Rongeurs

60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des prélèvements de sang par voie rétro-orbitaire sous anesthésie, puis une plongée simulée en caisson hyperbare suivie d'une heure d'observation pendant laquelle un accident de décompression peut provoquer des symptômes douloureux. Le porteur indique que les rats seront tués dès l'apparition des premiers symptômes, et qu'ils sont tous mis à mort pour prélever sang et organes. Il justifie le recours à l'animal par l'absence de biomarqueur fiable et par l'étude sur "l'organisme entier".

Objectifs

L’accident de décompression (ADD) est un syndrome systémique survenant suite à la formation de bulles dans la circulation sanguine et dans les tissus lors d’une diminution de la pression environnementale. Les mécanismes de l’ADD sont encore aujourd’hui assez peu connus et cet accident est décelé uniquement sur la base des symptômes qu’il déclenche. Dans le but d’approfondir les connaissances sur le rôle de l’inflammation et de la coagulation dans la mise en place et la susceptibilité à l’ADD, nous allons étudier les réponses cellulaires de globules blancs et de plaquettes lorsque ces dernières sont exposées à différents stress rencontrés en plongée. L’objectif de ce projet est donc double : (i) confirmer/infirmer l’existence d’une relation entre la résistance à l’ADD et des modifications fonctionnelles des globules blancs et des plaquettes, (ii) étudier les différences liées au sexe dans les mécanismes de résistance à l’ADD.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre les mécanismes de résistance à l’accident de décompression (ADD) ainsi que les mécanismes physiologiques impliqués dans la mise en place de ce syndrome. Ces travaux pourront être bénéfiques en santé humaine et plus particulièrement dans un cadre de prévention de l’ADD. A court terme, les bénéfices de ce projet portent sur la compréhension de la sensibilité à l’ADD. Plus particulièrement, sur l’implication des réponses leucocytaires et plaquettaires face à une modification de la pression hydrostatique et de la pression de l’air. A moyen terme, l’intégration de ces réponses au niveau physiologique et la caractérisation du type de stress ayant eu un impact plus marqué sur les réactions cellulaires permettra d’orienter nos recherches futures. A plus long terme, la mise en évidence de facteurs de risque permettrait de prévenir l’ADD avant une plongée. La perspective d’avoir une meilleure approche sur les mécanismes de l’ADD permettrait de mettre en place des protocoles de décompression toujours plus fiables afin de mieux prévenir l’accident.

Procédures

Les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin par voie rétro-orbitaire réalisé sous anesthésie / analgésie. Si cela est nécessaire, les animaux de l'étude préliminaire pourront être soumis à un deuxième prélèvement sanguin dans les mêmes conditions. Les deux prélèvements seront séparés d'une période de 3 semaines. Au minimum 4 semaines après le dernier prélèvement retro-orbitaire, les animaux seront soumis à un protocole hyperbare de 60 minutes au total suivi d'une période d'observation d'1 heure.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : - Le stress lié à la préhension et à l’injection d'asnesthésiques / analgésiques. Ces nuisances légères ne durent que le temps de l’injection (1 – 2 minutes). - Une possible diminution de la température corporelle au cours de l’anesthésie. Cette nuisance est légère et dure environ 20 minutes. - Le prélèvement sanguin au niveau du sinus rétro-orbitaire entraine un stress. Ces nuisances ne durent que le temps du prélèvement (1 – 2 minutes). - L’angoisse lors de la plongée simulée. Cette nuisance est légère et dure 2h30 (temps de l’exposition hyperbare et temps d’observation). - La douleur induite par l’apparition de symptômes de l’ADD lors de la période d’observation. Ces nuisances seront modérées et très brèves (moins de 1 minutes).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de cette procédure car nous avons besoin de prélever du sang et des organes afin de réaliser des analyses multiples (Cultures primaires, dosages sanguins (facteurs inflammatoires, facteurs de coagulation), histologie…).

Remplacement

Notre travail porte sur l’étude de la sensibilité à l’accident de décompression (ADD). Les connaissances actuelles ne nous permettent pas de travailler uniquement sur le modèle cellulaire car il n’existe pas encore de biomarqueur fiable permettant de définir une sensibilité accrue à l’accident. De plus, l’accident de décompression est un syndrome systémique impliquant de nombreuses réponses autres que l’inflammation et la coagulation comme le stress oxydant et la dysfonction vasculaire par exemple. L’analyse des tissus post exposition hyperbare nous permettra de confronter nos résultats obtenus au niveau des globules et des plaquettes sanguines à ce que l’on observe sur l'organisme entier.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans cette étude a été déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et de permettre la réalisation d’une mise au point de la culture primaire (déterminer la quantité de cellules que nous pouvons mettre en culture suite au premier prélèvement, viabilité cellulaire…). Les tests statistiques utilisés intègreront 2 facteurs à étudier : susceptibilité à l’accident de décompression et sexe. De plus, après mise à mort des animaux, les prélèvements tissulaires vont nous permettre d’approfondir nos résultats de manière intégrée en sortie de plongée.

Raffinement

Tout au long du protocole, les conditions de stabulation sont réalisées dans un souci de bien-être de l’animal et les animaux sont suivis quotidiennement. Toute la procédure expérimentale est réalisée par des personnes formées et habituées à travailler avec des animaux de laboratoire. Pour réduire au maximum la douleur du prélèvement sanguin, l’animal sera ponctionné sous anesthésie/antalgie. L’induction de l’anesthésie sera réalisée par voie gazeuse afin de réduire au maximum le stress lié à la préhension et à l’injection. L’animal sera placé sur tapis chauffant et sa température corporelle sera monitorée jusqu’au réveil. Après le prélèvement sanguin, un suivi quotidien des animaux est réalisé avec une grille de score adaptée. Avant de démarrer le protocole d’exposition hyperbare, les animaux sont maintenus pendant 30 minutes dans le caisson hyperbare afin de les habituer à l’environnement et de réduire le stress. Le protocole de plongée utilisé limite au maximum l’apparition d’ADD sévère et les animaux seront mis à mort dès l’apparition des premiers symptômes pour réduire au maximum la souffrance.

Choix des espèces

Le rat est un modèle très utilisé pour l’étude des mécanismes de l’accident de décompression. De ce fait, nous disposons d’un certain nombre de données, en particulier sur la souche Wistar qui est couramment utilisé au laboratoire afin de caractériser les mécanismes de résistances à l’accident de décompression. Nous possédons de nombreuses données biologiques concernant les effets de l’exposition hyperbare et une bonne connaissance des symptômes de l’accident de décompression. Cette expertise acquise au cours des projets précédents permettra une meilleure gestion du projet et de ses résultats. Nos travaux précédents ont été effectués sur des animaux matures sexuellement. Nous souhaitons donc utiliser des animaux au stade de « jeunes adultes », matures sexuellement. Lors de l’étude préliminaire, le prélèvement sanguin sera réalisé à l’âge de 8 et 11 semaines et la plongée simulée dans le caisson hyperbare à l’âge de 15 semaines. Lors de l’étude définitive, le prélèvement sanguin sera réalisé à l’âge de 10 semaines et la plongée simulée dans le caisson hyperbare à l’âge de 14 semaines.

590 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues diabétiques et obèses par leur lignée db/db, elles sont exposées à des sons de forte intensité, jusqu'à 116 décibels, provoquant des pertes auditives, puis subissent des mesures d'audition sous anesthésie et des prélèvements de sang répétés. Leur oreille interne est prélevée après la mise à mort, ce prélèvement ne pouvant se faire sur un animal vivant. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthodes alternatives validées" et conclut à la "nécessité" du recours à l'animal.

Objectifs

La transmission d’un son de l’oreille externe en signaux aux cellules ciliées, cellules sensorielles de l’oreille interne situées dans la cochlée et reliées au nerf auditif. La vibration du tympan est transmise via la fenêtre ovale au liquide de l’oreille interne via les osselets (marteau, enclume et étrier). Les ondes sonores transmises dans le liquide de l’oreille interne sont traduites en signaux électriques par les cellules ciliées. Ces signaux électriques sont transmis au cerveau par le nerf auditif. Lorsque les cellules ciliées sont lésées, par une substance chimique, un traumatisme ou par le vieillissement, la personne a une perte auditive. Plus de 90% des pertes auditives sont dues à une destruction des cellules ciliées ou du nerf auditif (Hildebrand et al., 2008; Kujawa and Liberman, 2019). Dans le cadre du diabète et plus particulièrement celui de type-2, le mécanisme conduisant à une surdité n’est pas clairement établi. Plusieurs hypothèses ont été avancées, notamment une atteinte vasculaire au niveau de la cochlée, par analogie avec la rétinopathie et la néphropathie diabétique résultant d’une altération des micro-vaisseaux sanguins avec l’épaississement du sang par l’hyperglycémie. En parallèle, le diabète de type 2 induit une inflammation systémique chronique qui à terme peut avoir des répercussions au niveau de l’oreille interne et entraîner une dégradation des cellules ciliées, ou une augmentation de la susceptibilité au bruit. Chez la souris, il a été démontré qu’un trauma acoustique modéré, provoquant une surdité temporaire chez les animaux sains, induisait une surdité permanente chez des animaux diabétiques (Han et al., 2018). Enfin, une neuropathie périphérique ciblant le nerf auditif pourrait également conduire au développement de la surdité en lien avec le diabète. Il n’existe aucun traitement pharmacologique pour la surdité et les traitements du diabète, bien que permettant un meilleur contrôle de la glycémie ils ne traitent pas le cause de l’hyperglycémie qui reste élevée avec des conséquences au long-terme. Face à l’augmentation constante de la prévalence de ces deux pathologies, la recherche d’une solution thérapeutique adaptée reste un enjeu majeur de santé.

Bénéfices attendus

Les bénéfices escomptés sont de valider ou d’invalider l’efficacité de candidats médicaments dans ces indications thérapeutiques. Ceci permettra de mieux sélectionner les candidats médicaments et de concentrer la rechercher et développement uniquement sur les candidats médicaments avec un haut potentiel d’efficacité.

Procédures

Les animaux vigiles seront exposés à des sons de forte intensité 2 intensités seront testées 100 et 116dB. Trois protocoles d’exposition seront testés : 100dB durant 2 heures 100dB durant 2 heures chaque jour jusqu’à 7 jours consécutifs 116dB pendant 1 heure Des mesures d’audition seront réalisées chaque semaine sous anesthésie générale. Un prélèvement de sang sera réalisé chaque semaine (au maximum 100µl) L’administration de traitement sera réalisée. Le traitement pourra être administré chez les animaux vigiles lors des traitements administrés par voie orale, intra-péritonéale, intraveineuse, sous cutanée. Le traitement sera réalisé chez des animaux sous anesthésie générale lors des traitements par transtympanique.

Impact sur les animaux

Développement d’un diabète de type 2 et d’une obésité. Pertes auditives consécutives à l’exposition au son de forte intensité

Devenir

Les animaux sont euthanasiés car des prélèvements de l’oreille interne sont réalisés pour des analyses anatomopathologiques. Le prélèvement de l’oreille interne ne peut se réaliser sur des animaux vivants donc les animaux sont euthanasiés en vue de ces prélèvements.

Remplacement

Remplacer : le recours à l’animal de laboratoire est nécessaire car il n’existe pas de méthodes alternatives validées pour évaluer l’audition et développer des modèles pathologiques de trauma acoustique ou d’acouphènes. Les atteintes des cellules ne peuvent pas être étudiées via la culture cellulaire ou les modèles informatiques car nous ne pouvons pas reproduire la complexité des mécanismes conduisant aux troubles de l’audition. L’influence d’une pathologie métabolique telle que le diabète de type-2 sur la surdité est complexe, impliquant plusieurs facteurs (vasculaires, inflammatoires et modifications lipidiques) qui ne peuvent être évalués que in vivo chez l’animal. Néanmoins nous réalisons une veille bibliographique active afin de suivre les modèles de remplacement qui sont susceptibles d’être développés à l’avenir.

Réduction

Réduire : le nombre d’animaux nécessaire a été calculé, selon des méthodes de biostatistiques, en tenant compte de la variabilité des modèles et des méthodes d’induction des troubles auditifs. Cette approche nous permettra d’obtenir des résultats fiables

Raffinement

Raffinement : dans nos études, les impératifs éthiques associés, tels que les modalités d’administration et de prélèvement, l’hébergement et l’enrichissement du milieu, la prévention de toute douleur, détresse ou inconfort chez l’animal, seront intégrés avec une attention particulière pour le phénotype diabétique et obèse (entre 5 et 25 semaines d’âge fenêtre d’âge des animaux inclus dans nos études). Un contrôle hebdomadaire de la glycémie et du poids des animaux nous permettra de suivre l’hyperglycémie et l’obésité dans le temps. Parmi les complications liées au diabète possiblement attendus, la polyurie (augmentation de la fréquence et du volume d’élimination urinaire), la polydipsie (augmentation de la sensation de soif) et la polyphagie (augmentation de la sensation de faim) sera prise en charge via des conditions d’hébergement adaptés (change des cages plus fréquent, mise à disposition de plus d’eau et de nourriture) . Une attention particulière sera portée aux procédures anesthétiques sur animaux obèses, par rapport au stockage de certains produits anesthésiants dans les graisses.

Choix des espèces

Le modèle de diabète chez la souris db/db est bien établi et caractérisé. Nous sommes en mesure de suivre l’évolution de l’audition chez cette espèce. C’est pourquoi nous avons choisi de travailler avec cette espèce dans le cadre de ce projet. Concernant le stade de développement nous allons inclure de jeunes adultes (développement du diabète à partir de 5 semaines et jugé non délétère selon la bibliographie de l’éleveur jusqu’à 25 semaines). Pour s’affranchir des pertes auditives liées à l’âge et se focaliser sur l’influence du diabète.

12 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit une injection de collagénase dans un disque de sa queue pour provoquer une discopathie que le porteur décrit comme une douleur "intense et longue", puis une pompe analgésique, une injection de plasma enrichi en plaquettes et un suivi par IRM chaque semaine pendant douze semaines. À la fin, les rats sont tués pour prélever leur queue et réaliser des coupes histologiques. Le porteur présente l'application à l'humain comme un transfert facile si la régénération du disque est démontrée.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité de l'injection de Plasma riche en plaquettes (PRP) pour la régénération discale chez le rat.

Bénéfices attendus

Les bénéfices seront de deux ordres : 1) si l’injection de PRP permet une régénération discale chez le rat, ceci pourra être facilement transféré en clinique pour aider au traitement des discopathies humaines. 2) l’IRM est une méthode d’imagerie non-invasive qui devrait permettre d’évaluer l’efficacité thérapeutique du PRP sans biopsie et à des temps précoces.

Procédures

Toutes les procédures décrites dans ce document seront réalisées sous anesthésie générale, grâce à l'inhalation d'isoflurane à dose contrôlée. Chaque rat de ce projet subira une discopathie dans 1 disque de la queue grâce à une injection de collagénase. Sept jours plus tard, une pompe osmotique sera implantée en sous-cutané pour libérer un analgésique en continu. Puis 1mL de sang sera prélevé par la veine caudale pour préparer le PRP. Celui-ci sera injecté dans le disque pathologique la même journée. Finalement, des examens IRM seront réalisés 1 fois par semaine (sans nécessité d’injection d’agents de contraste) pendant 12 semaines.

Impact sur les animaux

La discopathie mécanique entraine une douleur intense et longue si elle n’est pas soignée, comme c’est le cas chez l’humain. C’est pour cela qu’une administration continue d’analgésique sera réalisée depuis l’induction de la maladie jusqu’à l'euthanasie de l’animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés lorsque les points limites seront atteints ou lorsqu'ils auront subi les 12 semaines de suivi IRM. Cette euthanasie est nécessaire pour prélever les queues et réaliser des coupes histologiques pour détecter la présence de sites inflammatoires, valider la régénération du complexe disco-vertébral et ainsi corréler avec le signal IRM obtenu.

Remplacement

La technique IRM permet de définir, chez l’homme, la maladie établie. Notre projet, à visée translationnelle, vise à optimiser une séquence IRM permettant un diagnostic plus précoce de la maladie humaine de discopathie dégénérative, afin d’améliorer la prise en charge de la maladie chez l’homme. Ce projet utilise un modèle animal de discopathie chez le rat dans cet objectif.

Réduction

Seulement 12 rats seront utilisés car notre étude précédente a permis de suivre par IRM l’inflammation discale sans traitement par PRP. Nous souhaitons donc désormais utiliser principalement des rats traités au PRP. Nous analyserons la différence de vitesse de réparation du disque entre les 2 groupes. Un test Anova sera pratiqué.

Raffinement

Les 12 rats seront répartis dans 4 cages avec des tubes en carton, de la paille, du coton, un bois à ronger, de la nourriture et de l’eau à volonté. Des observations quotidiennes et des scorages d’évaluation de la douleur hebdomadaires seront pratiqués dès le début de l’expérimentation pour évaluer l’évolution de la maladie. De ce fait, des points limites ont pu être établis. La cellule bien-être du laboratoire sera impliquée quotidiennement dans l’évolution du protocole. L’analgésie sera appliquée dès le début de l’expérimentation sur l’animal, et sera administrée en continue grâce à l’installation de pompes osmotiques en sous-cutanée tout au long des 12 semaines d’observations IRM.

Choix des espèces

Les rats Lewis seront utilisés du fait de leur utilisation courante dans la littérature. Nous pourrons ainsi comparer facilement nos résultats. Comme nous souhaitons transférer les séquences IRM 3D nouvellement développées à l’homme, les animaux seront utilisés à l’âge adulte (250g pour les rats) car la croissance est terminée et le prélèvement sanguin de 1 mL possible.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un modèle génétique leur fait développer des tumeurs pulmonaires chez toutes les souris dès six semaines, avec un affaiblissement respiratoire et une mortalité atteignant 100 % à 35 semaines, et elles reçoivent sur animal vigile un génotypage par prélèvement de la queue puis des injections répétées dans l'abdomen. Les souris perdant plus de 20 % de leur poids ou qui se prostrent sont mises à mort. Le porteur affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne permet cette évaluation et conclut à la "nécessité" d'un système immunitaire complet.

Objectifs

Ces dernières années l’immunothérapie connu un essor important dans la prise en charge des cancers. Elle a montré une efficacité conséquente dans diverses indications, cependant un certain nombre de patients présentes des résistances spontanées ou acquises. L’objectif principal de cette étude est d’évaluer l’efficacité anti-cancéreuse des anticorps monoclonaux seuls ou en combinaison avec une immunothérapie dans des modèles de souris. L’objectif secondaire est d’appréhender les mécanismes d’action de ces anticorps par l’évaluation des modulations du système immunitaire.

Bénéfices attendus

Nous évaluons l’effet anti-tumoral de thérapies ciblées seules ou en combinaison avec une immunothérapie dans le cadre de plusieurs projets cliniques. Les travaux présentés dans ce projet permettront une meilleure compréhension du fonctionnement des candidats médicaments et de leur fonctionnement en association avec des inhibiteurs de point de contrôle. Ils permettront également de mieux définir le profil des patients éligibles au traitement et susceptibles d’y répondre.

Procédures

Toutes les souris prévues dance ce protocole subiront un prélèvement tissulaire de 2mm au niveau de la queue afin de réaliser leur génotypage et un marquage à l’oreille à 4 semaines postpartum. Ce geste est pratiqué sur animal vigile et prend 5 secondes. Toutes les souris prévues dans le protocole subiront des injections intrapéritonéales d'anticorps ciblés (2 injections par semaine à partir de 8 semaines) et/ou une immunothérapie (1 injection par 2 semaines de 12 à 18 semaines). Elles sont faites sur animal vigile dans un délais de 20 secondes à partir de la contention.

Impact sur les animaux

Le modèle de souris conduit à la formation de tumeurs pulmonaires dans 100% des souris à partir de 6 semaines et de manière moins fréquente à des lymphomes thymiques. Les symptômes du développement tumoral et l’apparition possible d’une mortalité chez certains individus est observée à partir de 12 semaines. Une mortalité de 100% des souris est observée à 35 semaines. Ces lésions induisent ainsi des difficultés respiratoires conduisant à l’affaiblissement général de l’animal. Toutes les souris prévues dans le protocole subiront des injections intrapéritonéales pouvant générer de la douleur. Elles sont faites sur animal vigile dans un délais de 20 secondes à partir de la contention.

Devenir

Tous les animaux porteurs de tumeurs seront donc mis à mort en fin de procédure expérimentale selon les critères décrits dans le projet. Les animaux ne présentant la modification génétique à l’origine du développement tumoral seront mis à mort à 18 semaines dans la procédure 1 ou en même temps que les dernières souris présentant la modification génétique et qui atteignent un point limite dans la procédure 2.

Remplacement

La présence d’un système immunitaire complet, des cellules tumorales et du tissu sain d’origine est nécessaire à la compréhension des mécanismes biologiques qui impliquent l’activité de notre candidat médicament. Il n'existe pas de modèles d'étude in silico ou in vitro permettant l'évaluation de son efficacité dans le contrôle de l’immunité et les cellules cancéreuse.

Réduction

Nous avons calculé le nombre minimum de souris à inclure, en prenant en compte notre expérience, les études déjà publiées utilisant ce modèle ainsi que pour disposer de suffisamment de matériel biologique pour rendre nos résultats interprétables. Procédure 1) Le nombre de souris sera de 20 par groupe de traitement avec 4 traitement différents effectués sur des animaux porteurs ou non de la maladie. Soit un total de 20 souris x 8 groupes = 160 souris. Cette procédure sera réalisée en 2 lots de souris soit 320 souris pour l’ensemble de la procédure de manière à pouvoir réaliser l’ensemble des analyses biologiques nécessaire à l’évaluation de l’activité du candidat médicament et à la compréhension de son mécanisme d’action. Procédure 2) Le nombre de souris sera de 35 par groupe, permettant d’effectuer les études de survie avec les 4 traitements différents sur les animaux porteur ou non de la maladie. Soit 35 x 8 = 280 souris. Procédure 3) Le nombre de souris sera de 10 par lot dans les deux procédures. Chaque lot de la procédure 3 est préalable aux lots de la procédure 1 et 2. Soit un total de 30 souris. La réalisation du second lot de la procédure 1 et la procédure 2 seront conditionnés aux résultats obtenus avec la première expérience. S’il n’y a pas d’effet sur l’incidence tumorale, le reste du protocole ne sera pas réalisé, constituant une réduction. La stratégie de croisement des souris génétiquement modifiées est optimisée de manière à générer des individus qui seront tous utilisés dans les différentes procédures. De plus, les femelles et les mâles entreront dans les analyses de manière à utiliser tous les individus générés pour ce projet.

Raffinement

Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux permettra la recherche de tout signe de souffrance. Le poids des animaux sera évalué 1 à 3 fois par semaine selon les phases du développement tumoral. Pour l’ensemble des procédures, les signes de souffrance seront surveillés 2 fois par semaine puis 3 fois par semaine à partir d’un âge de 12 semaines. Des signes de fatigue, cachexie et d'isolement sociale sont également possibles ainsi qu'un blanchissements et refroidissement des extrémités. Ces signes peuvent être en lien avec l’affaiblissement provoqué par l’atteinte pulmonaire caractéristique de ces souris. Les individus concernés seront mis à mort. Les animaux seront mis à mort si la perte de poids supérieure est à 20% du poids maximal observé ou la prostration de l'animal. Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure, soit à 18 semaines en procédure 1 ou à l’obtention d’un point limite en procédure 2. Les animaux non porteurs de la maladie de la procédure 2 seront mis à mort en même temps que les derniers animaux porteurs. Dans la procédure 3, la stratégie de croisement fait appel à des femelles sauvages de manière à ce qu’elles ne présentent pas les effets délétères liés à la mutation génétique. Les mâles sont prélevés et restitués à l’élevage de la lignée de manière à ne pas avoir à générer d’individus pourteurs de la maladie supplémentaires.

Choix des espèces

Certaines de ces molécules sont des anticorps dirigés contre des cibles de souris. La souris compétente est le modèle le plus approprié pour greffer du tissu de cette même espèce tout en permettant de faire des suivis de pharmacocinétique et pharmacodynamie dans le cadre de traitements avec des anticorps monoclonaux et de inhibiteurs de point de contrôle. Par ailleurs les schémas d'administration des anticorps sont bien standardisés (voie, doses, posologies, ...) contrairement à d'autres modèles tels que le zebrafish. Par conséquent, les modèles de souris immunocompétentes tels que les souris sont nécessaires à la réalisation de cette étude. Les expérimentations seront effectuées sur des souris adultes (âge supérieur à 7 semaines) conformément aux modèles établis.

780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections dans le muscle de la patte et des prélèvements de sang au niveau de l'oeil, avant la mise à mort et le prélèvement d'organes, pour comparer des candidats vaccins contre le SARS-CoV-2 et la grippe. Le porteur affirme n'attendre aucune souffrance, tout en prévoyant l'exclusion et la mise à mort immédiate des souris montrant prostration ou perte de poids. Sur le remplacement, il indique que le modèle souris est adapté mais aussi "imposé par son utilisation dans les tests précliniques des compagnies pharmaceutiques".

Objectifs

Les épidémies de coronavirus et de grippe posent un problème majeur de santé publique. Ces 2 virus sont soumis à de nombreuses modifications génétiques limitant l’efficacité des vaccins actuels. Le virus SARS-Cov2 possède, entre autres, une protéine permettant l’entrée du virus dans les cellules. C’est la cible des vaccins actuels qui génèrent une réponse immunitaire générant de nombreux anticorps de courte durée de vie. Le virus possède également la nucléocapside (N) contenue à l’intérieur du virus, qui est la protéine qui mute le moins entre les différentes souches de coronavirus. Pour le virus de la grippe, il existe également une protéine très conservée, la nucléoprotéine (NP), faisant d’elles des cibles pertinentes pour l’efficacité des vaccins sur le long terme. La technologie mise au point permet aux candidats vaccins d’être très accessible aux cellules du système immunitaire pour protéger des infections. Un partenariat avec une entreprise de biotechnologie permet l’obtention de nouveaux candidats contre la Grippe ou le SARS Cov2 contenant cette technologie. Il est intéressant d’étudier si ces nouvelles formulations vaccinales sont capables de produire des anticorps permettant de lutter contre les virus, mais également de stimuler le système immunitaire afin d’obtenir une protection longue dans le temps. Plus précisément, pour le projet SARS Cov2 les réponses immunitaires sont étudiées suite à l'injection de différents candidats vaccins contenant la protéine permettant l’entrée du virus et/ou la nucléocapside. Pour le projet grippe, des formulations vaccinales avec NP sont caractérisées dans la lutte contre les épidémies saisonnières. Ces études seront réalisées chez le modèle souris. Techniquement, les formulations vaccinales à tester sont injectées dans le muscle de la patte qui est une voie utilisée pour étudier de nombreux phénomènes immunologiques. Des prélèvements de sang réalisés permettront de quantifier les anticorps générés chez les animaux, et des prélèvements d’organes, post mortem, seront étudiés pour valider si les candidats vaccins sont efficaces.

Bénéfices attendus

Les nouveaux condidats vaccins sont très prometteurs pour la santé humaine. Les vaccins récemment développés contre le SARS-CoV-2 ou produits chaque année contre la grippe saisonnière, sont majoritairement destinés à générer une réponse anticorps vis-à-vis de protéines du virus présent à sa surface. Avec l’apparition de nombreuses mutations et donc l’apparition de nouveaux variants, des formulations vaccinales, visant à développer une réponse immunitaire à long terme, pourrait permettre de pallier les problèmes des vaccins actuels. Cela permettrait de mieux traiter les patients avec un vaccin capable d’induire une protection contre différentes souches de SARS-CoV-2 et de la grippe. Selon les résultats obtenus, il pourra être envisagé de porter ce projet à plus grande échelle avec la possibilité de phases cliniques.

Procédures

Tous les animaux du projet vont recevoir 2 injections dans le muscle de la patte sans anesthésie préalable. Ces injections sont espacées de 21 ou 28 jours selon la procédure utilisée et dureront environ 5 à 10 secondes par souris. Pour 30% des animaux, 2 prélèvements de sang seront réalisés, le premier durant les phases d'immunisations, et le second au jour de sa mise à mort. 100ul de sang seront prélevés au niveau de l'oeil sur animaux vigiles. Pour 70% des animaux, seul un prélèvement de sang sera réalisé au jour de la mise à mort de l'animal. Avant chaque prélèvement de sang, une goutte d'un collyre anesthésique local (Tétracaïne) sera appliqué. Chaque prélevement durera 5 secondes par souris.

Impact sur les animaux

Pour l'ensemble du projet aucune souffrance des animaux n'est attendue. Toutefois, si une souris présente des signes de souffrance tel que la prostration, l'absence de réponse aux stimuli extérieurs ou la perte de poids, elle sera exclue de la procédure et immédiatement mise à mort.

Devenir

L'ensemble des animaux du projet sont mise à mort lors de chaque procédure.

Remplacement

La vaccination repose sur la mise en place d’une réponse immunitaire faisant appel à l’ensemble des organes lymphoïdes et des différents tissus ciblés. Le choix du modèle souris est donc adapté, et également imposé par son utilisation dans les tests précliniques des compagnies pharmaceutiques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit à minima sans compromettre les objectifs du projet. Pour obtenir des résultats statistiquement interprétables, des groupes de 6 souris sont nécessaires. L'analyse de puissance et l'estimation de la taille de l’échantillon se font en amont de l’expérimentation. Test d’hypothèse: est-ce que la moyenne de la population traitée avec une constructions X est différente de la moyenne de la population contrôle et de la moyenne des autres groupes immunisés. Pour les analyses des résultats et les comparaisons de plusieurs échantillons nous utilisons les Analyses de variance ou ANOVA (one-way analyses of variance) qui va consister à chercher le rapport entre la variance entre les groupes et la variance à l'intérieur des groupes. Également les tests statistiques comme des tests de comparaison de moyennes de Student, ou non paramétrique (Mann Whitney) avec un seuil minimal du risque alpha fixé à 5% peuvent être utilisés selon les comparaisons souhaitées.

Raffinement

Les souris seront acclimatées durant une semaine. L'immunisation est réalisée dans le muscle. C'est une voie permettant l'obtention d'une bonne réponse immunitaire et étant le peu invasif pour l’animal. Enfin, avant chaque prélèvement de sang, un collyre anesthésique local (Tétracaïne, une goutte) sera appliqué.

Choix des espèces

La réponse immunitaire est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale particulière qui rend impossible son étude dans des tests in vitro

384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nouveau-nées, elles reçoivent une injection d'un virus dans le cerveau, puis sont évaluées à quatre mois par des tests comportementaux, l'open field et le labyrinthe en Y, avant perfusion intracardiaque et prélèvement du cerveau. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable des traitements et décrit les manipulations comportementales comme indolores. Il juge encore "indispensable" le recours à l'animal, les modèles cellulaires iPS ou CRISPR n'offrant selon lui que des informations partielles.

Objectifs

Ce projet répond à des interrogations scientifiques qui sont essentielles au développement de nouvelles stratégies anti-Alzheimer innovantes ciblant MT5-MMP. Les objectifs du projet sont les suivants :

Bénéfices attendus

Nous espérons que ce projet nous apportera: A court/moyen terme : Une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux impliquant MT5-MMP dans : 1) le métabolisme de l’APP et plus précisément celui de ses fragments neurotoxiques, C99 et Abêta ; 2) le métabolisme de Tau ; et 3) les processus inflammatoires dans le cadre de la MA. A moyen/long terme : Le développement de stratégies thérapeutiques originales et innovantes basées sur la régulation des activités de MT5-MMP qui pourraient apporter des solutions chez l’homme.

Procédures

Le projet est organisé sur une seule procédure car les animaux de départ (nouveau-nés au stade P1) seront utilisés jusqu'à la fin de l'expérimentation (5 mois). La procédure est organisée en 4 étapes : 1) injection intracérébroventriculaire d'AAV9 dans des souris nouveau-nées. Nous injecterons par voie intracérébroventriculaire (ICV) des souris nouveaux-nées 5xFAD et leurs contrôles sauvages à P1 avec des AAV9 qui codent pour différents variants de la protéase MT5-MMP. Cette étape d'injection est d'une durée de 30 sec. 2) Génotypage des nouveaux-nés. Une biopsie de la queue (< 1 mm) est réalisée et les petits sont remis avec leur mère. Le génotypage permettra l'identification WT (sauvages) ou 5xFAD (Alzheimer). Cette étape est réalisée dans la durée de l'anesthésie. 3) Analyse comportementale. Quatre mois après l’injection, les capacités cognitives des souris seront évaluées dans des tests comportementaux, notamment l’open field et le labyrinthe en Y. La durée des manipulations dans l'open field est de 2x5min pendant 5 jours, et la durée des manipulations dans le labyrinthe est de 8min pendant 5 jours. 4) Perfusion intracadiaque et prélèvements. La durée de cette étape est d'environ 15min. Suite aux tests comportementaux, les animaux seront euthanasiés, leurs cerveaux récupérés pour des analyses histopathologiques ou microdisséqués pour des analyses biochimiques. Ces analyses porteront sur différents marqueurs de la pathologie, notamment en relation avec le métabolisme de l’APP et de ses fragments les plus toxiques (e.g., C99, peptide Abêta), l’accumulation de la protéine tau, ainsi que sur des marqueurs cellulaires et moléculaires de la neuroinflammation.

Impact sur les animaux

Il n’y pas d’effets indésirables attendus sur les animaux liés à l’utilisation des traitements proposés. Les interventions telles que l'injection ICV chez le jeune et la biopsie de la queue sont réalisés sous anesthésie. En ce qui concerne le comportement, il s'agit de manipulations répétées qui sont indolores et non invasives.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure par surdosage anesthésique en injection IP d’un mélange Kétamine (150 mg/kg) et Xylazine (15 mg/kg) suivi d'une perfusion intracardiaque. La mort survient par les effets du surdosage anesthésique.

Remplacement

Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants (cellules iPS et système CRISPR/Cas9), ces modèles n’offrent que des informations "physiopathologiques" très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. En ce sens, pour compléter nos observations in vivo (compréhension des effets bénéfiques de l’absence de MT5-MMP), nous avons développé des approches expérimentales in vitro comme des cultures primaires ou des cultures HEK ou iPS, avec des sous-expression/sur-expression de MT5-MMP, en parallèle du développement de modulateurs d’activité de MT5-MMP. Nos résultats obtenus doivent à présent être confortés in vivo. L’efficacité de futurs traitements originaux anti-MT5-MMP dans la MA doit se traduire par une amélioration biologique/histologique et comportementale dans des modèles murins, notamment le modèle 5xFAD. Ces souris 5xFAD représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie car elles développent rapidement une MA expérimentale (dès 2 mois), laquelle est très similaire à celle observée chez l’homme, comparée à la MA développée par d’autres modèles des souris (9-12 mois).

Réduction

Le nombre de lots expérimentaux et d'animaux au total est décrit en détail au paragraphe 4.2. - WT (mâles+ femelles)n= 6 groupes x32 souris = 192 - 5xFAD (mâles+ femelles)n= 6 groupes x32 souris = 192 Soit 384 animaux Ce nombre d'animaux a été réduit au minimum pour pouvoir être validé d’un point de vue statistique notamment pour les études comportementales, d'autant que nous travaillons sur des souris issues de plusieurs reproductions et prend également en compte un certain nombre d’échec dès l’étape d’injection des AAV à P1.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement et une attention particulière sera accordée aux procédures de raffinement. Les souris disposeront de nids végétaux à base de fibres courtes de coton, utilisés comme enrichissement de l'environnement et matériau de nidification afin de réduire l'ennui et de diminuer le stress en stimulant l'activité tout en procurant un sentiment de sécurité chez l'animal.

Choix des espèces

Les souris constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles de la MA, ainsi que, comme modèle pré-clinique pour tester les effets in vivo de molécules thérapeutiques potentielles. Pour étudier l’impact de MT5-MMP sur les marques de la pathologie nous utiliserons des souris sauvages et des souris génétiquement modifiées (5xFAD) exprimant les gènes humains codant pour l’APP et la PSEN1 (préséniline 1) portant, respectivement, 3 et 2 mutations familiales de la MA, d’où leur nom 5xFAD. Toutes les souches possèdent le même fond génétique C57/BL6 et seront générées à l'animalerie. Les animaux seront utilisés à deux stades : 1) Stade post-natal P1, dans lequel les injections d’AAVs seront faites, permettant ainsi l’expression des variants de MT5-MMP dès les premiers jours de vie post-natale. 2) Stade adulte à l’âge de 4 et 5 mois. Cet âge représente une phase précoce de la maladie dans laquelle on peut déjà observer des marques évidentes de la pathologie, aussi bien au niveau comportemental que biochimique et histopathologique.