 mg/kg 48h plus tard). Durée totale < 30 secondes. - Prélèvements : Tous les prélèvements (poumons, plasma) sont réalisés sur animaux euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les animaux ne subiront aucune manipulation plus douloureuse qu'une injection ponctuelle par voie intra-péritonéale ou intraveineuse (cellules), ou une instillation intranasale (LPS) sous anesthésie générale. Les injections pourront provoquer l'apparition d'un stress chez les animaux, mais toutes sont rapides (pas plus de quelques secondes) et les animaux sont maintenus immobiles le temps de l'injection (voie i.p. ou i.v.) afin de limiter au maximum l'éventuelle douleur provoquée. Dans le cas des instillations intranasales, une gêne respiratoire pourra dans certains cas être observée au moment des instillations dans la narine.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les poumons des animaux seront prélevés dans le but d'analyser les TLS pulmonaires ainsi que les ILC3. Les animaux devront donc être euthanasiés suite à l'inflammation induite par le LPS afin de prélever leurs poumons pour procéder aux analyses ex vivo décrites dans les procédures (suivi de la densité de TLS et de la population d'ILC3, purification d'ILC3 fonctionnelles pour leur utilisation in vitro et in vivo). Du sang sera également prélevé post mortem sur les animaux afin de procéder à des dosages plasmatiques de catécholamines, afin de s'assurer notamment de la dénervation du système nerveux sympathique.

Remplacement

Il n'existe pas actuellement d'approches alternatives in vitro pour provoquer la formation des structures lymphoïdes tertiaires dans les situations inflammatoires et permettant d’évaluer le rôle des différentes sous-populations cellulaires pulmonaires dans l’induction de ces structures.

Réduction

Nous utiliserons au maximum un total de 465 souris sur trois années dans les approches expérimentales envisagées. Ce nombre a été calculé au plus juste, afin de permettre des analyses statistiques fiables pour chaque expérience. Ces expériences ne répèteront pas d’expériences publiées antérieurement.

Raffinement

Transport depuis le lieu du fournisseur agréé et période d’acclimatation d’au moins une semaine, conditions d’hébergement des souris soigneusement contrôlées : les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés en groupe (5 par cage au maximum). Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté). Locaux d’expérimentation agréés. Les instillations intranasales pouvant engendrer une gêne et un stress intenses seront réalisées sur les animaux sous anesthésie générale (par injection par voie i.p. d'un mélange xylazine-kétamine) afin de limiter ces perturbations. Les animaux seront maintenus immobiles pour les injections afin de limiter la douleur et le stress pouvant éventuellement être provoqués par leur mouvement. Expériences arrêtées dès les premiers symptômes comportementaux et physiologiques d’une santé altérée apparaissant chez les souris : l'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent responsables du bien-être des animaux. Les points limites tout au long des procédures sont déterminés comme suit. 1. Tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire 2. Modification du comportement caractéristique d'une douleur intense, d'une détresse ou d'une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et/ou terne, prostration, dos voûté, difficultés respiratoires) 3. Anomalies pouvant entrainer une douleur intense, une détresse ou une souffrance : perte de poids supérieure ou égale à 20% du poids initial de l'animal (pesées entre 1 et 3 fois par semaines selon les procédures : J0-J4-J6-J10-J15 et J20 pour la procédure 1 ; J0-J2-J4-puis 1x/semaine jusqu'à J30-J32-J34-J37 et J40 pour la procédure 2 ; J0-J4-J7-J10 et J14 pour la procédure 3), plaies et ulcères, tumeurs, fractures... Les éventuels risques anesthésiques seront également pris en compte, avec une surveillance de la détresse respiratoire des animaux lors des instillations intranasales (avec arrêt et/ou modulation du rythme des instillations si observation de difficultés respiratoires), et surveillance des animaux après les instillations et avant leur réveil.

Choix des espèces

La souris est l’animal permettant d’explorer le plus facilement la formation des TLS ainsi que les interactions entre cellules du système immunitaire et fibres nerveuses grâce à l’accessibilité d’un grand nombre de réactifs (ex. anticorps, cellules de lignée cellulaire tumorale transfectées avec l’ADNc codant la luciférase). Par ailleurs, les cellules immunitaires ont été exhaustivement caractérisées chez la souris : les marqueurs des cellules d’intérêt de cette étude sont connus et de nombreux anticorps spécifiques sont disponibles. Enfin, différents protocoles développés chez la souris sont décrits de façon détaillée dans la littérature et sont donc applicables sans nécessité de mises au point longues et consommatrices d’animaux. Les animaux seront reçus à l'âge de 12 semaines, puis mis en stabulation pendant une semaine minimum avant de débuter l'expérimentation (8 semaines pour la procédure 2). Cet âge a été choisi car à ce stade de développement, les souris sont sevrées, ont atteint une taille adulte et disposent d'un système immunitaire et nerveux mature. Les expériences durent entre 10 à 40 jours soit un âge maximum de 17,5 semaines (ou avant si les souris présentent des signes de souffrance, une perte de poids>20% de leur poids initial ou détresse respiratoire) à la fin de l'expérience.

3000 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tués à l'issue, environ 200 réutilisés et 20 placés en adoption. Les animaux, souvent porteurs de tumeurs greffées et issus d'un projet précédent, servent à entraîner le personnel aux gestes techniques, jusqu'à quinze journées et deux gestes par jour, dont les administrations, les prélèvements, la chirurgie et l'euthanasie. Le porteur indique que la mise à mort peut être elle-même le geste appris. Il justifie l'usage d'animaux vivants par l'échec d'un rat synthétique jugé insuffisamment réaliste.

Objectifs

Ce projet, dédié à la formation et au maintien des compétences du personnel interne, répond aux exigences réglementaires (arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques) et éthiques. Il permet de répondre aux besoins d’acquisition de compétences sous tutorat ou de perfectionnement de gestes techniques nécessaires à l’activité de recherche spécifique. Les gestes qui pourront être travaillés sur souris ou rats sont les suivants : 1)Identification des animaux 2)Techniques d’administrations 3)Procédures non invasives réalisées sous anesthésie gazeuse (ex. imagerie) 4)Prélèvements sanguins 5)Techniques de chirurgie sous analgésie et anesthésie 6)Techniques d’euthanasie 7)Autopsies : apprentissage de l’anatomie avec reconnaissance et prélèvements d’organes en post-mortem. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont essentiellement issus d’un premier projet autorisé. Du fait du design des études en oncologie nécessitant de greffer des animaux qui ne sont ensuite pas tous inclus dans les études de pharmacologie, une grande proportion d’animaux formation sera porteur de tumeur greffée en sous cutanée dont le volume sera de petite taille et contrôlé (de type « petit nodule »). Cette réutilisation des animaux permet de valoriser les animaux non inclus dans les études et contribue à la règle des 3R par la réduction du nombre d’animaux. A défaut de disponibilités compatibles avec les besoins en formation, les animaux nécessaires seront commandés spécifiquement auprès des fournisseurs.

Bénéfices attendus

L’entrainement et la compétence du personnel, au-delà de l’aspect réglementaire, contribuent à la bonne réalisation des études, à la fiabilité des résultats, ainsi qu’au respect du bien-être animal par la réalisation de gestes maitrisés. A l’inverse, un geste technique mal réalisé au cours d’une étude peut avoir pour conséquence : - Un stress de l’animal - Une souffrance de l’animal allant jusqu’à la mort en cas de fausse route lors d’un gavage par exemple. - Une plus forte variabilité des résultats de l’étude ou des résultats ininterprétables amenant à devoir reproduire l’étude en utilisant plus d’animaux.

Procédures

Pour les gestes techniques, une limite de 15 journées d’utilisation (consécutives ou non) est fixée par animal à raison d’un nombre maximal de 2 gestes par jour. En fonction du type de technique à acquérir et de l’objectif de formation visés, différentes combinaisons de techniques d’administration et/ou de prélèvements peuvent être réalisées sur un même animal. Les gestes qui pourront être réalisés sont : - identification, administrations et prélèvements sur animaux vigiles (quelques secondes) ou anesthésiés (

Impact sur les animaux

Un maximum de 15 journées d’utilisation seront possibles avec un nombre maximal de 2 gestes techniques simples réalisés par jour. Un seul geste chirurgical sera possible. Aucun animal présentant des signes de douleur ou de souffrance suite à un geste technique ou une chirurgie ne sera gardé en vie.

Devenir

La plupart des animaux seront porteurs de tumeurs, ils devront donc être euthanasiés à la suite de la formation. La mise à mort peut être elle-même la technique pour laquelle la personne sera formée. Dans de rares cas, des animaux qui ne proviennent pas d’une utilisation précédente et en bonne santé pourront être ré-utilisés pour de la mise au point de modèle chirurgical dans le cadre d'un autre projet. L’utilisation de ces animaux se fera uniquement dans le cadre d'un projet autorisé et de gravité de sévérité prospective modéré. Enfin, des cas ponctuels d’adoptions pourraient être organisés sur des animaux immunocompétents, ne présentant pas de phénotype dommageable, en bonne santé, n’ayant jamais été porteurs de tumeurs et dans un contexte où il n’y a pas de besoin de formations à l’euthanasie. L’avis vétérinaire et l’autorisation des autorités compétentes seraient un préalable à ces adoptions.

Remplacement

Par le passé, des sessions d’entrainement sur la contention et l’administration de composés ont été effectuées sur des rats synthétiques (rat Koken) mais n’ont malheureusement pas été concluantes suite au manque de tonicité et de mouvement de l’animal et à la mauvaise reproduction de l’enveloppe corporelle et du système veineux. De plus, certains gestes techniques, comme les prélèvements sanguins à la veine saphène, par exemple, ne pouvaient pas être effectués sur ce moyen de substitution. Il n’y a donc pas d’autres choix, actuellement, que d’exercer ces entrainements sur des rongeurs anesthésiés ou vigiles avant de les mettre en pratique dans des expériences d’un projet de recherche.

Réduction

Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont essentiellement issus d’un premier projet autorisé. Cette réutilisation des animaux permet de valoriser les animaux non inclus dans les études et contribue à la règle des 3R par la réduction in fine du nombre d’animaux. A défaut de disponibilités compatibles avec les besoins en formation les animaux nécessaires seront commandés spécifiquement auprès des fournisseurs. Un même animal pourra faire l’objet de plusieurs gestes techniques à raison d’un maximum de 2 gestes par jour. En effet, nous pourrons associer un geste dédié à l’administration avec un geste dédié aux prélèvements sanguins. Par exemple, on pourra cumuler des administrations Intra-veineuses avec des prélèvements de sang à la veine jugulaire sous anesthésie gazeuse. Ainsi, en combinant ces 2 types d’entrainement sur un maximum de 15 journées sur 6 mois (30 gestes maximum) on valorisera au maximum les animaux.

Raffinement

Une attention particulière sera portée sur les volumes des prélèvements sanguins et volumes d’administration, qui seront basés sur des guidelines reconnues. Si un animal présente un signe clinique altérant son bien-être ou nécessitant un soin il sera euthanasié. Pour les animaux porteurs de tumeur, le point limite lié au volume tumoral est inferieur aux normes habituelles afin de s’assurer que l’impact lié à la précédente utilisation de l’animal reste léger. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux tout au long des entrainements, dans des cages enrichies leur permettant de fouiller. Des éléments de nidification sont apportés ainsi que des éléments d’enrichissement en polypropylène permettant une complexification de l’environnement. L’observation de l’utilisation de l’enrichissement sera un paramètre complémentaire permettant de s’assurer du bien-être des animaux.

Choix des espèces

Les projets de l’équipe in vivo se faisant avec des modèles souris ou rat, il convient de s’entrainer sur ces espèces en adéquation avec les activités. Des animaux sevrés seront utilisés majoritairement (jeunes adultes et adultes). Cependant, pour des besoins spécifiques de formation, des animaux non-sevrés pourront être également utilisés.

45 rats nude vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une greffe de cellules tumorales cérébrales humaines lors d'une chirurgie d'une heure, puis des injections intraveineuses de nanoparticules et des séances d'imagerie par scanner et IRM, pour optimiser la dose visualisant un glioblastome. Le porteur estime la douleur légère au motif que le cerveau n'est pas innervé, la gêne provenant de l'incision du crâne. Il affirme que la distribution des nanoparticules in vivo est "indispensable" et qu'aucune méthode alternative n'est possible.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales appelée glioblastomes sont les cancers du cerveau les plus fréquents et sont généralement agressifs. En clinique, actuellement le protocole de traitement de ces tumeurs cérébrales commence par une ablation chirurgicale, suivie de séances de radiothérapie et de chimiothérapie. En effet, dans la plupart des cas, l’ablation chirurgicale ne permet que de retirer partiellement la masse tumorale. Les cellules cancéreuses restantes après chirurgie sont ensuite traitées par radiothérapie et chimiothérapie. Ce projet se place dans le contexte clinique de traitement des tumeurs cérébrales, et plus particulièrement sur l’amélioration de l’efficacité du traitement par radiothérapie guidée par l'image grâce à l’utilisation de nanoparticules. Une nanoparticule radiosensibilisante (en cours de développement clinique) a été développée pour permettre une imagerie bimodale par résonance magnétique (IRM) et tomodensitométrie (TDM). L’objectif principal de ce projet consiste à optimiser la dose de nanoparticule à injecter chez le rat pour visualiser la tumeur en IRM et en TDM. Nous avons préalablement évalué in vitro (sur cellules tumorales humaines) l’intérêt s de ces nanoparticules pour les 2 modalités d’imagerie, la toxicité des nanoparticules ainsi que l’efficacité thérapeutique en association avec la radiothérapie et avons ainsi pu démontrer leur pouvoir « radiosensibilisant » et leur intérêt pour de l’imagerie bimodalité. Nous souhaitons confirmer ces résultats très prometteurs sur un modèle de tumeur cérébrales chez le rat et optimiser les conditions d’imagerie.

Bénéfices attendus

Les nanoparticules que nous avons développées présentent de multiples intérêts. (1) elles permettront de décupler les effets toxiques du traitement de radiothérapie au sein de la tumeur (2) elles permettront un meilleur suivi par imagerie de la progression/régression tumorale au cours du traitement des patients L’objectif du projet étant ainsi d'optimiser les modalités de traitement des tumeurs cérébrales.

Procédures

Chirurgie 1h sous anesthésie gazeuse. 1 fois Imagerie par bioluminescence : injection intra-péritonéale sur animal vigil (quelques secondes) puis15 min d'imagerie sous anesthésie gazeuse. 1 fois Injection de nanoparticule par voie intraveineuse dans la veine de la queue ( quelques secondes) : 2 fois à 3 jours d'intervalle. Imagerie par tomodensitométrie sous anesthésie gazeuse : 30 min; 2 fois Imagerie IRM sous anesthésie gazeuse : 20 min; 2fois

Impact sur les animaux

Chirurgie opératoire classée modérée car la procédure est parfaitement maitrisée au sein de notre laboratoire . Malgré une opération invasive due à l’incision de la peau du crâne et à l’injection de cellules intracérébrale, la douleur engendrée par l’acte chirurgical est estimée modérée, car dès le lendemain le rat se laisse manipuler aisément, ne montre aucun signe de peur (cris, prostration, agressivité) lors du nettoyage de la plaie. Le cerveau n’étant pas innervé, la douleur principale engendrée par l’opération provient de l’incision de la peau du crâne que nous estimons légère. Utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux. Imageries non invasives réalisées sous anesthésie volatile.

Devenir

Animaux mis a mort à la fin de la procédure ou si un point limite est atteint. Les animaux seront mis à mort et le cerveau ainsi que les organes seront prélevés pour analyse macroscopique et histologique.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes. De plus la distribution des nanoparticules in vivo est indispensable pour évaluer leur intérêt en imagerie. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous pourrons suivre dans le temps sur chaque animal la croissance tumorale ainsi que la prise de contraste par les nanoparticules. Nous obtiendrons ces données sans avoir besoin de mettre à mort les animaux à différents temps. Cette procédure offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux car la prise d’image peut être réitérée au cours du temps

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) . L'atteinte d'un point limite décrit dans le descriptif de la procédure conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux depuis le site d’hébergement et de chirurgie vers les sites d’imagerie, notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées : l’anesthésie gazeuse étant rapidement réversible. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger. Une prise en charge analgésique sera réalisée en pré-opératoire et post-opératoire par injection sous-cutanée de Meloxicam avec possibilité de réitération les 2 jours suivants la chirurgie.

Choix des espèces

Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. En outre, le choix de cette espèce se justifie par les limitations de résolution offertes par l’imagerie. Les rats nude (dépourvus d’une partie du sytème immunitaire) sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines car il n'y a ainsi pas de rejet du greffon tumoral implanté. Nous privilégions des rats mâles, sexe utilisé jusqu’à présent dans nos études antérieurs afin de pouvoir confronter nos résultats. Des rats âgés de 8 semaines sont utilisés, à un stade où leur conformation crâniale correspond à celle de l’atlas sur lequel nous nous basons pour injecter les cellules tumorales dans un endroit précis du cerveau.

220 rats femelles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, seize gardés en vie pour des formations internes et le reste tué pour des prélèvements terminaux de peau, muscle et os. Les animaux sont épilés puis exposés à des rayonnements ionisants sur la patte arrière sous anesthésie, ce qui provoque une radiodermite douloureuse et une possible perte de poids. Le porteur décrit un modèle destiné à tester des vasoconstricteurs contre les brûlures des radiothérapies. Il affirme qu'un modèle in vivo est "nécessaire" pour évaluer la réponse à l'échelle de l'organisme.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de mettre en place un modèle d’irradiation localisée de la patte chez le rat afin de mimer les brulures pouvant survenir des radiothérapies ou des actes de radiologie interventionnelle. Une fois le modèle mis en place, les objectifs seront de tester différents produits et d’évaluer leurs efficacités sur la prévention et/ou la limitation du développement des lésions.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à démontrer l’efficacité de vasoconstricteurs (substance permettant de rétrécir le diamètre des vaisseaux sanguins) en application cutanée préventive pour prévenir et/ou limiter l’apparition de lésions cutanées suite à une exposition aux rayonnements ionisants (radiothérapie et radiologie interventionnelle).

Procédures

Les animaux seront épilés (crème dépilatoire) et exposés aux rayonnements ionisants sous anesthésie gazeuse. Des pesées et un scoring des lésions seront réalisés sur animaux vigiles. Une fois par semaine le flux sanguin au niveau des pattes sera mesuré au laser doppler sous anesthésie gazeuse. Des prélèvements terminaux (prélèvement de sang, de la peau, des muscles et des os) seront réalisés sur tous les animaux.

Impact sur les animaux

L’objectif de ce projet étant de développer un nouveau modèle de radio dermite radio-induite chez le rat, les animaux exposés aux rayonnements ionisants vont développer des dermatites radiques localisées au niveau de la patte arrière gauche plus au moins sévères en fonction de la dose d’exposition. Cette dermatite radique va conduire à une douleur locale au niveau de la patte. Une perte de poids n’est pas à exclure lorsque le pic de la lésion sera atteint ainsi qu’une utilisation réduite de cette patte. La durée et la sévérité de ces effets va dépendre de la dose d’exposition.

Devenir

Les animaux devront être euthanasiés à la fin de l’expérience afin de réaliser les différents prélèvements prévus. Une partie des rats sera gardée en vie et pourront être utilisés dans des sessions de formation interne.

Remplacement

Dans le but de caractériser un nouveau modèle de radiodermite chez le rat et d’évaluer l’efficacité thérapeutique de vasoconstricteurs pour le traitement ou la prévention des radiodermites radio-induites il est nécessaire d’avoir recours à un modèle « in vivo ». Ce modèle nous permettra d’évaluer l’impact de l’irradiation à différentes énergies et la réponse thérapeutique à différents vasoconstricteurs sur le développement d’une pathologie à l’échelle de l’organisme.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation de 220 rats sur 5 ans. Le nombre d’animaux utilisé correspond au minimum nécessaire pour obtenir un résultat scientifique robuste et statistique.

Raffinement

Les conditions de soins et d’hébergement des animaux seront adaptées aux procédures réalisées afin de limiter le plus possible le stress et la souffrance de l’animal. Les rats seront hébergés en groupe et dans un environnement enrichi. Lors des irradiations, des anesthésiques seront utilisés et une surveillance des animaux sera mise en place après les irradiations. Le bienêtre animal sera également évalué en réalisant des pesées, des photos des lésions et un scoring lésionnel ainsi que la mise en place de points limites adaptés.

Choix des espèces

Pour les besoins de ce projet nous avons choisi d’utiliser l’espèce animale rat car des équipes ont déjà travaillé sur la même thématique avec ce modèle. Nous pourrons ainsi comparer l’efficacité du traitement appliqué à ces études. Nous utiliserons des animaux adultes (10 – 12 semaines) afin d’éviter une potentielle hétérogénéité liée à l’âge. Pour ce projet nous utiliserons uniquement des rats femelles. L’objectif n’étant pas d’étudier le dimorphisme sexuel, les femelles, moins agressives, ont été choisies, ce qui permettra de garder les animaux en groupes sociaux stables.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit trois injections intramusculaires dans les pattes arrière sur animal vigile maintenu par contention, puis deux prélèvements sanguins au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, pour comparer des candidats vaccins anticytokines en développement. Le porteur indique que les prélèvements oculaires peuvent provoquer douleurs, blépharospasme et écoulements. Il conclut que l'absence de méthode in vitro rend le recours à la souris "incontournable", préférant une lignée transgénique produisant des protéines humaines.

Objectifs

Les cytokines sont des protéines naturelles qui assurent la communication intercellulaire et orchestrent les réponses immunitaires, inflammatoires ou allergiques. Leur surexpression ou dérégulation conduit à l’apparition ou au développement de pathologies auto-immunes, inflammatoires ou cancéreuses. Ces pathologies sont aujourd’hui de véritables enjeux de santé publique. C’est pourquoi, une nouvelle stratégie d’immunothérapie active a été développée, reposant sur la production d’anticorps anti-cytokine, par le système immunitaire du patient, après administration d’un candidat vaccin. Ce dernier est composé d’une protéine porteuse couplée à une cytokine. Un test d’activité chez la souris permet de sélectionner les meilleurs candidats vaccin lors de la phase de développement. Il n’existe à ce jour pas de méthodes in vitro permettant d’évaluer la réponse immunologique à ce vaccin. Cette limitation rend incontournable le recours à l’expérimentation animale, pour tester l’efficacité de nouveaux candidats vaccins. Cette étude sert à valider la conformité des lots de vaccins produits pour les études précliniques, ainsi qu’à valider les évolutions du procédé inhérentes au développement jusqu’aux études cliniques. A terme ce test chez la souris sera standardisé pour être utilisé comme test de contrôle qualité pour la libération des lots de vaccins.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider que les modifications apportées au cours du développement du procédé de fabrication du vaccin n’affectent pas l’activité in vivo de ce dernier qui à terme sera administré chez l’homme au cours d’un programme d’évaluation clinique.

Procédures

Chaque animal recevra trois injections de vaccin par voie intramusculaire aux sites d’injections des pattes arrière (100 µl au total, 50 µl par patte). Les injections sont réalisées sur animaux vigiles maintenus par contention pendant 30 secondes. Ensuite, chaque animal sera prélevé 2 fois au sinus retro orbitaire sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane (anesthésie sur une durée de 5min). Le prélèvement de sang est réalisé en moins de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables généralement observés sont principalement dus à l’injection ou au prélèvement au sinus retro orbitaire. Les effets secondaires liées au candidat vaccin ne sont pas attendus. Le principe du vaccin étant de provoquer une réponse immune, des effets indésirables de type inflammatoire peuvent se produire principalement au site d’injection et se manifester par des œdèmes et érythèmes pouvant durer quelques heures à quelques jours. L’injection se faisant par voie intramusculaire dans le muscle de la patte arrière une douleur musculaire localisée pourra entre autres être détectée si l'animal a tendance à se mordre au niveau de la zone douloureuse. Les prélèvements sanguins se faisant au niveau du sinus rétro-orbitaire, des effets indésirables sur l’œil peuvent se produire. La survenue de contractions répétées et involontaires des muscles des paupières (blépharospasme), la sécrétion lacrymale éventuellement accompagnée de photophobie, les écoulements, la survenue d'œil rouge ou opaque seront examinés, puisqu'ils traduisent des douleurs oculaires et l'état des yeux.

Devenir

Le système immunitaire des souris utilisées ayant été stimulé par les candidats vaccin, ce dernier conservera une « mémoire » des vaccinations précédentes. Nous ne serons donc plus dans la possibilité d’obtenir chez ces souris, une réponse immunitaire comparable à des animaux nouvellement-vaccinés. De surcroit les souris ont une durée de vie assez courte et l’utilisation d’animaux âgés n’est pas recommandé pour l’obtention d’une bonne réponse immunitaire. Après le deuxième prélèvement, soit à jour 56 après la première injection, les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale.

Remplacement

La stimulation du système immunitaire par vaccination ne peut s’effectuer que sur animaux vivants. Il n’existe pas à ce jour de méthode in vitro permettant de remplacer le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Ce protocole suit la condition pour lequel un nombre de 10 animaux par groupe procure une puissance statistique suffisante (tests statistiques classiques, i.e. Wilcoxon). Les groupes de souris sont divisés en sous-groupes de 10 selon leur sexe.

Raffinement

Les animaux disposent d'une période d'acclimatation conséquente (minimum 7 jours) avant l'initiation de tout protocole, afin de limiter l'angoisse subie. Ils subissent ensuite des contraintes très modérées. Les injections réalisées en intramusculaires et les prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, ont lieu de façon ponctuelle et n’induisent pas de modification de leur bien-être. Enfin, des points-limites généraux avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis. De plus, des antalgiques sont prévus si l’animal présenté un signe de souffrance (Buprénorphine à 0,05 mg/kg par voie sous-cutanée). Si un animal présente l'un des points limite à un seuil critique, il est mis à mort afin d'abréger sa souffrance. Une attention particulière sera portée aux conditions d’hébergement des animaux. Le bruit dans les zones d’hébergement ainsi que dans la zone d’expérimentation sera réduit au maximum. Les souris seront hébergées par groupe de 5 souris maximum par cage. Ce milieu sera enrichi (igloo + copeaux) et la nourriture et l’eau seront fournis ad libitum afin de s’assurer du bien-être de l’animal.

Choix des espèces

Il n’existe à ce jour pas de méthodes in vitro permettant d’évaluer la réponse immune à un vaccin. Cette limitation rend incontournable le recours à l’expérimentation animale, préférentiellement la souris, pour tester l’efficacité de nouveaux candidats vaccins. La réponse immunitaire chez la souris est assez proche de celle de l’Homme. Dans le cas des tests de nos vaccins candidats pour l’Homme, il est nécessaire d’utiliser une lignée de souris transgénique. Ces souris sont capables de produire des protéines d’intérêt ayant une séquence humaine. Ces conditions sont ainsi proches des réponses immunes attendues chez l’Homme lors de l’administration de nos vaccins et sont donc plus pertinentes pour en évaluer l’efficacité.

396 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale de cellules cancéreuses pour développer une carcinose péritonéale, puis un traitement par injection ou par aérosol pressurisé sous anesthésie, avant une mise à mort par ponction cardiaque. Le porteur affirme que les animaux ne souffrent pas de la maladie et signale un risque de mortalité lié à la laparotomie du groupe traité par PIPAC. Il conclut que les expérimentations in vitro ne permettent pas de représenter la complexité d'un organisme vivant.

Objectifs

La carcinose péritonéale est associée à un mauvais pronostic avec une survie médiane sans traitement de 5 mois. Le traitement à visée curative de la carcinose péritonéale repose sur la chirurgie de réduction tumorale qui a pour but de retirer toute la maladie macroscopique suivie de la chimiothérapie hyperthermique intrapéritonéale CHIP (c’est-à-dire le traitement d’une chimiothérapie chauffée à 43°C directement dans l’abdomen qui a pour but d’agir sur les nodules microscopiques). Ce traitement est très efficace, le taux de survie à 5 ans est alors de 45- 51%, avec une médiane de survie de 41 mois. Cependant, ce protocole comporte un risque important de mortalité et de morbidité. C’est pour cela que notre unité a choisi de s’intéresser à une alternative à ce traitement. Nous nous sommes intéressés aux Vésicules extracellulaires (VEs) dérivées des cellules souches car il a été montré que les VEs chargées en mTHPC (molécule utilisée en thérapie photodynamique pour l'activation des macrophages; dans notre projet nous utiliserons de la chimiothérapie dans les VEs) avaient une plus grande affinité pour les nodules de carcinose alors que la forme libre de mTHPC ciblait tous les tissus. Le mTHPC (meta-tetra(hydroxyphenyl)chlorin) a été utilisé dans une étude précédente pour montrer l'efficacité des VEs. De plus, nous nous sommes aussi intéressés à la grande avancée depuis 15ans dans le traitement des carcinoses péritonéales : la technique PIPAC « Chimiothérapie Intra- Péritonéale Pressurisée par Aérosols » qui consiste à délivrer pendant une coelioscopie, au bloc opératoire, une chimiothérapie pour contrôler une carcinose péritonéale et peut être rendre des cas opérables secondairement. Cette méthode s’est avérée améliorer la biodisponibilité locale de la chimiothérapie dans les nodules péritonéaux par rapport au lavage péritonéal classique. Aussi, la concentration en chimiothérapie utilisée serait moins importante. C’est pourquoi, l'objectif est de comparer l’effet de cette technique PIPAC à la simple injection en intrapéritonéale pour l’administration des VEs chargées en chimiothérapie comparée à la forme libre sur l’évolution de la carcinose péritonéale d’origine colique et ovarienne.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus seraient de trouver une alternative au traitement classique de la carcinose péritonéale (chirurgie de cytoréduction suivie d'une CHIP (chimiothérapie hyperthermique intrapéritonéale) qui ne peut être pratiqué sur tous les patients. De plus, ce traitement alternatif engendrerait moins d'effets secondaires car la quantité en chimiothérapie serait moins importante et l'utilisation des VEs permettrait une thérapie ciblée sur les cellules cancéreuses.

Procédures

Les souris vigiles seront soumis à une injection de cellules cancéreuses en intrapéritonéale (1 fois 30 secondes). Elles seront soumises à un traitement soit par injection intrapéritonéale (1 à 2 fois par semaine 30 secondes) (de la chimiothérapie sous forme libre ou dans le VEs) soit par PIPAC (de la chimiothérapie sous forme libre ou dans le VEs) (1 fois 30minutes) sous anesthésie générale (une injection sous-cutanée de buprénorphine (1 fois 30 secondes) puis injection intrapéritonéale d'un mélange kétamine (100mg/kg) zylazine (10mg/kg) (1fois 30 secondes). Puis sous anesthésie, ils auront un suivi non invasif par bioluminescence pour suivre l'évolution tumorale (3 fois 20 minutes pour les bal/c; 12 fois 20 minutes pour les C57BL/6). A la fin de l'expérience elles auront une injection sous-cutanée de buprénorphine (1 fois 30 secondes) puis 30 minutes après elles seront sous anesthésie générale (isoflurane à 30%) pour réaliser un prélèvement intracardiaque de sang qui permettra une analyse postmortem.

Impact sur les animaux

A la suite de l'injection intrapéritonéale des cellules cancéreuses, les souris développeront une carcinose péritonéale qui sera suivie au cours du temps par bioluminescence car les cellules injectées expriment la luciférase. Ce suivi sera indolore mais peut engendrer un stress pour l'animal. Aussi, d'après notre expérience sur les modèles de carcinose péritonéale, les animaux ne souffrent pas de la maladie et le suivi par bioluminesce nous permettra d'arrêter la maladie avant qu'elle n'évolue trop. Enfin, nous pourrons observer un risque de mortalité chez les souris qui auront la PIPAC car nous devrons effectuer une laparotomie et, la procédure de PIPAC dure 30 minutes, alors que les autres groupes recevront une simple injection intrapéritonéale. C'est pour cela que les groupes qui auront la PIPAC seront composés de 12 souris alors que les autres seulement de 10 souris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à J14 ou à 12 semaines post-injection des cellules CT26-luc ou ID8-luc respectivement par ponction cardiaque puis dislocation cervicale sous anesthésie générale. Ce sera un prélèvement total de sang pour des analyses post mortem; mais aussi de tissus pour être analysés par le service d’anatomopathologie.

Remplacement

Pour le remplacement, nous ne pouvons remplacer le modèle murin car pour tester un éventuel traitement (ici analyser l’efficacité de la PIPAC et des VEs chargées en chimiothérapie) les expérimentations in vitro ne permettent pas de représenter la complexité d’un organisme vivant. Seul l'évaluation de l'effet de la chimiothérapie sous forme libre ou dans les VEs sera analysée in vitro sur les cellules. L'effet d'un traitement sur une monocouche de cellules cancéreuses in vitro nous permet de montrer l'efficacité de ce traitement sur ce type cellulaire mais le traitement devra être étudier in vivo pour être sûre de son efficacité dans un organisme vivant où il y a différents types cellulaires, et différents tissus qui seront touchés.

Réduction

Nous n'avons pas effectué de tests de puissance mais en dessous de 7 animaux par groupe, du fait des variations de nos modèles ou vitesse de propagation de la maladie il y a trop peu de données pour avoir un résultat solide. Compte tenu de notre expérience sur le modèle et de la variabilité observée, un nombre minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire. , 12 quand il y a un risque de mortalité lié à la procédure réalisée. Ce sont des règles de bonne pratique pour toutes expériences en oncologie sur l’animal, utilisant des xenogreffes. Aussi, nous allons utiliser deux groupes de souris contrôles pour 4 groupes de traitement. Cela permettra de diminuer le nombre d'animaux. Enfin, le suivi par bioluminescence permet également une réduction du nombre d'animaux car cette technique permet un suivi longitudinal sur le même animal sans sacrifice à des temps intermédiaires.

Raffinement

Les animaux disposeront une période d'acclimation de 5 jours minimum et seront observés quotidiennement. Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids, le comportement (yeux fermés, dos voûté, isolement), l’apparence physique (automutilation, plaies) et la gêne pour se déplacer qui seront notifiés dans un cahier de suivi des animaux 2 fois par semaine. Les souris seront hébergées en portoir ventilé avec alimentation standard classique Harlan 20.16) et eau stérile ad libitum. Cycle nycthéméral 12h jour/12h nuit Température : 22°C Aussi, les souris disposeront d’enrichissement tels que maison rouge, nids en papier kraft ou buchette de bois à ronger pour leur permettre d’exprimer tout le comportement social normal d’une souris et ainsi améliorer leurs conditions d’hébergements. En cas d’atteinte des points limites, ils seront alors exclus de l'expérience dans les 24heures.

Choix des espèces

Il s’agit de souris femelles immunocompétentes (BALB/c ou C57BL6). Ces types de souris sont utilisés largement dans la recherche en cancérologie pour sa capacité d’incrémenter l’incidence tumorale après injection des cellules cancéreuses. Nous utiliserons des BALB/c pour créer une carcinose colique (lignée cellulaire CT26) et des C57BL6 pour créer une carcinose ovarienne (lignée cellulaire ID8). Les souris seront utilisées à l’âge de 7-8 semaines pour ne pas interagir avec les processus de vieillissement et pour qu’elles ne soient pas trop jeunes pour supporter la chimiothérapie.

72 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections sous-cutanées puis subissent des prélèvements sanguins répétés par la veine de la queue, jusqu'à treize sur certaines périodes, pour établir le profil pharmacocinétique de formulations à libération prolongée d'un médicament. Le porteur réalise cette étude pour un laboratoire client et affirme que le recours à l'animal entier reste une étape "nécessaire" et obligatoire d'un point de vue réglementaire. Il précise avoir préféré le rat à la souris pour son volume sanguin plus important, afin de limiter les effectifs.

Objectifs

Le laboratoire pharmaceutique client a développé des matrices de type gel qui peuvent être complexées avec des composés thérapeutiques et être administrées par voie sous-cutanée afin d'induire une libération prolongée du composé complexé. Ce type de formulation (ou galénique) permet ainsi, en théorie, de réduire très sensiblement la fréquence d'administration de médicaments dont la voie d'administration est sous-cutanée. Néanmoins, il est nécessaire de tester, pour chaque composé à complexer, sa stabilité à moyen long terme dans la matrice afin que ce dernier conserve son efficacité. Par ailleurs, la durée de libération va également dépendre étroitement de la composition du gel, notamment de son "maillage" moléculaire. Le présent projet vise ainsi à explorer le profil pharmacocinétique de 6 formulations à libération prolongée du médicament X (agoniste des récepteurs nicotiniques) administrées par voie sous-cutanée chez le rat, dans le but d'optimiser son développement. Les données obtenues seront comparées aux profils pharmacocinétiques obtenus après administration d'une galénique classique du composé X par voie intraveineuse et sous-cutanée. La formulation permettant la meilleure stabilité du compose X et de ses paramètres pharmacocinétiques sera conservée pour la suite du développement, notamment dans un cadre clinique.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de catégoriser les formulations à libération prolongées du médicament X de npotre client en fonction de leur paramètres pharmacocinétiques et de prioriser les meilleures formulation piour la suite du développement préclinique et clinique. La formulation à libération prolongéedevrait à terme permettre de réduire considérablement la fréquence d'administration du composé X qui est déjà utilisé en clinique humaine sous sa forme galénique classique.

Procédures

Pesée (1min ; 2 fois ; De D-10 à D-1). Injections sous-cutanée NaCl 0,9% (1min ; quotidien ; De D-5 à D-1). Habituation boîtes de contention (5min ; De D-4 à D-2). Anesthésie gazeuse (5min ; A D-3). Administration sous-cutanée du composé d'intérêt pour 63 animaux (1min ; A D0). Administration intraveineuse [Anesthésie gazeuse ; Injection] (5min ; A D0). Prélèvements sanguins de 200µL pour le composé d'intérêt (5min ; 4 fois ; De 30min à 24h / 13 fois ; une par jour ; A D2, D3, D4, D5, D7, D10, D13, D16, D19, D22, D28, D35 et D42). Prélèvements sanguins de 200µL pour les contrôles (5min ; 4 fois ; De 30min à 24h / 8 fois ; une par jour ; A D2, D3, D4, D5, D7, D10, D13 et D16).

Impact sur les animaux

La répétition des prélèvements sanguins via la veine de la queue est de nature à induire un stress aux animaux. Par ailleurs, ces prélèvements répétés pourraient s'avérer générateurs de lésions problématiques au niveau de la queue. Afin de limiter le stress, les animaux seront manipulés de façon quotidienne par les expérimentateurs et habitués aux systèmes de contention utilisés au cour des prélèvement. Sur les 24h suivants l'injecton, il est nécessaire d'obtenir des points de prélèvements rapprochés dans le temps pour un analyse correcte des paramètres pharmacocinétiques. Afin de limiter le nombre de prélèvements par animal, chaque groupe exprimental sera divisé en deux sous-groupes (4 et 5 animaux respectivement) qui ne subiront que la motié des prélèvements sanguins sur les 24h premières heures post-administration. Afin de se prémunir de lésions potentielles au niveau du site de prélèvement sanguin, ceux-ci seront pratiqués à l'aide de microperfuseurs à ailettes, ces derniers autorisant un prélèvement sanguin en n'insérant que le premier millimetre de l'aiguille dans la veine. Une attention particulière sera portée à la queue des animaux. Si un hématome venait à apparaitre, les prélèvements suivants seraient pratiqués sur le coté opposé de la queue.. Par ailleurs, le volume de sang prélevé pour chaque point (200µL) est limité au volume minimum possible pour la réalisation des analyses pharmacocinétiques (PK) postérieures.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Après euthanasie, certains organes seront prélevés (coeur, poumons, cerveau...) afin d'étudier une accumulation éventuelle à leur niveau du composé X ou d'éléments constituants de la matrice de libération prolongée.

Remplacement

Le présent projet vise à déterminer les paramètres pharmacocinétiques de formulations à libération prolongée d'un médicament X. Le recours à l’animal entier reste une étape nécessaire et obligatoire d'un point de vue règlementaire pour ce type d'étude. Le choix du modèle rat a été préféré à la souris du fait des capacités accrues de prélèvemlents sanguins sur ce modèle (volémie plus importante).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure d'obtenir des données significatives sur les paramètres pharmacocinétiques étudiés. Le nombre d'animaux par groupe a été choisis selon les recommandations d'un ouvrage de référence. Le nombre de 9 animaux par groupe a été choisi en tenant compte d'une possibilité de variabilité plus importante de la biodisponibilité des drogues progressivement libérées par la matrice en sous-cutanée par rapport à une administration classique (libération immédiate). Ce nombre a également été adapté à la nécessité de créer deux sous-groupes de 4 ou 5 animaux par groupe expérimental afin de limiter le nombre de prélèvements sanguins sur chaque animal à D0 (chaque sous-groupe ne subira que la moitié des prélèvements sur le premier jour) afin de rester dans des limites de volume de prélèvement cumulé acceptables (voir plan de prélèvements en Annexe).

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études pharmacocinétiques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Notamment, les volumes des prélèvements sanguins en série seront limités au strict nécessaire pour l'élaboration des dosages. Les prélèvements s'avérant relativement fréquents le premier jour de l'étude, l'effectif a été doublé afin de ne réaliser que la moitié des prélèvements sur un même animal pour cette journée. Par ailleurs, les prélèvements seront réalisés par ponction de la veine de la queue à l'aide de microperfuseurs à ailettes, ces derniers autorisant un prélèvement sanguin en n'insérant que le premier millimetre de l'aiguille dans la veine. Les animaux seront hébergés à 4/5 par cage et un enrichissement du milieu de vie sera assuré par l'ajout de petites briquettes en bois et de tubes cartons spécifiques pour rat (SAFE). Enfin, un suivi journalier des animaux permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis (administration d'analgésiques; cf annexes). Concernant l'hébergement, les animaux seront hébergés par groupes de 4 ou 5 animaux dans des cages individuellement ventillées, dans notre animalerie EOPS. Ils recevront de la nourriture et de l'eau ad libitum. Le cyclejour/nuit sera de 12h/12h et la température sera régulée à 21°C +/- 1°.

Choix des espèces

Le rat a été préféré à la souris compte tenu du nombre de prélèvements et des volumes sanguins nécessaires à l'étude. La même étude sur la souris aurait nécessité de limiter le nombre de prélèvements à 1 ou 2 par animal, ce qui aurait eu pour conséquence d'augmenter considérablement les effectifs de l'étude. Par ailleurs à ce stade, les études sur animaux non rongeurs n'ont pas été envisagées par soucis de Remplacement (Règle des 3Rs). Il nous apparait que les études sur les mammifères non murins devraient être limitées aux études règlementaires sur des leads (molécules actives) déjà sélectionnés. Or dans le cas présent il s'agit d'une étude de sélection de leads, permettant d'optimiser la R&D du client et de limiter le développement ultèrieur aux leads présentant les meilleurs propriétés pharmacocinétiques. Les animaux utilisés seront des rats adultes (300 g à réception/350g env. au démarrage des expérimentation). Ce stade de développement a été choisi: - en se basant sur le recommendations d'un ouvrage de référence. - en considérant le nombre de prélèvements et les volumes sanguins nécessaires à la bioanalyse.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une implantation stéréotaxique de sondes de microdialyse ou de canules, puis une microdialyse de quatre heures ou des tests comportementaux, le labyrinthe en croix surélevé et le test de nourriture en milieu nouveau, pour étudier la transmission GABAergique dans la réponse aux antidépresseurs. Le porteur qualifie les nuisances de très faibles et affirme que le cerveau est dépourvu de fibres sensibles à la douleur. Il conclut que l'usage de la souris est "indispensable", seul un animal entier vivant et vigile permettant selon lui d'appréhender ces réponses.

Objectifs

Les inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine (ISRS, dont la fluoxétine) affectent le fonctionnement de différentes zones cérébrales pour induire l'effet antidépresseur. Parmi elles, l'hippocampe est une structure cérébrale clé à l'interface de différentes fonctions : cognition, émotion, ou encore régulation hormonale. Il est donc important de comprendre comment les ISRS affectent le fonctionnement des différents types de neurones qui composent l'hippocampe. Parmi eux, les interneurones du gyrus dentelé sont une cible de choix. En effet, ils sont un lien avec beaucoup d'autres neurones de l'hippocampes grâce à leurs nombreuses connexions. Ils expriment aussi le récepteur 5-HT3 de la sérotonine ce qui les rend sensibles aux élévations de la transmission sérotoninergique induites par un ISRS. Enfin, le rôle des interneurones GABAergiques est controversé quant à leur lien avec les jeunes neurones issus de la neurogenèse adulte hippocampique qui est un élément important de la réponse aux antidépresseurs. Ce travail vise donc à évaluer dans un premier temps comment un traitement chronique avec un ISRS affecte la transmission gabaergique et si cette transmission affecte la réponse comportementale au traitement antidépresseur. Dans un second temps nous évaluerons si l’ablation génétique de la neurogenèse hippocampique affecte cette transmission gabaergique.

Bénéfices attendus

La compréhension de l'implication de transmission gabaergique de la réponse aux antidépresseurs est un élément important dans la compréhension globale de la réponse aux antidépresseurs. Si cette compréhension s'est approndie largement sur les systèmes monoaminergique et plus récemment sur le sytème glutamatergique, le système gabaergique n'est à ce jour que peu étudié dans le cadre de la réponse aux traitements antidépresseurs. Ceci peut paraitre étonnant tant l'utilisation des benzodiazépine est courante dans la pratique clinique pour traiter les commorbidités anxieuses chez des patients dépressifs notamment en début de traitement avec un antidépresseur.

Procédures

Les animaux auront une implantation stéréotaxique soit de sondes de microdialyse soit de canule d'administration locale. Les animaux seront soit dialysés (4h) soit seront évalués dans un test comportemental (le labyrinthe en croix survélévé (5min) ou le test du novelty suppressed feeding (6min)) après administration locale de la molécule d'intérêt. Dans le cas de la microdialyse la chirurgie prend une tretaine de minutes il en va de même pour l'implantation du guide canule pour l'adminstration locale.

Impact sur les animaux

Les nuisances pour ces animaux sont très faibles. Pour l'axe comportemental, les administrations locales seront réalisées par du personnel qualifié à ces techniques et les tests comportentaux n'impliquent pas de douleur ou de durée d'expérimentation déraisonnable. Les implantations intracérébrales constituent une gène légère pour l'animal. Le cerveau est dépourvu de fibres sensibles à la douleur, à titre d'exemple des chirurgies similaires sont réalisée chez l'humains sous simple anesthésie locale.

Devenir

Euthanasie des animaux à l'issue de chaque procédure, pour vérification anatomique des implantations.

Remplacement

L'utilisation de souris est indispensable pour ce projet. L'évaluation de processus complexes qui induisent une réponse neurochimique ou comportementale n'est à ce jour pas modélisable. Ainsi seul un animal entier vivant et vigile permet d'appréhender ces éléments.

Réduction

Le calcul de puissance effectué pour les expériences de microdialyse a été réalisé avec le logiciel biostatGV. Les concentrations de GABA et de glutamate dans les dialysats sont attendues avec un écart type estimé à 20 % (issue des données de la littérature et de notre propre expérience) et la possibilité de discriminer un effet de 25% a été envisagé. Une puissance de 0,9 et un alpha de 0,05 ont été choisis. Ceci indique 14 animaux par groupe nombre qui est augmenté à 15 pour pallier aux aléas expérimentaux. Une approche statistique sera envisagée par analyse de la variance entre les différents groupes d'animaux suivis pas des tests post-hoc adéquat. Les seuils de significativité seront fixés à *p

Raffinement

Un anesthésique (hydrate de chlorale) est utilisé pour effectuer l'implantation des sondes de microdialyse. Le cerveau est un organe dépourvu de fibres nerveuses libres dédiées à la nociception, bien qu'invasive cette chirurgie se révèle mineure pour les animaux

Choix des espèces

L'utilisation de de souris est nécessaire pour ce projet en particulier la souche 129 Sv Tac par son niveau basal faible de negenèse adulte hippocampique. Les animaux entreront dans le protocole expérimental lorsqu'ils seront agés de 8 à 10 semaines.