Rongeurs

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié est rendue obèse et prédiabétique par un régime hypercalorique de deux à quatre mois, puis toutes sont opérées pour poser un cathéter dans l'intestin grêle et reçoivent des perfusions quotidiennes et des prélèvements de sang à la queue. Elles sont ensuite tuées pour prélever leurs organes. Le porteur présente le projet comme un "passage obligé vers la clinique" et affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité d'un organisme vivant.

Objectifs

De nombreuses bactéries vivent dans le tube digestif, elles représentent 90% du microbiote intestinal. Celui-ci régule le métabolisme énergétique et le système immunitaire. Ces bactéries produisent une grande diversité de substances bactéricides, appelées bactériocines. Ces bactériocines agissent comme des antibiotiques et permettent aux bactéries qui les produisent de se défendre contre des bactéries pathogènes. Nous utiliserons un modèle préclinique de souris, rendues obèses et prédiabétiques par un régime alimentaire riche en graisses. Ces animaux souffrent également de dysbiose. Les animaux contrôles, seront nourris avec un régime standard. Suite à des recherches bibliographiques, nous avons sélectionné une bactériocine, qui pourrait avoir un effet bénéfique sur l’homéostasie glucidique et la composition du microbiote intestinal. Nos résultats précédents nous ont permis de démontrer l’effet positif d’un traitement intra-péritonéal avec cette molécule sur la tolérance au glucose et la sécrétion d’insuline chez des souris prédiabétiques. Ainsi, ce peptide est potentiellement une cible d’intérêt via un effet direct sur des tissus cibles. Nos derniers résultats ont également montré que, lorsque ce peptide est administré par voie orale pendant plusieurs jours, celui-ci est dégradé au niveau du duodénum. Ainsi il n’atteint pas le colon, au niveau duquel il pourrait avoir un effet bénéfique sur la composition du microbiote intestinal. Ce peptide est produit naturellement dans l’intestin et il agit sur son environnement immédiat en participant à l’équilibre de l’écosystème microbiotique. C’est pourquoi nous aimerions l’administrer quotidiennement par voie entérique, à l’aide d’un cathéter placé directement au niveau iliaque de l’intestin grêle chez la souris. Notre projet vise à étudier et valider la preuve de concept du rôle de ce peptide en tant que régulateur de l'homéostasie du glucose et ayant un effet bénéfique sur la composition du microbiote intestinal. Ainsi cette molécule pourrait constituer une nouvelle classe de médicaments pour le traitement du diabète de type 2. Au cours de cette étude, qui durera 5 ans, nous utiliserons 192 animaux.

Bénéfices attendus

Le peptide que nous utilisons est produit naturellement dans l’intestin et il agit sur son environnement immédiat en participant à l’équilibre de l’écosystème microbiotique. Dans des situations de déséquilibre de cet écosystème, comme observé dans les situations d’obésité ou de diabète de type 2 (DT2), une administration par voie entérique de notre molécule pourrait avoir des effets sur la composition du microbiote intestinal et sur la régulation de l’homéostasie glucidique. Notre projet vise à étudier et valider cette preuve de concept, et pourrait constituer une nouvelle classe de médicaments pour le traitement du diabète de type 2.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1. La moitié des animaux sera nourrie avec un régime hypercalorique pendant 2 à 4 mois, ainsi ces animaux deviendront prédiabétiques. 2. Les animaux seront opérés pour placer un cathéter dans l’intestin grêle. Ils seront opérés une fois, la chirurgie sous anesthésie générale dure 45 minutes. 3. Les animaux seront perfusés une fois par jour pendant 10 minutes, pendant 5 jours. Puis ils auront 2 jours de pause avant d’être à nouveau perfusés une fois par jour pendant 10 minutes, pendant 5 jours. Les animaux seront vigiles. 4. Les animaux seront utilisés pour faire des tests : deux fois pendant deux heures, à 7 jours d’intervalle. Pendant ces 2 heures nous mesurerons leur glycémie 6 fois et nous prélèverons un petit volume de sang (au bout de la queue, 4 fois). Les animaux seront vigiles.

Impact sur les animaux

Pour tous nos protocoles nous veillons à diminuer les effets indésirables prévus sur les animaux. Nous utilisons un régime alimentaire riche en gras, pour rendre nos animaux obèses, mais nous leur laissons le régime standard pour que les animaux aient toujours le choix. Malgré leur prise de poids, les animaux se déplacent correctement. Pour la chirurgie nos animaux reçoivent des soins avant, pendant et après l’opération afin d’éviter toute souffrance. Nous les surveillons tous les jours après l’opération jusqu’à leur rétablissement. Avant d’effectuer des tests sur nos animaux, nous les habituons pour diminuer leur stress le jour de l’expérience. Pendant l’expérience, nous respectons les volumes de prélèvement et d’administration autorisés, et nous les surveillons.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, car nous avons besoin de prélever leurs organes pour les analyser ultérieurement.

Remplacement

Notre projet correspond à un travail de phase préclinique visant à tester l'effet anti-diabétique d'une nouvelle molécule. C'est donc un passage obligé vers la clinique et l'Homme. Il n'existe pas actuellement de modèle in vitro permettant de reproduire la complexité d'un organisme vivant. Enfin, nos modèles murins, à savoir les souris C57BL6j mâles rendues obèses par régime hypercalorique, sont très bien caractérisées au niveau métabolique depuis plusieurs dizaines d'années dans plusieurs laboratoires, dont le nôtre.

Réduction

Dans le domaine de la diabétologie et vu le type de mesures que nous allons effectuer, nous limiterons au maximum le nombre d’animaux par groupe (n=8) de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et la prise en charge de la douleur est prévue avant, pendant, et après l’opération. L’ensemble des procédures de ce projet visent à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal.

Choix des espèces

Les souris ont une physiologie métabolique proche de l'Homme notamment en ce qui concerne la régulation de la glycémie; et sont souvent utilisées comme modèles de pathologies humaines, comme l'obésité et le diabète de type 2. De plus, nous voulons tester l'effet de notre molécule sur un modèle animal, dans la perspective de la tester ensuite dans une phase clinique humaine. Afin d'obtenir des souris obèses et prédiabétiques, nous devons les soumettre à un régime hypercalorique, à partir de l'âge de 8 semaines, pendant 2 mois. Ainsi, toutes nos expériences seront réalisées sur des souris adultes d'un âge minimal de 4 mois. Utiliser des animaux adultes mime la situation chez l'Homme où le diabète de type 2 apparait également à l'âge adulte.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont la moitié vigiles au moment de la mise à mort, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris transgéniques modèles de la maladie d'Alzheimer, elles subissent une chirurgie pour implanter une pompe délivrant le traitement, des tests comportementaux, puis sont tuées pour analyser le cerveau. Les souris perdant plus de 15 % de leur poids ou montrant prostration ou agressivité sont mises à mort. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de modèles alternatifs validés" et que l'euthanasie est "incontournable".

Objectifs

La maladie d’Alzheimer sous sa forme sporadique est le résultat d’interactions fortes entre des facteurs génétiques et environnementaux. La cause primaire et les mécanismes sous-jacents restent à ce jour inconnus, mais un lien important semble exister entre la maladie d'Alzheimer et le stress. Cependant, le rôle du stress dans cette maladie est très mal connu. Il nous a donc semblé important de caractériser de façon précise l’implication des hormones du stress (les glucocorticoïdes) dans la maladie d'Alzheimer et d’évaluer le potentiel thérapeutique des glucocorticoïdes, grâce à l’utilisation de nouveaux modulateurs sélectifs de leurs récepteurs (sGRm), dans un modèle préclinique de la maladie d’Alzheimer, la souris transgénique J20. Ce projet comprend 2 objectifs principaux: Déterminer l’impact d’un traitement chronique (4 semaines) avec un modulateur sélectif des récepteurs aux glucocorticoïdes sur l’évolution de la pathologie Alzheimer chez des souris J20 ; et d’évaluer l'efficacité de ce traitement chronique à long terme.

Bénéfices attendus

La maladie d’Alzheimer est le résultat d’interactions fortes entre des facteurs génétiques et environnementaux. La cause primaire et les mécanismes sous-jacents au développement de la maladie d'Alzheimer restent à ce jour inconnus, mais un lien important semble exister entre la maladie d'Alzheimer et l’hypersécrétion précoce des hormones du stress ou glucocorticoïdes. Cependant, le rôle de ces hormones, ainsi que leur potentiel thérapeutique dans la maladie d'Alzheimer reste très méconnu. L’objectif de cette étude sera donc d’évaluer le potentiel thérapeutique d’une nouvelle famille de molécules très sélectives modulant l’activité des récepteurs aux glucocorticoïdes. Si l’efficacité de ces modulateurs sélectifs est démontrée, une étude clinique chez des patients atteints de la maladie d'Alzheimer pourra être envisagée très rapidement, dans la mesure où les tests de toxicité chez l’homme ont été validés sur cette famille de composés et que l’une de ces molécules est déjà en clinique (Phase II) dans le cadre d’une autre pathologie associée aux stress.

Procédures

L’ensemble des animaux (160 animaux) seront soumis à une procédure chirurgicale pour la mise en place de la pompe osmotique (durée 5 minutes sous anesthésie gazeuse), à des tests comportementaux et enfin seront mis à mort pour l’analyse des tissus cérébraux. Mise à mort sur animaux anesthésiés (80 animaux) ou vigiles (80 animaux). Les animaux seront suivis entre 4 (80 animaux) et 8 semaines (80 animaux).

Impact sur les animaux

L’incision nécessaire à l’introduction de la pompe osmotique délivrant le traitement peut entrainer un inconfort temporaire (dans les 24h suivant la chirurgie), et induire un grattage plus important au niveau de la cicatrice. Afin d'éviter au maximum cet effet lié à la cicatrisation, l’incision est réalisée au niveau de la nuque de l’animal, une zone moins accessible au grattage.

Devenir

Dans la mesure où il sera nécessaire d’étudier l’impact des différents traitements sur le cerveau, l’euthanasie des souris est incontournable.

Remplacement

De manière très générale, il est aujourd’hui très difficile en neurosciences d’étudier le fonctionnement du cerveaux sur des modèles simplifiés et donc de remplacer l’étude sur l’animal dans sa globalité. En effet, il n'existe pas de modèles alternatifs validés pour étudier la neurodégénérescence et le déclin cognitif dans la maladie d’Alzheimer.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé pour ne pas compromettre les objectifs du projet. Le nombre d'animaux est basé sur une connaissance approfondie des modèles et de l'expérience acquise par notre équipe. Le nombre d'animaux a été déterminé par un logiciel de statistique.

Raffinement

Afin de minimiser les effets du stress, mais également de contrôler l’état général des animaux, l’animalier, et/ou l’expérimentateur, manipuleront quotidiennement les animaux et observeront le comportement général de l’animal, ainsi que leur apparence. Toute observation anormale (comportement, poids, pelage, plaie,…) sera transmise à l’expérimentateur afin d’être traitée dans les plus brefs délais et sera noté dans un tableau de suivi expérimental. Un animal sera euthanasié s’il présente, une perte de poids > 15%, une attitude inhabituelle traduisant un mal être (prostration, agressivité...), ou l’apparition de toute altération de l’état général (altération du pelage, tumeur, excroissance, prolapsus…).

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix au niveau international pour l’étude de la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer. Ces études chez l’animal vigile sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements potentiels. De plus, l'utilisation d'animaux transgéniques (modèle de la maladie d’Alzheimer) justifie également le choix de cette espèce. Nous allons réaliser le traitement chronique sur le modèle souris Alzheimer entre 6 et 9 mois. C’est-à-dire à un âge où ces souris présentent des déficits comportementaux, et une augmentation des différents marqueurs biochimiques associés à la physiopathologie Alzheimer, mais aussi une hyperactivité de l’axe du stress (augmentation des taux sanguins en glucocorticoïdes).

1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du sein triple négatif, puis un suivi hebdomadaire par imagerie et des contentions répétées pour mesurer la tumeur, celle-ci pouvant atteindre 2 000 mm³ avant la mise à mort, avec perte de poids et parfois nécrose. Elles sont ensuite tuées pour prélever tumeur, poumons et rate. Le porteur affirme que ces phénomènes "ne peuvent être reproduits in vitro" et conclut que le recours aux animaux est "indispensable".

Objectifs

Les cancers figurent parmi les principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. Les origines du cancer sont multiples et font intervenir à la fois des facteurs génétiques et des agents extérieurs. Il a été démontré que la suractivation et/ou la surexpression de la protéine Rac1 (membre de la superfamille des protéines Rac) entraine l’initiation de différentes étapes de l’oncogénèse telles que la progression, l’invasion tumorale et la formation de métastases. Ces résultats suggèrent que l’inhibition de l’activité de Rac1 serait une nouvelle stratégie thérapeutique contre la progression tumorale et des métastases. Notre objectif général est de développer de nouveaux inhibiteurs de Rac1. Après un programme de recherche dédié à l’identification de nouveaux inhibiteurs, nous avons sélectionné une molécule « lead » qui inhibe spécifiquement la protéine Rac avec une efficacité et une affinité supérieure aux molécules commerciales (EHT1864 et NSC23766). Les propriétés thérapeutiques anti-métastatiques de cette molécule lead ont été évaluées dans des modèles murins de cancer du sein triple négatif . Les résultats prometteurs de cette étude nous ont amenés à développer une série chimique issue de notre molécule lead pour optimiser ce nouvel inhibiteur de Rac et envisager une utilisation clinique. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les effets anti-tumoraux de ces nouvelles molécules sur la croissance tumorale, le système immunitaire et la survie à l’aide de modèles murins ( immuno-compétents et immuno-déficients) de cancer du sein triple négatif

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier et de caractériser de nouveaux inhibiteurs de Rac. Au regard de nos premiers résultats, ces inhibiteurs devraient présenter des propriétés anti-tumorales et anti-métastatiques. Ainsi le développement de ces molécules permettrait d’envisager de nouveaux traitements (first in class) dans de nombreux cancers invasifs tels que le cancer du sein ou le cancer du côlon pour lesquels les impasses thérapeutiques sont nombreuses, menant au décès du patient.

Procédures

Les animaux (n=1800 maximum) subiront une greffe de cellules de cancer du sein (modèle triple négatif). Une imagerie sera réalisée sur tous les animaux une fois par semaine pour suivre l’évolution des métastases. Tous les animaux seront également soumis à une contention (2 fois par semaine pendant 40 jours maximum) pour évaluer la croissance tumorale (mesure au pied à coulisse). Aucun prélèvement sera réalisé sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Ces 2 modèles de cancer du sein triple négatifs sont maitrisés dans notre laboratoire depuis plusieurs années. Notre première étude met en évidence que l’injection chronique d’un inhibiteur de Rac1 n’induit pas de toxicité chez l’animal mais permet de diminuer la fréquence des métastases, le volume de la repousse tumorale et augmente statistiquement la survie des animaux. Les 2 procédures expérimentales consistent à effectuer des greffes sous-cutanés chez des souris. Ce geste chirurgical de grade modéré peut entrainer une légère douleur et une irritation passagère qui seront surveillées et contrôlées par une médication appropriée et décrite dans cette saisine. L’évolution de la tumeur sera surveillée tout au long du protocole pour limiter les nuisances liées au modèle. En effet, par exemple la taille de la tumeur ne doit pas entraver la mobilité de la souris. Par conséquent, si la tumeur atteint 2000mm3, point limite de ces procédures, la souris sera mise à mort. Dans ce type de modèles, les nuisances attendues sont également une perte de poids (ou une non prise de poids, surtout au début du protocole) et parfois une nécrose au niveau de la tumeur peut également apparaitre. Les nuisances attendues dans ce type de modèle devraient être moindre chez les souris traitées avec les inhibiteurs de Rac1.

Devenir

Procédure 1 : Mise à mort des animaux au maximum 40 jours après le début des traitements ou si un point limite est atteint. Procédure 2 : Mise à mort des animaux faite pour récupérer la tumeur, les poumons et la rate. Ces prélèvements biologiques post-mortem seront nécessaires pour étudier et caractériser les lymphocytes infiltrant la tumeur

Remplacement

Le cancer et la formation des métastases sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes et de nombreux acteurs conduisant en particulier à l’échappement des cellules cancéreuses de la tumeur primaire et leur dissémination dans l’organisme. Tous ces paramètres ne peuvent être reproduits in vitro c’est pourquoi le recours aux animaux est indispensable.

Réduction

Ce projet utilisera au maximum 1800 souris sur 5 ans. L’utilisation d’une technique d’imagerie permet de suivre au cours du temps de façon non invasive la taille des tumeurs ainsi que la cinétique d’apparition des métastases et d’autre part d’évaluer l’efficacité des traitements. Cette approche permet de réduire de façon notable le nombre d’animaux nécessaires par groupe. Cette approche permet également de visualiser et quantifier le volume des tumeurs et donc, en parallèle de l’observation comportementale, de pouvoir adapter l’analgésie à mettre en place et de déterminer le jour auquel il faut procéder à l’euthanasie de l’animal. De plus, en cas de résultats négatifs d’une molécule testée dans la 1ère étape expérimentale, l’étape 2 ne sera pas engagée ce qui réduira considérablement le nombre de souris utilisées (soit 240 souris/molécule testée). Nous utiliserons un test de Mann-Whitney pour les analyses intergroupes, un test de Wilcoxon pour les intragroupes et un test de Log-rank sera utilisé pour l’analyse de la survie. Une p-value inférieure à 0.05 sera considérée comme significative.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement par des personnes expérimentées afin d’assurer le bien-être des animaux et détecter toute souffrance. Uniquement le personnel qualifié et expérimenté réalisera les expérimentations animales afin que les procédures soient réalisées efficacement et avec les soins appropriés afin de réduire au maximum le stress et la souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés 3 à 5 par cages et les cages sont enrichies avec des frisottis. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses humaines (modèles de xénogreffes sur souris immunodéprimées) et murines (modèles syngéniques sur souris immunocompétentes). Pour cette étude, nous utiliserons de jeunes femelles adultes (âgées de 8 semaines) pour bénéficier de l’influence hormonale sur la croissance tumorale (tumeur mammaire)

15 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le modèle leur impose de sévères atteintes du squelette, cyphose, scoliose et déformation de la cage thoracique, et une espérance de vie réduite par le risque de rupture de l'aorte, entre 27 et 240 jours. Elles reçoivent des injections, jusqu'à six prélèvements de sang et une biopsie de l'oreille, puis sont tuées pour analyse des organes. Le porteur annonce un bénéfice "éventuel à long terme" pour les patients atteints de cette maladie rare et affirme que le projet "ne peut pas se faire sans modèle animal".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer une nouvelle approche thérapeutique pour une maladie des os avec des troubles cardiovasculaires. En effet, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif pour cette maladie. Les seules approches thérapeutiques actuellement utilisées sont des approches palliatives et seulement pour les symptômes cardiovasculaires de la maladie.

Bénéfices attendus

Le projet va nous permettre de faire la preuve de concept chez l’animal d'un traitement pour cette maladie. Il s’agit d’une maladie rare sévère pour laquelle à l’heure actuelle il n’existe aucun traitement. Dans le cas où cette approche fonctionnerait cela nous permettrait de continuer le développement dans le but d’apporter un jour un traitement efficace pour les patients. Il s’agit donc d’un bénéfice éventuel à long terme pour ces patients.

Procédures

Les animaux sont soumis à des injections traitements (30 secondes), ainsi que des prélevements de sangs (5 minutes). Les prélèvements de sang sont sur animal anesthésié et un animal aura maximum de 6 prélèvements dans sa vie. Les animaux auront également une biopsie d'oreille pour déterminer s'ils sont porteurs de la maladie (20 secondes).

Impact sur les animaux

Le modèle de souris utilisé dans ce projet a d’importantes atteintes squelettiques comprenant une sévère cyphose, une scoliose et une surcroissance de la cage thoracique ainsi qu’une espérance de vie réduite due à une importante probabilité de rupture aortique. Il est connu que l’espérance de vie de ces animaux est de 27 à 240 jours notamment à cause des problèmes vasculaires intervenant à des âges différents selon les animaux et ne pouvant donc pas être prédits. Cependant ces animaux arrivent à se déplacer et manger. Toutes ces altérations sont caractéristiques de la pathologie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. En effet, le projet nécessite d'étudier la structure des organes afin de vérifier l'efficacité du traitement testé et cela ne peut se faire que sur animal euthanasiés.

Remplacement

Globalement, la construction des traitements et l’optimisation de ces derniers se sont faites et continuent à se faire en se basant sur des publications scientifiques, et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés. Les différents traitements produits sont précédemment testés in vitro afin de valider leur efficacité. Une importante recherche bibliographique a été effectuée afin d’identifier les cellules atteintes lors de la pathologie et ainsi développer un traitement le plus ciblé possible.

Réduction

Le juste nombre d’animaux a été calculé de manière à réduire le nombre minimum d’animaux par lot, tout en produisant des résultats statistiquement significatifs et robustes. De manière à répondre aux exigences de réduction, nous allons utiliser des groupes contrôles en commun chaque fois que cela est possible. Globalement, un ensemble de 10-12 animaux par groupe sera suffisant pour valider l’efficacité d’un traitement.

Raffinement

​Les animaux sont hébergés en groupe à maximum 5 par cage . Chaque cage contient des enrichissements de type tige en papier, igloo et buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les malocclusions des incisives. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima trois fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et mis à mort dans les 24 heures avec l’accord du directeur d’étude et/ou d’un vétérinaire.

Choix des espèces

Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant du Syndrome de Marfan, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie, et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs. Ce modèle de souris est pertinent car il a été construit pour mimer la pathologie et plusieurs études démontrent que les principales caractéristiques de la pathologie sont retrouvées dans ce modèle. Les animaux seront utilisés de la naissance jusqu’à environ 24 semaines maximum afin de pouvoir caractériser chacune des étapes du développement de la pathologie.

100 mulots sylvestres capturés dans la nature vont être utilisés, tous tués à l'issue par dislocation cervicale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des prélèvements de sang par voie rétro-orbitaire sous anesthésie et une injection de LPS, avant d'être tués pour prélever leurs organes. Le porteur anticipe une mortalité de 3 % dans les pièges et un stress lié à la capture et à l'hébergement. Il affirme que l'usage d'animaux sauvages est "requis", la réponse immunitaire des individus sauvages différant de celle des animaux de laboratoire.

Objectifs

Le concept de «One Health» postule que la santé humaine, animale et environnementale sont liées et promeut une approche systémique des questions environnementales, au profit des problématiques de santé publique associées. De nombreux changements environnementaux induits par les activités humaines (Fragmentation des habitats, pollution, zoonoses, ...) affectent les écosystèmes et la faune sauvage à l’échelle mondiale. Parmi ces menaces, l’exposition aux éléments traces métalliques (ETM) peut induire de nombreux effets toxiques à tous les niveaux d’organisation biologique (de la molécule aux services écosystémiques). L’exposition de Mammifères sauvages à des ETM toxiques a montré un effet immunosuppresseur aussi bien en laboratoire qu’en milieu naturel, les rendant potentiellement plus susceptibles aux pathogènes circulant dans l’environnement. Les performances du système immunitaire des animaux sont par ailleurs modulées par la qualité et la quantité des ressources alimentaires disponibles dans leur environnement. Les études abordant les effets des métaux sur le système immunitaire des Mammifères terrestres in natura sont rares et les mécanismes de l’immunomodulation par les métaux et par les ressources alimentaires mal connus. Des études comparatives portant sur le système immunitaire de rongeurs ont montré une différence significative des réponses immunitaires entre des groupes d’individus sauvages et de laboratoires, rendant nécessaire l’expérimentation sur le terrain, en complément d’approches en laboratoire. Dans ce contexte, l’objectif du présent projet vise à comprendre les mécanismes des impacts des métaux toxiques et de la qualité nutritionnelle sur l’état et le fonctionnement du système immunitaire de Rongeurs sauvages. Après une étude préliminaire visant à la mise au point, chez le Mulot sylvestre, de tests immunologiques développés chez la Souris domestique, le projet portera sur le site d’une ancienne fonderie de zinc (Zn) et de plomb (Pb) située dans les Hauts-de-France. Ce site se distingue par un gradient de concentrations en cadmium (Cd), Pb et Zn dans les sols : les concentrations décroissent des zones les plus contaminées, situées au pied de l’ancien site métallurgique, vers des zones peu affectées à plusieurs kilomètres de l’ancienne usine (et considérées comme « témoin » dans la présente étude).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de l’impact des polluants métalliques sur le système immunitaire d’une espèce sauvage, le Mulot sylvestre. Ces résultats permettront de développer des marqueurs de toxicité non conventionnels (par opposition aux marqueurs classiquement utilisés en évaluation des risques écotoxicologiques (ERE) que sont la mortalité, la croissance ou la reproduction) qui pourront à terme être transposés dans les procédures réglementaires d’ERE. L’immunomodulation du système immunitaire par les métaux permettra également d’évaluer l’impact potentiel sur la susceptibilité de ces Rongeurs à héberger des pathogènes zoonotiques, c’est-à-dire transmissible à l’Homme (par exemple les bactéries Borrelia sp. responsables de la maladie de Lyme).

Procédures

Pour les procédures 1 et 2, une prise de sang sera réalisée sous anesthésie générale pour chaque animal. Pour la procédure 3, les animaux recevront deux prises de sang sous anesthésie générale espacées de 5 jours. La prise de sang est effectuée en insérant une pipette Pasteur dans le sinus rétro-orbitaire des Mulots sylvestres pour collecter un échantillon sanguin (~150-200 µL en fonction de la masse de l’animal considéré) par capillarité, méthode de prélèvement considérée comme la moins stressante chez des souris de laboratoire. Le volume de sang maximal prélevé est estimé à 1,5% de la masse corporelle, soit 300 µL de sang pour un individu de 20 g. La prise de sang sera réalisée 2h après une injection intrapéritonéale de LPS (500 µg/kg). A la suite de cette intervention les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Mortalité La littérature ainsi que l’expérience des personnels impliqués dans ce programme laissent envisager un taux de mortalité de l’ordre de 3%. Les causes de décès peuvent être un stress conduisant à une rupture des cervicales ou un refroidissement en période froide (peu probable au printemps) et/ou pluvieuse dans les pièges. Des arrêts cardiaques peuvent être constatés dans les pièges ou lors des manipulations. En dehors de l’arrêt des captures en cas de conditions météorologiques défavorables, ces mortalités indésirables sont difficilement totalement évitables. Stress à la capture et durant les manipulations Les captures d’organismes sauvages entrainent nécessairement un stress, réduit au minimum par la relève des pièges dès que possible le matin (les captures ayant généralement lieu la nuit). Dès que les animaux sont sortis des pièges ou des cages, et après détermination spécifique immédiate, les animaux non-cibles (Campagnols par exemple) sont immédiatement relâchés, réduisant le stress au minimum. Les animaux-cibles (Mulots sylvestres) sont immédiatement anesthésiés pour la suite des manipulations (examen morphologique pour la détermination du sexe, mesures mophométriques pour la détermination de l’âge, prise de sang, injection de LPS). Les animaux trop jeunes sont relâchés dès les mesures morphométriques permettant d’estimer leur âge, de même que les femelles gestantes. Stress durant l’hébergement L’hébergement, sous tente et avec contrôle des conditions environnementales (Température, hygrométrie), dure de quelques heures à 5 jours maximum dans le présent projet. L’hébergement est individuel, ce qui, au printemps, correspond au comportement solitaire des Mulots sylvestres en période de reproduction et évite d’éventuels comportements antagonistes. L’observation comportementale et la pesée (permettant d’évaluer un point-limite fixé à une perte de masse de 20%) sont quotidiennes de manière à détecter un éventuel stress élevé chez les individus. L’expérience de l’équipe sur cette espèce montre que les individus tolèrent la captivité courte (5 jours) sans montrer de comportements (activité motrice, alimentaire…) dénotant un stress élevé.

Devenir

Les individus seront mis à mort pour un prélèvement d'organes. Ces organes permettront la mise au point de mesures immunologiques et la mesure de l’exposition aux métaux, grâce aux mesures des concentrations dans les tissus. Il s’agit d’une décision prise collégialement par les membres de la structure du bien-être animal de notre unité, au regard des aspects éthiques, scientifiques et logistiques.

Remplacement

L’objectif du projet est d’étudier la réponse immunitaire d’animaux exposés à une contamination environnementale en fonction de leur charge parasitaire (helminthes intestinaux) et de la qualité nutritionnelle de leur alimentation. L’utilisation d’animaux est requise car, à notre connaissance, aucune approche de modélisation ne permettrait d’obtenir de telles données. Des études comparatives sur le système immunitaire de rongeurs ayant montré que la réponse immunitaire d’individus sauvages et d’animaux de laboratoire différaient significativement, l’utilisation d’animaux sauvages est donc aussi requise.

Réduction

La variabilité inter-individuelle des réponses immunitaires est très forte en conditions naturelles. La variabilité liée à la biodisponibilité des ETM (Capacité de transfert de l’environnement vers un organisme) conduit aussi à des concentrations variables en ETM dans les organes cibles de différents individus du même site. Sur la base de ces informations, les effectifs prévus pour les procédures 1, 2 & 3 ne peuvent être inférieurs à 20 Mulots (Procédure 1), 40 Mulots (Procédure 2) et 40 Mulots (Procédure 3) pour garantir une puissance statistique suffisante et la valorisation scientifique des résultats.

Raffinement

Suite à une procédure invasive telle qu’une prise de sang dans le sinus rétro-orbitaire ou une injection de LPS, les animaux sont remis en cage et observés à différents temps après la procédure pour évaluer leur état sanitaire (blessure à l’œil, comportement dénotant une diminution de la vue, apathie, manque d’appétit…). Un point-limite (perte de 20% de la masse) est évalué quotidiennement lors des périodes d’hébergement (qui n’excédent pas 5 jours dans le présent projet). Les animaux seront hébergés sous tente avec un contrôle des conditions environnementales (Température, hygrométrie) et les anesthésies, mesures et prélèvements seront effectués dans le véhicule agréé pour expérimentation animale, donc en un lieu séparé de l’hébergement. Les animaux conservés pour les expérimentations sont hébergés entre quelques heures et 5 jours maximum en fonction de la procédure concernée. Les animaux sont hébergés dans les meilleures conditions possibles (hébergement individuel pour éviter des comportements antagonistes, cages adaptées, enrichissement). L’ensemble des procédures est effectuée par ou sous supervision directe de personnels hautement qualifiés et expérimentés dans le domaine de ce type d’expérimentation.

Choix des espèces

L’espèce choisie est le Mulot sylvestre (Apodemus sylvaticus). Il s’agit d’un Micromammifère abondant, ubiquiste, opportuniste avec un régime alimentaire varié (Majoritairement granivore). Son positionnement trophique intermédiaire le place comme une source de nourriture de premier choix pour un grand nombre de prédateurs (Rapaces et Mammifères) incluant des espèces patrimoniales (Milan royal par exemple). Leurs nombreuses utilisations dans la littérature permettent de les définir comme bio-indicateurs des impacts des activités anthropiques dans les écosystèmes, incluant la pollution environnementale. Leur facilité de capture et leur capacité à être maintenus en captivité en font un modèle biologique idéal par rapport aux objectifs scientifiques de cette étude. Les Mulots sylvestres utilisées dans la procédure 1 permettront de tester le croisement possible entre les techniques développées sur Souris et l’espèce modèle retenue dans ce projet, le Mulot sylvestre. Seuls des individus d’âge subadulte et adulte (masse supérieure à 15g) seront utilisés pour cette étude.

52 souris âgées de 15 mois vont être utilisées, toutes tuées à l'issue sous anesthésie profonde sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections dans le cerveau d'un facteur pathogène et, pour une partie, la pose d'électrodes puis un isolement une semaine sur deux pour enregistrer leur sommeil pendant plusieurs mois. Leur cerveau est ensuite prélevé pour analyse après la mort. Le porteur affirme que la souris reste "incontournable" et présente le projet comme visant à valider un premier modèle animal évolutif de la maladie de Parkinson.

Objectifs

La maladie de Parkinson (MP) est connue pour ses symptômes moteurs dus une dégénérescence neuronale bien identifiée. D’autres symptômes de la MP sont aujourd’hui caractérisés comme le trouble du comportement en sommeil paradoxal (TCSP). Pendant le sommeil paradoxal (SP), nous sommes inconscients et naturellement paralysés. Les patients TCSP (âgés d’une cinquantaine d’années) perdent cette paralysie et extériorisent alors leurs rêves sous forme de mouvements incontrôlés dangereux. Le TCSP est le meilleur marqueur diagnostic à 10 ans de la MP, ces deux pathologies étant donc intimement liées. Sur la base de nos travaux récents chez les rongeurs, nous avons formulé une hypothèse sur ces mécanismes délétères communs aux deux pathologies, affectant d’abord les neurones controlant le sommeil, puis au cours du vieillissement ceux atteints dans la MP. Le délai entre l’apparition du TCSP et de la MP refléterait la lente propagation des processus dégénératifs à travers le cerveau au cours du vieillissement. Notre objectif est de tester cette hypothèse en tentant de reproduire chez la souris âgée ces mêmes processus pathologiques affectant le SP puis d’observer si un syndrome parkinsonien se develope avec le temps, comme observé chez les patients MP. Ce projet de recherche préclinique s’articule autours de deux volets experimentaux complémentaires et menés en parallèle, l’un anatomo-pathologique (neurones dégénérés), l’autre physiologique (modification du sommeil) et comportemental (comportements de type parkinsonien), permettant de corréler les différents evénements pathologiques et leur évolution au cours du vieillissement.

Bénéfices attendus

Malgré d’intenses recherches, un modèle animal reproduisant fidèlement au cours du vieillissement la maladie de Parkinson (MP) fait encore défaut, en particulier au cours de la période pendant laquelle la pathologie s’installe insidieusement dans le cerveau. L’un des biomarqueurs pré-symptomatiques de la MP reconnu aujourd’hui est une maladie du sommeil (Trouble comportemental en sommeil paradoxal) qui anticipe la MP d’une dizaine d’années. Il y a donc un intérêt à comprendre les mécanismes pathologiques liant le TCSP et la MP. Concrètement, ce projet scientifique ambitieux vise à valider le premier modèle animal évolutif dont la puissance résiderait dans la reproduction chronologique des évènements pathologiques prenant place, insidieusement, pendant la phase pré-symptomatique de la MP. Cet outil ouvrirait des perspectives pour l’élaboration de stratégies neuroprotectrices pour anticiper précocement l’évolution aujourd’hui encore irréversible vers la MP.

Procédures

Pour ce projet de recherche préclinique, 2 procédures expérimentales sont prévues nécessitant l’utilisation d’un total de 52 souris âgées de 15 mois. Procédure 1 (n = 20 souris, 2 lots de 13 et 7 individus, respectivement): les souris subiront sous anesthésie générale controlée une intervention chirurgicale consistant en deux injections intracérébrales du facteur pathogène (ou contrôle) responsable de la MP, suivi de l'implantation d'électrodes à demeure permettant l'enregistrement chronique du sommeil. Les souris seront isolées une semaine sur 2 en chambre d'enregistrement, dans un baril de plexiglass transparent de 25cm de diamètre contenant enrichissement, eau et nourriture ad libitum et filmées 24h/24h. En fin de procédure (12 mois maximum apès la chirurgie selon l’évolution de leur état général), les souris subiront une anesthésie chirurgicale profonde sans réveil pour l’analyse post-mortem des cerveaux. Procédure 2 (n = 32 souris, 4 lots, n = 8 individus chacun): les souris subiront sous anesthésie générale controlée une intervention chirurgicale consistant en une injection intracérébrale du facteur pathogène responsable de la MP. Selon les lots experimentaux, les souris ainsi traitées subiront 30, 60, 90 ou 180 jours après la chirurgie une anesthésie chirurgicale profonde sans réveil pour l’analyse post-mortem des cerveaux afin de corréler l’évolution des modifications anatomo-pathologiques aux effets physiologiques observés et au vieillissement.

Impact sur les animaux

Procédure experimentale n° 1 de degré de sévérité modéré: les souris seront soumises à une intervention chirurgicale sous anesthésie générale pour deux injections intracérébrales du facteur pathogène (ou contrôle) responsable de la MP. Des électrodes permettant l’enregistrement en continu de l’activité du cerveau pendant le sommeil seront posées à demeure. Pendant cette intervention d’une durée de 90 min, toute douleur sera couverte par l’administration générale et locale d’analgésiques avant, pendant et après la chirurgie. Une légère perte de poids est attendue (-5%) avec un retour au poids initial en 48h. Pendant la semaine de récupération, les souris seront 2 par cage avec un séparateur grillagé de sorte qu’elles puissent interagir tout en limitant les possibilités d’agression et de détérioration des électrodes. Elles seront isolées une semaine sur 2 en caisson individuel pour l’enregistrement de leur sommeil et de leurs comportements pour toute la durée de la procédure. Nous attendons l’apparition d’un TCSP sans savoir par avance si/quand il apparaîtra, ce délai constituant de fait l’objectif de l’étude. Nous serons quotidiennement vigilants pour détecter dès que possible l’apparition de signes comportementaux et physiologiques indicateurs du TCSP, de modifications quantitatives et qualitative de leurs sommeil et de leurs comportements. En fin de procedure, elles subiront une perfusion intracardiaque sous anesthésie générale profonde sans réveil. Procédure expérimentale n°2 de degré de sévérité modéré: les souris seront soumises à une intervention chirurgicale sous anesthésie générale pour l’injection intracérébrale du facteur pathogène responsable de la MP. Pendant cette intervention d’une durée de 60 minutes, toute douleur sera couverte par l’administration générale et locale d’analgésiques avant, pendant et après la chirurgie. Une légère perte de poids est attendue (- 5%) avec un retour à la normale en 48h. Les souris seront alors placées à 4 par cage pour favoriser les interactions sociales. Elles subiront une perfusion intracardiaque sous anesthésie générale profonde sans réveil après 30, 60, 90 et 180 jours de survie apres la chirurgie pour prélever leur cerveau. N’attendant pas de dérèglement de leur sommeil ni de leur comportement, elles seront cependant régulièrement observées pour détecter de légères dégradations de leur état général, possible au cours du vieillissement.

Devenir

A l'issue des procédures 1 et 2, les souris subiront une anesthésie générale profonde et sans réveil pour nous permettre de récupérer leur cerveau dans les meilleures conditions de préservation des tissus neuronaux et d’analyser ainsi l’évolution des phénomènes dégénératifs cérébraux au cours du vieillissement (selon la durée de survie après la chirurgie initiale) et de les corréler avec les modifications de leur sommeil et de leurs comportements. Les données anatomiques ainsi obtenues chez des souris âgées seront comparées à celles obtenues chez des souris jeunes avec les mêmes paradigmes expérimentaux, permettant de mieux comprendre ce qui se passe pendant le vieillissement.

Remplacement

L’intérêt d’étudier le TCSP réside dans son caractère prédictif de la MP. Il est impossible d’aborder ces questions chez l’homme sain ou malade car aucune méthode d’imagerie cérébrale spécifique de la MP n’est encore disponible à l’hôpital. Des contrôles anatomo-pathologiques sont souvent réalisés chez des patients décédés pour confirmer le diagnostic mais ils ne permettent pas d’étudier l’origine de la maladie. Par ailleurs, des animaux moins évolués que les mammifères (drosophile, poisson rouge, vers C. elegans etc.) sont parfois utilisés pour l’étude du sommeil (activité/inactivité) mais ils ne possèdent de sommeil paradoxal et la complexité de leur cerveau n’est en rien comparable avec celle de l’Homme. D’autres méthodes prometteuses se développent actuellement comme la modélisation in silico, l’intelligence artificielle, les cultures cellulaires sur puces et depuis peu les organoïdes cérébraux mais elles ne constituent pas encore d’alternatives crédibles à la souris pour aborder des mécanismes pathologiques complexes responsables de ces pathologies évolutives et neurodégénératives. Aussi, l’utilisation de la souris est encore aujourd’hui incontournable et c’est un animal parfaitement adapté aux études physiologiques et comportementales de très longue durée prévues dans ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux (n=52) nécessaire pour cette étude est légitimé par son organisation en 2 procédures expérimentales (physiologie/comportement et anatomo-pathologie) conduites en parallèle. La taille de chaque lot a été calculée, optimisée et réduite à son minimum sur la base de nos travaux antérieurs mettant en œuvre les mêmes techniques expérimentales chez la souris. Ces calculs tiennent compte, sans compromettre la reproductibilité et la significativité statistique des données expérimentales (petits échantillons): 1) des « erreurs et échecs » possibles à chaque étape des procédures expérimentales ; 2) la variabilité interindividuelle des paramètres physiologiques considérés ; et 3) la dégradation des signaux au cours du temps (plusieurs mois de suivi longitudinal) pouvant rendre leur interprétation aléatoire. Chaque animal ne sera soumis qu’à une seule procédure expérimentale se terminant par une anesthésie sans réveil avec prélèvement du cerveau pour analyses post-mortem, éliminant toute possibilité de réutilisation. En revanche, le nombre de lots, et donc celui des souris, pourra être sensiblement réduit selon les résultats obtenus, en particulier pour la procédure expérimentale n°2. Ainsi, les lots prévoyant des temps de survie post-traitement de longue durée seront abandonnés si des indices de TCSP et de perturbations locomotrices apparaissent plus précocement.

Raffinement

Pour minimiser le stress individuel par le maintien d’interactions sociales quotidiennes, les souris seront hébergées dès leur arrivé dans notre animalerie en groupes de 4 individus par cage jusqu’à ce qu’elles atteignent l’âge de 15 mois, marquant alors le début des deux procédures expérimentales. L’agressivité peut augmenter avec le temps chez certains mâles, nous obligeant alors à les séparer du groupe. Le cas échéant, ils seront placés dans une cage double munie d’un séparateur grillagé afin que les deux souris puissent interagir mais sans contact direct. De plus, des enrichissements seront systématiquement mis en place dans les cages pour favoriser le bien-être des animaux pendant toute la durée des procédures. Après l’étape de chirurgie sous anesthésie générale, l’état de santé des animaux sera suivi régulièrement jusqu’à la fin des procédures, une attention particulière étant d’abord portée à la récupération post-opératoire (ajout d’AINS si nécessaire, suivi du poids, de la mobilité et du comportement). Nous utiliserons donc une grille d’évaluation de différents paramètres pour suivre leur retour objectif à des valeurs normales pendant la semaine de récupération. Une fois les procédures débutées, notre préoccupation sera de suivre quotidiennement l’évolution de plusieurs paramètres physiologiques et locomoteurs pertinents pour notre étude (qualité et quantité du sommeil, locomotion, exploration, etc.) pour détecter rapidement l’apparition de signes caractéristiques du TCSP et suivre de près la dégradation de l’état de santé général, aussi lié au vieillissement naturel. Ces modifications constitueront dès lors le point limite de nos procédures expérimentales avec mise à mort sans délai, pour prévenir l’apparition d’une éventuelle souffrance et d’une dégradation de leur autonomie, tout en établissant la preuve de concept recherchée dans cette étude.

Choix des espèces

Pour plusieurs raisons, nous avons choisi de travailler avec des souris âgées de 15 mois au début des procédures expérimentales. A cet âge-là, les souris sont à la moitié de leur espérance de vie, en pleine santé et sont matures sur le plan cérébral et locomoteur avec un cycle veille-sommeil stabilisé, efficace et consolidé. C’est à cet âge moyen qu’apparaît le TCSP chez les patients, précurseur de la MP. Le sommeil paradoxal (SP) est spécifique aux mammifères incluant la souris et l’Homme. Des animaux de niveau phylogénétique inférieur (mouche, poisson, vers etc) sont parfois utilisés pour l’étude du sommeil (activité / inactivité) mais ils n’ont pas de SP et la complexité de leur système nerveux n’est pas comparable à celle des mammifères. Ces modèles animaux ne sont donc pas des alternatives à la souris pour étudier le sommeil et développer des modèles précliniques de ses principales pathologies. Nos travaux récents ont identifié chez la souris les structures cérébrales ciblées dans le TCSP, leur organisation anatomique étant très similaire à celle du cerveau humain. Enfin, c’est une espèce animale plus adaptée que le rat aux études physiologiques et comportementales de longue durée (pas d’augmentation significative du poids et du volume corporel) facilitant ainsi leur manipulation et hébergement sur le long terme et raccourcissant la durée des procédures du fait de leur plus courte espérance de vie (2,5 ans maximum).