Rongeurs

116 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un régime gras de douze semaines pour induire obésité et diabète, une chirurgie de constriction de l'aorte par thoracotomie que le porteur associe à une mortalité de 10 %, une injection de virus AAV, puis des mesures cardiaques, pour tester l'effet protecteur d'une protéine, la myotubularine MTM1. Les bénéfices sont annoncés au conditionnel, comme une "nouvelle perspective thérapeutique". Le porteur conclut qu'il n'existe pas de modèle in vitro permettant de "s'affranchir" du modèle animal.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer les effets de la surexpression de la myotubularine MTM1 dans la progression de l'insuffisance cardiaque chez la souris, notamment dans un contexte lié à l'obésité. Nos résultats in vitro sur des cellules cardiaques en culture montrent que la surexpression de MTM1 réduit le stress oxydant et préserve les fonctions mitochondriales au cours d'un stress. Ces résultats suggèrent un effet protecteur de MTM1 et ouvrent la voie à des essais in vivo.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence les effets protecteurs de la surexpression de MTM1 dans l'insuffisance cardiaque liée à l'obésité, d'étudier les mécanismes moléculaires impliqués et de proposer la myotubularine MTM1 comme nouvelle perspective thérapeutique.

Procédures

Les animaux seront soumis à 5 interventions différentes: 1/ un régime riche en graisse (60%kcal) pendant 12 semaines afin d'induire un phénotype obèse et diabétique de type 2; 2/ une procédure chirurgicale visant à réaliser une constriction de l'aorte afin d'induire un stress cardiaque, pendant 4 semaines; 3/ une injection iv par la veine caudale de virus associés aux adénovirus (AAV) permettant de surexprimer la myotubularine MTM1; 4/ une échocardiographie transoesophagienne afin de mesurer la fonction cardiaque des animaux; 5/ une mesure de la composition corporelle (echoMRI).

Impact sur les animaux

Le régime HFD 60% induit un phénotype obèse et peut entrainer des difficultés de déplacement des animaux, l'apparition d'un diabète, le graissage du pelage des animaux, une polyurie/polydipsie. Par conséquent, les animaux soumis à un régime HFD auront un suivi plus précis avec des remplissages des biberons d'eau et changes de litières plus fréquents si nécessaire. La chirurgie TAC étant une procédure chirurgicale invasive impliquant une thoracotomie, elle peut entrainer une mortalité post-opératoire (précédemment observée à 10% de l'effectif). Les AAV sont utilisés en thérapie génique et vaccinologie. Plus spécifiquement, les AAV-MTM1 sont actuellement en essais cliniques pour des thérapies géniques sur le chien (labrador) et chez l'homme atteints par la myopathie myotubulaire liée à l'X (pathologie consécutive à une mutation de MTM1). L’échocardiographie transoesophagienne est réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 2%) et n’entraîne pas de nuisances pour l’animal. La mesure de la composition corporelle est réalisée sur animal vigile et acclimaté.

Devenir

Tout les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Quand cela est possible, le modèle animal sera remplacé par des techniques in vitro. Cependant, il n’existe à l’heure actuelle pas de modèle in vitro permettant de s’affranchir du modèle animal.

Réduction

Le critère principal de jugement sera la mesure de la fraction d'éjection (EF) et de raccourcissement (FS) du ventricule gauche. Des données de la littérature nous permettent de prévoir que nos groupes expérimentaux doivent comporter 12 individus afin d’avoir une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les doublons expérimentaux seront évités, et des mesures strictes seront appliquées afin de réduire la douleur pendant les procédures expérimentales: anesthésie, tapis chauffant, monitoring global de l'animal. Un suivi journalier est mis en place par un zootechnicien qualifié afin de détecter le plus précocement possible la souffrance éventuelle de l’animal. Les signes de douleur spécifiques de la souris seront surveillés, comme la prostration, perte de poids, absence de toilettage.

Choix des espèces

Ce projet vise à caractériser les effets de la surexpression de MTM1 sur la progression de l'insuffisance cardiaque. Ces aspects complexes et interconnectés ne peuvent être reproduits qu'in vivo sur des modèles expérimentaux. Seul l'animal vivant peut permettre d'évaluer ces paramèters et il n'existe pas à l'heure actuelle de moyens alternatifs. Les animaux utilisées seront âgées de 2 mois (jeune adulte). Les souris de 2 mois sont les plus réceptives à la chirurgie TAC et les plus sensibles à l'induction par AAV (des souris plus âgées ont été décrites comme pouvant être résistante à l'induction).

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, après dissection de la peau, elles reçoivent dans la trachée une injection d'une molécule provoquant une fibrose pulmonaire, puis une greffe de cellules précurseurs de cellules graisseuses, avant mise à mort et prélèvement des poumons au 21e jour. Le porteur indique que l'induction de la fibrose peut entraîner des difficultés respiratoires et une perte de poids. Il présente le projet comme une étude de faisabilité et affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative pour modéliser la réponse d'un "organe entier".

Objectifs

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie rare, chronique et progressive de cause inconnue. Elle est très sévère, avec une survie inférieure à 30% à 5 ans après le diagnostic. Cette maladie se caractérise par des dommages pulmonaires liés à une cicatrisation anormale et chronique, avec l'accumulation de tissu fibreux (fibrose) menant à la destruction des alvéoles pulmonaires. Ces alvéoles sont de minces sacs creux qui prolongent les voies respiratoires, où se déroulent les échanges gazeux avec le sang; elles sont essentielles à la respiration. L'accumulation de tissu fibreux dans le poumon est en grande partie due à l'accumulation de fibroblastes et à leur activité de sécrétion de différents facteurs. Ces fibroblastes sont des cellules d'aspects fusiformes, normalement présentes dans le tissu; ils sont parfois appelés "cellules de soutien". Dans la FPI, les processus menant à la fibrose sont encore mal connus. Or, des travaux récents ont mis en évidence la présence de cellulles graisseuses dans les poumons de patients atteint de FPI. De plus, des données ont montré que ces cellules graisseuses diminuaient in vitro l'activité des fibroblastes de fibrose. Dans d'autres organes, le tissu graisseux a une influence démontrée sur la fibrose (foie, rein, coeur). Nous souhaitons donc étudier son rôle potentiel dans la fibrose pulmonaire. Cependant, des travaux préliminaires n'ont pas permis de mettre en évidence de cellules graisseuses chez la souris dans les modèles de fibrose pulmonaire. Dans le cadre de ce protocole (étude de faisabilité d’une durée de 1 an), la greffe de cellules donnant naissance à des cellules graisseuses dans le poumon sera testée dans un modèle de fibrose pulmonaire chez la souris.

Bénéfices attendus

Ces expériences préliminaires de transplantation de précurseurs de cellules graisseuses permettront de démontrer la faisabilité de cette approche pour étudier le rôle des cellules graisseuses dans la fibrose pulmonaire. Il s'agit d'une première étape importante afin d’identifier le tissu graisseux pulmonaire associé à la fibrose pulmonaire comme potentielle cible thérapeutique dans cette maladie mortelle.

Procédures

En début de procédure (jour 1), les souris recevront, sous anesthésie générale, une injection unique d'une molécule induisant la fibrose pulmonaire. Cette molécule sera injectée directement au niveau de la trachée chez les souris endormies, après dissection de la peau et des tissus sous cutanés : la visualisation directe de la trachée permet une meilleure chance de succès de la procédure. Après injection, la lésion sera suturée par un ou deux points de suture : la souris recevra un antalgique au cours de la procédure, et qui pourra être répété. Cette intervention dure 5 à 10 minutes pour chaque souris. Cinq jours plus tard, les souris recevront une injection unique de cellules capables de donner naissance à des cellules graisseuses (cellules précurseurs), soit au travers de la paroi thoracique, sous anesthésie gazeuse brève (5 minutes), soit via la trachée, après intubation, sous anesthésie générale, (10 minutes) avec des suites post-opératoires similaires à l’injection du produit fibrosant. A l'issue de la procédure (jour 21), les souris seront euthanasiées après anesthésie profonde, après quoi plusieurs prélèvements seront effectués. Un prélèvement de sang sera réalisé ainsi que le prélèvement des poumons.

Impact sur les animaux

L'induction de la fibrose pulmonaire chez les animaux peut déclencher des difficultés respiratoires et une possible altération de l'état général avec perte de poids. Une surveillance quotidienne des animaux est effectuée par l'expérimentateur (exploration de l'aspect physique et de la motricité), ainsi que par le personnel de l'animalerie. Une surveillance au moins 3 fois par semaine minimum des animaux est effectuée par l'expérimentateur selon la grille d'évaluation des points limites (mesure de poids, exploration de l'aspect physique et de la motricité, etc.). La fréquence de surveillance des animaux pourra être augmentée selon leur état général et leur poids.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure en suivant une méthode réglementaire. Les prélèvements seront effectués après euthanasie de l'animal. Les animaux ne subiront qu'un seul protocole complet au cours de leur vie.

Remplacement

Le modèle murin est pertinent de par son système respiratoire très similaire à celui de l’Homme. A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique, tout en tenant compte du risque de mortalité si les points limites sont atteints. De plus, les prélèvements obtenus grâce à une seule souris permettent de mener de multiples mesures.

Raffinement

Nous veillerons à ce qu'il n'y ait pas d'animaux isolés dans les cages durant les expériences afin de préserver les groupes sociaux. Les animaux seront anesthésiés lors des procédures et recevront des antalgiques systématiquement concomitament de l'anesthésie. L'enrichissement consistera en la mise en place de coton dans les cages, et d'une nourriture facile à ingérer en cours de protocole. Les souris auront un accès permanent à de la nourriture et de la boisson. Une surveillance visuelle quotidienne des animaux est effectuée par l'expérimentateur (exploration de l'aspect physique et motricité), ainsi que par le personnel de l'animalerie. Une surveillance clinique au moins 3 fois par semaine des animaux est effectuée par l'expérimentateur selon une grille d'évaluation (mesure de poids, exploration de l'aspect physique et motricité, douleur, etc.): en cas d'atteinte d'un ou plusieurs point limite, les animaux seront sortis de la procédure et euthanasiés. La fréquence de surveillance des animaux pourra être augmentée selon l'état général des animaux et leur poids. En post-opératoire, la douleur et la cicatrice seront suivies de manière rapprochée. La douleur sera prise en charge par l'administration d'antalgiques. En cas de douleur et d'atteinte d'un point limite, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Le modèle souris est pertinent car son système respiratoire est proche de celui de l’Homme. Les modèles de fibroses pulmonaires chez la souris sont largement décrits dans la littérature. Les souris offrent la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et de cibler le rôle d’une molécule en particulier dans le poumon. Des animaux adultes d'au moins 8 semaines seront utilisés car la fibrose pulmonaire est une pathologie du sujet adulte.

153 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant une maladie auto-inflammatoire rare, elles développent une vasculopathie et un déficit immunitaire avec une survie réduite, subissent l'ablation d'une phalange pour le génotypage puis un prélèvement sanguin sous anesthésie sans réveil. Elles sont tuées pour prélever les organes immunitaires, tout animal atteignant un score de souffrance donné étant mis à mort. Le porteur affirme que ces analyses exigent un modèle mammifère in vivo, la souris étant selon lui appropriée.

Objectifs

Le SAVI (STING-associated vasculopathy with infancy-onset) est une maladie auto-inflammatoire rare. Elle se caractérise par une inflammation systémique dès l’enfance (fièvre et syndrome inflammatoire), induisant notamment une vasculopathie cutanée sévère (engelures et ulcérations aux joues et aux extrémités comme nez, doigts, orteils), et une pneumopathie interstitielle. Le SAVI est dû à une mutation de gain-de-fonction (= suractivation) de STING, un facteur clé de la réponse immunitaire. Nous avons créé un modèle murin portant la mutation majeure (STING V154M) et reproduisant les signes de la maladie humaine. Les souris présentent un déficit immunitaire avec baisse des lymphocytes, et une survie diminuée à 6 mois. STIM1 est un interacteur connu de STING, et il a été démontré que cette interaction est cruciale pour la régulation de l’activité de STING. Le but du projet est de valider l’hypothèse scientifique selon laquelle une modulation de STIM1 pourrait réduire la suractivation de STING et ainsi améliorer le phénotype des souris SAVI.

Bénéfices attendus

Le projet vise à fournir la preuve de concept que la modulation de STIM1 peut améliorer l’auto-inflammation des souris STING V154M. Ceci pourrait conduire au développement d'approches thérapeutique pour les patients atteints de SAVI.

Procédures

A 10 jours : prélèvement d’un échantillon de phalange (acte de 10 secondes) pour extraction d’ADN et génotypage (= vérification de la présence/absence des mutations STING et STIM1). A 2-3 mois : anesthésie pour prélèvement de sang (acte de 5 minutes), puis mise à mort pour prélèvement des organes du système immunitaire.

Impact sur les animaux

Les souris STING V154M présentent un phénotype dommageable avec notamment un déficit immunitaire. Bien qu’une amélioration de ce phénotype soit attendue suite à la modulation de STIM1, il est possible qu’il n’y ait pas d’effet bénéfique. Nous proposons donc une surveillance hebdomadaire avec une procédure de suivi utilisant une grille de score tenant compte de plusieurs critères sur l’aspect général et le comportement des souris. Par ailleurs, les souris seront soumises à une phalagectomie (génotypage), ainsi qu'une prise de sang (sous anesthésie et sans réveil).

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement des organes du système immunitaire.

Remplacement

Notre projet vise à étudier les réponses immunitaires dans un système complexe qui met en jeu des coopérations des organes lymphoïdes tels que la rate et les ganglions. Ces analyses nécessitent un modèle in vivo de mammifère, et nous ne pouvons avoir recours à des modèles in vitro. Par ailleurs, les connaissances du système immunitaire sont très développées chez la souris, qui représente de ce fait un modèle approprié pour étudier la physiopathologie de SAVI et établir des approches thérapeutiques qui pourraient être transférées aux patients dans l’avenir.

Réduction

Un nombre de 15 souris maximum/groupe (8 groupes au total) sera utilisé pour s’assurer que l’étude soit statistiquement et scientifiquement valable. Le test d’Agostino-Pearson sera réalisé afin de vérifier que les données suivent une loi Normale. Si la loi Normale est respectée, le test d'ANOVA sera appliqué. Si toutefois les données expérimentales ne respectent pas la loi Normale, un test non paramétrique (Kruskal-Wallis) sera appliqué. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées chez les mêmes souris, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires. Par ailleurs, nous allons utiliser des souris mâles et femelles afin de réduire d’avantage le nombre de souris utilisées pour les procédures expérimentales.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux, dans des cages enrichies (barreau à ronger, matériel de nidification). Une grille de suivi permettra d’appliquer un point limite prédictif et adapté. Afin d'évaluer les points limites, cette grille prend en compte les points des catégories suivants : 1) L'aspect général de l'animal (hérissement des poils, yeux clos, flancs creusés...) : 2) Le comportement de l'animal (mobilité́, prostration, dos vouté́, isolement par rapport aux autres animaux). Ce suivi sera réalisé de manière hebdomadaire sur toute souris portant la mutation STING V154M à partir du sevrage et jusqu’à la mise à mort pour expérimentation. Chaque animal ayant une somme totale de scores ≥ 3 doit être mis à mort. Si un animal atteint le score de 2 dans une seule catégorie, celui-ci doit être également mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent et courant en immunologie. Son système immunitaire est bien étudié, de nombreux réactifs (notamment les anticorps) sont disponibles, et de nombreuses techniques d’analyse sont établies afin de mener à bien les analyses. L’expérimentation se fera à partir d’un âge adulte (2-3 mois) afin de pouvoir analyser les organes lymphoïdes matures (après mise à mort).

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines sont irradiées pour une greffe de moelle osseuse, toutes suivent un régime gras de douze semaines avec prélèvements sanguins répétés, pour étudier l'inflammation des artères dans les maladies cardio-métaboliques. Elles sont tuées par dislocation cervicale, surdosage d'anesthésique ou CO2 selon les expérimentateurs. Le porteur affirme que ces pathologies complexes rendent l'approche in vivo "indispensable" et que le dépôt de cholestérol ne peut s'étudier in vitro.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires représentent la première cause de décès dans le monde. Récemment, l'inflammation (réponse de l'organisme à une agression) est apparue comme une composante centrale dans l'apparition de ces maladies mais les mécanismes restent encore inconnus. Le dérèglement des cellules du système immunitaire est souvent associé à l'inflammation et à la progression des maladies cardiovasculaires dites cardio-métaboliques, dans lesquelles un dysfonctionnement du métabolisme cellulaire (utilisation des matières nutritives pour fabriquer de l'énergie) aboutit au développement de ces maladies. Plus précisément, au sein des vaisseaux sanguins, un type particulier de cellules immunitaires, appelé les macrophages, joue un rôle important dans l'élimination des déchets pour éviter l'encrassement des vaisseaux qui provoque une inflammation et le développement de plaques d'athérome (plaques de gras bouchant les artères). Cependant, une surcharge en déchets et en cholestérol sanguin dérégule le métabolisme des macrophages qui ne sont plus capables d'exercer leur rôle d'"éboueurs" des vaisseaux. Le métabolisme cellulaire dépend d'une organelle qu'on appelle la mitochondrie qui permet de transformer les nutriments en énergie. De récentes publications ont montré l'importance de la dérégulation des mitochondries dans le développement de l'inflammation. En particulier, une modification de la structure des membranes des mitochondries entraine des perturbations quantitatives et qualitatives de ces organelles. Les membranes mitochondriales ont une structure spécifique qui dépend de lipides spécifiques appelés phospholipies mais leurs rôles dans la fonction mitochondriale des cellules immunitaores restent inconnus. Néanmoins, leur quantité dans le sang est souvent associé aux maladies cardio-métaboliques. Ce projet vise donc à identifier le rôle de la synthèse des phospholipides dans les macrophages. Pour cela, des approches génétiques d'invalidation de gène seront réalisées. Cela permettra de mieux comprendre l'origine de l'inflammation dans les maladies cardio-métaboliques afin de développer de nouvelles approches diagnostiques et thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Cette étude pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement visant à mieux contrôler la fonction des cellules immunitaires et ceci dans les maladies cardio-métaboliques. L’ensemble des procédures proposées dans ce projet sont connues comme non remplaçables par des procédures ne faisant pas intervenir directement l’animal.

Procédures

Groupe 1 (Procédure1) : Prélèvements de sang à la joue sur animaux vigiles (toutes les 2-3 semaines) à partir de l'âge de 6 semaines. 12 semaines de régime riche en graisse. 48h en cage métabolique pour étudier les variations métaboliques (1 souris par cage) puis injection de glucose par voie intra-péritonéale (une injection) puis détermination de la glycémie (taux de sucre sanguin) par prélèvement de sang au niveau de la veine de la queue (1 goutte). Groupe 2 (Procédure 1) : Injection de Tamoxifen en intra-péritonéal sur souris vigiles à l’âge de 6 semaines tous les deux jours pendant une semaine (soit 3 injections). Pour ce groupe de souris, le Tamoxifen est nécessaire pour invalider, indirectement, le gène cible. Prélèvements de sang à la joue sur animaux vigiles (toutes les 2-3 semaines) à partir de l'âge de 6 semaines. 12 semaines de régime riche en graisse. 48h en cage métabolique pour étudier les variations métaboliques (1 souris par cage) puis injection de glucose par voie intra-péritonéale (une injection) puis détermination de la glycémie (taux de sucre sanguin) par prélèvement de sang au niveau de la veine de la queue (1 goutte). Dans le cadre de la Procédure 2 (greffe de moelle osseuse), les souris receveuses, âgées de 10 semaines, seront irradiées (pour éliminer les cellules de la moelle osseuse) dans un irradiateur prévu à cet effet pendant 6min30sec. Ces souris recevront une solution contenant des cellules de moelle osseuse par voie intra-veineuse au niveau de la veine de la queue. Ces souris seront ensuite soumises aux interventions citées ci-dessus selon leur groupe. Par ailleurs, une grille de score a été établie afin de limiter la douleur, et déterminer les mesures à prendre si besoin (antalgique (anti-douleur), désinfection ou mise à mort).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont une douleur légère lors du prélèvement à la joue et lors des injections intra-péritonéales et intra-veineuses. Lors du changement de cage, les animaux peuvent être légèrement stressés mais ce stress diminue au bout des 24h d'acclimatation à la cage métabolique. Il peut également survenir une perte de poids et une prostration suivant l’irradiation, ainsi que, très rarement, une respiration perturbée et une mobilité réduite avec le régime riche en graisses.

Devenir

A la fin des expériences, toutes les souris seront mises à mort par dislocation cervicale, surdosage d’anesthésiant ou asphyxie au CO2 (selon les expérimentateurs).

Remplacement

Les maladies cardio-métaboliques sont des pathologies complexes dans lesquelles de multiples voies métaboliques et physiologiques interviennent. De ce fait, une approche in vivo reproduisant ces interactions nous est indispensable pour répondre à notre problématique. De plus, l'étude du dépôt de cholestérol dans les artères ne peut être réalisé in vitro. Des modèles murins capable de développer de l'athérosclérose ont donc été développés et validés par la communauté scientifique comme outils d’études précliniques.

Réduction

Notre approche statistique garantit l’obtention de résultats exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Dans le cadre de cette étude, et pour chaque groupe, nous utiliserons des souris mâles et femelles. Ceci permettra d’utiliser l’ensemble des animaux générés dans les élevages. De plus, les résultats pourront ainsi être appliqués à la fois aux hommes et aux femmes. Ce projet prévoit l’utilisation de 560 souris sur 5 ans.

Raffinement

La mise en place de points limites précoces, prédictifs, adaptés à chaque procédure et basés sur une observation détaillée des animaux au cours de chaque procédure, permettra de limiter la sévérité de celles-ci. Les souris seront hébergées selon les mesures réglementaires pour le raffinement : en groupe (6 souris par cage, ou 5 souris par cage si une des souris fait 30g ou plus) dans des cages enrichies (igloos, ouate, baguettes de bois à ronger).

Choix des espèces

1) Nous avons choisi le modèle murin car c’est un modèle standard bien reconnu dans le domaine scientifique pour l’investigation de manipulations génétiques liées aux maladies cardio-métaboliques. 2) Nous avons également des souris déficientes pour le gène ApoE ou LDLR connues pour leurs différents facteurs de risque liés au développement de l’athérosclérose et donc à l’apparition des maladies cardio-métaboliques après un régime riche en graisse. 3) Des souris déficientes pour la protéine Cardiolipin synthase 1 spécifiquement au niveau des macrophages nous permettront de déterminer l’importance de cette enzyme sur la dynamique mitochondriale et le métabolisme des macrophages. 4) De plus, le modèle murin présente plusieurs avantages par rapport à d’autres espèces : cycle de vie court, natalité importante. A partir de l’âge de 6 semaines (âge à partir duquel les souris sont considérées comme suffisamment matures), les souris nécessitant une induction au Tamoxifen seront injectées. La greffe de moelle osseuse est réalisée sur des souris plus âgées (10 semaines). A l’âge de 8 ou 17 semaines toutes les souris seront soumises à un régime riche en graisse durant une période de 12 semaines afin de permettre la formation des plaques d’athérome. Pendant cette période, les expériences de calorimétrie et de tolérance au glucose seront réalisées afin d’étudier les variations des voies métaboliques. A la fin des expériences, les souris seront mises à mort par dislocation cervicale, par surdosage d’anesthésiant ou par asphyxie au CO2 (selon les expérimentateurs) à 29 semaines ou moins selon les procédures.

1700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections quotidiennes d'acide hypochloreux dans la peau, cinq jours par semaine pendant six semaines, induisant une fibrose et des ulcérations cutanées, pour tester une thérapie cellulaire contre la sclérodermie. Elles sont toutes tuées en fin de procédure pour prélever les organes. Le porteur affirme que l'efficacité d'un tel traitement ne peut être évaluée sur les seuls modèles in vitro dans un contexte d'inflammation et de fibrose.

Objectifs

La sclérodermie systémique (ScS) est une maladie auto-immune grave. Elle est caractérisée par une fibrose systémique, des anomalies vasculaires et une auto-immunité. Cette fibrose peut concerner d’autres organes que la peau, notamment le poumon qui représente une atteinte fréquente, sévère et mortelle de cette maladie systémique. Elle touche aussi les reins ou le cœur. Des thérapies basées sur les cellules stromales mésenchymateuses (ASC) sont en cours d'évaluation clinique et les résultats préliminaires sont encourageants. Nous avons récemment montré que les vésicules extracellulaires (VE) produites par ces cellules ont des effets biologiques comparables aux cellules parentales. Cependant, des données controversées existent sur la capacité thérapeutique des ASC isolées de patients et aucune étude in vivo dans un modèle proche de la pathologie humaine n’a été réalisée. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique des cellules stromales mésenchymateuses ou des vésicules extracellulaires issues de patients sur la sclérodermie induite chez la souris.

Bénéfices attendus

Ces approches de thérapie cellulaire chez l’animal ont une portée translationnelle avant leur utilisation en clinique chez des patients souffrant de sclérodermie et pour lesquels il n’existe aucun traitement disponible à ce jour. Les cellules sont déjà en cours d’évaluation en clinique et les vésicules extracellulaires pourraient être utilisées à moyen terme dans cette pathologie. Nos études in vitro ont identifié des molécules qui pourraient jouer un rôle dans l’effet thérapeutique des cellules. Si elles confirment leur intérêt in vivo, nous pourrions valider un nouveau médicament plus efficace que les cellules en cours d’évaluation clinique. En terme de santé publique, l’impact attendu est majeur puisqu’il n’existe pas de traitement de la sclérodermie qui est une maladie mortelle. Améliorer les stratégies actuelles de thérapie cellulaire aura des retombées énormes à moyen terme sur la prise en charge des patients.

Procédures

Les animaux recoivent des injections d’acide hypochloreux (HOCl) en intra-dermique (5 jours/semaine pendant 6 semaines) et une injection intraveineuse du traitement 1 fois à J21. L’épaisseur de la peau est mesurée au site d’injection avec un caliper toutes les semaines pour évaluer la fibrose cutanée. Ces mesures permettent d’avoir un suivi clinique de la pathologie.

Impact sur les animaux

Les cellules stromales mésenchymateuses et leurs vésicules extracellulaires ont été déjà validées pour leur rôle thérapeutique dans ce modèle de sclérodermie avec un bénéfice associé au traitement. Les injections répétées d’HOCl peuvent générer un inconfort des souris mais elles ne montrent plus de signes d’inconfort après quelques jours de manipulation quotidienne. L’injection quotidienne d’HOCl prend moins d’1 min sans anesthésie. Le modèle peut provoquer des ulcérations cutanées mais qui sont améliorées par le traitement. Le suivi des ulcères est réalisé au quotidien et les injections de HOCl sont suspendues le temps de la cicatrisation.

Devenir

L’ensemble des animaux sera euthanasié à l’issue des procédures pour permettre l’analyse du modèle expérimental et des traitements réalisés (prélèvements d’organes et histologie).

Remplacement

Avant de proposer une thérapie cellulaire chez l’homme, il est important de démontrer l’efficacité thérapeutique des cellules stromales mésenchymateuses ou de leurs vésicules extracellulaires dans un modèle pré-clinique pertinent. Des modèles in vitro sont utilisés en amont mais ne suffisent pas seuls à évaluer l’efficacité de ces traitements dans un contexte in vivo comportant de l’inflammation, de la fibrose et du remodelage tissulaire qui sont observés au niveau cutané et pulmonaire.

Réduction

Nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment au laboratoire et avons calculé que l’inclusion de 8 souris par groupe expérimental permet d’obtenir des valeurs significatives pour au moins deux marqueurs importants de la maladie.

Raffinement

Enrichissement du milieu : Les animaux sont hébergés en portoirs statiques avec couvercles filtrants. L’enrichissement du milieu consiste en l’apport de copeaux dans les litières et carrés de cellulose. Des igloos sont également installés dans les cages. Les animaux font l’objet d’un contrôle quotidien. Surveillance liée aux procédures : Les souris sont examinées tous les jours pour vérifier l’apparition potentielle d’ulcères et l’absence d’infections. Si un ulcère apparait, le comportement des souris est particulièrement observé pour s’assurer que d’autres signes de souffrance n’apparaissent. L’injection intraveineuse des traitements est une procédure très rapide qui ne génère qu’un léger stress lié à la manipulation des souris pendant moins d’une minute

Choix des espèces

Le modèle murin de sclérodermie systémique a été choisi parce qu’il présente l’avantage de reproduire assez fidèlement les caractéristiques cliniques observées chez l’homme et est considéré comme une référence de sclérodermie. Les animaux sont utilisés à l’âge de 6 semaines, à maturité sexuelle. Les études de mise en place du modèle ont montré une incidence à 100% de la sclérodermie.