Rongeurs
Traitement pharmacologique de la pression générée par la croissance tumorale pour inhiber la progression de la tumeur du côlon et supprimer l’activation des cellules souches cancéreuses.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
410 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses de tumeurs du côlon spontanées, elles reçoivent un anticancéreux par voie orale pendant 25 jours et huit injections, avec imageries sous anesthésie, et sont mises à mort à -20 % de poids ou en cas d'atteinte grave. Le porteur indique des effets secondaires de type infections, diarrhée et hypothermie, et revendique la "première étude au monde" d'une approche mécanopharmacologique du cancer du côlon. Il affirme qu'aucun modèle de laboratoire ne remplace la souris pour reproduire la croissance tumorale in vivo.
Objectifs
L'objectif de cette étude est de déterminer l'efficacité clinique d’un anti-cancéreux en tant que thérapie adjuvante aux protocoles actuels de traitement du cancer du côlon. Cet anti-cancéreux est déjà autorisé comme chimiothérapie unique pour le cancer de la thyroïde et agit en inhibant l'action de certains récepteurs exprimés à la surface des cellules pour réduire la croissance tumorale et supprimer les métastases. Pour déterminer l'efficacité thérapeutique des thérapies adjuvantes, il faut tenir compte du moment où les médicaments sont administrés dans le schéma du protocole (soit en même temps, soit indépendamment). Dans le cadre de ce projet, les médicaments seront administrés indépendamment, l’anti-cancéreux étant d'abord administré pendant 13 jours avant le début des traitements standard, afin de vérifier l'efficacité thérapeutique des protocoles standard sur la croissance tumorale, les métastases et l'activation des cellules souches cancéreuses.
Bénéfices attendus
Cette étude préclinique utilise une nouvelle approche mécanopharmacologique de la chimiothérapie qui délivre d'abord un premier traitement aux souris afin d’inhiber la progression tumorale métastatique et la résistance aux traitements avant application des traitements classiques. Nous proposons qu'en modifiant les délais d'administration du médicament qui ont été testés précédemment, nous parviendrons à démontrer une diminution de la charge tumorale, une suppression de l'activation des cellules souches cancéreuses et une réduction de l'incidence de la résistance au traitement lorsque l’anti-cancéreux est administré avant les traitements standard et non en même temps. Ce projet vise ainsi à identifier les effets à court terme (phase ) et à long terme (phase ) des nouvelles stratégies de traitement mécanopharmacologique, et constitue la première étude au monde à mettre en œuvre une approche mécanopharmacologique de la chimiothérapie du cancer du côlon. Dans l'ensemble, cette étude permet non seulement de prendre en compte les calendriers administratifs des médicaments lors de la conception des protocoles chimiothérapeutiques du cancer du côlon, mais elle met également en évidence un nouveau rôle des forces mécaniques intrinsèques de la pression de croissance tumorale dans la promotion et la régulation de la progression métastatique et de la résistance aux chimiothérapies
Procédures
Les animaux seront imagés sous anesthésie générale au maximum 6 fois pendant les 70 jours de l'expérience. Durée de l'anesthésie : 20 minutes Les animaux recevront un traitement quotidien par voie orale pendant 25 jours et recevront 8 injections de traitements (voie intrapéritonéale). Administration de molécules réalisée sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les effets secondaires courants des traitements standard utilisés comprennent un risque accru d'infection (dû à la réduction du nombre de globules blancs), la diarrhée, la perte d'appétit et l'hypothermie.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Il n'existe actuellement aucun modèle de laboratoire de remplacement qui imite avec précision la croissance tumorale in vivo, notamment les pressions de croissance mécaniques associées qui provoquent l'activation des cellules souches cancéreuses, en dehors des modèles de souris. De plus, l'administration de chimiothérapies par voie orale nécessite souvent un métabolisme , ce qui signifie que le médicament doit d'abord subir une étape métabolique préliminaire pour devenir actif – c’est notamment le cas de notre molécule d’intérêt qui doit d'abord être métabolisée par le foie avant de pouvoir être considérée comme un chimiothérapeutique actif. Ainsi, pour reproduire complètement le contexte clinique, un système multi-organes (un animal) est nécessaire. Bien qu’il existe des systèmes de corps sur puce microfluidiques qui incorporent plusieurs lignées cellulaires et reproduise cet environnement multi-organes, l'interaction spécifique des protocoles testés sur l'activation des cellules souches cancéreuses ne peut être étudiée dans ce contexte.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux requis pour atteindre la signification statistique, la formation de protocoles non invasifs spécifiques sera effectuée par des experts de l'équipe et des techniques d'imagerie in vivo seront utilisées tout au long de ce projet afin de réduire le nombre d'animaux requis pour atteindre la signification statistique.
Raffinement
Toutes les souris seront surveillées quotidiennement tout au long de la phase de traitement du protocole afin de garantir leur bien-être. Toutes les expériences d'imagerie seront menées de manière à minimiser et à prévenir la douleur. Une grille de notation sera appliquée pour contrôler le bien-être des animaux tout au long du projet proposé. Les critères mentionnés dans la grille de notation seront appliqués. Les évaluations cliniques des saignements, de l'hypothermie, de la diarrhée ou des changements comportementaux grossiers (échelle des grimaces de souris) seront surveillées et enregistrées. Comme mentionné précédemment, la déshydratation, la diarrhée et l'hypothermie seront surveillées de près tout au long de la phase de traitement, et le bien-être général des souris sera étroitement surveillé tout au long de la partie observation et survie de l'étude. Toute souris présentant des comportements débilitants qui ne peuvent être traités par des stratégies de gestion de la douleur ou soignés, sera euthanasiée. Les souris seront pesées deux fois par semaine et si une perte de 20% ou plus est déterminée, la souris sera euthanasiée. Toutes les souris recevront les anesthésiques appropriés afin de garantir que les souris soient maintenues dans un état de santé optimal et que le nombre minimum de souris soit utilisé tout au long du protocole. Pour analyser la croissance tumorale in vivo, des analyses d'imagerie in vivo seront effectuées. Toutes les expériences d’imagerie seront réalisées sous anesthésie et seront effectuées par une équipe de 2 personnes si nécessaire et ne dureront pas plus de 20 minutes par animal. Pour toutes les techniques d'imagerie, un gel oculaire et des tapis et/ou lampes chauffants seront utilisés pour minimiser l'inconfort et l'hypothermie.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences sur la cancérogenèse et pour les essais thérapeutiques sur le cancer, car les médicaments sont métabolisés de la même manière que chez l'homme, ce qui rend obsolète l'utilisation de lignées cellulaires ou d'autres animaux comme les poissons. La souche de souris choisie contient une mutation génétique importante connue pour jouer un rôle dans le développement du cancer du côlon chez l'homme. Elle est donc depuis longtemps reconnue comme le modèle de choix pour le développement spontané de tumeurs intestinales et coliques lorsque les souris atteignent l'âge de 12 à 16 mois et et sont donc communément appelées "vieilles souris" ou "souris âgées". Les souris porteuses de la mutation développent spontanément des tumeurs intestinales et coliques et la formation d'ACF entre l'âge de 12 et 16 mois. Comme ce projet vise à déterminer l'efficacité thérapeutique des protocoles standard sur les tumeurs endogènes, toutes les souris utilisées dans cette étude seront âgées de 12 à 16 mois, les expériences commenceront sur des souris âgées de 14 mois au maximum, afin de garantir le bien-être optimal de la souris pendant les trois phases de l'expérience (phase d'observation avant traitement, phase de traitement et phase de survie). Il est important de noter que les expériences commenceront indépendamment de la formation d'une tumeur détectable, car le fond génétique garantit la formation d'ACF (le précurseur du cancer du côlon).
Caractérisation physiologique de modèles murins d’une ataxie cérébelleuse récessive.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Modèles génétiques d'une ataxie cérébelleuse, elles passent six tests de coordination et un test musculaire répétés à cinq âges, et une partie reçoit un agent déclenchant une crise d'épilepsie, avant mise à mort. Le porteur qualifie ces tests de non "générateurs de souffrance" tout en les classant en gravité modérée à sévère selon l'intensité de la phase d'épilepsie. Il indique que les cultures cellulaires ne peuvent remplacer l'étude du phénotype comportemental des souris.
Objectifs
Ce projet vise à étudier une ataxie cérébelleuse d’origine génétique qui se manifeste chez les patients par une ataxie cérébelleuse avec une évolution lente et progressive pouvant être associée à une intolérance à l’exercice, un retard mental faible à modéré, des crises d’épilepsie et des pseudo-épisodes vasculaires cérébraux. L’objectif de ce projet est de comprendre les processus pathologiques de cette ataxie cérébelleuse en étudiant le phénotype de deux modèles de souris génétiquement différents. • Le premier possède une délétion totale du gène responsable de la maladie et développe une forme modérée de la maladie. Ce modèle sera étudié dans son nouvel environnement. • Le deuxième possède une mutation ponctuelle retrouvée chez un patient qui est censée reproduire la forme la plus symptomatique de la maladie. Nous obtiendrons ainsi de bons modèles capables de reproduire les différentes atteintes cliniques rencontrées chez les patients. Si le deuxième modèle reproduit la forme la plus symptomatique, avec la présence non seulement des signes cliniques mais aussi des lésions histologiques, ce nouveau modèle remplacera le premier modèle.
Bénéfices attendus
Bénéfices attendus : - A court terme, ce projet spécifiquement consacré à l’étude d’une ataxie cérébelleuse récessive, permettra tout d’abord de valider et d’approfondir le phénotype identifié dans le modèle avec délétion totale du gène, précédemment validée sur un autre site, ainsi que celui du nouveau modèle avec la mutation ponctuelle. - A moyen terme, l’ensemble des expériences réalisées sur ces deux modèles murins permettront d’obtenir une vision intégrée et globale du fonctionnement du gène responsable et de la physiopathologie de cette ataxie. Elles permettront de mettre en place des essais pré-cliniques afin de tester l’efficacité d’agents pharmacologiques sur le modèle le plus pertinent. - A plus long terme, une bonne compréhension de la physiopathologie de cette ataxie et l’identification de solutions thérapeutiques efficaces permettront le transfert de ces données vers la clinique pour une meilleure prise en charge et prévention de la maladie.
Procédures
Dans ce projet, les animaux seront soumis à 6 tests comportementaux permettant de mesurer la coordination des animaux et 1 test musculaire répartis sur 4 jours. Ils seront répétés à 5 âges différents. Ces tests ne sont pas générateurs de souffrance pour les souris. La durée de ces tests est comprise entre 30 secondes et 5 minutes. Une partie de ces animaux seront soumis, sur une durée de 20 minutes, à un agent pharmacologique inducteur d’épilepsie. A la fin de chaque étude, une anesthésie générale sera pratiquée précédant la mise à mort.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les tests comportementaux ont une classe de sévérité modérée à sévère. Les effets indésirables rencontrés comprennent : Classe modérée : - Une courte période de fatigue musculaire, - Une courte période où les souris seront mouillées après passage dans un bassin de nage à 27°C. Classe sévère possible: - Une courte phase d’épilepsie. Aucun effet nuisible de cette phase épileptique n’a été observé lors de nos précédentes expérimentations. La sévérité dépendra de l’intensité de la phase d’épilepsie.
Devenir
Dans ce projet, les animaux qui seront étudiés à différents âges seront replacés dans leur cage entre chaque série de tests. A la toute fin des études, les animaux seront mis à mort.
Remplacement
L’utilisation de cultures cellulaires primaires, nous permet de tester différentes hypothèses en réduisant le nombre d’animaux requis pour la caractérisation des deux modèles. Le nombre de souris proposé dans les différentes procédures tient compte de ce remplacement. En aucun cas, l’utilisation de modèles cellulaires ne peut remplacer en totalité l’utilisation d’animaux contenus dans les différentes procédures. L’information apportée par les modèles cellulaires ne permet pas d’apprécier le phénotype général, comportemental ou encore cognitif des souris.
Réduction
Il est estimé que le projet mobilisera sur 5 ans un maximum de 480 animaux hors animaux reproducteurs et maintien de la lignée. Toutes les procédures sont conçues pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, tout en tenant compte du nombre minimum nécessaire pour appliquer les tests statistiques adaptés. Les travaux de notre équipe et les données préliminaires nous permettent d’estimer le nombre de souris pour avoir une valeur statistique suffisante (20 souris par condition pour les tests de comportement et 10 souris par condition pour les analyses biochimiques et histologiques). Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, autant que possible, les mêmes animaux seront utilisés pour réaliser les analyses fonctionnelles, histologiques, moléculaires et biochimiques. Enfin, si le modèle avec mutation ponctuelle ne présente pas un phénotype comportemental, histologique et biochimique différent du modèle avec délétion totale du gène, la procédure 3 ne sera pas effectuée afin de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans les conditions standard d’hébergement et l’environnement sera enrichi (igloo polycarbonate, rouleau de cellulose,…). Aucune des procédures que nous réaliserons sur les animaux ne devrait entraîner de douleur ou de stress aux animaux. Tout au long de la procédure 1 , un suivi régulier des animaux sera réalisé (une à deux fois par semaine). Il nous permettra de s’assurer du bon vieillissement des animaux au fil des mois. Ce suivi est basé sur la mise en place de points limites et méthodes de prise en charge de la douleur spécifique pour notre projet.
Choix des espèces
Avec 98% d’identité protéique avec l’Homme, la souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et la génétique sont bien connues. Les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. La nécessité d'utiliser des souris génétiquement modifiée est liée à l'absence de modèle mammifère naturel correspondant à la maladie humaine. Par ailleurs, les premières données de l’étude du modèle murin avec une délétion complète montrent que ce modèle reproduit les caractéristiques pathologiques étudiées dans ce projet mais ne reconstruisent pas tous les aspects de la maladie. C’est pourquoi, le deuxième modèle avec une mutation ponctuelle a été généré et sera étudié pour voir s’il reproduit la symptomatologie la plus étendue de la maladie. Notre étude préalable a été faite sur le modèle avec une délétion complète dans leur ancien environnement et après validation du projet par le comité d’éthique. Cette étude nous a permis de préciser les âges auxquels la validation du phénotype des modèles avec délétion complète (dans son nouvel environnement) et avec une mutation ponctuelle sera faite. Les âges étudiés sont 5, 10, 20, 30, 52 semaines. Seule l’étude de la sensibilité à l’épilepsie sera effectuée à un seul âge, qui dépendra de la chronologie d’apparition du phénotype des souris modèles.
Mécanismes neurobiologiques des effets renforçants de la nicotine chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie cérébrale sous anesthésie permettant de manipuler des sites d'action de la nicotine, puis une évaluation comportementale de la balance entre effets appétitifs et aversifs, avant mise à mort. Le porteur limite les effets indésirables déclarés à l'inconfort lié à la chirurgie. Il justifie le recours à la souris par l'interdiction de ces techniques invasives chez l'humain et l'absence de modélisation, et revendique un intérêt "fondamental" pour comprendre la dépendance au tabac.
Objectifs
La nicotine est le composé du tabac responsable de la dépendance qui est observée chez près de 40% des fumeurs. La nicotine agit de façon complexe sur le cerveau, pouvant être appétitive ou aversive selon les doses et les individus. Il est considéré que cette balance entre effets appétitifs et aversifs joue un rôle important dans le fait de continuer à fumer ou non après les premières cigarettes. Ce projet scientifique a pour but d’étudier les mécanismes cérébraux de la balance entre effets appétitifs et aversifs de la nicotine. Nos travaux récents indiquent que la balance appétence/aversion dépendrait d’un équilibre entre l’action de la nicotine sur deux structures cérébrales distinctes. Nous manipulerons des sites d’action spécifiques de la nicotine dans ces structures cérébrales et évaluerons la balance appétence/aversion au travers du comportement chez la souris.
Bénéfices attendus
Ces expériences produiront des connaissances uniques sur les mécanismes cérébraux qui sous-tendent la balance entre effets récompensants et effets aversifs de la nicotine. Comprendre cette balance et être en mesure de la modifier est d’un intérêt fondamental pour une meilleure compréhension de la vulnérabilité à développer et maintenir une consommation de tabac. Cette compréhension est aussi d’intérêt thérapeutique dans le cadre de la dépendance au tabac ainsi que pour le raffinement de l’usage thérapeutique de la nicotine elle-même.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie gazeuse et sous analgésique.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont l'inconfort associé à la chirurgie dans des conditions où toutes les mesures sont prises pour réduire douleur et risque d’infections (aseptie, anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, suivi post-opératoire).
Devenir
Les animaux ne peuvent pas être impliqués dans de nouvelles procédures et sont euthanasiés au moyen d’une procédure réglementaire réalisée exclusivement par une personne experte.
Remplacement
Les procédures décrites ont recours exclusivement à la souris de laboratoire pour les raisons suivantes : 1. Il est interdit de mettre en œuvre chez l’homme des techniques neurobiologiques invasives telles que celles décrites ici et qui permettent d’établir des liens de causalité tels que ceux que nous cherchons à tester, 2. Il n’existe pas encore de modélisation mathématique des processus psychopharmacologiques dont nous cherchons à comprendre les mécanismes biologiques, 3) nous étudions comment l’intégration des effets appétitifs et aversifs de la nicotine affecte la prise de nicotine. Cette balance entre appétence et aversion, et son intégration comportementale, ne peuvent être observées et étudiées sur des lignées cellulaires ou tout autre modèle ex vivo.
Réduction
L'utilisation d'un trop grand nombre d'animaux est contraire à l'éthique, mais si trop peu d'animaux sont utilisés, l'expérience peut manquer de puissance statistique et se révélée vaine donc non éthique. Nos effectifs sont déterminés et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Le confort de l’animal est noté quotidiennement au moyen d’une grille d’évaluation. Un soin particulier est porté à la formation des expérimentateurs pour une manipulation adaptée des animaux. Les soignants qui s’occupent de nos animaux sont encadrés par, ou sont eux-mêmes, des personnels diplômés soigneurs animaliers. Les animaux sont hébergés en cycle inversé (obscurité : 7h-19h). Les expériences se déroulent donc quand les animaux sont actifs (phase nocturne) et leur sommeil est ainsi respecté. Les animaux sont pris en main de façon appropriée [jamais par la queue, les pattes reposant sur un support (bras, main…) pour éviter la sensation du vide], 2 fois par semaine (habituation) puis quotidiennement pour une familiarisation optimale avec l’expérimentateur. Pour enrichir l’environnement, des carrés de cellulose, permettant la confection de nids, sont placés dans chaque cage d'habitation et renouvelés systématiquement lors du change. Les paramètres environnementaux des pièces d’hébergement et d’expérience sont contrôlés en permanence. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie gazeuse, sous analgésique et sur couverture chauffante.
Choix des espèces
Compte tenu des questions que nous posons, il est nécessaire d’utiliser une espèce mammifère dont le développement des réseaux neuronaux permet l’expression d’un comportement aussi complexe que la prise de drogue. Or il a été montré un continuum entre les mécanismes psychologiques et biologiques des processus de récompense entre le rongeur et l’homme, et ces processus sont à la base du comportement que nous étudions. Les outils de chémogénétique nécessaires au test des hypothèses que nous formulons ont été développés chez la souris. Les souris utilisées seront agées de 10 semaines à leur arrivée. Il s’agit de souris jeunes adultes. Cette période du développement correspond à la période de vulnérabilité à la nicotine. Par ailleurs, la plasticité vasculaire diminue chez les souris dès 4-5 mois faisant courir un risque lors de la chirurgie vasculaire.
Impact de l’hypoxie intermittente sur l’activation du système sympathique et ses répercussions sur le métabolisme et la fonction cardiaque 2/2
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système respiratoire
160 souris vont être utilisées, chacune maintenue en hypoxie intermittente huit heures par jour pendant seize semaines, dans des procédures que le porteur classe à un niveau de souffrance léger. À trois reprises, elles reçoivent des injections de glucagon, d'insuline, d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline ou de dexaméthasone pour mesurer leur réaction, et passent trois prélèvements de sang à la queue ainsi que trois ECG et échographies cardiaques sous anesthésie générale. Les retombées restent au conditionnel : des traitements "Béta bloquant ou autre" ne seraient envisagés que si l'hypoxie dérègle bien le système sympathique. Le porteur écrit que "Tous les animaux sont gardés en vie" après l'échographie et regagnent leur animalerie "pour la suite du projet", et évoque ailleurs des examens menés avant une mise à mort finale, sans dire quand ni comment les souris sont tuées.
Objectifs
Le projet vise à répondre à deux questions scientifiques, à savoir : -L’hypoxie intermittente (induite par l’apnée obstructive du sommeil AOS) provoque-t-elle des dérèglements de l’activation sur système sympathique ? -Si oui, ces dérèglements sont-ils responsables des troubles métaboliques hépatiques associés à ce stress hypoxique et plus largement à cette pathologie (AOS) ?
Bénéfices attendus
L'activation du système sympathique dans la pathologie de l'AOS commence d'être décrite en clinique par des observations cardiaques (ECG). Par ailleurs, cette activation a sans doute des répercussions sur le plan métabolique et cardiaque que nous allons tenter de comprendre. Si une activation de la voie sympathique s'avère dans notre modèle d'exposition à l'HI avec des désordres métaboliques associés, nous allons pouvoir envisager des traitements d'inactivation de cette voie (Béta bloquant ou autre) avec des répercussions importantes. Au final, l'idée est de développer une nouvelle thérapie pour lutter contre les dérèglements métaboliques associés au SAOS
Procédures
Les animaux seront soumis à de l'hypoxie intermittente 8 heure par jour, pendant 16 semaines. Ils suivront des tests de stimulations à différentes drogues connues afin d'évaluer leur sensibilité à celles-ci (3 tests à la 2ème, 8ème et 16ème semaine d'exposition à l'hypoxie). Ils auront des mesures de glycémie par microprélèvements (goutte de sang prélevée à la queue, 3 tests). Ils suivront 3 ECG et 3 échographies cardiaques non invasifs, réalisés sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Le modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente est bien connu au laboratoire et les effets secondaires sur les animaux sont bien décrits (augmentation de la ventilation et augmentation de l'hématocrite sans conséquence majeure). Les traitements utilisés sont déjà connus dans la littérature et au laboratoire, il ne devrait pas y avoir de problème. Les injections de glucagon devraient augmenter la glycémie des animaux (sans excès). Les injections d'insuline devraient provoquer une baisse de la glycémie. Si celle-ci devient inférieure à 40mg/ml les animaux recevront une injection de glucose à 10% (2mg/kg). Les injections d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline et de dexaméthazone sont attendues pour augmenter légèrement la fréquence cardiaque.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à l’issue de la procédure d’échographie cardiaque et retournent dans leur animalerie d’hébergement pour la suite du projet.
Remplacement
Nous avons pris en compte la règle des 3 R car ces expérimentations seront réalisées avec le souci de remplacer l'expérimentation animale. Seulement à ce jour aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle animal pour analyser les dérèglements des systèmes intégrés comme l'activation du système sympathique .
Réduction
Nous réduisons le nombre d'expérience en multipliant les tests à partir d'un seul animal grâce a des analyses non invasives (ECG+Echographie) à différents temps (avant le sacrifice terminal). Nous utilisons également le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables.
Raffinement
Cette étude est menée avec un grand souci de raffinement d'autant que ces analyses sont très sensibles aux moindres perturbations des animaux (stress etc). Ainsi nous veillerons à respecter scrupuleusement les cycles jours/nuit et limiterons fortement les allers et venues dans l'animalerie ainsi que le bruit pour ne pas déranger les animaux. Les animaux suivront également des habituations de manipulation par les expérimentateurs afin de limiter fortement le stress des animaux durant les analyses. Les animaux seront anesthésiés durant les ECG et les échographies.
Choix des espèces
La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l'Homme, notamment dans le cadre d'études systémiques, permettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques et physiopathologiques avant d'entreprendre des études cliniques. Enfin la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparativité des études scientifiques. Le modèle d'exposition des souris à l'hypoxie intermittente étant déjà bien caractérisé et publié dans la littérature. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte ou adulte afin de mimer au mieux la pathologie clinique qui survient à l’âge adulte. Age de 16 semaines à l'entrée dans l'étude.
Suivi par imagerie de peptides pour le traitement de la maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Sous anesthésie gazeuse, elles reçoivent une injection intraveineuse unique d'un peptide marqué par fluorescence, puis cinq séances d'imagerie, avant mise à mort et prélèvement du cerveau pour vérifier le passage de la barrière hémato-encéphalique. Le porteur limite les nuisances déclarées au stress de préhension lors des pesées et des anesthésies. Il indique avoir sélectionné les peptides par modélisation informatique et tests in vitro en amont, mais affirme que la confirmation du passage "impose" le recours à l'animal.
Objectifs
La Maladie de Parkinson (MP) fait partie des maladies neurodégénératives progressives qui affectent le système nerveux central (SNC) entraînant la mort des cellules nerveuses. Elle est la deuxième maladie neurodégénérative et sa prévalence augmente fortement avec l'âge. Elle est associée à la perte de neurones dans le cerveau et dans les neurones survivants, on observe la présence d’agrégats de protéines qui perturbent leurs fonctionnements. La plupart des thérapies actuelles n'atteignent pas leurs cibles car elles sont incapables de traverser la Barrière Hémato-Encéphalique (BHE), elles procurent un soulagement temporaire des symptômes mais elles sont aussi accompagnées d’effets secondaires graves. Par conséquent, il existe un besoin urgent de nouvelles stratégies thérapeutiques. L'une des stratégies non invasives les plus prometteuses pour l'administration de médicaments au SNC est l'utilisation de peptides pénétrant les neurones mais capables de passer la BHE. Parmi les cibles potentielles, le gène LRRK2 appelé « Dardarine », du mot basque dardara signifiant « tremblement », a été identifié. Ce gène interagit avec une protéine (PP1), cette interaction entraine des mutations du gène LRRK2 identifiées dans la MP. Des peptides interférents (IP) ciblant l'interaction PP1/LRRK2ont été développés dans le cadre de ce projet ANR afin de disposer de nouveaux outils pour aider à comprendre cette interaction et sa signification biologique dans la MP. Ces molécules sont économiques, chimiquement polyvalentes et non immunogènes. Récemment, plusieurs peptides pour la délivrance cérébrale ont été décrits. Parmi les peptides synthétisés, six peptides ont été sélectionnés et associés à trois navettes pour générer des peptides bifonctionnels capables de traverser la BHE et de bloquer l'interaction PP1/LRRK2 dans les neurones du cerveau. Nos objectifs sont de suivre la distribution et la localisation des six peptides marqués avec le fluorochrome Cyanine 7 chez la souris et valider leur capacité à passer la BHE. A l'issue de cette évaluation, le meilleur peptide sera sélectionné et une étude de dose sera réalisée.
Bénéfices attendus
La maladie de Parkinson est une pathologie neurodégénérative et un problème de santé publique. Il existe aujourd'hui des traitements symptomatiques mais ayant une efficacité limitée dans le temps. La recherche d’un traitement curatif efficace pour cette pathologie est donc une nécessité. Ce projet s’intègre dans une approche translationnelle pour permettre l’identification de peptides thérapeutiques pour traiter la MP, et prévenir l’apparition d’effets indésirables graves et fréquents. Ce projet permettra non seulement de confirmer que les peptides sont capables de traverser la BHE mais également, d’envisager leurs utilisations chez les patients atteints de la MP pour prévenir les troubles invalidants. Ces nouveaux traitements permettront d'avoir un bénéfice direct pour les patients et leurs entourages ainsi qu'un bénéfice pour la société en évitant des troubles comportementaux ayant d'importantes conséquences médico-sociaux-économiques.
Procédures
Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux vigiles. Les souris seront soumises à 2 pesées (réalisées sur animal vigile), chaque pesée durera moins de 30 secondes. Afin d'éviter du stress et de l'inconfort aux animaux, l'injection intraveineuse unique de peptide sera réalisée sous analgésie locale couplée à une anesthésie gazeuse (l'anesthésie dure maximum 5 minutes). Les imageries de fluorescence, un total de 5 imageries de 5 minutes maximum par souris sur toute la durée de la procédure, seront réalisées sous anesthésie gazeuse. A la fin de la procédure, un prélèvement sanguin unique et terminal sera réalisé sur animaux anesthésiés et analgésiés, ce prélèvement dure maximum 5 minutes.
Impact sur les animaux
Du stress lié à la préhension des souris pourra être généré lors de la pesée des animaux, deux pesées de moins de 30 secondes seront réalisées. Du stress pourra également être généré au moment de la préhension de la souris pour l'analgésie oculaire (moins de 30 secondes) et lors de l'anesthésie gazeuse, cette dernière dure environ 5 minutes. Une seule injection intraveineuse rétro-orbitaires sur souris anesthésiée sera réalisée (moins de 30 secondes). Du stress pourra être généré lors des anesthésies gazeuses nécessaires pour réaliser les imageries sur les souris (5 imageries maximum/souris).
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de pouvoir prélever les cerveaux qui seront imagés par fluorescence afin de confirmer que le(s) peptide(s) ont passé la barrière hémato-encéphalique.
Remplacement
L'objectif étant de confirmer que des peptides ont la capacité de passer la barrière hémato-encéphalique (BHE), ceci impose d'avoir recours à des animaux pour atteindre l'objectif. Par contre, des études de modélisation informatiques ont permis de désigner des peptides d'intérêt. Une vingtaine de peptides générés vont être évalués in vitro sur un modèle mimant la BHE par une monoculture de cellules endothéliales capillaires cérébrales avec un milieu conditionné par des astrocytes dans un transwell système. Six candidats potentiels seront été retenus et seront évalués dans ce projet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux, seuls 6 peptides couplés à un fluorophore seront évalués. Nous avons également fait le choix de n'utiliser qu'une seule posologie (5mg/kg) pour chaque peptide afin de sélectionner le meilleur candidat et ce, dans le respect du principe de réduction. Le choix de la posologie s'est basé sur des données d'imagerie antérieures utilisant des peptides pour le traitement d'autres pathologies. En conséquence, le nombre d’animaux a été déterminé en réduisant au maximum le nombre de souris par groupe, 4 souris par peptide afin d’obtenir des résultats exploitables et valides. Nous comparerons les moyennes de fluorescence cérébrale des différents peptides (loi normale par un test de Bartlett puis analyses des moyennes par un test ANOVA).
Raffinement
Les souris seront acclimatées durant 4-7 jours à l'animalerie avant d'être incluses dans la procédure qui a été conçue de manière à minimiser les dommages causés aux animaux. Il s'agit d'une procédure de classe légère, du stress pourra être généré lors la préhension des animaux pour les pesées (durée de moins de 30 secondes par animal). Afin de limiter le stress et l'inconfort de l'animal, une analgésie oculaire sera mise en place par l'utilisation d'un collyre ophtalmique. Les souris seront ensuite endormies par anaesthésie gazeuse et les peptides seront injectés par voie intraveineuse (durée de moins de 30 secondes par animal). Les souris seront ensuite imagées à différents temps sous anesthésie gazeuse (5 imageries par animal d'une durée de 5 minutes chacune). Tout au long de la procédure, les souris seront suivies, le registre de soins complété en se rapportant à la grille de suivi de soins.
Choix des espèces
La souris est un modèle très utilisé pour l’étude par imagerie. De ce fait, nous utiliserons des souris, de la souche Swiss non consanguines, qui sont couramment utilisées pour les études de pharmacologie et de distribution. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 7 semaines, adultes et matures sexuellement, dont le poids varie entre 20-30 grammes. C'est l'âge des souris adultes couramment utilisées dans la littérature lors d'étude d'imagerie et de distribution de produits.
Caractérisation de la neurostimulation transcranienne ultrasonore en photométrie par fibre
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
187 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit sous anesthésie une injection de vecteur viral dans le cerveau et l'implantation d'une fibre optique, opération d'une à deux heures, puis des séances de stimulation par ultrasons, avant mise à mort pour analyse du cerveau. Le porteur décrit la chirurgie comme d'impact "modéré et limité dans le temps" et la stimulation comme "indolore et non invasive". Il affirme qu'aucune méthode alternative in vitro n'est disponible, l'étude du comportement reposant sur l'animal vivant.
Objectifs
Ce projet porte sur la neurostimulation ultrasonore. Cette technique permet théoriquement d’activer des zones du cerveau à travers le crâne de manière indolore et non invasive, offrant donc un espoir pour de nouvelles thérapies pour certains troubles neuropsychiatriques sévères. L’objectif de ce projet sera de caractériser les paramètres physiques et expérimentaux permettant une neurostimulation fiable et optimale de plusieurs zones du cerveau qui sont connues pour jouer un rôle important dans ces troubles. Cette caractérisation sera réalisée chez la souris avec une méthode de photométrie par fibre. Celle-ci permet de visualiser l’activité neuronale par imagerie chez la souris, laquelle sera soumise à différents types d’émissions d’ondes ultrasonores. La mesure de l’activité des neurones sera permise par (1) l’expression d’un gène spécial (dont la protéine dégage de la fluorescence en fonction de l’activité des neurones) qui devra être injecté (= transfecté) dans la zone du cerveau que l’on souhaite stimuler et imager, et (2) par une canule optique implantée dans la zone cérébrale dont on veut suivre l’activité neuronale, laquelle pourra être reliée par fibre optique à l’appareil de photométrie lors des mesures et des stimulations ultrasonores transcrâniennes. Le projet comprendra 2 phases : (1) une phase de développement permettant de déterminer l’expression optimale du gène transfecté pour des zone du cerveau superficiel ou profond (40 souris maximum). (2) une phase de caractérisation des effets de neurostimulation par les ultrasons dans différentes zones cibles en fonction des différents paramètres physiques et expérimentaux suivants : fréquence (2 niveaux 0.5 et 1.5 MHz), pression acoustique (10 niveaux de 0 à 500 kPa), distance de la cible (3 niveaux : rayon de 0 – 0.5 – 1 cm), niveau d’anesthésie (3 niveaux de 0.5% – 1% – 1.5% d’isoflurane). La deuxième phase nécessitera 21 souris par zone sur les 7 zones cibles donc un total de 147 souris.
Bénéfices attendus
Ce projet pourra permettre de caractériser les paramètres optimaux de neurostimulation par ultrasons. Ceci est essentiel pour une meilleure évaluation des potentialités thérapeutiques de cette méthode pour de nombreux troubles neuropsychiatriques (comme l’autisme, la dépression et les troubles anxieux)
Procédures
Comme indiqué dans les procédures, tous les animaux (phase 1 et phase 2) seront soumis à une injection de vecteur de transfection et à une implantation de fibre optique sous anesthésie générale (isoflurane), ces interventions durant environ 60 à 120 min. Les animaux des phases 1 et 2 (187 souris maximum) suivront cette procédure (chaque souris subira une seule injection et une seule implantation). Un suivi post-opératoire sera réalisé consistant à un monitoring du poids, de l’alimentation, et de l’observation du comportement en cage accompagné d’un traitement analgésique pendant 3 jours (metacam). Lors de la phase 2, la réalisation des stimulations ultrasonores transcrânienne sera réalisé à la suite d’anesthésie générale gazeuse afin d’installer les animaux dans le dispositif sans stress et de placer le transducteur qui délivre les ondes ultrasonores de manière précise. Cette intervention est néanmoins indolore et non-invasive.
Impact sur les animaux
La chirurgie permettant l’injection du vecteur viral puis l’implantation de la fibre optique pour la photométrie a un impact modéré et limité dans le temps (quelques heures ou jours) sur le bien-être animal, les animaux récupérant rapidement de ce type de chirurgie, et l’encombrement et le poids de l’implant (canule, et fibre pendant les enregistrements) étant très faibles (< 0,1 g) : de nombreux laboratoires ont déjà utilisé ce type d’approche sur l’animal mobile et éveillé sans impact majeur sur le bien-être. La stimulation ultrasonore transcrânienne est une approche non invasive et indolore. L’animal sera installé sur le dispositif (permettant de calculer des coordonnées stéréotaxiques) et testé lors de chaque session à la suite d’une anesthésie gazeuse, limitant ainsi tout stress de manipulation et associé à l’installation dans le dispositif.
Devenir
Procédure 1 : Tous les animaux sont euthanasiés à l’issue de cette procédure Procédure 2 : Tous les animaux sont euthanasiés à l’issue de cette procédure. Lors des 2 procédures, cette étape de mise à mort est nécessaire pour la caractérisation histologique de l’expression du transgène et du placement des canules optiques.
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale à la stimulation ultrasonore transcrânienne nécessite l’utilisation d’animaux.
Réduction
Les effectifs ont été calculés afin de permettre une réduction des effectifs optimisée permettant de suivre les recommandations éthiques en maintenant une puissance statistique d’au moins 0.8 pour une taille d’effet f de Cohen égale à 0.25 à un seuil de significativité de 0.05.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (cabanes plexiglass et cartons, tubes). Les animaux recevront un traitement analgésique (Buprecare, Metacam) avant, juste après et 24 à 48h suivant l’intervention, puis si nécessaire un traitement antibiotique. Chaque animal est placé sur un matelas chauffant pour éviter toute hypothermie. Les cornées sont protégées de la déshydratation. L’anesthésie gazeuse est ici privilégiée pour mieux contrôler la profondeur d’anesthésie et pour une meilleure récupération post-opératoire. Une surveillance post-opératoire d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris et intervenir si nécessaire.
Choix des espèces
Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale à la stimulation ultrasonore transcrânienne nécessite l’utilisation d’animaux. Les animaux seront adultes (âgés d’environ 8 semaines ou plus) au début de l’étude. Justification : il s’agit de comprendre ces phénomènes dans un cerveau adulte (8 semaines correspondant au début de l’âge adulte chez la souris.
Validation pré-clinique de l’efficacité d’un nouveau médicament biologique dans le traitement du mélanome
- Recherche fondamentale
- Oncologie
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome sous la peau puis six à neuf injections d'une molécule développée au laboratoire, avant mise à mort pour analyses. Le porteur qualifie la greffe de "geste rapide et peu douloureux" et n'attend "pas d'effets indésirables particuliers", tout en notant que la tumeur peut gêner le déplacement de l'animal. Il présente la molécule comme une "découverte majeure" et affirme que l'évaluation doit se faire "sur les organismes vivants".
Objectifs
Les objectif de ce projet sont d'évaluer l'efficacité de la molécule thérapeutique développée au laboratoire et de démontrer son inocuité.
Bénéfices attendus
La démonstration de l'efficacité d'une nouvelle molécule anticancéreuse à très faible dose et sans toxicité sur les cellules saine représente une découverte majeure dans le domaine de la cancérologie. Elle serait une avancée notable et un espoir pour les patients intolérants aux thérapies actuelles et souffrant de leurs nombreux effets secondaires.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection sous-cutanée lors de la greffe des tumeurs (1 fois, 20 secondes) et à des injections intrapéritonéales ou sous-cutanées pour l'admisnitration des traitements (6 à 9 sur toute la durée du protocole ; 15 sec par injection) et la mesure de la tumeur.
Impact sur les animaux
La greffe de tumeurs sous-cutanée est un geste rapide et peu douloureux pour les animaux. De plus, au vu des premiers résulats ìn vitro, nous ne nous attendons pas à des effets indésirables particuliers. La croissance tumorale sur le flanc peut parfois géner le déplacement de l'animal.
Devenir
A l'issue de la procédure le sacrifice des animaux sera effectué afin de procéder aux analyses biochimiques et histologiques.
Remplacement
Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictif, les évaluations de nouveaux agents thérapeutiques en oncologie doivent être réalisées sur les organismes vivants. La molécule candidate a été préalablement étudiée ìn vitro. De nouvelles études complémentaires in vitro sont en cours actuellement.
Réduction
Les groupes expérimentaux sont constitués de 10 individus pour le suivi de croissance tumorale afin de disposer d’une puissance statistique suffisante pour l’évaluation des effets de nos traitements. La molécule candidate a été préalablement étudiée ìn vitro. De nouvelles études (tissus-cibles et stabilité de la molécule) sont en cours actuellement. Ces résultats nous permettent d'ajuster plus précisément le nombre d'animaux.
Raffinement
Trois fois par semaine, chaque animal sera examiné, pesé, la taille tumorale sera déterminée à l’aide d’un pied à coulisse. Le raffinement du protocole prendra en compte le suivi rapproché de la taille des tumeurs. Ce suivi individuel permettra la surveillance du bien-être des animaux qui seront hébergés par groupe de dix dans un établissement agréé. La molécule candidate a été préalablement étudiée ìn vitro. De nouvelles études (toxicité) sont en cours actuellement. Ces résultats nous permettent de limiter au maximum les effets potentiellement indésirables sur les animaux.
Choix des espèces
La souris, outre l’avantage lié à ses caractéristiques physiologiques, est un modèle génétiquement homogène et largement commercialisés donc qui permet de standardiser au maximum nos expériences. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles : pas de biais expérimentaux lié à la croissance ou à la puberté. L'utilisation d'un modèle murin offre une large variété d'outils d'analyses biologiques du modèle. Les souris autorisent également une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique chez l’humain. Enfin, le modèle de cellules cancéreuses décrit comme très sensible à notre drogue est d'origine murine.
Immunomodulation sélective par des immunocytokines contenant des variants d’une cytokine immonomodulatrice
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
10 256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie, dont le système immunitaire est reconstitué avec des cellules humaines, reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des traitements répétés, développant des tumeurs mesurées jusqu'à une "taille éthique" et des symptômes de perte de poids et de poils hérissés. Le porteur écrit que l'administration d'un anti-douleur "n'est pas pertinente" pour ces effets indésirables. Il conclut que cette étape chez la souris est "indispensable" pour tester ce type de traitement anticancéreux avant un passage chez l'humain.
Objectifs
Le système immunitaire est impliqué dans le contrôle des infections par des pathogènes viraux ou bactériens et également dans le contexte des cancers. La réponse immunitaire résulte notamment de l’activation de différents types de lymphocytes T dont certains ont une action plutôt positive (cellules T effectrices) et d’autres ont une action plutôt négative et inhibitrice des cellules T effectrices (cellules T régulatrices). Les cellules T inhibitrices sont néanmoins importantes pour limiter les pathologies auto-immunes c’est-à-dire éviter que la réponse immune se mette en place contre notre propre organisme. Il est donc important de développer des thérapies capables d’activer de façon distincte soit les réponses positives effectrices soit les réponses inhibitrices régulatrices. Notre projet consiste à évaluer l’une de ces approches thérapeutiques en utilisant une molécule naturellement produite par le système immunitaire que nous modifions pour lui donner la capacité d’agir plutôt sur les cellules T activatrices ou plutôt sur les cellules T inhibitrices. Cette molécule non modifiée a déjà été testée chez l’Homme et a montré des effets secondaires importants mais en nous appuyant sur nos résultats antérieurs et sur nos brevets, l'équipe a identifié des modifications de la molécule permettant des fonctions plus spécifiques et ainsi limiter les effets indésirables. Notre objectif principal est d'évaluer dans des essais précliniques l'efficacité de ces produits pour contrôler la croissance des tumeurs en utilisant des modèles de tumeurs transplantables chez l‘animal, et de les combiner à d’autres immunothérapies bloquant certaines voies inhibitrices de la réponse immune. Par ailleurs, ce projet permettra d’expliciter les mécanismes d’action des molécules testées afin d’optimiser les traitements et constitue une étape préalable aux essais cliniques chez les patients.
Bénéfices attendus
Notre projet a pour but d’évaluer dans des essais précliniques des molécules modifiées pour agir sur le système immunitaire et permettre un meilleur contrôle de la croissance tumorale. Par ailleurs, cette étude permettra d’analyser les mécanismes d’action de ces molécules et leur éventuelle toxicité et ainsi faire progresser les connaissances scientifiques dans le domaine de l’immuno-oncologie. Les résultats devraient conduire à une meilleure approche thérapeutique antitumorale, seule ou en combinaison avec d’autres thérapies antitumorales pour les essais cliniques chez l’Homme.
Procédures
Dans une 1ere procédure qui vise à évaluer des immunothérapies dans des souris humanisées porteuses de tumeur, les souris vigiles sont injectées par voie intraveineuse avec des cellules immunes humaines, 1 fois par expérience. L’ensemble des animaux de cette procédure sont injectés vigiles par voie sous-cutanée avec des cellules tumorales, 1 fois par expérience. Ils reçoivent également des traitements par voie intra-peritonéale 1 à 2 fois par semaine. La reconstitution en cellules immunes humaines est suivie à l’aide de prélèvements de sang réalisés sur animal vigile ou anesthésié (durée de l'anesthésie
Impact sur les animaux
Les souris immunodeficientes reconstituées avec des cellules immunes sanguines humaines peuvent développer des symptômes de perte de poids ou de poils hérissés à partir de 3-4 semaines environ après l’injection des cellules humaines qui s’intensifient au cours du temps. Les souris immunodeficientes reconstituées avec des précurseurs hématopoïétiques humains peuvent développer également les symptômes décrits ci-dessus mais beaucoup plus tardivement (> 2 mois) et moins fortement. Les souris qui sont greffées avec des lignées tumorales (humaines ou murines) développent donc une tumeur qui est mesurée régulièrement et les souris seront euthanasiées si la taille éthique est atteinte. Aucun effet indésirable n’est attendu suite à l’administration des traitements par voie intrapéritonéale.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour analyses post-mortem
Remplacement
Ce projet découle de résultats obtenus in vitro à l'aide notamment de cellules humaines de donneurs sains. Après des étapes in vitro pour caractériser et sélectionner des IL2V et ICK potentiellement thérapeutiques, et sachant que la tumeur interagit avec l'ensemble de son environnement in situ (vascularisation, stroma…) pour se développer, l'évaluation pré-clinique des traitements est nécessaire dans un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré tel que la souris. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours (culture et test fonctionnels in vitro, analyse de base de données de patients…), cette étape chez la souris est indispensable pour tester l'efficacité et le mécanisme d'action de ce type de traitement avant d'envisager une application clinique chez l'Homme en thérapie anti-cancéreuse
Réduction
Le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum selon que ce sont des expériences de mise au point ou des expériences de test d'efficacité de traitements afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans les conditions réglementaires et l'administration d'un anti-douleur n’est pas pertinente pour diminuer les effets indésirables potentiels . Les souris sont surveillées régulièrement et elles sont mises à mort lorsque les points limites sont atteints.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les expériences menées en thérapeutique du cancer et elle a depuis longtemps servi à l'étude de thérapies antitumorales, notamment car la physiologie de la souris est proche de celle de l'Homme. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques permettant d'identifier des cibles précises pour la thérapie. En effet, il existe un grand nombre de modèles de tumeurs transplantées ainsi que des modèles de tumeurs spontanées qui sont disponibles. Les souris C57BL/6, Balb/c et NSG seront utilisées à l'âge adulte à partir de 6 semaines afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. Les souris humanisées sont reconstituées à l’âge adulte et utilisées environ 18 à 24 semaines après la greffe des cellules CD34+.
Exploration fonctionnelle des différences sexuelles dans la modulation de la douleur
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent selon les groupes une chirurgie sous anesthésie ou une injection dans la patte de carraghénane ou de zymosan pour induire une douleur inflammatoire, neuropathique ou post-opératoire, puis des tests de sensibilité mécanique et thermique (Von Frey, Hargreaves), avant mise à mort au CO2. Le porteur décrit une hypersensibilité "de courte durée et réversible" mais reconnaît une perte de poids et une mobilité réduite après chirurgie. Les bénéfices tiennent en une phrase, développer "de nouvelles stratégies thérapeutiques", et il affirme que l'expérimentation sur souris est "indispensable".
Objectifs
Récemment, nous avons pu identifier des différences sexuelles dans la récupération post-lésionnelle de plusieurs modèles de douleur. Afin de comprendre la physiologie de la douleur, des études comportementales seront réalisées. En effet, le comportement est le résultat d’une intégration complexe de l’information sensorielle de la périphérie vers le cerveau. Notre étude nécessite donc l’utilisation de souris adultes génétiquement modifiées (mâles et femelles) sur lesquelles des tests comportementaux de sensibilité mécanique et thermique, en conditions normales et pathologiques devront être réalisés (inflammatoire, neuropathique et post-opératoire). L’hypersensibilité mécanique et thermique induite lors de la mise en place des conditions pathologiques est de courte durée et réversible dans le temps (sauf procédure 2).
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude pourraient permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques adaptées aux hommes et aux femmes.
Procédures
Pour les chirurgies (procédures 1 et 2), les souris seront sous anesthésie générale (soit 88 animaux au total). Chaque souris ne subira qu’une seule chirurgie et donc une seule anesthésie (chirurgie de courte durée donc une seule injection suffit). Pour les modèles inflammatoires, l’injection intraplantaire de Carraghenane ou de Zymosan ne sera réalisée qu’une seule fois.
Impact sur les animaux
Il est possible qu’après la chirurgie il y ait une perte de poids. D’autre part, une mobilité réduite est engendrée lors des deux premières procédures. Ces effets dureront jusqu’à la fin du comportement douloureux (voir pour chaque procédure).
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort par inhalation de CO2 (concentrations croissantes). En effet, ces animaux ne peuvent être réutilisés pour d’autres procédures.
Remplacement
La thématique principale de notre laboratoire est de comprendre comment et pourquoi une personne a mal. Notre projet nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes in-vitro. En effet, la douleur ne peut être dissociée du système physiologique global de l’animal. Il est donc nécessaire de réaliser une étude comportementale afin d’étudier l’intégration complexe de l’information sensorielle de la périphérie jusqu’au cerveau. Cette approche globale est d’autant plus nécessaire que ces différences comportementales mâle/femelle peuvent émaner de différences génétiques. Celles-ci peuvent impacter la circuiterie comme la signalisation moléculaire à différents niveaux de l’intégration de l’information sensorielle. Ainsi, l’expérimentation sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet.
Réduction
Des stratégies seront mises en place afin de limiter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions liées à l'étude. Ainsi, l’élaboration précise des protocoles de comportement et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. De plus nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues en réalisant toute une série de tests comportementaux non-invasifs sur le même animal, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Par ailleurs, l’utilisation d’outils statistiques permet d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaire. Pour les tests en « time course », les résultats obtenus seront analysés en utilisant la Two-way Repeated Measure ANOVA, avec comme facteurs le génotype, le sexe et l'évolution au cours du temps. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire et génétique des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables. Les procédures décrites sont appliquées depuis plusieurs années au sein de notre équipe et sont maitrisées par les expérimentateurs. Nous avons donc l'expérience nécessaire concernant la réalisation des procédures et l’évaluation de l'impact sanitaire sur les animaux. La qualité de notre plan expérimental ainsi que l’étude détaillée du nombre d’animaux nécessaires à l’obtention d’un résultat scientifique statistiquement valable nous permettent d’optimiser le nombre d’animaux utilisés. Ce projet nécessitera au maximum 168 souris.
Raffinement
Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, dans un environnement enrichi (coton et/ou dôme) pour optimiser les conditions d’hébergement et favoriser un comportement normal afin de diminuer au maximum le stress des animaux. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé et 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages. De ce fait, l’état sanitaire et environnemental des animaux sont contrôlés tous les jours. Nous avons recours à l'anesthésie/analgésie lors du procédé chirurgical et des soins pré-, per- et post-opératoires adéquats sont administrés. Les procédures expérimentales seront planifiées (disponibilité des locaux d'expérimentation, du matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation), ce qui permettra de diminuer le stress des animaux et de favoriser la validité des expériences. Avant les tests de Von Frey et de Hargreaves, les animaux sont habitués pendant 1h dans l’enceinte. Enfin, des points limites les plus précoces possibles seront établis en fonction des tests de comportements utilisés. Un examen clinique est effectué quotidiennement afin de vérifier la cicatrisation et l’état général de l’animal. Toutes ces stratégies d’optimisation sont mises en place dans le but de réduire voire supprimer la souffrance chez l’animal.
Choix des espèces
Chez la souris, les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires à celles décrites chez l’homme. Travaillant sur la physiologie d’animaux adultes, nos tests comportementaux et nos analyses moléculaires seront réalisés sur des souris âgées de 8 à 12 semaines.
Impact de l’hypoxie chez la souris dans la mise en place du sommeil paradoxal chez les nouveaux nés et sur ses réseaux à long terme.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nouveau-nées, une partie est exposée huit jours à une hypoxie sévère (10 % d'oxygène, équivalent à 4 500 mètres) pour reproduire la grande prématurité, reçoit une injection de 4-hydroxytamoxifène, puis à l'âge adulte une implantation d'électrodes cérébrales et une privation de sommeil paradoxal de 48 heures, avant mise à mort et analyse du cerveau. Le porteur indique que la chirurgie a un effet négatif modéré et peut provoquer des irritations autour de l'implant. Il affirme que l'analyse in vivo reste "incontournable" et que la souris est "nécessaire" faute de modèle reproductible in vitro.
Objectifs
La période postnatale correspond à la période critique au cours de laquelle l’environnement façonnent et affinent les neurones contrôlant nos comportements et notre cognition. Des perturbations induites durant cette période peuvent avoir des conséquences dramatiques et persistantes sur le fonctionnement du cerveau. Cette situation se retrouve chez les bébés en prématurité. Il est possible de reproduire la plupart des déficits observés chez les bébés grand-prématurés à travers un modèle rongeur classique dit d’hypoxie chronique. Des études récentes suggèrent une perturbation des réseaux de neurones dans ce modèle animal, qui sont profondes et persistantes. Il est probable que ces perturbations soient responsables de déficits cognitifs variés, incluant des troubles du sommeil. Dans ce contexte, notre projet vise à évaluer la perturbation du sommeil dans un modèle souris d’hypoxie chronique, et de caractériser les perturbations du développement et de l’activité des réseaux neuronaux sous-jacents
Bénéfices attendus
La prématurité touche entre 50 000 et 60 000 naissances par an et est en hausse sur ces dernières années. Comprendre ses effets à long terme c’est permettre de mieux le traiter à terme. Ainsi à travers notre projet nous pourrons évaluer : - l’effet de l’hypoxie sur l’activité neuronale global chez le nouveau-né -l’évolution de cette activité chez l’adulte à partir de l’enregistrement de l’activité cérébrale de l’animal -Cela nous permettra également de savoir à terme comment le sommeil paradoxal est impacté par ce phénomène.
Procédures
L’animal sera soumis à différents protocoles : Protocole 1 (classe modérée) : Après leur naissance, nous exposerons la moitié des animaux à une période d’hypoxie de 8 jours (réduction de la concentration d’oxygène à 10% correspondant à une altitude d’environ 4500 mètres). Les animaux seront ensuite immédiatement marqués après la période hypoxique par injection d’hydroxytamoxifen (4-OHT), marquant définitivement l’activation neuronale chez ces petits puis seront exposés à la suite des protocoles à l’âge adulte. Protocole 2 (classe modérée) : Les animaux seront implantés d’électrodes, permettant d’enregistrer l’activité cérébrale, sous anesthésie à l'âge de 12 à 16 semaines. Cette procédure est utilisée depuis de nombreuses années dans notre laboratoire et optimisée pour limiter son impact sur le bien-être animal. Après une période de récupération d'une semaine, les animaux seront enregistrées afin d’identifier leur activité cérébrale. Des mesures d’enrichissements seront mises en place pour permettre à l’animal d’exprimer un maximum de comportements naturels et compenser son isolement social durant les expérimentations. Protocole 3 (classe modérée) : Ensuite, nous exposerons les animaux, âgées de 12-16 semaines, à une privation spécifique de sommeil paradoxal (SP) pendant 48h. Cette privation conduit, une fois terminée, à une accumulation du SP dans un court lapse de temps (1h30) permettant d’observer son activation neuronale durant une période restreinte (~2h). Cette procédure a été initialement élaborée afin de limiter l’impact de l’expérimentation sur le bien-être animal.
Impact sur les animaux
L’ensemble des procédures utilisées dans ce projet ont été élaborées et sont maîtrisés depuis plusieurs années au sein de notre laboratoire. Aucun signe indicatif de douleur n’a été remarqué pour ces procédures. Cependant, un suivi journalier des souriceaux sera effectué durant l’ensemble des protocoles. Certains effets indésirables minimes peuvent apparaitre : Protocole 1 : Outre les critères d'appréciations de l'état des mères (stress, léthargie…) et des petits (estomac vide, abandon de la mère…) durant la phase d'hypoxie il est possible d’observer une activité de la mère réduite lors de la mise en place de l’hypoxie (réduction du taux d’oxygène). Afin de limiter cet impact il est possible de réduire le taux d’oxygène par paliers afin de passer de 20.9% à 10%. De plus l’injection de 4-OHT peut induire une légère gêne des membres postérieurs de l’animal réduisant légèrement sa mobilité. Cet effet s’estompe généralement dans la demi-heure après injection. Protocole 2 : Les étapes de chirurgies induiront un effet négatif modéré sur le confort des animaux adultes. Outre les critères d’appréciations de l’état des souris post-chirurgie (réduction poids, posture, pelage …) il est possible d’observer chez l’animal des petites lésions/irritations induites par le toilettage de cette zone ou un grattage excessif autour de l’implant. L’application d’une pommade ou de Bétadine sur la zone lésée est alors recommandée. Protocole 3 : Aucun signe indicatif de douleur ni d’effet indésirable n’a été remarqué pour ce protocole.
Devenir
Afin d'évaluer l'impact de l'hypoxie dans la mise en place du sommeil paradoxal chez les nouveaux nés et sur ses réseaux à long terme, tous les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus et effectuer une analyse histologique poussée (marquage immunohistochimique, densité de population neuronale ...)
Remplacement
L’analyse in vivo reste incontournable pour ce projet de Recherche. En effet, les séquelles neurologiques posthypoxiques dépendent de mécanismes complexes impossibles à reproduire in vitro d’où la nécessité d’un modèle animal pour étudier la pathologie. De plus l’étude du SP ne peut être conduite sur des animaux de niveau phylogénétique inférieur (mouche, poisson rouge…). Par ailleurs, notre projet permet d’établir l’évolution d’une activité cérébrale et plus particulièrement du sommeil paradoxal au cours du développement chez les nouveaux nés et à l’âge adulte, nécessitant alors le modèle transgénique décrit précédemment et, par définition d’un modèle transgénique stable, des souris.
Réduction
La petite taille des lots de souris a été calculée au plus juste à partir de nos études antérieures utilisant les mêmes protocoles dans le but de générer des données reproductibles dont la significativité sera validée par les tests statistiques adaptés (Par exemple, si paramétrique, un test de variance Anova à deux dimensions, et si non paramétrique, à une seule dimension, Kruskal-Wallis avec comparaison multiple de Dunn). Elle tient donc compte des ‘’erreurs et échecs’’ qui peuvent survenir à chaque étape de la procédure expérimentale. Pour finir, nous avons mis en place dans l’équipe depuis plusieurs années un système de préservation de toutes les séries de coupes non utilisées. Cette banque de tissu, accessible à l’ensemble de l’équipe est mise à jour systématiquement lorsque de nouveaux tissus ont été produit à la suite d’une coupe de cerveau. Le nombre d’échantillon/puits de coupes disponibles y est indiqué et peut être utilisé à d’autres fins ou futurs projet si ces derniers ont déjà été exploités sur leur projet d’origine. Ainsi, elle permet d’optimiser sur le long terme l’utilisation du tissu tout en réduisant le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
De nombreuses actions de raffinement seront mises en place lors des procédures décrites dans ce projet. Toute procédure de chirurgie (implantation d’électrode…) est étudié pour durer le minimum de temps possible (environs 45min) et sera accompagnée systématiquement d’utilisation d’anesthésiques et d’analgésiques, et d’un suivi journalier des animaux afin de détecter et traiter immédiatement tout signe d’inconfort des animaux. Pour la procédure d’hypoxie, les femelles seront échangées tous les 2 jours entre les cages normoxiques et hypoxiques, afin de préserver la quantité et la qualité du lait qu’elles produisent pour nourrir leurs souriceaux, et de minimiser au maximum le stress conséquent à la procédure sur les animaux. Afin de prévenir le stress engendré par la manipulation de l’animal avant chirurgie par exemple, plusieurs handling seront effectuées les jours précédant le protocole et l’animal sera habitué au préalable à chaque condition (habituation au câble d’enregistrement, aux injections en IP…). Des critères d’interruption des expérimentations et d’exclusion (souffrance physique et psychique, perte de poids…) seront estimés avec une grille d’évaluation quotidienne, leur impact étant délétère sur le sommeil.
Choix des espèces
Notre projet nécessite l’utilisation d’animaux transgéniques afin d’évaluer l’influence de l’hypoxie au cours du temps sur l’activité cérébrale de l’animal et en particulier de l’activité du sommeil paradoxal. Les séquelles neurologiques post-hypoxiques dépendent de mécanismes complexes qu’il est impossible de reproduire in vitro. Un modèle animal est donc nécessaire pour étudier les conséquences à court et long terme de l’hypoxie sur l’activité du sommeil paradoxal. Or, la souris est un des modèles animaux les plus adaptées dans la mise en place d’un génome modifié. De plus l’ensemble des données précédentes recueillis par les différentes équipes sur l’impact de l’hypoxie et sur l’activité du sommeil paradoxal ont été effectuée chez la souris. Ainsi à travers notre protocole une partie des souriceaux seront soumis à une hypoxie de P3 à P11 (8 jours) lorsque les autres seront en condition normoxique. Ensuite l’ensemble des souris retourneront en condition d’hébergement standard jusqu’à l’âge de 12-16 semaines environs, période où l’implantation des électrodes sera effectué pour l’enregistrement de sommeil paradoxal à l’âge adulte une semaine plus tard.
Etude du potentiel thérapeutique de peptides ciblant les oligomères d’Aβ dans le modèle murin APP/PS1 de la maladie d’Alzheimer EU 2/3
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issues d'un élevage de souris modifiées pour la maladie d'Alzheimer, elles reçoivent un peptide par voie intranasale tous les deux jours pendant six mois, puis passent trois tests de mémoire, un test de mémoire de travail spatiale, un test associant un contexte à une émotion et un test de reconnaissance d'objet, avant mise à mort et prélèvement du cerveau. Le porteur indique que l'administration intranasale peut provoquer un stress et une détresse respiratoire. Il affirme que l'usage de ces animaux est "indispensable", les effets sur la mémoire ne pouvant s'étudier qu'in vivo.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer est la forme la plus courante de démence chez les personnes âgées. Elle se caractérise par un déclin progressif de la mémoire et des capacités cognitives, qui est initié par l'accumulation de protéines anormales dans le cerveau. Ces protéines anormales provoquent une altération des cellules nerveuses qui est responsable du déficit de mémoire. Le défi est donc d'augmenter la résistance des cellules nerveuses à cette toxicité. Cependant, les traitements actuels de la maladie d'Alzheimer améliorent les symptômes comportementaux sans modifier l'évolution de la maladie. Une approche prometteuse consiste à contrer l'accumulation de ces protéines anormales à un stade précoce de la maladie et nous avons concu pour cela de nouveaux composés moléculaires. Nous avons caractérisé l'efficacité de ces composés à bloquer la formation, l'accumulation et la toxicité de ces protéines anormales dans des modèles in vitro de la maladie. L'ensemble de ces résultats ouvrent la voie à l’utilisation de ces composés pour lutter contre les altérations cognitives précoces dans la maladie d'Alzheimer. Dans ce projet, ces composés seront utilisés in vivo dans un modèle murin préclinique de la maladie d'Alzheimer, afin d'étudier leur impact sur différents types de mémoire et sur les cellules nerveuses. Les conséquences de cette stratégie expérimentale seront également analysées sur la charge du cerveau en protéines anormales.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ces expériences a pour but de déterminer si cette stratégie peut limiter la toxicité due aux protéines anormales et améliorer de manière durable les capacités de mémorisation chez des souris, modèle de la maladie d’Alzheimer. L’objectif est d’étudier l’impact de ces composés sur les déficits de mémoire, les altérations des cellules nerveuses et la charge en protéines anormales dans le modèle murin de la maladie d'Alzheimer. L’utilisation de ces animaux est donc indispensable à une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques de la maladie d’Alzheimer et à l’estimation d’un effet bénéfique potentiel du traitement sur les déficits cognitifs. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la maladie pour envisager dans le futur de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les 3 procédures envisagées s’appuient sur la production de souris, puis l’administration non invasive de composés d’intérêt par voie intranasale chez la souris vigile pour faciliter leur transport jusqu’au cerveau. Ces traitements d’infusion d’une durée de 10 minutes seront initiés à la 8ème semaine et répétés tous les 2 jours sur une période de 6 mois. Dans la procédure 1 d’élevage, 112 souris transgéniques mâles et femelles APP/PS1 seront obtenues par croisement de souris hétérozygotes à phénotype non-dommageables. Dans la procédure n°2, l’effet de ces traitements sera étudié sur 64 souris (16 souris par groupe) par des tests comportementaux pour évaluer leurs capacités à fixer une information en mémoire. Pour chaque animal, 3 tests comportementaux seront réalisés au 8ème mois. Tout d’abord, un test destiné à évaluer la mémoire de travail spatiale sera réalisé 1 fois sur 5 jours, sur une durée de 8 minutes chaque jour. Après une semaine de délai, un test évaluant la capacité d’associer un contexte à une émotion sera effectué 1 fois sur 2 jours sur une durée de 4 minutes chaque jour. Enfin, après une autre semaine de délai, un test de reconnaissance d’objet sera entrepris sur 3 jours, sur une durée de 20 minutes le premier jour et 10 minutes les 2 jours suivants. Après cette étude comportementale, les souris seront anesthésiées profondément puis mises à mort pour prélever leur cerveau et réaliser une étude biochimique complémentaire. Cette étude permettra d’analyser l’impact des traitements sur la charge en protéines anormales dans ces souris modèle de la maladie d'Alzheimer. Dans la procédure n°3, 48 souris (12 souris par groupe) seront anesthésiées profondément et analgésiées après la fin des traitements, puis perfusées en intracardiaque en état de mort cérébrale pour fixer leur cerveau et réaliser une étude immunohistochimique. L’effet de ces traitements sur les cellules nerveuses sera étudié par un marquage spécifique sur coupes de cerveau.
Impact sur les animaux
L'application intranasale de composés peut induire un certain stress chez la souris. Pour limiter ce stress au maximum, les souris auront une période d'habiuation au protocole de 2 semaines avec un renforcement positif appliqué à chaque étape clé. Des aléas expérimentaux peuvent se produire après l'administration intranasale de composés comme l'induction d'une détresse respiratoire. Pour réduire ce risque, le protocole respecte une attente de 2 minutes entre chaque administration intranasale. Enfin, la possibilité qu'une hypersensibilité aux composés administrés apparaissent chez de rares souris sera envisagée. Dans ce cas, l'animal sera sorti immédiatement de l'étude et mis à mort après induction d'une anesthésie profonde.
Devenir
A l’issue de la procédure 1, les 112 souris seront utilisées dans la procédure expérimentale 2, pour 64 d’entre elles, et dans la procédure 3 pour les 48 souris restantes. A l’issue de la procédure n°2, les 64 souris seront anesthésiées profondément et mises à mort pour prélever leur cerveau et réaliser une étude biochimique en complément de l’étude comportementale. A l’issue de la procédure n°3, les 48 souris seront analgésiées puis anesthésiées profondément et perfusées en état de mort cérébrale pour fixer leur cerveau et réaliser une étude immunohistochimique. Ces 3 procédures permettront de déterminer si l’administration des composés d'intérêt permet de limiter la toxicité due aux protéines anormales, chez la souris modèle de la maladie, et d’améliorer de manière durable les capacités de mémorisation de ces souris, en conservant l'intégrité de leurs cellules nerveuses.
Remplacement
Des études sur ces composés ont été réalisées sur des modèles cellulaires et en éprouvette pour limiter l’utilisation d’animaux au strict nécessaire, c’est à dire à l’évaluation des performances cognitives. Les effets du traitement sur la mémoire ne peuvent en effet s’étudier que dans les conditions in vivo chez l’animal.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est réduit au maximum sans compromettre les objectifs du projet et avoir des résultats statistiquement exploitables. Le nombre de souris a été réduit à n=112 en référence aux études comparables de la littérature. Ce nombre d’animaux est nécessaire car plusieurs traitements seront délivrés par voie intranasale en administrant les composés actifs ou les molécules contrôles chez des souris de génotypes différents. Les performances cognitives de ces souris seront évaluées après traitement grâce à trois apprentissages comportementaux. Comme ces apprentissages successifs peuvent réorganiser les circuits nerveux, il sera nécessaire d'utiliser d'autres souris (procédure 3) pour étudier l’impact des traitements sur la densité et la morphologie des cellules nerveuses. Dans la procédure 2, un même cerveau sera utilisé pour 2 approches différentes (i.e. approche comportementale sur l’animal vivant, puis approche moléculaire avec l’analyse biochimique de la charge en protéines anormales du cerveau). Une compilation d’études de la littérature indique qu’il est nécessaire d’avoir 15 animaux par groupe (4 groupes) pour atteindre la significativité statistique avec un test statistique adapté. Cette limite justifie le nombre de souris fixé à 16 souris par groupe, soit 1 animal supplémentaire à la limite de la significativité, afin de prévoir les possibles aléas (problème survenant lors des 6 mois de l'étude et/ou mort de l’animal).
Raffinement
Avant d’initier le protocole d’administration intranasale, les souris de 6 semaines seront habituées à la manipulation pendant une période de deux semaines. Elles seront habituées à être soulevées, placées en position inclinées vers l’arrière, et à recevoir une microgoutte (2,5 ul) de saline en contact avec la narine pour qu’elle soit aspirée au moment de l’inspiration. Cette habituation sera réalisée de manière à limiter le stress de l’animal lors de l’administration intranasale des composés, et se base sur une technique de renforcement positif avec une récompense sous forme de lait concentré sucré. Les souris seront suivies quotidiennement suite à l’infusion intranasale des traitements. Leur état sera noté selon des critères établis qui prennent en compte divers facteurs (poids, état du pelage, comportement dans la cage et lors de la manipulation de l’animal, fabrication d’un nid). Ceci nous permettra de nous assurer du bien-être des animaux. Tout animal présentant des signes de douleur ou de mal être avec atteinte de point limite sera aussitôt sorti du protocole, anesthésié profondement et mis à mort.
Choix des espèces
Les souris génétiquement modifiées sont couramment utilisées en neurosciences pour l'étude de traitements visant à améliorer les performances de mémoire dans la maladie d’Alzheimer ou pour mieux connaître les mécanismes moléculaires mis en jeu. Ces souris génétiquement modifiées présentent l'avantage unique de mimer les formes dites familiales de la maladie qui sont observées chez certains patients. Des souris âgées de 6 semaines à 8 mois seront utilisées dans ce projet car l’accumulation de protéines anormales dans leur cerveau débute à 8 semaines, et les déficits de mémoire se produisent au 8ème mois chez les mâles ou les femelles.
Effet thérapeutique des cellules stromales mésenchymateuses par ingénierie tissulaire ou thérapie cellulaire dans l’arthrose
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
4 450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit dans le genou des injections de collagénase ou de sang pour induire une arthrose, avec incisions sous anesthésie, une autre partie une implantation de biomatériau suturée sous la peau du dos, pour tester des thérapies cellulaires et d'ingénierie tissulaire. Le porteur indique que les injections de collagénase provoquent une laxité de l'articulation et une douleur modérée. Il annonce des "retombées énormes" à moyen terme pour les patients tout en reconnaissant que ces cellules ne sont encore qu'"en cours d'évaluation" en clinique.
Objectifs
L'arthrose est une maladie articulaire dégénérative caractérisée par une perte progressive de cartilage au niveau des articulations. Plus de 50% des adultes de plus de 65 ans sont touchés par la maladie. Chez les plus jeunes, une arthrose post-traumatique peut se développer suite à des traumatismes accidentels. Enfin, une incidence croissante d’arthrose hémophilique est observée chez les patients hémophiles jeunes suite à des saignements répétés dans les articulations. Dans tous ces cas d’arthrose, aucun traitement curatif n’est disponible, seuls des anti-douleurs et des traitements de viscosupplémentation locale sont proposés. Le traitement ultime est la pose de prothèses. Cette intervention chirurgicale présente un certain nombre de limitations et n'est pas recommandée chez les patients jeunes. Chez ces patients, la réparation du cartilage et de l’os par thérapie cellulaire ou ingénierie tissulaire pourrait représenter une thérapie alternative. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’intérêt de la thérapie cellulaire et de l’ingénierie tissulaire pour diminuer les signes d’arthrose dans deux modèles expérimentaux murins ou favoriser la formation d’un nouveau tissu de réparation du cartilage.
Bénéfices attendus
Les deux approches de thérapie cellulaire et d’ingénierie tissulaire ont une portée translationnelle pour une utilisation en clinique chez des patients souffrant d’arthrose. Ces cellules médicament sont déjà en cours d’évaluation en clinique et nous espérons valider des cellules plus efficaces que les cellules en cours d’évaluation. En outre, ces cellules pourraient être encapsulées au sein d’un matériau et implantées au sein d’une lésion de cartilage chez les patients afin de remplacer le tissu détruit par la pathologie. Cette double approche permettrait à la fois de protéger et réparer les articulations des dégradations associées à l’arthrose. En terme de santé publique, l’impact attendu est majeur puisqu’il n’existe pas de traitement de l’arthrose. Améliorer les stratégies actuelles de thérapie cellulaire ou d’ingénierie tissulaire aura des retombées énormes à moyen terme sur la prise en charge des patients.
Procédures
Une partie des animaux sera soumise à des injections dans l’articulation d’un genou de patte arrière. Selon la procédure, ils recevront 5µL de collagenase (2 fois) ou de sang (injections tous les 2 jours pendant 3 à 6 semaines) suivi par l’injection de cellules ou de vésicules extracellulaires (1 fois) ou bien 5µL de gel contenant ou pas des cellules (1 fois). Une incision d’environ 2 mm est réalisée au niveau de la peau qui recouvre le genou. Toutes les injections se font sous anesthésie générale gazeuse (maximum 5 min/animal) et locale (application de lidocaïne en pommade) au moment de l’intervention. Une autre partie des animaux recevra une implantation d’un matériau contenant des cellules médicament en sous-cutanée. Une incision d’environ 5mm est réalisée au niveau de la peau du dos et le scaffold sera inséré sous la peau. Une suture sera réalisée après l’implantation. L’impantation se fera sous anesthésie générale gazeuse (maximum 8 min/animal) et locale (application de lidocaïne en pommade).
Impact sur les animaux
Nuisance et effets indésirables : faibles à modérés. Les incisions au niveau cutanée pour les injections intra-articulaires et sous-cutanée sont réalisées sous anesthésie (
Devenir
L’ensemble des animaux sera euthanasié à l’issue des procédures pour permettre l’analyse du modèle expérimental et des traitements réalisés (histologie).
Remplacement
Avant de proposer une thérapie cellulaire ou une approche d’ingénierie tissulaire chez l’homme, il est important de démontrer l’efficacité thérapeutique des traitements proposés dans un modèle pré-clinique pertinent. Des modèles in vitro sont utilisés en amont mais ne suffisent pas seuls à évaluer l’efficacité de ces traitements dans un contexte complexe d’inflammation et d’altérations tissulaires rencontrés in vivo.
Réduction
Nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment au laboratoire et une analyse statistique afin de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour chaque expérience. Nous utiliserons donc 15 souris par groupe expérimental afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en portoirs statiques avec couvercles filtrants. L’enrichissement du milieu consiste en l’apport de copeaux dans les litières et carrés de cellulose. Des igloos sont également installés dans les cages. Les animaux font l’objet d’un contrôle visuel quotidien en se basant sur une grille d’évaluation des signes potentiels de souffrance. Surveillance liée aux procédures : Les souris sont examinées pour vérifier la cicatrisation et l’absence d’infection au niveau des incisions dans les jours qui suivent les gestes opératoires.
Choix des espèces
Le modèle murin d’arthrose induite à la collagénase (CIOA) a été choisi parce qu’il présente l’avantage de reproduire assez fidèlement les caractéristiques cliniques observées chez l’homme et est considéré comme une référence de l’arthrose inflammatoire. Les animaux sont utilisés à semaine 10, âge recommandé pour ces modèles d’arthrose ou en ingénierie tissulaire