Rongeurs
Impact du ciblage des cellules sénescentes sur la longévité et l’espérance de vie en bonne santé
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Laissées vieillir jusqu'à 18 à 24 mois, elles reçoivent un anticorps ou un composé sénolytique par injection ou gavage tous les quinze jours, avec prélèvements de sang et d'urine, pour étudier l'élimination des cellules sénescentes dans le vieillissement. Le porteur anticipe la mort d'environ 20 % des animaux avant la fin, et la mise à mort de ceux qui perdent 15 % de leur poids. Il justifie le recours à la souris par la nécessité d'étudier un "organisme entier".
Objectifs
Ce projet fait partie d'une étude plus globale de caractérisation du rôle de la surveillance immunitaire des cellules sénescentes dans le vieillissement, les maladies liées à l’âge et le cancer. Ce projet est basé sur les résultats obtenus au sein du laboratoire qui démontrent un lien entre la surexpression d’un glycolipide à la surface des cellules pulmonaires sénescentes et leur échappement au système immunitaire. L’objectif du projet est de déterminer l’effet du blocage de glycolipide par un anticorps sur la réponse immunitaire et le développement de maladies liées à la senescence chez la souris âgée. L’interaction et la communication entre les cellules sénescentes et les cellules immunitaires seront étudiées pour établir le mécanisme par lequel ces cellules exercent des pressions d’adaptation mutuelles observée in vitro. Le développement et l’avancement de diverses maladies liés à l’âge (Fibrose pulmonaire, fibrose rénale, fibrose hépatique, arthrose, ostéoporose, cancer) seront également suivis afin d’évaluer l’effet thérapeutique de l’anticorps comparé à un sénolytique connu (une combinaison de molécules éliminant les cellules sénescentes). Nous voulons évaluer si cette approche immunothérapeutique pourrait augmenter la durée de vie des souris ainsi que diminuer leur état de fragilité générale. La finalité de ce projet pourrait permettre de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre le vieillissement pathologique en ciblant spécifiquement des molécules de surfaces associées aux cellules sénescentes. Cette approche pourrait être utile pour les patients dans de nombreuses maladies liées à l’âges incluant le cancer. Les résultats de cette étude devraient nous permettre de mieux développer l’anticorps et d’envisager des essais cliniques de phase précoce chez l’homme.
Bénéfices attendus
Par cette étude on s’attend à avoir une meilleure compréhension mécanistique des interactions entre le système immunitaire et les cellules sénescentes au cours du vieillissement mais également de déterminer le rôle et l’importance des point de contrôles immunitaires associés à la sénescence dans l’élimination des cellules sénescentes. Nous nous attendons également à comprendre si une approche immunothérapeutique visant ce ganglioside pourrait être envisagée afin de traiter et prévenir les maladies liées à l’âge et la comparer à un traitement déjà connu.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - Administration de l’anticorps ou le sénolytique de référence ou les solutions contrôles (PBS ou isotype contrôle) par injection intrapéritonéale ou par gavage, pour tous les animaux, une fois tous les 15 jours pour 6 injections/gavages; durée d'environ 3 minutes par animal par injection/gavage - Pesée (toutes les semaines pour tous les animaux; durée moins d'une minute par pesée - Prélèvement sanguin (200µl une fois par mois pour tous les animaux) ; durée d'environ 5 minutes de manipulation (dilatation de la queue puis incision etrécupération, coagulation par pensement coagulant) par animal par injection - Collecte d’urine (tous les mois pour tous les animaux) sur animal vigile; durée moins d'une minute par anaimal - Imagerie µCT sur animal anesthésié (5 par groupe), durée d'environ 7 minute par animal.
Impact sur les animaux
Le phénotype âgé est un phénotype dommageable car il peut induire l’apparition de nombreuses maladies. Entre 18 et 24 mois nous nous attendons à avoir 20% de perte d’animaux par mort « naturelle ». Une feuille de score adaptée au vieillissement sera faite pour suivre le bien-être des animaux. On notera que les souris seront systématiquement pesées chaque semaine. Une baisse de 15% du poids de la souris par rapport à la précédente pesée conduira à sa mise à mort.
Devenir
Pour les 2 procédures, nous voulons déterminer l’état physiologique de l’animal et sa durée de vie. Pour cela, nous devons analyser sa survie globale sans souffrance et mettre à mort tous les animaux qui ne seraient pas décédés de causes naturelles pour pouvoir prélever les organes et les analyser en histologie, cytométrie et RNAseq mais aussi de tester les capacités fonctionnelles des cellules ex vivo. L’analyse concernant les tissus ne peut se faire autrement que ex vivo. La mise à mort de l’animal est donc nécessaire afin de pouvoir prélever les organes. Un maximum de tissus seront récupérés afin que de tirer le plus d’information possible de cette expérience. Ainsi, l’objectif scientifique de ce projet nécessite la mise à mort (ou la mort naturelle) de tous les animaux.
Remplacement
La sénescence et le système immunitaire étant un processus intégré impliquant une communication intra- et inter- cellulaire et tissulaire, ce projet nécessite une étude à l’échelle de l’organisme entier. Notre projet vise à étudier les mécanismes biologiques à l’origine du vieillissement et en particulier à l’origine du vieillissement pathologique. Nous voulons comprendre comment un organisme peut vieillir et déterminer si de nouvelles stratégies thérapeutiques peut empêcher le vieillissement pathologique et l’incidence de nombreuses maladies liées à l’âge. Ces mécanismes reposent sur de nombreuses interactions entre différentes cellules telles que les cellules âgées dites « sénescentes » ou les cellules immunitaires mais également sur la communication entre différents organes. À la vue de la complexité des mécanismes étudiés aucun modèle in vitro ou synthétique ne peut mimer le niveau de complexité de ces interactions ni remplacer l’étude sur l’animal. Seul l’analyse au niveau d’un organisme vivant pourra nous permettre de déterminer si le ciblage des cellules sénescentes par notre anticorps permet de limiter la présence des cellules sénescentes dans les tissus, d’évaluer l’état d’activation du système immunitaire, les conséquences sur l’incidence de maladies liées à l’âge, l’effet sur la longévité et sur l’espérance de vie en bonne santé. En revanche, lorsque les mécanismes principaux seront identifiés, leur étude mécanistique sera réalisée le plus possible par des méthodes de remplacement en réalisant des expériences in vitro de coculture.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs avec le nombre minimum de souris pour les 2 approches expérimentales (longévité globale et vieillissement en bonne santé). L’ensemble du projet a donc été conçu pour REDUIRE au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en conservant une puissance statistique robuste. Pour cela nous avons utilisé 3 approches complémentaires. - Tout d’abord une analyse complète des données de la littérature sur les agents sénolytiques pour connaitre la taille des effets biologiques et connaitre les nombres d’animaux et les effets statistiques déjà observés. - Ensuite, nous avons choisi de coupler nos analyses avec un suivi longitudinal des animaux par utilisation de l’imagerie par scanner (microCT ; technique équivalente au PET-Scan utilisé en clinique pour l’évaluation de la fibrose chez l’homme mais adaptée au petit animal). Ceci a pour effet de réduire drastiquement le nombre d’animaux en procédant à un suivi individualisé de chaque souris. - Nous avons « croisés » les contrôles pour les 2 procédures. Ainsi, le groupe contrôle recevra 6 IP d’anticorps isotype contrôle et 6 gavages contrôles, le groupe expérimental D+Q recevra 6 gavages de D+Q et 6 IP d’isotype contrôle et enfin le groupe anti ganglioside recevra les 6 IP d’anticorps anti ganglioside et 6 gavages contrôles. Ceci est exactement identique pour les 2 procédures. Cette stratégie a permis de supprimer complètement un groupe contrôle et donc de réduire le nombre d’animaux utilisé. - Nous réaliserons les 2 procédures en parallèle puisque les animaux sont issus du même lot chez le fournisseur et seront stabulés initialement et traités exactement de façon identique. Ceci permettra de comparer les résultats entre les 2 procédures, d’utiliser les mêmes animaux contrôles de 18 mois (les 15 animaux t0) et donc de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés en évitant de reproduire des contrôles inutilement. - Enfin, nous avons calculé précisément la grandeur de l’effectif nécessaire pour notre étude grâce au logiciel Gpower avec un test ANOVA oneway de puissance statistique de 0.8 associé à un effet taille moyen calculé sur les données déjà publiées d’effet de sénolytique (0.5) pour p≤0.05.
Raffinement
Les procédures de ce projet comprennent les éléments de raffinement suivants : Suivi quotidien des animaux, à l’aide d’une fiche de suivi appuyée par une grille de score clinique comprenant des points limites précoces et adaptés. Les animaux sont hébergés dans des pièces spécifiquement dédiées aux expériences sur le vieillissement permettant d'exercer un suivi plus précis et de limiter le stress et les risques de contamination en réduisant le passage dans ces zones. La conservation d’une cohésion sociale durant la durée de vie de l’animal. L’ajout d’éléments supplémentaire d’enrichissements incluant des maisons à ronger et des twists pour modifier la nidification en complément de l’enrichissement standard incluant des maisons rouges solides et des cotons carrés. Les animaux seront manipulés régulièrement par les mêmes expérimentateurs afin de les habituer et de limiter le stress lors des procédures. Les protocoles d’imagerie non invasive permettant un suivi longitudinal sont menés sous anesthésie gazeuse. L'ensemble de ces mesures de raffinement visent à assurer le bien-être des animaux et assurer des résultats scientifiques de qualité pour éviter toute reproduction expérimentale inutile.
Choix des espèces
Le modèle murin est un modèle de choix avec une physiologie proche de l’homme (squelette osseux, poumons) et un cycle de vie relativement court (animal âgé à 18 mois). Chez la souris, les mécanismes de réparation et de dérégulation de la physiologie des tissus sont très bien décrits. Ils permettent une analyse précise de l'ensemble des phases mises en jeu au cours de ces évènements biologiques. Le modèle murin choisi est le seul nous permettant une approche intégrative des processus impliqués dans les maladies liées à l’âge. En effet, il permet d’étudier de façon concomitante les cellules immunitaires, les cellules sénescentes, l’avancement des maladies et l’expression du ganglioside. La physiopathologie des tissus est considérée suffisamment proche de celle de l’homme pour en tirer des données exploitables. La souris est le seul modèle accessible pour ce genre d’étude afin de répondre au questionnement scientifique de ce projet. Des souris âgées de 18 mois au début des expérimentations seront utilisées. Voulant étudier un large panel de maladies liées à l’âge et à la sénescence, le modèle le plus pertinent est donc d’utiliser des souris en vieillissement, soit ici 18 mois d’âge équivalent à 60 ans chez l’Homme. Les deux procédures décrites ici utiliseront donc des animaux au même stade de développement. Les données de la littérature montrent que certains phénotypes liés à l’âge émergent à partir de 12 mois mais que leur incidence est significativement plus élevée à partir de 18 mois. Pour analyser les capacités thérapeutiques de l’anticorps anti ganglioside et les conséquences de celui-ci sur l’émergence de ces maladies liées à l’âge et la longévité des animaux, nous allons utiliser donc des souris adultes âgées de 18 mois. Ceci nous permettra d’étudier comment le traitement fonctionne dans un organisme déjà vieillissant. D’autre part, en démarrant l’étude avec des animaux issus des mêmes croisements et directement âgés, en provenance du même fournisseur et avec un statut sanitaire SOPF très contrôlé, nous limiterons les effets de variabilité expérimentale.
Rôle des anticorps IgG dirigés contre des bactéries commensales dans un modèle animal de colite (rat HLA-B27)
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
373 rats transgéniques HLA-B27 vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Ils développent une colite spontanée et reçoivent des injections puis des prélèvements sanguins sous anesthésie tous les quinze jours, pour étudier le rôle d'anticorps dirigés contre le microbiote dans les maladies inflammatoires de l'intestin. Le porteur indique que ces rats développent aussi arthrite et uvéites, sans prévoir de surveillance spécifique de ces atteintes. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit ces maladies.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) regroupent 2 entités la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique dont l’étiologie et la physiopathologie restent mal connues. L’inflammation intestinale chronique serait le résultat d’une réponse immunitaire aberrante, dirigée contre des antigènes du microbiote intestinale, et survenant chez des individus génétiquement susceptibles. Parmi les anticorps couramment associés au développement des MICI ont été identifiés les anticorps anti oligomannane de Saccharomyces cerevisae (ASCA), les anti-flagelline (anti C-bir1), les anti-porine C d’Escherichia coli (anti-OmpC). A l’heure actuelle, ces anticorps sont considérés par les cliniciens comme de simples marqueurs biologiques. Toutefois des avancées récentes tendent à montrer qu’il existerait des interactions complexes entre la réponse immunoglobuline (Ig) G et le développement ou l’évolution des lésions intestinales dans les MICI. Les objectifs principaux de ce travail de recherche seront dans un premier temps d’étudier la présence, la nature et le rôle de la réponse humorale chez le rat HLA-B27, modèle classique de colite expérimentale puis dans un second temps de déterminer si la réponse humorale dirigée contre un antigène donné du microbiote a un rôle bénéfique, délétère ou neutre dans le développement et la progression des lésions de colite dans notre modèle de rat HLA-B27. Enfin, il sera essentiel de déterminer la participation de la réponse humorale dans l’évolution naturelle de la colite de nos animaux grâce à l’injection d’immunoglobulines polyvalentes qui rentreront en compétition avec les immunoglobulines des rats. Nous étudierons l’effet préventif et curatif de ces IVIG.
Bénéfices attendus
Ce modèle animal adapté à l’exploration des IgG spécifiques du microbiote est intéressant pour éclairer le mécanisme pathologique à l’œuvre dans les MICI humaines et éventuellement permettre d’aboutir à des thérapeutiques modulant la production ou l’action de ces anticorps.
Procédures
Procédure 1 : Les 320 rats recevront 3 injections de 300µl de composés (150µg/ml en NaCl 9‰) ou NaCl 9‰ (groupe contrôle) en intra-péritonéale à 5 ,7 et 9 semaines de vie (durée de l'injection 10 sec) . Ces injections se feront sur animaux vigiles. Ces mêmes animaux sous anesthésie générale auront tous les 15 jours, de la semaine 5 à 24, un prélèvement sanguin (durée de l'anesthésie 5 min). Une endoscopie sous anesthésie générale pendant 20 minutes pourra être réalisée à semaine 16 et 20 de vie. Procédure 2: Les 10 rats de l'expérience préliminaire recevront sous anesthésie de 5 minutes une série de 5 injections dans la veine caudale d'immunoglobulines polyvalentes (400mg/kg/ jour pendant 5 jours) à 6 semaines de vie puis ils auront tous les 15 jours jusqu'à 18 semaines de vie un prélèvement sanguin toujours sous anesthésie de 5 minutes. Pour la procédure dite préventive, les 24 rats recevront sous anesthésie (5 minutes) deux série d'injections intra-veineuses d'IVIG (400mg/kg/ jour pendant 5 jours) ou NaCl 9‰ à 6 et X semaines de vie (X déterminé par l'expérience préliminaire). A partir de la 6ème semaine, un prélèvement sanguin quinzomadaire aura lieu sous anesthésie générale de 5 minutes. Pour la procédure dite curative, 24 rats recevront sous anesthésie (5minutes) une série de 5 injections intra-veineuse d'IVIG (400mg/kg/ jour pendant 5 jours) ou NaCl 9‰ à 12 semaines de vie . A partir de la 12 ème semaine, un prélèvement sanguin quinzomadaire aura lieu sous anesthésie générale de 5minutes jusqu'au sacrifice à 24 semaines.
Impact sur les animaux
L'immunisation par des antigènes bactériens pourrait engendrer une colite plus sévère et donc une perte de poids plus importante ou anticipée chez ces rats. Des points limites veilleront à surveiller cette éventualité. De plus, les rats HLA-B27 développent d'autres pathologies inflammatoires telles l'arthrite, les uvéites. Dans notre animalerie et sur le fond génétique Fischer F344, ces pathologies se développent a minima. Aucune surveillance ou prévention spécifique (mesure épaisseur articulations)n'est donc prévue. Cependant, les animaux sont observés quotidiennement et si les points limites (identiques à ceux de la colite) sont atteints, les animaux seront euthanasiés. Dans le cas où il y aurait difficulté à s'alimenter, des croquettes et de l'eau gélifiée seraient disposés dans la cage afin d'en faciliter l'accès.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront sacrifiés et différents organes seront prélevés pour étudier la réponse immune muqueuse, et l'état inflammatoire de nos rats.
Remplacement
Il est nécessaire de travailler in vivo pour reproduire la physiopathologie complexe des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin: les interactions entre le microbiote, la barrière intestinale et le système immunitaire sont indispensables pour étudier la réponse humorale envers les bactéries commensales. Il n'existe pas d'autres méthodes capables de reproduire in vitro ce processus physiopathologique.
Réduction
Le nombre d'animaux prévu par groupe est de n=8 sur la base de la puissance statistique des tests utilisés (intégrant la dispersion des valeurs individuelles, déterminés auprès de la littérature et suite à des expériences pilotes). Les paramètres mesurés seront analysés par des tests non paramétriques pour petits échantillons (tests de Kruskal et Wallis, Wilcoxon Mann Whitney, corrélation de Spearman). Pour la deuxième procédure, une expérience préliminaire nous permettra de déterminer le meilleur timing d'injection afin de pouvoir analyser les données générées dans de bonnes conditions.
Raffinement
Les rats sont élevés sur place donc pas de transport et de changement d'environnement, uniquement changement de portoirs. Procédures classiques: minimum de bruits, enrichissement des cages et respect du nombre d'animaux par cages, manipulation calme et douce. Les animaux en phase expérimentale seront observés quotidiennement et pesés de façon bi-hebdomadaire avec une attention particulière aux points limites suivants: modifications du comportement (poils hérissés, prostration, cris, blessures) et perte de poids supérieure à 15%.
Choix des espèces
Le rat transgénique HLA-B27 est utilisé comme modèle expérimental de maladies inflammatoires dont les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. Le modèle de colite spontanée chez ce rat s'inscrit dans le cadre d'une maladie systémique comme chez l'homme. Pour les 2 procédures, les animaux utilisés auront de 6 à 24 semaines de vie pour un suivi longitudinal de la réponse humorale.
Évaluation du potentiel thérapeutique de la greffe de cellules souches hématopoïétiques modifiées génétiquement dans la maladie d’Alzheimer.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
385 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont affaiblies par quatre jours de Busulfan qui peut entraîner infections et perte de poids, reçoivent une greffe de cellules souches par injection derrière l'œil, puis passent des tests de mémoire nommés (piscine de Morris, labyrinthe en croix surélevé, open field). Le porteur évalue une thérapie cellulaire contre la maladie d'Alzheimer, dont il présente le bénéfice pour l'humain au conditionnel. Il justifie le modèle murin par l'absence de modèle in vitro reproduisant la perte de mémoire.
Objectifs
Notre objectif est de développer une nouvelle approche thérapeutique dans la maladie d'alzheimer (MA) visant à surexprimer deux protéines du métabolisme du cholesterol, en utilisant comme véhicule des cellules souches hématopoïétiques (CSH) de souris. Ces cellules peuvent en effet être génétiquement modifiées ex vivo par un vecteur lentiviral pour exprimer un gène thérapeutique. Elles peuvent être ensuite réinjectées chez l’animal (modèle de la MA), après un traitement qui détruit les CSH de la moelle. Les cellules ainsi injectées reconstitueront le système hématopoïétique des animaux hôtes et après passage de la barrière hématoencéphalique, pourront se différencier localement pour exprimer nos protéines d'intêrets. Ce projet a pour but d’évaluer le potentiel thérapeutique de cette approche dans le but de diminuer la pathologie liée à l’accumulation de l’amyloïde Beta.
Bénéfices attendus
Le projet permettrait de mieux caractériser les rôles des protéines d'intérêts dans la maladie d’Alzheimer. Si cette étude apporte des résultats encourageants, les bénéfices seraient de développer une approche thérapeutique potentielle permettant de traiter la MA chez l'humain. Cette approche permettrait une administration par voie intraveineuse de macrophages/monocytes purifiés et génétiquement modifiés obtenus à partir des CSH des patients eux-mêmes au lieu d'une greffe de CSH (qui est une technique invasive). Ces cellules élimineraient les protéines toxiques qui causent les symptômes de la maladie.
Procédures
Les animaux seront immunodéprimés par injection de Busulfan pendant 4 jours (l'injection dure 10 secondes par souris) puis recevront une greffe de cellules souches génétiquement modifiées par injection rétro-orbitale le jour d'après la dernière injection de Busulfan (l'injection dure moins de 2 min par souris, réalisée sous anesthésie gazeuse). Deux semaine après la greffe, une partie des animaux seront nourris avec de la nourriture spéciale (appelée PLX5622) permettant de dépleter la microglie du système nerveux central pendant 28 jours. Des prélèvements sanguins seront réalisés (1 fois par mois maximum avec un volume prélevé de 150 uL maximum et seulement si les souris pèsent plus de 20g, le prélèvement dure 2 min maximum par souris) sous anesthésie gazeuse pour vérifier la bonne prise de la greffe. Le premier prélèvement sera réalisé 2 mois après la greffe. Des tests comportementaux seront réalisés sur un des modèles murins de la maladie d'Alzheimer. Les tests commenceront 1 semaine après le prélèvement sanguin et s'étaleront sur 2 semaines. Pour la piscine de Morris, chaque essai dure maximum 1 min et chaque animal a 3 essai par jour pendant 5 jours. Le labyrinthe en croix surélevé et l'openfield durent 10 min chacun par souris et un seul essai est réalisé. L'euthanasie sera réalisée après les tests comportements, entre 6 et 7 mois d'âge.
Impact sur les animaux
Le conditionnement pré-greffe par injection de Busulfan 4 jours de suite affaibli les souris (perte de poids) et peut entrainer des infections. L’injection IV se fait dans le sinus rétro-orbitale se trouvant à l’arrière de l’œil. L’aiguille est donc insérée à côté de l’œil et l’œil n’a aucun dommage après l’injection (une lésion oculaire est possible mais rare). L’injection dure moins d’une minute. Nous avons préféré réaliser des injections rétro orbitale au lieu d’injection dans la veine caudale car cette dernière méthode est plus stressante que l’injection rétro orbitale (placement sous une lampe chauffante pour dilater la veine, contention mécanique). Les croquettes spécifiques n’entrainent aucun effet indésirable. Lors des prélèvements sanguins, les souris peuvent perdre beaucoup de sang. Les tests comportementaux peuvent être stressants et angoissants pour les animaux.
Devenir
A l'issue de nos deux procédures, les animaux sont euthanasiés pour récuperer les tissus post mortem pour réaliser des analyses histologiques et biochimiques.
Remplacement
Nous souhaitons utiliser un modèle animal (souris) car aucun modèle in vitro ou de culture cellulaire ne permet aujourd’hui d’étudier les symptômes de perte de mémoire typiques de cette maladie ainsi que la complexité des mécanismes neuronaux. De plus, la souris est un modèle d'alzheimer bien caractérisé tant d’un point de vue comportemental que biologique (marqueurs histologiques ou moléculaires) pour évaluer le bénéfice thérapeutique associé à notre approche. Pour ce faire, nous utiliserons au maximum 4 modèles de d'alzheimer déjà décrits.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques fiables. En effet, des travaux précédents ont permis de montrer que l’étude de groupes de 15 animaux par groupe permettait d’obtenir des résultats statistiquement significatifs en comportement, ainsi que dans les analyses biochimiques et de biologie moléculaire, réalisées sur de petits échantillons (1 hippocampe / souris). De plus, ce nombre d’animaux prend en compte la mortalité spontanée, ayant cours du fait du phénotype, particulièrement chez les APP/PS1 De9 (perte d’environ 10% dans un groupe APP/PS1 De9 non traité), et de l’âge des souris. Ainsi, dans ce projet, nous prévoyons un total de 385 souris. Des tests statistiques seront ensuite réalisés sur les résultats obtenus pour avoir une interprétation fiable de ces résultats.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation (annexe III de la directive 2010/63/EU), les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (avec mise au point de points limites) et des soins adaptés si besoin. Les animaux sont hébergés en groupe avec un coton pour faire un nid dans chaque cage. Les animaux sont hébergés en groupe de 5 dans des cages ventilées. Les animaux sont examinés quotidiennement par les expérimentateurs et par le personnel de l'animalerie. Si nécessaire et en cas d'agressivité des mâles, les animaux seront séparés. Tous signes d’inconfort ou de détresse, tels que l'apparence (poil ébouriffé, dos courbé, perte excessive de poils) et un comportement anormal (agressivité soudaine, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit), feront l’objet d’une surveillance accrue et d’un isolement en cas de besoin. Les critères absolus (état de choc, léthargie, inconscience, immobilité, forte hypothermie, difficultés respiratoires) entraîneront l’euthanasie. Toutefois, les critères absolus ne devraient pas être mis en évidence aux vues des procédures utilisées. Pour les chirurgies, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale et en prévention de la douleur un antidouleur sera administrer. Une nouvelle injection sera administrée à l’animal le lendemain matin. Un gel ophtalmologique est appliqué sur les yeux des animaux pour éviter l’assèchement de la cornée durant l'anesthésie. Les animaux ayant subi une chirurgie seront observés quotidiennement la semaine suivant la chirurgie avec une attention particulière.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et la génétique sont bien connues et sont relativement proches de celles de l’Homme. De plus, les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. La nécessité d'utiliser des souris transgéniques est liée à l'absence de tout mutant spontané dans une espèce de mammifères qui correspond à la maladie humaine. Nous avons prévu d’utiliser au maximum 4 modèles animaux de la MA ayant tous des avantages à leur utilisation afin de valider notre approche thérapeutique dans ces modèles. Pour les souris APP/PS1 : jeunes adultes de 2 mois pour réaliser la greffe avant l’apparition du phénotype (plaques Ab). Pour les souris THY-Tau22 : jeunes adultes de 2 mois pour réaliser la greffe avant l’apparition du phénotype (protéines Tau). Pour les souris APP23 : jeunes adultes de 2 mois pour réaliser la greffe avant l’apparition des symptômes cognitifs.
Etude des effets combinés de différentes molécules dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie inocule un peptide amyloïde dans leur cerveau pour provoquer une perte de mémoire, puis elles reçoivent un traitement combiné et passent des tests comportementaux, dont un test d'évitement où elles subissent un choc électrique. Le porteur vise une combinaison de molécules contre la maladie d'Alzheimer, à tester ensuite chez l'humain. Il présente le modèle murin comme "indispensable", seul recours in vivo reproduisant les symptômes.
Objectifs
Trouver un traitement contre la maladie d’Alzheimer (MA) est aujourd’hui une priorité. Cependant la MA étant une maladie multi-cible les chercheurs s’accordent à dire qu’un seul traitement ciblant une des nombreuses cibles de la MA ne sera pas suffisant et qu’une combinaison de plusieurs molécules serait plus efficace afin d’obtenir un effet thérapeutique. La combinaison de la mémantine ainsi que du Donepezil reste aujourd’hui un des traitements utilisés chez les patients atteints de la MA et ce malgré une efficacité remise en doute depuis plusieurs années par la communauté scientifique. Il est donc primordial de tester d’autres molécules de manière combinée sur un modèle de la MA afin de pouvoir un jour procéder au développement clinique d’un traitement combinatoire.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de mettre en avant un effet combinatoire de diverses molécules afin de contrer les symptômes de la maladie d'Alzheimer. Les combinaisons efficaces testées sur le modèle murin auront pour but finale d'être testé en clinique chez l'homme.
Procédures
Les animaux auront au cours de leur vie une chirurgie permettant l'inoculation du peptide amyloide 25-35 dans le ventricule cérébral droit. Cette intervention est d'une durée de 7 minutes maximun entre le début de l'anesthésie à l'isoflurane et la fin de l'innoculation du peptide amyloide. Ensuite durant 7 jours les animaux recevront une injection intrapéritonéale du traitement combinatoire mis en place. Suite à ce traitement les performances mnésiques des animaux seront testées, avec des tests comportementaux.
Impact sur les animaux
Un certain stress lié à la procédure chirurgicale et aux injections pourra être engendré. Une perte mnésique voulu, et dû à la diffusion du peptide amyloide dans le cerveau sera également observé. Durant le test comportemental d'évitement passif, les animaux recevront un choc électrique léger, (0.3 mA pendant 3 sec) afin d'évaluer leur performance mnésique.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de récupérer le cerveau et procéder à des tests biochimiques post- mortem.
Remplacement
L’utilisation de modèles murins de la MA pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques de la MA dans une fenêtre de temps relativement courte.
Réduction
Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe (12 souris/groupe). Une veille bibliographique sera également prise en compte durant les 5 années du projet. Plusieurs structures du cerveau seront prélevées dans cette étude afin de concentrer un maximum d’échantillons et éviter ainsi de relancer des expérimentations.
Raffinement
Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des maisons en cartons et des carés de cotons afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Dans le cas où le traitement pharmacologique serait à l’origine de douleur visible ou de détresse le traitement serait interrompu et si nécessaire la mise à mort de l’animal serait anticipée. Ce sera le cas lorsque l'animal perdra 20% de son poids de départ ou lorsque celui-ci présentera des lésions cutanées signe d’un stress ou d'une agressivité vis à vis de ses congénères. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur
Choix des espèces
Afin de mimer rapidement les symptômes de la maladie d'Alzheimer en vue d'un traitement curatif, la souris reste à ce jours le modèle se rapprochant au plus près de l'homme. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte soit à partir de 6 semaines.
Utilisation de la souris pour l’évaluation de la gonadotoxicité d’une combinaison de chimiothérapies chez la femme atteinte de cancer du sein
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
Des souris femelles de six semaines, juste après la puberté, reçoivent une injection unique, de solution saline pour les témoins, ou de trois chimiothérapies combinées du cancer du sein (Epi/Cy/5-FU) pour les autres. 154 souris vont être utilisées, toutes tuées à plusieurs délais après le traitement pour examiner l'atteinte de leurs ovaires, dans des procédures que le porteur classe à un niveau de souffrance léger. Chaque molécule a déjà été étudiée seule chez la souris, et le porteur indique que leur association pourrait entraîner une toxicité cardiaque ou intestinale, "Bien que cela n'ait jamais été évalué". Le résumé ne donne ni les délais de mise à mort, ni le calcul de l'effectif, réduit à une "réflexion biostatistique", ni le contenu des points limites qu'il dit "adaptés".
Objectifs
Le dépistage précoce des cancers et les progrès de leurs traitements ont considérablement augmenté les taux de survie des jeunes patientes. Cependant la fertilité après la guérison est souvent très affectée. La préservation de la fertilité est donc un enjeu majeur dans la prise en charge de ces patientes. Dans l’ovaire de la femme, le stock des cellules de la reproduction est fixé tôt au cours de la vie et ne cesse de décroître jusqu’à la ménopause. Les effets de la chimiothérapie conduisent à une réduction drastique de ce stock, ce qui se traduit par une infertilité. Dans le cadre du cancer du sein, les patientes reçoivent habituellement une combinaison de plusieurs chimiothérapies. Les médicaments les plus couramment utilisés dans le cadre du cancer du sein sont au nombre de trois et sont administrés en même temps chez les femmes. Chaque médicament exerce, en plus de son action anti-cancéreuse, un effet néfaste sur les ovaires. Ces effets ont été étudiés, pour chaque médicament de manière indépendante, dans des modèles de souris mais l’effet toxique sur les ovaires de la combinaison de ces 3 médicaments, n’a jamais été étudié. Ce projet vise à explorer l’effet de cette association de trois chimiothérapies sur l’ovaire de souris. Nous utiliserons la souris comme modèle d’étude car l’expérimentation est impossible chez la femme. L’impact sur le stock de cellules de la reproduction sera étudié ainsi que les mécanismes par lesquels ces médicaments agissent pour le détruire. Les animaux recevront une seule injection soit d’une solution saline en guise de contrôle, soit d’un volume égal contenant la combinaison des trois médicaments. Les souris seront euthanasiées différents temps après le traitement et l’impact de la chimiothérapie combinée sur les ovaires sera évalué.
Bénéfices attendus
L’amélioration de la compréhension des mécanismes impliqués dans la gonadotoxicité de la chimiothérapie permettra l’identification de molécules limitant l’impact négatif de ce traitement sur les ovaires. Les résultats de ce travail sont une étape essentielle avant de tester des traitements spécifiques pour prévenir la gonadotoxicité des chimiothérapies combinées habituellement utilisées dans le cancer du sein.
Procédures
Une injection de moins de 5 secondes
Impact sur les animaux
Les différentes drogues ont été testées individuellement sur des souris et n'ont pas provoqué d'effet indésirable notable. Bien que cela n’ait jamais été évalué, il est possible que la chimiothérapie combinée (Epi/Cy/5-FU) induise une certaine toxicité cardiaque et/ou intestinale chez les animaux.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés
Remplacement
L’ovaire est un système complexe composé de cellules de la reproduction et d’autres cellules qui communiquent entre elles. L’étude de l’effet de l’administration d’une combinaison de chimiothérapies sur les cellules de la reproduction ne peut être réalisée que sur un organisme vivant. Il n’existe pas de modèle cellulaire qui permettent de reproduire ce qui se passe dans l’ovaire. Des modèles de culture d’ovaire entier ont été testés lors d’études préliminaires, mais le tissu ovarien après culture ne permet pas d’évaluer le nombre de cellules de la reproduction ni leur croissance. Ces données n'ont jamais été publiées. Il n’existe donc pas de modèle in vitro reproduisant la structure et la physiologie ovarienne permettant de récapituler les mécanismes induits par la chimiothérapie. L’objectif final de ce projet est de trouver une nouvelle thérapie pour limiter l'impact de la chimiothérapie sur les ovaires chez la femme atteinte de cancer. Pour cela, nous devons tout d’abord déterminer le mécanisme de toxicité de la combinaison de chimiothérapie sur l’ovaire ce qui nécessite de réaliser des expériences in vivo chez la souris.
Réduction
Nous limiterons le nombre d’expériences et de souris. Il est essentiel d'utiliser le plus petit nombre d'animaux possible sans nuire à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a été intégrée à la construction du projet
Raffinement
Les souris sont hébergées dans une pièce avec un cycle 12 h jour/12 h nuit en présence d'enrichissement dans la cage. La température est maintenue à 22°C, l'accès à la nourriture et à l'eau est libre. Chaque jour, l'état des animaux est contrôlé par les personnes en charge de l’étude et/ou le personnel de l'animalerie. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
La souris est un animal dont les étapes de la physiologie ovarienne sont bien établies. Les souris femelles seront utilisées à 6 semaines juste après la puberté pour avoir une réserve ovarienne importante et des follicules en croissance.
Impact des macrophages sur la matrice extracellulaire tumorale et la réponse immunitaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
564 souris, dont des souris génétiquement modifiées, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses post-mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont greffées sous la peau du flanc sans anesthésie, puis elles reçoivent sous anesthésie de moins de cinq minutes une à trois injections d'un agent que le porteur dit "non douloureux". Selon les groupes, leurs macrophages sont éliminés, ce qui peut provoquer diarrhées, déshydratation et perte de poids pendant six jours dans l'un des protocoles, et une nécrose peut apparaître sur la tumeur en fin d'expérience. Le porteur écrit avoir "besoin impérativement" d'expériences in vivo, et prévoit que certaines n'auront lieu que si les premières donnent des "résultats intéressants", ce qui fait de l'effectif de 564 un plafond.
Objectifs
Au cours de la tumorigénèse, la matrice extracellulaire, qui constitue l’architecture de tout tissu, est profondément modifiée, contribuant à la progression tumorale en limitant l’accès des cellules immunitaires à l’intérieur de la tumeur, et en favorisant les métastases. Les macrophages sont des cellules immunitaires qui peuvent avoir des effets pro- ou anti-tumoraux, et sont capables de modifier la matrice extracellulaire. Notre projet étudie dans un premier temps le rôle des macrophages dans la modification de la matrice tumorale, pour évaluer, à terme, leurs effets sur la réponse immunitaire naturelle et sous immunothérapie. En particulier, notre projet vise à comprendre comment les propriétés physiques de la matrice influencent l’infiltration des cellules immunitaires, et le rôle que jouent les macrophages dans ce processus.
Bénéfices attendus
Ce projet va contribuer à une meilleure compréhension du dialogue entre cellules tumorales, cellules immunitaires et matrice extracellulaire, 3 acteurs centraux de la tumorigénèse. Les modèles expérimentaux choisis permettront d’obtenir des connaissances fondamentales sur les tumeurs solides et la réponse immunitaire contre celles-ci. Ce projet pourrait permettre à terme d’améliorer les stratégies d’immunothérapies par anticorps ou cellules CAR-T.
Procédures
1-Greffe de cellules tumorales en sous cutanée : 1 seule fois par animal, sur animal vigile, puis injections d’un agent non douloureux par voie intra-péritonéale sous anesthésie. 3 injections par animal (durée de l'anesthésie inférieure à 5 min) 2- Greffe de cellules tumorales en sous cutanée : 1 seule fois par animal, sur animal vigile, puis injection d’un agent non douloureux par voie intraveineuse sur animal anesthésié. 1 injection par animal (durée de l’anesthésie inférieure à 5 minutes)
Impact sur les animaux
Nous injectons au niveau du flanc des souris des tumeurs sous-cutanées plus ou moins résistantes aux immunothérapies, puis déplétons ou non les macrophages. L’expérience dure entre 9 et 15 jours. Nos observations se font à des temps précoces de la tumorigénèse, la taille de la tumeur reste modérée et ne gêne pas les déplacements de l’animal. Une nécrose peut apparaitre sur la tumeur en fin d’expérience. Le traitement pour la déplétion des macrophages peut provoquer des diarrhées et une déshydratation, pouvant entrainer une perte de poids pendant la durée de la déplétion dans un des modèles (6 jours)
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Des études in vitro ont montré l’importance de la matrice extracellulaire dans la tumorigénèse. Afin d’évaluer l’effet des macrophages et de la matrice extracellulaire sur la réponse immunitaire, nous avons besoin impérativement de réaliser des expériences in vivo pour avoir une tumeur, un stroma et un système immunitaire complets.
Réduction
Chaque tumeur sera coupée en 2 échantillons afin de réaliser plusieurs analyses sur la même tumeur pour permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cela permet également de corréler les résultats des différentes analyses pour chaque tumeur et de pouvoir mieux analyser les raisons potentielles d’hétérogénéité inter-souris. Par ailleurs, certaines expériences ne seront réalisées que si les expériences précédentes donnent des résultats intéressants (différences de matrice extracellulaire et / ou d’infiltrat immunitaire).
Raffinement
En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, les animaux sont suivis attentivement (mesure de la tumeur, poids, aspect et comportement) afin de détecter tout signe de souffrance ou d’angoisse, et d’assurer leur bien-être, et les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux. Les animaux seront sacrifiés en cas d’atteinte des points limites. Du gel nutritif et hydratant sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire, et limiter la perte de poids et la déshydratation qui peuvent être causés par les traitements pour la déplétion des macrophages. En cas de déshydratation, une réhydratation parentérale sera réalisée. En cas d’inflammation cutanée ou de nécrose superficielle des tumeurs, de la crème hydratante et cicatrisante sera appliquée.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en immunologie et recherche en thérapeutique anti-cancéreuse. La forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins en font un modèle idéal. Par ailleurs, nous utilisons des modèles murins génétiquement modifiés déjà développés et bien caractérisés qui sont les plus adaptés à ce projet. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, afin d’avoir un système immunitaire adulte.
Développement d’une biothérapie pour un groupe de maladies rares : Aggrecanopathies (2022-I-005)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
15 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'anomalies squelettiques qui se dégradent avec l'âge au point de gêner leur alimentation, elles reçoivent des injections et jusqu'à six prélèvements sanguins avant l'analyse de leurs organes, pour évaluer une biothérapie contre un groupe de maladies rares des os. Le porteur qualifie lui-même le bénéfice pour les patients d'"éventuel à long terme". Il conclut que le recours au modèle murin est "inévitable".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de développer un nouveau traitement pour une famille de maladie des os. En effet, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif pour ce groupe de maladie. Les seules approches thérapeutiques actuellement utilisées sont des approches palliatives et seulement pour certains symptômes de la maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet va nous permettre d'évaluer un traitement pour cette famille de maladie. Il s’agit d’un groupe de maladies rares sévère pour laquelle à l’heure actuelle il n’existe aucune approche thérapeutique. Dans le cas où cette approche fonctionnerait cela nous permettrait de continuer le développement dans le but d’apporter un jour un traitement efficace pour les patients. Il s’agit donc d’un bénéfice éventuel à long terme pour ces patients.
Procédures
Les animaux sont soumis à des injections de traitement (30 secondes), ainsi que des prélevements de sangs (5 minutes). Les prélèvements de sang sont sur animal anesthésié et un animal aura maximum de 6 prélèvements dans sa vie. Les animaux auront également une biopsie d'oreille pour déterminer s'ils sont porteurs de la maladie (20 secondes).
Impact sur les animaux
Le modèle de souris utilisé dans ce projet présente des anomalies squelettiques qui se dégradent avec le temps et les empêchent de s’alimenter normalement lorsque les animaux sont âgés (environ 12 mois). Ces altérations sont caractéristiques de la maladie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés. En effet, le projet nécessite d'étudier la structure des organes afin de vérifier l'efficacité du traitement testé et cela ne peut se faire que sur animal euthanasiés.
Remplacement
Globalement, la construction des traitements et l’optimisation de ces derniers se sont faites et continuent à se faire en se basant sur des publications scientifiques, et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés. Les différents vecteurs viraux produits sont précédemment testés in vitro afin de valider leur efficacité. Une importante recherche bibliographique a été effectuée afin d’identifier les cellules atteintes lors de la pathologie et ainsi développer un traitement le plus ciblé possible. Cependant l’utilisation du modèle murin de la maladie est inévitable afin de déterminer le bénéfice thérapeutique ainsi que d’évaluer les potentiels effets toxiques du traitement.
Réduction
Le juste nombre d’animaux a été calculé de manière à réduire le nombre minimum d’animaux par lot, tout en produisant des résultats statistiquement significatifs et robustes. De manière à répondre aux exigences de réduction, nous allons utiliser des groupes contrôles en commun chaque fois que cela est possible. Globalement, un ensemble de 10-12 animaux par groupe sera suffisant pour valider l’efficacité d’un traitement. Ce modèle étant un nouveau modèle de souris, il est possible que ce nombre soit amené à changer au cours des études et des différents résultats obtenus.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe à maximum 5 par cage. Chaque cage contient une tige en papier, un igloo et une buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les malocclusions des incisives. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima trois fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et mis à mort dans les 24 heures avec l’accord du directeur d’étude et/ou d’un vétérinaire.
Choix des espèces
Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant d’Aggrecanopathies, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie, et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs. Ce modèle de souris est pertinent car il est connu pour mimer les principales caractéristiques de la pathologie. Les animaux seront utilisés de la naissance jusqu’à environ 52 semaines maximum afin de pouvoir caractériser chacune des étapes du développement de la pathologie.
Modèle de candidose orale
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont anesthésiées trois fois par semaine pendant quatre semaines et leur cavité buccale est colonisée par la levure Candida albicans, pour mettre au point un modèle d'infection oropharyngée. Le porteur, une société de biotechnologie, présente ce modèle comme un service destiné à ses clients pour tester des composés. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la réponse immunitaire de l'hôte.
Objectifs
La forme la plus fréquente de candidose est une infection superficielle de la bouche, du vagin ou de la peau, qui provoque l’apparition de plaques blanches ou rouges, et un prurit (démangeaisons), une irritation, ou les deux. Les patients immunodéprimés peuvent présenter de très graves atteintes au niveau de l’œsophage ou d’autres organes. Le projet consiste à développer un modèle pré-clinique prédictif afin de tester de nouvelles drogues en développement contre les infections oropharyngées à Candida albicans.
Bénéfices attendus
Notre société de biotechnologie possède une plateforme scientifique dédiée à la validation de nouveaux composés et thérapies pour ses programmes de R&D et ses clients. Le développement de ce nouveau modèle pré-clinique permettra de répondre aux attentes de différents clients et contribuera au développement de thérapies anti-infectieuses innovantes.
Procédures
S'il est prévu d'analyser les animaux après nécropsie uniquement, des prélèvements uniques de sang pourront être réalisés sous anesthésie
Impact sur les animaux
-anesthésie 3 fois par semaine pendant 4 semaines. -écouvillonnage de la cavité buccale et de la langue avec un écouvillon enduit de levure C. albicans -établissement d'une colonisation de la cavité buccale par la levure -traitements par différentes voies d'administration (per os, ip, iv, in).
Devenir
A la fin de la procédure tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever et analyser les organes d'intérêt.
Remplacement
Le recours à l’animal de laboratoire se justifie dans le sens où l’efficacité in vivo d’un composé sur une infection résulte non seulement de l’effet de ce dernier sur les micro-organismes mais également de la réponse du système immunitaire de l’hôte sur ces agents pathogènes. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes.
Réduction
Une attention toute particulière est portée sur le nombre d’animaux utilisés dans le projet. Nous travaillons avec une compagnie spécialisée dans les biostatistiques. Cette collaboration nous permet d’utiliser le nombre strictement nécessaire pour chaque expérience et de l’optimiser durant toute la durée du projet.
Raffinement
L'accent sera mis sur les conditions d’hébergement (soins, enrichissement du milieu) des animaux dans le but d’augmenter autant que possible leur bien-être. Planification du protocole de façon à éviter les perturbations susceptibles d'affecter le bien etre des animaux. Recourir à l’anesthésie. Utilisation de procédures d’euthanasie appropriées.
Choix des espèces
L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus). Les modèles souris sont largement utilisés par les équipes de Recherche publique et privée dans le traitement des maladies infectieuses: Souris agées de 49-55 jours, afin de reproduire un modèle déjà décrit dans la littérature.
Test des fonctions cardiaques et musculaires chez des souris déficientes en Tafazzin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
30 souris déficientes en Tafazzine vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des échocardiographies sous anesthésie, des tests d'effort sur tapis roulant puis un prélèvement terminal du cœur, pour caractériser un modèle du syndrome de Barth. Le porteur reconnaît que ce projet ne teste aucun traitement et prépare seulement une future demande. Il justifie le recours à la souris par l'incapacité des modèles cellulaires à reproduire un "organisme tout entier".
Objectifs
Dans cette Demande d'Autorisation de Projet, nous voulons caractériser finement le modèle souris du Syndrome de Barth en terme de suivi de poids, d'endurance, et de fonctionnement mitochondrial et cardiaque. Cette caractérisation permettra de mettre en avant des défauts du modèle souris qui serviront dans une future demande d'Autorisation de Projet où nous testerons la capacicté de candidats médicaments à supprmier ces défauts (dans l'optique de proposer un médicaments à des patients atteints du syndrome de Barth). Ce projet est conçu pour permettre le déroulement des procédures expérimentales de tests de composés médicaments, à suivre, dans les conditions les plus respectueuses de l’animal et de l’environnement.
Bénéfices attendus
Avant de tester des candidats médicaments, il est nécessaire de caractériser la lignée murine, modèle du syndrome de Barth, dans nos animaleries afin de vérifier les meilleurs paramètres pour les futurs tests médicamenteux. Cela n'a jamais été fait auparavant de manière détaillée. La caractérisation du modèle souris au niveau du poids, du comportement, de la force musculaire ainsi que les analyses sur échantillons d'urine, de sang et d'organes seront réalisées dans une Demande d'Autorisation de Projet en cours. La présente demande d'Autorisation de Projet permet d'aller plus loin dans la caracterisation du modèle souris en réalisant échocardiogrammes et tests d'effort et d'endurance sur des appareillages uniquement présents dans une autre animalerie que celle où sont produits les animaux.
Procédures
pas de procédures chirurgicales sur animaux vivants. - échocardiographies - tests d'endurance sur tapis roulant - prélèvements terminaux du coeur sur animaux sacrifiés
Impact sur les animaux
Les caractéristiques du phénotype dommageable décrites par nos collaborateurs sont les suivantes : poids inférieur de 20 à 25% dès la naissance, défaut au niveau des ventricules cardiaques (plus fins : fonctions diastolique et systolique réduites), défaut au niveau de la morphologie des mitochondries (augmentation de la taille, baisse dans la densité des crêtes). Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. L'analyse échographique nécesite une analyse sous anesthésie. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données échographiques. Le suivi des performances sur tapis de course teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.
Devenir
Euthanasie de tous les animaux en fin de cinétique pour prélèvements terminaux du coeur. Afin d'utiliser au maximum tous les animaux, des prélèvements de coeurs seront effectués pour des analyses qui permettent d'évaluer l'état et le fonctionnement des mitochondries de coeurs. Si des défauts sont mis en avant chez la souris modèle du syndrome de Barth par rapport à la souris sauvage, nous pourrons par la suite, dans une prochaine demande d'Autorisation de Projet, tester la capacité des candidats médicaments à supprimer ces défauts.
Remplacement
Nous utilisons des modèles cellulaires eucaryotes pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome de Barth, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour procéder aux essais cliniques chez l'homme.
Réduction
Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés dans toutes les expérimentations de la procédure . Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés. Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 12 animaux par groupe. Afin de palier une éventuelle mort prématurée des animaux (suite à une blessure par exemple), nous prévoyons 25% d’animaux en plus, soit 15 souris par groupe. Une analyse statistique adaptée des résultats sera réalisée.
Raffinement
Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel compétent grâce à la grille de score des points limites. Le poids sera suivi 2 fois par semaine. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre (hors point limite), des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine, isolement si nécessaire jusqu'à ce qu'une amélioration soit observée. Si au bout de 48h aucune amélioration n'est constatée alors l'animal sera mis à mort. Points limites attendus: - poids des mutants est inférieur de 20 à 30% dès la naissance : si on dépasse les 25% d'écart l'animal sera euthanasié - défauts ventriculaires: si on observe une tachycardie, une bradycardie, une arythmie ou une fréquence respiratoire anormale, l'animal sera euthanasié par la dislocation cervicale pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. - points limites spécifiques à chaque geste développés dans chaque procédure.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. Les animaux seront élevés jusqu'au sevrage dans l'animalerie de production puis envoyés à l'animalerie où se feront les expérimentations de la présente DAP juste après le sevrage et utilisés durant 6 semaines. En effet le déficit de poids se voit normalement dès la naissance, il est donc intéréssant de corréler ce déficit avec d'autres phénotypes délétères (fonctions cardiaques et test à l'effort/endurance). Avant d'utiliser les animaux nous attendons qu'ils soeint sevrés.
Système nerveux central : Fonction cognitive
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 2650
4 900 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils passent des tests cognitifs mêlant exploration, récompenses alimentaires et chocs électriques brefs (jusqu'à quatre secondes, répétables vingt fois par jour) et reçoivent des substances à tester pendant jusqu'à dix-huit semaines. Le croisement du champ structuré et de la narration indique que 980 animaux contrôles sont réutilisés et 3 920 tués à l'issue. Le porteur qualifie les chocs de "brefs et de faible intensité" sans blessure, et affirme que ces tests comportementaux ne peuvent être remplacés par des méthodes alternatives.
Objectifs
Les déficiences cognitives apparaissent souvent avec le vieillissement des personnes. Elles sont également présentes dans les maladies neurodégénératives telles Alzheimer ou Parkinson et des troubles neuropsychiatriques comme la schizophrénie. Les fonctions cognitives regroupent en particulier la mémoire , l'attention, le language, fonctions exécutives (logique, stratégie, planification, raisonnement) et fonctions visuo-spatiales (orientation). Ces déficiences affectent la qualité de vie des patients et de leur entourage et à ce jour, il n'existe pas de traitements efficaces de ces déficiences: Donepezil et memantine n'ont pas montré une réélle efficacité pour réduire les troubles cognitifs dans la maladie d'Alzheimer. De même, les antipsychotiques permettent le traitement des symptômes positifs et négatifs (sociabilité) de la schizophrenie mais pas les déficits cognitifs (en particualier flexibilité / adaptation). L'objectif du projet est donc permettre le développement de nouveaux modèles et l’utilisation de tests comportementaux pour étudier l'efficacité de nouveaux traitements afin d’atténuer ces troubles cognitifs. Ces tests peuvent également permettre d’établir le profil de sécurité au niveau des fonctions cognitives de nouvelles substances médicamenteuses avant leur passage chez l’homme, et ce dans le cadre des recommandations européennes, américaines ou japonaises en vue de l’obtention des autorisations de mise sur le marché.
Bénéfices attendus
L’absence de traitement totalement efficace chez l'Homme pour traiter les troubles cognitifs liés au vieillissement, maladie d'Alzheimer , de Parkinson, schizophrénie ou tout autre pathologie neurologique et/ou psychologiques rend nécessaires l’utilisation de modèles murins pour la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces. Ces études permettent également d’établir un profil de sécurité de nouveaux médicaments pour éviter de mettre sur le marché des traitements qui pourraient avoir de forts effets secondaires sur les fonctions cognitives.
Procédures
Les procédures utilisées sont basées sur 1) l'exploration d'environnements, d'objects, de congénères pour une durée maximum de 30 minutes), 2) des renforcements positifs (récompense alimentaire) 3) des renforcements négatifs (chocs électriques brefs max 4 sec). Ces procédures peuvent être répétées quotidiennement (20 fois maximum). Dans chacune des procédures, les animaux sont traités avec la substance d’essai en une ou plusieurs occasions, la voie et la durée du traitement étant adaptés aux besoins de l’étude (en général, maximum 18 semaines).
Impact sur les animaux
Les procédures utilisées sont principalment basées sur l'exploration de nouveaux environnements, objects, congénères..., des renforcements positifs (récompense alimentaire) ou négatifs (chocs électriques). Les enceintes d'exploration et objects sont conçu de sorte à ne pas engendrer de blessure (absence de bord tranchant...); les chocs électriques sont brefs et de faible intensité, n'induisant pas de blessure (brûlure) ou décès. Ces procédures n'engendrent pas de réelle souffrance mais selon les stimuli utilisés, leur durée et fréquence, elles peuvent engender un léger stress sont donc classées en légère ou modérée. A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée aux molécules testées
Devenir
Tous les animaux contrôles peuvent être réutilisés après l’approbation du vétérinaire.
Remplacement
Les tests/modèles que nous souhaitons développer et valider dans ce projet ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux face à différentes tâches permetttant l'évaluations des capacités cognitives (reconnaissance spaciale (visuelle). reconnaissance sociale (olfactive), mémoire associative (évitement d'un stimuli potentiellement aversif).
Réduction
La stratégie expérimentale consiste à comparer, les groupes recevant la substance à tester à un groupe contrôle déficitaires, l'objectif étant de réduire les déficits observés par le veillisement ou les agents pharmacologiques tentant de mimer les maladies telles Alzheimer (scopolamine) ou Schizophrenie (PCP ou MK-801). Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet ou plusieurs agents en comparaison par rapport à un groupe contrôle. Compte tenu de la variabilité inter-individuelle de ces mesures comportementales, 12 à 15 rongeurs minimum sont nécessaires pour disposer de la puissance statistique suffisante et nécessaire pour comparer les différents groupes expérimentaux. Une analyse de variance à un facteur ou plusieurs factuers sont utilisés pour comparer les groupes entre eux ainsi que des paired Student's t tests pour comparer les performences individuelles (intra group comparaison).
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites permettant d'euthanasier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger, tunnel, présence de congénères. Les méthodes analytiques choisies sont suffisamment sensibles pour effectuer l'intégralité des mesures sur chaque animal et donc de limiter la répétition des études. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur le comportement de rongeurs est prédictif de leur efficacité en clinique. Dans le cadre de démence ou pathologies liès au veillissement, des rongeurs âgés de 18 à 24 mois seront utilisés. Dans le cadre d'autres pathologies psychotiques ou les troubles cognitifs peuvent apparaitre dès l'adolescence, des rongeurs de 6 à 10 semaines seront utilisés.
Rôle des filets périneuronaux dans la ré-activation des mémoires traumatiques associées au stress précoce chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 872 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des souriceaux sont soumis dès le sevrage à une "défaite sociale juvénile", des agressions physiques répétées par des souris adultes, puis reçoivent du tamoxifène, une chirurgie cérébrale et pour certains une stimulation magnétique, avec de nombreux tests comportementaux. Le porteur écrit que ce modèle induit "de la douleur physique" et "de la douleur psychique" et un phénotype anxio-dépressif, cette souffrance étant "la base du modèle". Les souris agresseuses sont aussi tuées, et il affirme qu'aucune méthode alternative in vitro ou in silico n'est disponible.
Objectifs
L’exposition précoce à des traumas, incluant la maltraitance infantile (négligence, abus sexuel, physique ou psychologique), est indiscutablement un des plus importants facteurs prédicteurs de pathologies psychiatriques à l’adolescence et à l’âge adulte, notamment de la dépression et du suicide. Les études d’imagerie montrent de façon systématique que les expériences de maltraitance infantile modifient les trajectoires de développement et la connectivité de régions cérébrales impliquées dans les mémoires aversives. Les substrats neurobiologiques de ces altérations sont cependant particulièrement inexplorés. Notre hypothèse est les memoires traumatiques associées au stress precoce sont consolidés et deviennent persistantes jusqu’à l’age adulte grace a la formation de la matrice extracellulaire, en particulier les filets perineuronaux (PNNs), qui se developpent autour de certains neurones pendant l’enfance et l’adolescence. Indirectement les PNNs participeraient ainsi à la survenue de troubles liés au stress, dont la dépression et le syndrome de stress post-traumatique. Pour tester cette hypothèse, nous utiliserons un modele animal de stress précoce chez la souris, la défaite sociale juvénile (DSj), basé sur un évenement traumatique pendant la periode juvénile (aggression physique). Nos objectifs sont de : - Cartographier les neurones qui participent à la mémoire du trauma - Tester si la manipulation de ces neurones est suffisante pour rappeler la mémoire du trauma - Tester comment ce modele de stress précoce affecte le développement des PNNs. - Tester si les la suppression des PNNs modifie l’activité des neurones qui participent au souvenir du trauma - Tester si une approche non-invasive de neurostimulation, en particulier la stimulation magnétique transcranienne (rTMS), au potentiel clinique bien établi dans le traitement des pathologies liées au stress tel que le stress post-traumatique et la dépression, modifie la formation des PNNs et perturbe le rappel de la mémoire du trauma.
Bénéfices attendus
L’adversité précoce est le plus grand prédicteur des troubles mentaux, en particulier de l’anxieté, du trouble de stress post-traumatique et de la dépression. Ces troubles sont les maladies mentales les plus rependues et la première cause d’invalidité dans le monde. En permettant une meilleure compréhension des substrats neurobiologiques des effets à long terme du stress précoce, ce projet s’inscrit donc dans une démarche nécessaire pour établir de nouvelles pistes thérapeutiques afin de soigner ces maladies. Ce projet vise en outre à étudier le rôle des PNNs dans la consolidation des traces mnésiques, à travers une démarche expérimentale innovante, il s’aligne donc parfaitement avec les enjeux et défis actuels en neurosciences fondamentales, avec pour bénéfice une meilleure compréhension du fonctionnement du cerveau au niveau cellulaire. Finalement, si la stimulation cérébrale non-invasive a des potentiels thérapeutiques bien établis en clinique pour les pathologies liées au stress, en particulier le trouble de stress post-traumatique et la dépression, les bases neurobiologiques de cette action thérapeutique est actuellement inconnue. En caractérisant mieux comment la rTMS modifie les traces mnésiques du trauma et la plasticité cérébrale à travers le remodelage des PNNs, cette étude permettra donc de mieux comprendre le potentiel de cette approche.
Procédures
Procédure 1 : sélection de souris de la souche agressives (200 souris de la souche expérimentale non OGM, 300 souris de la souche agressive) Des souris de la souche expérimentale subissent 3 sessions de 5 minutes (1 session par jour) où elles sont potentiellement agressées physiquement par des souris agressives afin de sélectionner des agressives. Procédure 2 : optimisation du dosage du tamoxifène (84 souris de la lignée expérimentale OGM) 1) Agression physique unique de souris expérimentale OGM par une souris agressive pendant 10 minutes 2) Injection intra péritonéale de Tamoxifène sur les souris expérimentale OGM (2 secondes par animal) 3) Agression physique unique de souris expérimentale OGM par une souris agressive (10 minutes) Procédure 3 : visualisation des neurones participant à la mémoire de la défaite sociale juvénile (544 souris de la lignée expérimentale OGM) 1) Exposition à la défaite sociale juvénile 2) Injection intra péritonéale de Tamoxifène 3) Tests de comportement (interaction sociale, hypophagie induite par la nouveauté, open-field, labyrinthe en croix surélevé, test de préférence au sucrose, test de nage forcée, boîte claire obscure. Procédure 4 : Rôle des filets périneuronaux dans le rappel du trauma (344 souris de la lignée expérimentale OGM) 1) Exposition à la défaite sociale juvénile 2) Injection intra péritonéale de Tamoxifène 3) Injection unique intra-cérébrale de chondroïtinase ou de solution saline par chirurgie stéréotaxique sous anesthésie gazeuse (durée de 2 heures par animal) 3) Tests de comportement Procédure 5 : effet de l’inhibition des neurones activés pendant la défaite sociale juvénile sur le rappel du trauma (216 souris de la lignée expérimentale OGM) 1) Exposition à la défaite sociale juvénile 2) Injection intra péritonéale de Tamoxifène 3) Implantation de fibres optiques par chirurgie stéréotaxique sous anesthésie gazeuse (durée de 2 heures par animal) 3) Tests de comportement combinés à stimulation lumineuse Procédure 6 : Effet de la Stimulation Magnétique Transcrânienne répétitive (rTMS) sur les traces mnésiques du trauma visualisées par photométrie (216 souris de la lignée expérimentale OGM) 1) Exposition à la défaite sociale juvénile 2) Injection intra péritonéale de Tamoxifène 3) Implantation de fibres optiques 4) protocole de rTMS sous anesthésie gazeuse (durée 10mn, 5 jours consécutifs) 3) Tests de comportement combinés à stimulation lumineuse
Impact sur les animaux
Les effets indésirables des différentes approches utilisées sont décrits ci-dessous : - Modèle de défaite sociale juvénile : Le modèle étant base sur des agressions physiques répétées, il induira de la douleur physique. Il induira également de la douleur psychique, un état de stress aigu pendant la procédure mais aussi durable, en induisant un phénotype anxio-depressif chez les souris exposées au modèle. Cette douleur psychique est la base du modèle, l’objectif étant d’étudier les substrats neurobiologiques des changements comportementaux induits par ce stress. - Injection IP de 4-OHT : La procédure peut avoir une conséquence négative sur le bien-être animal et induire une douleur aigue. -Tests de comportement : Basés sur des mesures quantitatives ou qualitatives d’exploration dans des dispositifs nouveaux et donc possiblement anxiogènes, les tests utilises peuvent induire un stress léger chez les animaux. - Injections intra-cérébrale et implantation de fibres optiques : La chirurgie stéréotaxique est susceptible d’induire douleurs physiques et inconfort chez l’animal, avec perte potentielle de poids et mobilité réduite dans les 2 jours qui suivent la procédure (pour l’implantation de la fibre optique, l’injection seule étant bien tolérée).
Devenir
Les animaux expérimentaux seront euthanasiés à l’issue des tests comportementaux en vue d’une perfusion transcardiaque permettant d’effectuer des procédures d’immunohistochimie après prélèvement des cerveaux. Les agresseurs, du fait de leurs caractéristiques agressives, seront euthanasiés étant donné l'impossibilité de réutiliser ces animaux ou de les faire adopter.
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro ou in silico n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. La souris est par ailleurs un choix pertinent de par les homologies structurelles qui existent avec l’homme dans l’organisation des zones cérébrales impliquées dans la réponse au stress et les émotions.
Réduction
Les effectifs sont optimisés pour prendre en compte qu’une partie des animaux (~15 à 30% selon nos données préliminaires et la littérature) sera résiliente au protocole de défaite sociale juvénile (DSj), ces effectifs sont donc nécessaires pour pouvoir comparer statistiquement les groupes expérimentaux pour les différentes variables comportementales (témoins, DSj susceptibles, DSj résilients). Dans le cas où aucune raison préalable ne laisse supposer un dimorphisme sexuel dans la variable mesurée l’expérience ne sera faite que sur des males. S’il est essentiel de pouvoir identifier des souris « aggresseurs », ce qui est un prérequis au protocole de DSj, les aggresseurs sélectionnés peuvent être réutilisés par la suite en tant qu’agresseurs au cours des procédures suivantes. Etant donné que les tests statistiques utilisés seront non-paramétriques, et donc ne seront pas basés sur des comparaisons de moyennes mais de rangs, une analyse de puissance cohérente dans ces conditions sans une connaissance a priori précise de la distribution des variables est difficile. Le choix des effectifs est basé principalement sur les données préliminaires comportementales et histologiques obtenues.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (cabanes plexiglass et cartons, tubes). Les animaux qui subissent la DSj seront suivis quotidiennement, dans l’heure suivant l’épisode de défaite sociale, avec une attention particulière portée à l’état général, l’état de chair et aux plaies cutanées potentielles des animaux tests, ce qui sera facilite par des formulaires de sante précis pour chaque souris. Des points limites énoncés plus bas seront mis en place avant intervention ou exclusion du protocole.
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, et finalement la possibilité d’utiliser des animaux transgéniques permettant l’utilisation d’outils de neurosciences intégratives font de la souris le modèle animal le plus pertinent. Les souris expérimentales sont utilisées le lendemain du sevrage, a P21, a un stade juvénile, et les expérimentations continuent jusqu’à l’âge adulte. Les souris CD1 servant d’agresseurs dans le modèle de DSj sont d’anciens reproducteurs adultes. Les souris C57BL/6 utilisées comme sentinelles pour tester l’agressivité des CD1 sont utilisées à un stade juvénile (P21).
Neurochimie chez le rongeur
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 2000
20 000 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des molécules à tester en administration unique ou répétée jusqu'à quinze jours, puis sont tués dans les quatre heures pour prélever des structures cérébrales et en mesurer les neuromédiateurs. Le porteur indique que les composés peuvent provoquer prostration, hyperlocomotion, perte de poids, stéréotypies, agressivité voire convulsions, auquel cas les animaux sont écartés et tués. Il justifie le recours au rongeur par la "nécessité" d'un système nerveux "intègre" pour évaluer les molécules.
Objectifs
La communication entre les différentes cellules du système nerveux central s’effectue via la libération de molécules, des neuromédiateurs, se liant à des récepteurs localisés sur les cellules cibles. Les nouveaux composés à tester, agissent sur ce système de transmission entre cellules nerveuses en activant ou inhibant la libération de neurotransmetteurs, en activant ou bloquant les récepteurs cibles. Afin de connaitre l’action de nos nouveaux composés sur l’activité de ces systèmes neurochimiques nous avons besoin d’évaluer les contenus en neuromédiateurs (dopamine, noradrénaline, acétylcholine, histamine…) et leurs métabolites (molécules résultant de leur dégradation) dans le cerveau ou des zones particulières du cerveau (hippocampe, hypothalamus, striatum, cortex…) de rongeurs. Pour ce faire nous avons besoin d’administrer nos composés à des rongeurs afin d’observer leurs effets sur les contenus en différents neuromédiateurs cérébraux.
Bénéfices attendus
La technique de neurochimie va permettre d'orienter la recherche de nouvelles molécules à visée thérapeutique - en permettant de vérifier leurs actions positives sur des systèmes neurochimiques connus pour être défaillants dans certaines pathologies psychiatriques (trouble du sommeil, dépression, anxiété, schizophrénie...). - au contraire en vérifiant leur absence d'effet délétère sur certains systèmes neurochimiques pouvant être impliqués dans des effets indésirables (addiction, hypolocomotion...). - en aidant la chimie médicinale à déterminer les familles de molécules ayant le plus d'activité sur un système neurochimique ciblé et à optimiser le(s) composé(s).
Procédures
Les animaux vont recevoir une administration aigüe ou chronique (maximum 15 jours, deux fois par jour) de molécules à tester. La mise à mort se fera au maximum 4 h après la dernière administration de composé.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors de ce protocole sont celles liées à l'administration du produit à tester et à son éventuelle toxicité. Les nouvelles molécules ont déjà passé une batterie de tests in vitro qui permet de sélectionner les molécules les plus sélectives et sans effet sur certaines cibles pouvant être à l'origine d'effet non désiré. Les effets indésirables liés aux produits testés pourront être une prostration ou une hyperlocomotion, une perte de poids (si traitement chronique), des stéréotypies, de l'agressivité voir des convulsions. Si ces signes sont détectés, les animaux sont écartés de l'expérimentation et euthanasiés.
Devenir
L'euthanasie des animaux est nécessaire afin de prélever les différentes structures centrales d'intérêt.
Remplacement
L’utilisation de souris ou de rats pour les mesures de neurochimie est justifiée par la nécessité de pouvoir déterminer les effets de nouvelles molécules sur un système nerveux intègre. En effet, le fonctionnement neurochimique du cerveau est particulièrement complexe avec de nombreuses interactions entre les différents systèmes neurochimiques des différentes régions du cerveau.
Réduction
Les tests de plusieurs molécules pourront être groupés afin de n'utiliser qu'un seul groupe témoin et le cas échéant un groupe testant les effets de molécule(s) de référence. Une prise en compte des données de pharmacocinétique dans le choix de doses et le(s) temps d'euthanasie post administration sera effectuée. Les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés.
Raffinement
L'euthanasie des animaux est réalisée dans une pièce séparée de la pièce de traitement afin de minimiser le stress pour les animaux en attente. Lors du change des animaux (une fois par semaine) une feuille de Suivi Bien-Être Animal est remplie en fonction d’une grille de 30 critères. Si nous constatons une déviation concernant au moins 3 critères sans qu’une action puisse corriger ces déviations, alors l’euthanasie de l’animal est envisagée. Ces grilles de critères bien-être animal sont archivées. Dans le cas d'une expérimentation chronique, en plus de la surveillance continue pendant 1h30 post-traitement, une fiche de suivi journalier est mise en place : tout signe de mal être (prostration, poils hérissés, perte de poids supérieure à 15% dans le cas des traitements chroniques, convulsions) entraînera l'exclusion de l'animal du protocole et son euthanasie (par exposition à une concentration croissante de CO2).
Choix des espèces
- La taille adéquat de l’animal : les rats et les souris présentent une taille suffisante pour permettre des microdissections de structures déterminées du cerveau. - Le rat et la souris sont déjà largement caractérisés d’un point de vue comportemental et neurochimique et ils ont un système nerveux suffisamment évolué pour extrapoler à l’homme certains résultats. De plus, la neuroanatomie est particulièrement bien détaillée et documentée chez le rat et la souris. Les études de neurochimie pourront être menées aussi bien sur de jeunes animaux sevrés que sur des animaux adultes en fonction des objectifs.