Rongeurs

224 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nés sans flore intestinale, ils reçoivent par gavage le microbiote de volontaires humains, subissent des prélèvements de selles hebdomadaires, un passage isolé de 24 heures en chambre respiratoire et une contention en tube pour mesurer leur composition corporelle, avant autopsie. Le porteur reconnaît que l'hébergement individuel et le gavage sont sources de stress, tout en les présentant comme brefs. L'objet du projet est de comparer l'effet sur la santé de yaourts et fromages issus d'élevages "agro-écologique ou intensif", et il affirme un "recours absolu" au modèle animal.

Objectifs

L’objectif du projet est de déterminer si des produits laitiers fermentés (yaourts et fromages affinés) fabriqués à partir de lait de vaches élevées en système agro-écologique ou intensif, impactent différemment la santé du consommateur

Bénéfices attendus

Le projet vise à faire la preuve de concept de la divergence de qualité de différents produits laitiers (fromages affinés ou laits fermentés) fabriqués à partir de lait de vaches en élevage agro-écologique ou intensif et des conséquences positives ou négatives respectives sur la santé du consommateur

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 types d'interventions au cours du pojet : 1) gavage orogastrique permettant l'implantation du microbiote du volontaire chez les rats axéniques (animaux nés sans microflore bactérienne colique) : 1 seule intervention, en tout début de projet et d'une durée inférieure à la minute car elle est pratiquée par des zootechniciens formés et expérimentés 2) prélèvements de selles : 1 intervention pas semaine et par animal, d'une durée inférieure à la minute, 3) Le passage dans les chambres respiratoires, qui permet de mesurer les gaz excrétés par les animaux (H2, CO2 et CH4), est réduit à son minimum de 24h et enfin 4) la composition corporelle est mesurée a l'aide d'un appareil analytique type RMN qui effectue les mesures en 3 min, pendant cette durée les animaux sont contentionnés dans un tube PVC afin qu'ils restent immobiles pour la précision des mesures.

Impact sur les animaux

Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Les donneurs étant, dans le cadre de ce projet des volontaires sains, l'alimentation est, de plus, adaptée, n'entrainant pas de troubles digestifs ou de croissance. La supplémentation, basée sur des produits laitiers fermentés de consommation courante, n'entraine pas non plus de nuisance ou d'effets indésirables pour les animaux. Cependant le gavage orogastrique qui va permettre l'établissement du modèle peut être source de stress, lié à la contention de l'animal. C'est pourquoi les animaux sont préalablement conditionnés à la manipulation et que le geste technique est réalisé par des zootechniciens formés et expérimentés qui vont limiter significativement la durée de ce stress potentiel (moins d'une minute). De la même façon, le prélèvement de selles chez l'animal peut être source de stress lié, également, à sa contention nécessaire, toutefois considérant la fréquence (1 fois pas semaine) et de la rapidité du geste (moins d'une minute), les effets indésirables sont très limités. Le placement des animaux en cage individuelle peut occasionner un stress lié à la découverte d'un nouvel environnement et à l'absence de congénaire. Bien que les animaux s'adaptent rapidement, une surveillance accrue sera mise en place pendant toute la durée de la procédure pour détecter d'éventuels signes de mal être. Si des signes apparaissent et persistent pendant les 3 premières heures du passage en chambre respiratoires, les animaux retourneront dans leurs hébergements d'origine. Ce stress est limité par le temps de passage dans les chambres respiratoires réduit à son minimum (24h) et des enrichissements type Sizzle Nest sont également ajoutés à l'environnement pour permettre la réalisation de nid par les animaux.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de cette procédure puis autopsiés afin de récupérer l'ensemble des organes et fluides métaboliques nécessaires aux futures analyses biologiques, génomiques et histologiques.

Remplacement

L’évaluation de l’impact santé de produits laitiers fermentés étudiés (yaourts et fromages produits à partir de lait de vaches en élevage agro-écologique ou intensif) nécessite le recours absolu à un modèle animal pour atteindre notre objectif. Il est en effet très difficile voire impossible d’analyser l’effet potentiel de ces produits sur l’intégrité intestinale (perméabilité, immunité) et la santé cardio-métabolique (masse grasse, tissus adipeux et hépatiques) chez l’homme. Ceci nécessite en effet une alimentation contrôlée et similaire pour tous les individus ainsi que des mesures et des prélèvements particulièrement difficiles à effectuer chez l’homme.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au strict nécessaire pour observer des effets statistiquement significatifs. De plus, les tissus prélevés seront soient analysés pour répondre au questionnements scientifiques proposés par le projet, soient conservés pour de futures analyses, non prélablement prévues dans le cadre du projet, et qui pourraient complémenter les résultats obtenus.

Raffinement

Les procédures, nécessitant un raffinement de leur exécution pour limiter leur impact sur les animaux, sont les gavages orogastriques, les prélèvements de selles et le passage en chambre respiratoire. Celles ci seront réalisées par des zootechniciens formés et expérimentés qui permettront de limiter la durée de la procédure par animal (moins d'une minute pour le gavage et les prélèvemets de selles. De plus, avant la première intervention, une habituation à la contention sera réalisée prélalablement par ces zootechniciens permettant ainsi de diminuer le stress suceptible d'être occasionné par ce geste technique. Les animaux font l'objet d'une surveillance quotidienne pour détecter, réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse. la classification modérée lors du passage en chambre respiratoire est justifiée par le fait que les animaux doivent etre places seul dans ces equipements afin de mesurer individuellement les excretions de gaz. Quelle que soit la procédure appliquée, si un animal présentait les signes suivant : perte de poids, prostration, comportement agressif, léthargique, etc... (points limites notables) ou plaies, saignement nasaux ou fécaux, etc...(points limites graves), l'arbre de décision concernant l'application des point limites serait suivi immédiatement.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies sont des rats mâles nés axéniques de la lignée Fischer âgés de 8 semaines. Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Il permet également le recueil d’une quantité plus importante de fèces et de contenus caecaux nécessaires aux études de la composition et de l’activité du microbiote intestinal que la souris. Les rats seront âgés de 8 semaines au moment de l'implantation du microbiote de volontaire par gavage oro gastrique. Cet âge correspond à un stade de développement optimal pour l'acceptation et la stabilisation dans le temps du microbiote transplanté.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'implantation de cellules tumorales dans le pancréas durant jusqu'à une heure, un suivi par échographie sous anesthésie une à deux fois par semaine, puis un prélèvement de sang et de tumeur avant mise à mort par dislocation cervicale. Le porteur fixe des points limites, une tumeur atteignant 2000 mm³ ou une perte de 20 % du poids déclenchant la mise à mort, sans que ces seuils soient forcément atteints. Le projet vise à mettre au point une technique de greffe présentée comme "plus prédictive" que la greffe sous la peau, et il affirme qu'aucune méthode in vitro ne reconstitue la tumeur et son environnement.

Objectifs

Le pancréas est un organe qui contient 2 types de cellules : les cellules exocrines dont la fonction est de libérer des enzymes et des sucs participant à la digestion et les cellules endocrines qui produisent des hormones notamment impliquées dans l’homéostasie glucidique. Avec 14000 nouveaux cas de cancers diagnostiqués par an, le cancer du pancréas est le 6e cancer le plus fréquent en France. L’adénocarcinome canalaire pancréatique (ACP) qui représente 90-95% des cancers du pancréas, se développe dans le compartiment exocrine et est très agressif et létal, avec un pourcentage de survie des patients à 5 ans inférieur à 10% (seuls 20% des patients souffrant d’ACP survivent plus d’un an). Les prévisions suggèrent que le nombre de cas d’ACP et de décès associés à ce cancer seront multipliés par 2 d’ici 2030. Cette augmentation est associée non seulement au vieillissement des populations, mais aussi à l’augmentation de la prévalence de l’obésité et du diabète dans le monde. Parmi les autres facteurs de risque pour ce cancer, on trouve le tabagisme, l’abus d’alcool et des prédispositions génétiques (

Bénéfices attendus

Actuellement, les études pharmacologiques dans le cadre du cancer canalaire pancréatique sont effectuées sur des modèles de xénogreffes de cellules tumorales humaines sous la peau de souris (greffe ectopique ou hétérotopique). Mais ces modèles ne récapitulent pas toutes les caractéristiques spécifiques associées à l’ACP et notamment le microenvironnement tumoral. La greffe de cellules tumorales pancréatiques dans le pancréas permet de retrouver ce microenvironnement tumoral et est donc considérée plus pertinente pour l’évaluation de nouveaux traitements anti-tumoraux. Ainsi les bénéfices de ce projet seraient de mettre au point un modèle plus prédictif de la pathologie humaine et ainsi de mieux prédire l’efficacité de candidats médicaments chez l’homme.

Procédures

-Puçage : un dispositif sous cutané est implanté à chaque animal quelques jours avant l’étude par trocart afin d’être identifié -Chirurgie pour l’implantation des cellules tumorales dans le pancréas : cette chirurgie durera de 30 min à 1 heure et sera réalisée une seule fois sur chaque animal avec mise en œuvre des bonnes pratiques chirurgicales (asepsie, protocole analgésique pré-post opératoire, surveillance et réveil en enceinte chauffée etc). -Mesure du volume tumoral par échographie sous anesthésie gazeuse. Réalisé une fois avant la greffe puis après rétablissement complet de l’animal suite à la chirurgie (7 à 10 j), à raison de 1-2 mesures échographiques par semaine (8 semaines maximum). La durée d’une mesure est déterminée à environ 30 minutes par souris. -Prélèvement de sang en fin d'étude, sur animal anesthésié et sans réveil consécutif, par ponction à la veine cave ou par ponction cardiaque. -Prélèvement terminal de tumeur : pour tous les animaux en fin d’étude, la tumeur sera prélevée sur les animaux préalablement profondément anesthésiés à l’Isoflurane et euthanasiés par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Tumeur pancréatique limitée à 2000 mm3 ; perte de poids limitée à 20% du poids maximal ; Signes cliniques rares : Abdomen gonflé ou apparition de métastases.

Devenir

Lorsque le volume tumoral est proche de 2000 mm3, ceci constitue un point limite et l’animal concerné est alors euthanasié. A la fin de chaque étude, tous les animaux sont euthanasiés pour réaliser des prélèvements de sang, de tumeur et/ou d’autres organes. Ces prélèvements seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…).

Remplacement

Ce projet a pour but de mettre au point un modèle de greffe orthotopique de cellules tumorales d’origine pancréatique. L’implantation des cellules dans le pancréas permet ainsi à la tumeur de se développer dans le microenvironnement d’origine d’un cancer du pancréas, permettant ainsi de se placer dans des conditions le plus proche possible de la pathologie humaine. Il est impossible à l’heure actuelle de reconstituer in vitro une tumeur et ses interactions avec le microenvironnement, et donc il n’y a pas de méthodes substitutives.

Réduction

-Un accompagnement par le service biostatistique sera réalisé pour estimer la variabilité de la pousse de la tumeur pour chaque lignée cellulaire étudiée dans le cadre de ce projet. Cette étape permettra d'établir le nombre d'animaux nécessaires par groupe pour les études futures d'efficacité de traitement et de pharmacodynamie. -Lorsque les souris seront euthanasiées, des prélèvements de tumeurs seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…). Cette approche permet donc d’optimiser les études et de réduire le nombre d’animaux en évitant de refaire des études pour obtenir des échantillons

Raffinement

- Les souris sont maintenues en groupes sociaux tout au long de l’étude. L’habitat des souris est enrichi de matériel adapté pour leur permettre d’exprimer leurs instincts naturels comme ronger ou nidifier (tube ou dôme, cocoon, sizzle dry) et de l’aliment est distribué dans la cage pour favoriser le comportement de fouissage. -Les animaux font l’objet d’une observation clinique tout au long de l’étude par les expérimentateurs et par les zootechniciens pour s’assurer de leur rétablissement, de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe clinique, les recommandations de la SBEA et les points limites seront appliqués. -La procédure de greffe orthotopique est réalisée selon les bonnes pratiques de chirurgie, avec : odes espaces séparés pour la préparation des animaux et pour la chirurgie oune anesthésie et une analgésie adaptées à la chirurgie oune asepsie maintenue pendant toute la chirurgie -L’analgésie péri-opératoire pourra être adaptée en termes de traitement administré et de durée en fonction des signes de douleurs observés et en concertation avec le vétérinaire. -Le suivi de la croissance tumorale par échographie est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur. Cette mesure est réalisée sous anesthésie gazeuse. Les tumeurs sont mesurées par échographie 1 à 2 fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais aussi pour limiter la souffrance et appliquer les points limites. En cas de volume tumoral s’approchant des 2000 mm3 lors d’une lecture, les souris seront euthanasiées. -Une palpation de l’abdomen est faite 2 à 3 fois par semaine pour suivre la progression de la tumeur. Elle est faite le jour du suivi échographique pour corréler la palpation à la mesure du volume tumoral, puis entre chaque mesure échographique. Cette palpation permet aussi de détecter un gonflement de l’abdomen en cas d’apparition d’ascite.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans la littérature pour la recherche pré-clinique. De plus, la greffe orthotopique de cellules tumorales dans le pancréas chez la souris est couramment utilisée dans les études précliniques d’oncologie. Ainsi la souris est le modèle de choix. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans les protocoles d’efficacité et de pharmacodynamie en oncologie.

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales humaines sur chaque flanc, des injections et des prélèvements sanguins répétés au niveau du sinus rétro-orbital sous anesthésie, avant une mise à mort pour analyser la tumeur, le sang et la rate. Le porteur indique que les tumeurs peuvent s'ulcérer et fixe ce point comme limite, et utilise des souris immunodéprimées pour qu'elles acceptent les cellules humaines. Le bénéfice attendu se réduit à une "preuve de concept" d'un système de globules blancs modifiés, et il affirme qu'on ne peut s'affranchir du modèle murin.

Objectifs

Les cancers représentent un problème de santé publique majeur causant environ 10 millions de décès par an. Les traitements disponibles présentent de nombreux effets secondaires et nécessitent souvent de multiples interventions, d’où la nécessité de nouvelles alternatives thérapeutiques plus efficaces, plus spécifiques, voir ciblées, et ce, sur le long terme. L'un des principaux problèmes expliquant la progression du cancer est l'incapacité du système immunitaire à éliminer les cellules tumorales, car l’environnement tumorale diminue les fonctions des cellules immunitaires. Récemment, des stratégies d'immunothérapie modulant le système immunitaire du patient pour augmenter son efficacité ont suscitées un fort intérêt. L’objectif du projet est d’améliorer le système immunitaire du patient, en modifiant un sous type de globules blancs, afin qu’il discrimine et détruise spécifiquement les cellules cancéreuses. Une protéine sera ajoutée à la surface des globules blancs pour détecter des marqueurs tumoraux et cette détection conduira à la sécrétion localement des molécules médicaments par le globule blanc modifié. L'objectif de ce système est donc d'apporter une solution thérapeutique durable et spécifique aux cancers en : 1) éliminant les cellules tumorales, 2) favorisant les réponses immunitaires anti-tumorales, et enfin 3) prévenant les rechutes grâce à la persistance des globules blancs modifiés et à leur réactivation en cas de nouvelles poussées de la maladie.

Bénéfices attendus

L’observation d’une diminution de la croissance tumorale dans notre projet, nous permettra d’obtenir une preuve de concept de notre circuit synthétique comme solution thérapeutique durable et spécifique aux cancers.

Procédures

- Greffe sous anesthésie : Injection sous-cutanée de cellules tumorales humaines sur chaque flanc (15 min/animaux). - Co injection de lymphocytes B et T par voie intraveineuse au sinus retro-orbitale sous anesthésie (2 min maximum en prenant en compte l'anesthésie et l'injection, le réveil est quasi immédiat) - Prélèvement sanguin au sinus rétro orbital sous anesthésie locale, toutes les deux semaines en prenant soin d’alterner l’œil prélevé (moins d'1 minute). -Injection IP (moins d'1 minute en prenant en compte la contention et l'injection). Pendant 3 semaines 1 fois par semaine -Prélèvement sanguin au sinus rétro orbital, 1 fois sous anesthésie générale (moins d'1 minute). - Les animaux seront pesés une fois par semaine (environ 1 minute) pendant 30 ou 40 jours en fonction de la procédure. - Les tumeurs seront mesurées au pied à coulisse 2 fois par semaine (environ 2 minutes) pendant 30 ou 40 jours en fonction de la procédure.

Impact sur les animaux

Suite à la greffe de cellules tumorales en sous cutanée, une tumeur va se développer et peut induire des distensions et ulcérations des tissus cutanées. Dans notre cas les durées d’expérimentation ne sont pas suffisamment longues pour permettre l’installation de distension des tissus, le point limite le plus critique est l’apparition d’ulcération des tissus cutanés qui peuvent apparaître chez certains animaux avant la fin de l’expérimentation. Le phénotype des animaux est non dommageable car ils sont élevés dans les conditions appropriées (conditions d’hébergement et d’expériences). Aucune douleur n’est attendue suite aux injections et prélèvements en ip et en iv sous anesthésie gazeuse et locale. De même, la pesée et la mesure des tumeurs ne devraient pas générer de douleur.

Devenir

A l'issue des procédure 1 à 3, les animaux seront mis à mort afin d'évaluer l'efficacité anti tumorale des cellules B modifiées en analysant la croissance tumorale ainsi que l’état d’activation du système immunitaire (cellules, cytokines, anticorps) dans le sang, la rate et la tumeur seront suivies.

Remplacement

Des expériences préliminaires ont été réalisées in vitro. Cependant, on ne peut pas s’affranchir du modèle murin. Après leur injection dans le sang, les cellules B modifiées, migrent efficacement et gagnent les organes périphériques secondaires où s’effectueront les étapes de maturation dépendantes de l’antigène : ganglions lymphatiques, rate... L’architecture et l’interaction avec d’autres composants cellulaires, au niveau du centre germinatif de ces organes, vont permettre leur prolifération et leur différenciation en cellules productrices d’anticorps et en cellules mémoires. C’est alors in vivo que nous pourrons observer d’une part la circulation et l’activation de nos cellules B modifiées et par la suite l’effet anti tumoral de ces cellules.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe a été défini après discussion avec des statisticiens, ainsi que sur la littérature scientifique pour estimer les effets attendus et a été réduit au minimum sans mettre en péril une interprétation statistique des résultats. La greffe des différentes cellules tumorales sur une même souris a permis de réduire de moitié le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Le nombre d’animaux par groupe (n=8) a été déterminé en prenant en compte le pourcentage de prise de greffe (80%).

Raffinement

Les manipulations des souris NSG immunodéficientes seront effectuées sous un poste de sécurité microbiologique de type II, ce qui leur permettent d’être dans un environnement complétement stérile garantissant ainsi un phénotype non dommageable. Tout au long des expériences, nous veillerons au bien-être des animaux, à réduire au maximum la souffrance et l'angoisse des souris grâce à la mise en place d’une grille de score clinique. Une période d’une semaine d’acclimatation sera mise en place avant le début du protocole et les animaux seront maintenus en groupes sociaux. Si un animal venait à se retrouver seul, une maisonnette en carton sera mise en place dans la cage. La greffe des cellules tumorales ainsi que le suivi de la bioluminescence seront réalisées sous anesthésie isoflurane afin d’éviter toute méthode de contention prolongée. La Co-injection des cellules B reprogrammées et des lymphocytes T CD4+ par voie intraveineuse au sinus retro-orbitale sous anesthésie isoflurane avec au préalable une anesthésie locale. Les prélèvements sanguins au sinus rétro orbital seront effectués sous anesthésie locale. Un prélèvement de sang total sera réalisé à la fin de l’expérimentation, sous anesthésie profonde au sinus retro-orbital ou intra cardiaque.

Choix des espèces

La souris NSG (NOD SCID-/- gammaC-/-) (absence de lymphocytes B, T et NK) a été choisie pour son immunodéficience sévère permettant la xénogreffe de cellules humaines. D’après notre expérience les souris NSG âgées d’environ 6 semaines permettent une meilleure prise de greffe.

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une craniotomie avec injection intracérébrale et pose d'une barre pour être enregistrées tête fixée pendant qu'elles sont éveillées, un conditionnement comportemental, puis une mise à mort par perfusion transcardiaque. Le porteur reconnaît un maintien en cage individuelle qui prive ces animaux grégaires de relations sociales, ainsi qu'un risque infectieux et l'inconfort du réveil après la chirurgie. Les bénéfices annoncés se limitent à une meilleure compréhension du cerveau présentée comme un "intérêt sociétal considérable", et il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut simuler la cognition.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de comprendre comment une structure clé de l'encodage de l'information spatiale et de la mémoire épisodique (l'hippocampe) est contrôlée par des catégories de neurones spécifiques, locaux (interneurones) ou issus de sa principale structure afférente modulatrice (le septum médian). Il s'inscrit dans l'objectif plus général de comprendre les propriétés des réseaux neuronaux qui sous-tendent l'encodage, le traitement et le stockage des informations ainsi que les déficits cognitifs associés aux principales pathologies cérébrales (neurodéveloppementales, neurodégénératives, épilepsie), sur des modèles expérimentaux chez le rongeur (souris).

Bénéfices attendus

Les avantages escomptés sont une meilleure compréhension du fonctionnement cérébral et de ses pathologies, ce qui représente un intérêt sociétal considérable.

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 types d'interventions, sur une durée totale de 2 à 4 mois : procédures chirurgicales (injection intracérébrale d'agents neuromodulateurs et implantation d'une barre pour enregistrement en mode tête-fixée chez l'animal vigile), d'une durée de 1 à 6h suivie d'une période de récupération d'au moins une semaine et d'attente de l'expression des constructions virales de 2 à 4 semaines, procédure comportementale expérimentale (enregistrements en mode tête fixée chez l'animal vigile) par sessions quotidiennes de quelques minutes au départ (période d'acclimatation d'1 à 2 semaines) puis progressivement jusqu'à 2 ou 3h (période d'apprentissage et d'entrainement, sur 2 à 4 semaines), et enfin anesthésie terminale (perfusion transcardiaque), procédure d'une durée de 30 à 60 min, au cours de laquelle l'animal est mis à mort.

Impact sur les animaux

Les dommages suivants : - l'élevage d'animaux normaux et transgéniques (mais sans phénotype dommageable) - la stabulation dans des conditions standardisées (et donc monotones) afin de permettre des résultats reproductibles et comparables à ceux d'autres laboratoires - les animaux doivent être maintenus en cage individuelle pendant la periode expérimentale, entrainant un déficit de relations sociales chez des espèces grégaires - du conditionnement comportemental afin de caractériser les réseaux neuronaux pendant la résolution de tâches cognitives et d'états cérébraux contrôlés - des anesthésies (avec ou sans réveil) et interventions chirurgicales (craniotomie) afin d'injecter des constructions virales et d'insérer les électrodes d'enregistrement de l'activité cérébrale, avec le cas échant l'inconfort associé au réveil post-chirurgical et un risque infectieux - des mises à mort prématurées (euthanasie) en fin d'expérience

Devenir

Les animaux doivent être maintenus en vie jusqu'à la dernière procédure (terminale), de façon à ce que les données scientifiques soient recueillies, y compris les données histologiques post-mortem.

Remplacement

L'étude des propriétés des circuits neuronaux impliqués dans la cognition nécessite l'observation et la manipulation de systèmes neuronaux intacts, et ne peut donc se faire que sur l'animal vivant. Il est en effet à ce stade de nos connaissances impossible de modéliser de façon réaliste le fonctionnement cognitif in vitro ou in silico. Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car elle présente le meilleur équilibre entre les bénéfices (accessibilité expérimentale et pertinence par rapport aux pathologies chez l'homme) et les dommages escomptés (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation).

Réduction

Seules les expériences absolument indispensables ont été prévues, nous avons évité la répétition inutile d'études antérieures, et le protocole expérimental est soigneusement préparé. Le nombre d'animaux nécessaires pour garantir un pouvoir statistique suffisant pour chacune de nos expériences est ici de 182 souris.

Raffinement

Les animaux utilisés sont des souris transgéniques, qui expriment un marqueur moléculaire permettant de cibler spécifiquement les neurones du type d'intérêt, et de leur faire exprimer des molécules nous permettant de contrôler expérimentalement leur niveau d'activité. Il devient ainsi possible de tester des hypothèses quant au rôle de ces neurones dans le circuit de façon causale (que se passe t'il quand ces neurones sont expérimentalement activés ou au contraire bloqués) et non plus seulement corrélative (quand ces neurones sont ils actifs). Les marqueurs moléculaires spécifiques des lignées utilisées n'ont pas d'incidence sur la physiologie, en dehors des strictes périodes de manipulation de l'activité des neurones, et le phénotype des animaux est donc sans conséquence sur leur bien être. Des éléments de distraction (les animaux sont élevés en cages collectives, autant que possible, selon des normes qui respectent leur besoin d'interactions sociales, et le milieu est enrichi avec du matériel de construction du nid) sont introduits dans les cages d'élevage pour pallier à la monotonie des conditions d'élevage en laboratoire. Pour prévenir, détecter et corriger les conditions de mal-être éventuel, les animaux sont suivis de façon très régulière par du personnel spécialisé, formé et sensibilisé au bien-être animal.

Choix des espèces

Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car cette espèce présente des similitudes neuronales et cognitives suffisantes pour assurer la pertinence des investigations menées par rapport au cerveau humain. La souris est également une espèce de choix pour modéliser les pathologies cérébrales concernées par cette étude, représentant un bon équilibre entre les bénéfices (disponibilité d'outils de biologie moléculaire, de génétique et de pharmacologie, facilité d'élevage, pertinence par rapport aux pathologies chez l'homme) et les dommages escomptés (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation). En outre, une quantité de données considérable dans le domaine des Neurosciences Cognitives a été obtenue avec cette espèce, ce qui nous permet une comparaison des résultats obtenus et une minimisation du nombre d'animaux utilisés en s'appuyant sur des données publiées par d'autres équipes et obtenues à l'aide de protocoles expérimentaux similaires. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes (4-8semaines), car c'est la tranche d'âge qui donne les meilleurs résultats pour les manipulations optogénétiques (meilleur taux de succès d'infection virale, meilleure récupération post-cirurgicale, enregistrements plus faciles sur cerveau jeune du fait des propriétés physiques de la dure mère et du tissu cérébral probablement moins myélinisé) tout en permettant une expérimentation sur un système nerveux qu'on considère mature, et en minimisant autant que possible la durée d'élevage en condition d'animalerie de laboratoire.

650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans la muqueuse orale ou, par incision du thorax, dans le poumon, puis subissent des irradiations et des séances d'imagerie scanner sous anesthésie. Le porteur indique que la tumeur ORL peut gêner l'alimentation et la tumeur pulmonaire la respiration, et prévoit des points limites déclenchant la mise à mort. Le projet vise à entraîner des algorithmes d'intelligence artificielle sur les images, retombées cliniques présentées au conditionnel, tandis qu'il affirme que l'étude de la réponse immunitaire exige un "organisme vivant entier".

Objectifs

L'avènement de l'immunothérapie a conduit à un changement de paradigme dans le traitement de plusieurs cancers solides et hématologiques, conduisant à des résultats impressionnants en termes de survie et de réponse tumorale. Cependant, seule une fraction des patients répond à l'immunothérapie, soulignant ainsi le besoin urgent de biomarqueurs pronostiques et prédictifs. L'infiltration immunitaire tumorale est un élément essentiel de la réponse immunitaire contre le cancer, conditionnant la réponse à l’immunothérapie. Le développement de stratégies non invasives pour quantifier cette infiltration immunitaire tumorale et prédire le résultat du traitement pourraient représenter une avancée majeure. Ce projet vise à développer et tester, dans des modèles tumoraux murins, une approche basée sur l’analyse d’images radiologiques (CT-scans) combinée à des méthodes d’intelligence artificielle pour développer des algorithmes prédictifs.

Bénéfices attendus

À l'ère de la médecine personnalisée, où les stratégies thérapeutiques sont de plus en plus adaptées aux profils spécifiques des patients et des tumeurs, le développement d’algorithmes prédictifs pourrait représenter un outil précieux d'aide à la décision, guidant la prise en charge des patients atteints de cancer. La possibilité de déchiffrer de manière non invasive le microenvironnement tumoral et de suivre la réponse au traitement, par le biais de signatures radio-immunes, pourrait impacter de façon majeure la pratique clinique. De plus, l’opportunité de suivre dynamiquement et "en temps réel" l’infiltration de cellules immunitaires peut nous permettre de proposer de nouveaux traitements sur mesure. Cela pourra améliorer l’efficacité des thérapies et réduire les chances d’échec thérapeutique, en sélectionnant les patients qui ont le plus de possibilités de répondre au traitement sélectionné et en arrêtant précocement des traitements inefficaces.

Procédures

Des injections de cellules tumorales seront réalisées chez tous les animaux, soit au niveau de la babine soit au niveau pulmonaire : - Les cellules tumorales seront injectées directement dans la muqueuse orale des souris préalablement anesthésiées, avec une aguille de petit diamètre (aiguille à insuline) (durée < 5 min). - L’injection de cellules dans le poumon prévoit une petite incision chirurgicale à niveau du thorax de souris (sous anesthésie systémique) pour exposer la plèvre. L’injection sera effectuée travers la plèvre avec une aguille de petit diamètre (aiguille à insuline) (durée max 20 min). Les irradiations seront faites sous anesthésie Kétamine/Xylazine (durée 15 min) Les imageries au micro-CT seront faites sous Kétamine/Xylazine ou Isoflurane (durée 15 min)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables chez les animaux seront occasionnés par l’injection des cellules tumorales. Des difficultés d’alimentation pour les souris avec une tumeur ORL sont possibles. Pour le modèle pulmonaire, la croissance de la tumeur peut engendrer une difficulté respiratoire. Pour ces raisons, nous avons mis en place des stratégies d'expérimentation et d'observation nous permettant de déterminer des points limites suffisamment précoces afin de limiter la douleur à son minimum. En effet, les animaux seront surveillés quotidiennement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales

Remplacement

Ce projet a pour but d’évaluer les effets de la radiothérapie localisée combinée ou non à des immunomodulateurs sur le microenvironnement tumoral et de suivre la réponse au traitement pour dévoiler des signatures radio-immunes. L’étude du recrutement et de la réponse des leucocytes dans la tumeur nécessite la présence d’un système immunitaire efficace dans un modèle dynamique (depuis la production des cellules dans la moelle osseuse, leur libération dans le sang, leur maturation dans les organes lymphoïdes secondaires, jusqu’au recrutement sur le site tumoral) qui ne peut pas être réalisée in vitro. Ceci met en jeu des interactions complexes nécessitant un organisme vivant entier. Les modèles murins sont imparfaits d’un point de vue purement biologique mais permettent d’étudier la réaction immunitaire anti-tumorale in vivo et ont l’avantage d’être d’une taille bien plus faible que chez l’humain, ce qui permet une inclusion en totalité des tumeurs et des tissus environnant pour une analyse histologique exhaustive. Cette inclusion en totalité ouvre une possibilité plus importante de mise en correspondance spatiale d’images histologiques et radiologiques, non réalisable en clinique, et apportera des éléments concrets quant à la réalité biologique d’hypothèses faites depuis plusieurs années en clinique. De plus, des modèles murins permettant la modulation in vivo de sous-populations spécifiques de cellules immunitaires (par exemple la déplétion vs l'enrichissement en CD8) au sein du microenvironnement immunitaire tumoral pourraient renforcer la signification biologique de notre signature radiomique. Nous envisageons pour cela un traitement personnalisé incluant radiothérapie et agents immunomodulateurs (par exemple anti-TGF beta, anti-CD8) capables d'agir sur la contexture immunitaire tumorale.

Réduction

La génération d’un algorithme prédictif et pronostique par deep learning nécessite l’analyse d’un large set de données. En effet, cela est nécessaire pour un bon entraînement des algorithmes de prédiction. De plus, il est nécessaire d’utiliser une cohorte indépendante sur laquelle tester l’efficacité des algorithmes développés. Il n’existe aucune donnée dans la littérature concernant des analyses radiomiques dans des modèles tumoraux murins. Notre estimation de 50 souris par groupe est donc basée sur des observations cliniques et sera adaptée sur la base des données obtenues pendant la réalisation du projet. En outre, les modèles murins que nous utiliserons ont déjà été testés et validés dans de nombreuses publications, et la collaboration avec Gustave Roussy nous permettra d'avoir des modèles déjà testés et performants, minimisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

Nous avons mis en place des stratégies d'expérimentation et d'observation afin de réduire au minimum la souffrance et la douleur des animaux. Les souris seront hébergées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Les animaux seront anesthésiés pour les procédures d’injection des cellules tumorales, d’irradiation et d’imagerie. De plus, l'environnement des animaux sera enrichi en permanence par du coton ou des nids en carton afin de diminuer leur angoisse et favoriser leur bien-être. Une pesée sera effectuée régulièrement. Les points limites seront strictement appliqués. - Le développement de la tumeur ainsi que les signes de toxicité (perte de pois, prostration) seront évalués 3 fois par semaine (euthanasie des souris dès qu’un point limite est atteint). -Un complément alimentaire (Renutryl, Nestlé) sera administré aux souris pour limiter les effets de l'asthénie et de l'irradiation. - Des aliments mous (pellets ramollis d’eau) pourront également être mis dans les cages pour faciliter l’alimentation des animaux

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie et est parmi les plus utilisées pour étudier les réponses immunitaires pendant le développement tumoral. De plus, pour des raisons de taille, de prix et de temps nous avons choisi cette espèce. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui promeut et facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en clinique. Les souris seront âgées de 8 ou 9 semaines, âge auquel les souris sont suffisamment matures. De plus, les modèles tumoraux ORL et pulmonaire ont été développés et caractérisés en utilisant des souris de cet âge, et nous allons maintenir ces mêmes paramètres pour cette étude.