Rongeurs

135 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué, puis leur mémoire spatiale est évaluée par le test du labyrinthe de Barnes, répété plusieurs fois par jour sur plusieurs jours, pour étudier le rôle des plaquettes dans la réparation cérébrale. Le porteur décrit un déficit moteur et sensoriel faible et transitoire, qui disparaîtrait en trois jours. Les retombées pour les patients victimes d'AVC sont renvoyées au conditionnel, l'objectif immédiat restant de comprendre la contribution des plaquettes.

Objectifs

En France, l'accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique, c’est à dire l’occlusion d’un vaisseau cérébral par un caillot sanguin, touche une personne toutes les 4 minutes. Les conséquences d’un AVC sont sévères : 25% des patients décèdent de leur AVC, 40% garderont un handicap et 25% développeront une démence. Les seuls traitements disponibles sont soit l’administration d’un médicament permettant de dissoudre le caillot de sang soit un dispositif médical permettant de le retirer mécaniquement. Malheureusement, ces traitements ne sont possibles que lors des 6 premières heures après la survenue de l’AVC ce qui limite considérablement leur utilisation. Il est donc essentiel de développer de nouveaux traitements pour étendre la fenêtre thérapeutique à la phase aiguë de l'AVC, mais aussi pour améliorer la réparation et /ou la récupération des dommages neurologiques post AVC. Des études récentes ont montré que des thérapies ciblant l’inflammation cérébrale pouvaient stimuler la modification structurale ou fonctionnelle du réseau neuronal (remodelage cérébral) et favoriser la récupération post-AVC à long terme, sur le plan de la motricité mais aussi en limitant/empêchant la démence. Un caillot sanguin est formé essentiellement de plaquettes. Ces dernières jouent un rôle essentiellement dans la coagulation du sang mais sont de plus en plus reconnues comme des modulateurs pertinents d'autres processus physiopathologiques, tels l'inflammation et la régénération tissulaire. A ce jour, leur contribution à la réparation neurovasculaire n’a été que très peu étudiée et uniquement à la phase aiguë. Étant donné que les plaquettes peuvent produire des facteurs favorisant le remodelage cérébral et/ou neuroprotecteurs, elles pourraient être impliquées dans les processus de remodelage cérébral après un AVC. L’objectif de ce projet vise à étudier le rôle des plaquettes dans la réparation cérébrale à long terme, et en particulier les conséquences d’un déficit en plaquettes sur la mémoire et l’apprentissage à long terme dans un modèle murin d’AVC.

Bénéfices attendus

L’AVC ischémique est aujourd’hui la 2nde cause de démence dans le monde, faisant d’elle une maladie chronique. Les plaquettes étant des réservoirs de facteurs neurotrophiques (protéines responsable de la croissance et de la survie des neurones) et de réparation cérébrale, facteurs connus pour être impliqués dans les processus de remodelage cérébral à long terme, il est nécessaire de comprendre leur contribution dans le développement de ces troubles de la mémoire. L’étude des mécanismes de mémoire et d’apprentissage dans des modèles d’AVC à long-terme nous permettrait ainsi d’obtenir une première réponse quant au rôle des plaquettes dans les processus de réparation post-AVC à long terme et dans le développement de ces troubles de la mémoire.

Procédures

Le Barnes maze consiste à explorer la mémoire spatiale, c’est-à-dire le temps mis par la souris pour se souvenir de l’endroit où a été placée une boite noire sous un labyrinthe circulaire de 20 trous. C’est une procédure observationnelle sans geste technique. La souris est placée dans un labyrinthe de Barnes permettant d’évaluer le temps nécessaire à une souris pour se souvenir de l'emplacement d'une zone cible. La souris sera simplement observée pendant 4 minutes. Cette phase d’observation sera réalisée 3 fois par jour pendant 4 jours, puis renouvelée 1 fois sur une journée après 2 jours de repos (même zone cible) et enfin pendant 3 jours en changeant l’emplacement de la zone cible. Entre chaque essai sur une journée, les souris seront laissées 1h au repos.

Impact sur les animaux

Ce modèle d’AVC conduit à un faible déficit et transitoire de la fonction motrice et sensorielle. Ces troubles disparaissent en quelques jours (3 jours en général)

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de projet dans un autre établissement pour lequel une autorisation a déjà été obtenue.

Remplacement

Aucun modèle in vitro ne permet de rendre compte de la complexité des évènements qui se mettent en place de manière intégrée au cours du temps après l’accident vasculaire cérébral, en particulier le comportement de la souris tels l’apprentissage et la mémoire.

Réduction

Les modèles d’AVC développés chez la souris sont parfaitement connus et maitrisés par les membres de l’équipe impliqués dans ce projet, ce qui permet l’évaluation précise du nombre d’animaux nécessaire afin de réaliser des statistiques ayant une puissance suffisante pour interpréter les résultats.

Raffinement

Le soin et le suivi des animaux seront faits par des personnes compétentes et expérimentées, journalière par l’animalier et bi-hebdomadaire par l’expérimentateur. Le bien-être de l’animal est également assuré par un enrichissement de son milieu environnemental (coton pour nidification). La douleur sera évaluée par la mise en place de points limites bien définis à l’aide d’une grille de score. En cas de douleurs, l’administration d’antalgique et d’analgésie sera réalisée. Si la douleur persiste, l’animal sera euthanasié. L’évaluation du comportement neurologique n’est pas douloureuse ; il s’agit de données d’observation. Toutes les précautions environnementales sont prises pour éviter le stress de l’animal. Les souris seront isolées dans une pièce calme adaptée à l’évaluation cognitive réservée exclusivement aux animaux de ce projet.

Choix des espèces

En se basant sur les nombreuses publications au sein de notre laboratoire, Les souris mâles seront évaluées sur le plan cognitif à l'âge adulte (fin des tests à 6 semaines après l'induction de l'accident vasculaire cérébral réalisée chez des souris adultes de 12 semaines). Nous utilserons que des souris mâles pour eviter des interférences avec le cycle hormonal des femelles.

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie une irradiation localisée du côlon à dose unique pour provoquer des lésions tardives, puis sont tuées afin de prélever le côlon. Le porteur indique une dépilation de l'abdomen et affirme qu'à cette dose les animaux ne perdent pas de poids. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative au modèle animal pour étudier ces séquelles des radiothérapies pelviennes.

Objectifs

L’objectif de cette étude est de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires au niveau du côlon qui sont responsables des séquelles tardives des irradiations de la zone pelvienne

Bénéfices attendus

La radiothérapie externe est l’un des traitements incontournables dans la prise en charge des cancers. L’objectif des médecins est la recherche d’un compromis entre le contrôle des tumeurs et la limitation des dommages aux tissus sains autour de la tumeur. En effet, dans le cas du traitement des cancers en zone abdominale, l’irradiation des tissus sains de la zone pelvienne entraîne de nombreux effets toxiques au niveau de certains organes tels que le côlon ou le rectum qui sont des « organes radiosensibles » du fait d’une forte capacité d’auto-renouvèlement de leur épithélium muqueux. La toxicité induite par la radiothérapie du tissu intestinal peut entrainer chez certains patients des séquelles à long terme, et donc impacter fortement la qualité de vie du patient voire même dans les cas les plus sévères engager son pronostic vital. L’ensemble et la complexité des séquelles induites suite à une radiothérapie pelvienne ont amené à la définition d’une nouvelle maladie, la « Pelvic Radiation Disease » ou PRD. Le nombre de patients survivants au traitement d’un premier cancer et leur durée de vie augmentent grâce aux progrès de la médecine. L’augmentation de cette survie est associée à une augmentation du risque de complications. Une prise en charge globale du traitement du cancer intégrant le suivi des patients à long terme (> 20ans) est donc indispensable. De plus, réduire les risques de séquelles du traitement du cancer dans sa globalité et améliorer la qualité de vie des patients est un objectif du troisième plan cancer. À ce jour, la complexité physiopathologique de la PRD encore mal décrite, associée au contexte septique intestinal, limite l’efficacité des thérapies disponibles ainsi que la mise en place de nouvelles thérapies efficaces et pérennes. Les options thérapeutiques disponibles pour le traitement des complications des radiothérapies sont insuffisantes. Ce projet, utilisant des techniques d’exploration innovantes, permettra d’améliorer les connaissances sur l’effet des irradiations sur le tissu colique et de déterminer des nouvelles voies de traitement.

Procédures

Les souris seront anesthésiées à l’isoflurane pour la réalisation de l’irradiation localisée (max 20 min)

Impact sur les animaux

Suite à l’irradiation locale du colon à la dose unique de 26 Gy, les souris vont avoir une dépilation au niveau de l’abdomen (zone irradiée). A cette dose, les animaux ne perdent pas de poids. Les animaux sont observés tous les jours. Les animaux présentant une perte de poids trop importante seront euthanasiés

Devenir

Les animaux seront euthanasiés, les colons seront prélevés pour des analyses histologiques, cellulaires ou moléculaires.

Remplacement

Le développement des séquelles coliques nécessite l’interaction entre différents compartiments tissulaires (vaisseaux, stromal, inflammatoire et épithélial), conditions retrouvées chez le modèle animal intégré. A ce jour, il n’existe pas d’alternative au modèle animal pour étudier les processus physiopathologiques des séquelles des radiothérapies pelviennes.

Réduction

Les modèles d’expérimentation pour l’étude tardive des lésions radio-induites sont fortement influencés par la physiologie. Dans le but d’effectuer des tests statistiques paramétriques sur les analyses histologiques, cellulaire (Cytométrie en flux, single cell, culture et co-culture) et moléculaires des groupes de 20 animaux sont nécessaires. Des tests statistiques seront réalisés afin de comparer tous les groupes entre eux : one- way ANOVA suivi d’un test de Tukey.

Raffinement

Différentes mesures spécifiques sont prises pour réduire au maximum l’impact sur le bien-être des animaux - Diminution de la dose d’irradiation afin d’avoir développement des lésions attendues : utilisation de la dose de 26 Gy qui ne génère pas d’ulcères tardifs graves du colon mais de la fibrose comme les patients qui ont bénéficié d’une radiothérapie fractionnée. - Hébergement en groupe (5 animaux par cage) avec enrichissement (coton et igloo en carton) -Observation quotidienne des animaux suivi du comportement et de leur aspect physique (aspect du poil, mobilité, prostration) - Les animaux seront pesés régulièrement.

Choix des espèces

Le modèle d’irradiation de la souris permet de reproduire des lésions colorectales similaires à celles que l’on peut observer chez des patients ayant des séquelles graves des radiothérapies pelviennes. De nombreux outils pour les études moléculaires sont disponibles chez la souris. Pour reproduire la pathologie humaine, des animaux au stade jeune adulte sont utilisés (8 semaines).

48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une microchirurgie du cerveau sous anesthésie puis des enregistrements EEG sous contention répétés sur vingt-trois jours, avant d'être tués pour prélever sang et cerveau, afin de tester une molécule anti-épileptique. Le porteur indique des douleurs liées au cadre stéréotaxique et un stress lié à la contention. Il présente ce modèle génétique d'épilepsie absence comme "incontournable" pour évaluer un nouveau médicament.

Objectifs

L'épilepsie est le syndrome neurologique le plus répandu, avec environ 70 millions de patients dans le monde. Elle se caractérise par des crises pouvant se manifester sous des formes diverses, comme une absence de manifestation visible caractérisant les épilepsies absences, ou des convulsions généralisées très spectaculaires dans beaucoup de formes d’épilepsies. Il existe de nombreux médicaments anti-épileptiques (MAEs) sur le marché, dont l’objectif est de contrôler (supprimer) les crises d’épilepsie. Néanmoins, 30 % des patients ne peuvent pas être libérés des crises malgré le large panel de MAEs disponibles. Le développement de nouvelles molécules, est donc nécessaire. C’est le sens de ce projet, visant à évaluer une nouvelle molécule dont les bénéfices ont déjà été démontrés in vivo. Il envisage de tester l’effet de la molécule sur un modèle rat d’épilepsie absences reconnu comme un modèle classique d’épilepsie généralisée d’origine génétique.

Bénéfices attendus

Les épilepsies absences affectent majoritairement les jeunes enfants. Le nombre journalier de crises peut être très élevé. Au-delà de l’impact immédiat que ces crises peuvent avoir au moment où elles se produisent (le jeune patient apparaît pour l’extérieur comme « dans la lune »), les crises peuvent altérer profondément les performances scolaires, via des mécanismes de défaut de consolidation mnésique durant le sommeil, induisant de ce fait des retards importants dans les différents apprentissages. Le développement de MAEs pertinents dans ce syndrome pourrait permettre de maintenir à un bon niveau les capacités d’apprentissage et de mémoire. De surcroît, au-delà de l’intérêt direct pour cette forme d’épilepsie, l’épilepsie absences est un modèle d’épilepsie généralisée d’ordre génétique incontournable pour l’évaluation d’un nouveau MAE.

Procédures

Micro Chirurgie cérébrale sous anesthésie général et analgésie, 30 min par rat sur 48 rats. Limitation de mobilité légère (monitoring EEG), 10 X 3h étalé sur 23J sur 48 rats.

Impact sur les animaux

Des douleurs (prise en charge par l’anesthésie et l’analgésie) liées au placement de l’animal dans le cadre stéréotaxique et à l'incision de la peau au dessus du crâne. Stress momentané (quelques minutes) dû à la contention de l’animal nécessaire pour connecter le système électroencéphalographique au rat.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour le prélèvement du sang et du cerveau

Remplacement

Les processus physiopathologiques conduisant à la récurrence des crises épileptiques sont différents d’un syndrome à un autre. Il n’est pas donc pas envisageable d’utiliser une approche in-vitro, encore moins in-silico, en remplacement de l’approche in-vivo puisque le trait évalué (fréquence des crises épileptiques) correspond à la réponse mettant en jeu tout un processus physiologique intégré chez un sujet respirant.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été réduit autant que possible tout en garantissant l’atteinte de l’objectif scientifique visé. Ainsi, la taille des échantillons a été calculée de sorte à mettre en évidence de façon statistique une réduction de 30% de la fréquence des crises épileptiques.

Raffinement

Le protocole suit des procédures standardisées soucieuses de minimiser le stress et toute souffrance des animaux avec une détermination précise des points limites. Ceci se traduit par une visite quotidienne à l’animalerie pour contrôler le bien-être des animaux, l’enrichissement des cages autant que faire se peut, le respect des normes liées aux surfaces/volumes des cages pour éviter la surpopulation ainsi que celles liées aux plages acceptables pour la température et l’hygrométrie. En outre, avant les procédures chirurgicales et les enregistrements EEG, les rats seront emmenés aux salles d’expérimentation, pour habituation et diminution du stress induit par la nouveauté.

Choix des espèces

Ce modèle génétique d’épilepsie absences établi chez le rat a été validé aussi bien pour la période d’installation de l’épilepsie (épileptogénèse) que pendant la période où l’animal est considéré comme présentant une épilepsie stabilisé. Dans ce modèle d’épilepsie absences, les crises apparaissent spontanément et progressivement à partir de l’âge de 2-3 mois chez tous les rats et se stabilisent à l’âge de 6 mois, atteignant alors un plateau. Nous réaliserons donc les chirurgies et les enregistrements EEG à partir de l’âge de 6 mois.

1 088 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un surdosage de paracétamol par injection pour provoquer une atteinte du foie, puis sont tuées par dislocation cervicale afin de prélever foie, rate et reins. Le porteur affirme que le surdosage entraîne un inconfort mais aucune douleur dans les vingt-quatre heures. Sur le remplacement, il affirme que l'intoxication au paracétamol est un processus complexe non modélisable in vitro et une étape préclinique "indispensable".

Objectifs

Ce projet a pour objectif de trouver de nouveaux traitements de l'insuffisance hépatique induite par le paracétamol.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait aboutir à la mise en place de nouveaux traitements de l'intoxication au paracétamol basés sur l'utilisation de la N-Acétyl Cystéine et d'inhibiteurs de nécrose régulée.

Procédures

Deux injections intrapéritonéales pour procédure 1 "Traitement par le paracétamol et les inhibiteurs", une injection intrapéritonéale et une injection intraveineuse par voie rétro-orbitale sous anesthésie isoflurane pour procédure 2 "Traitement par le paracétamol par voie intrapéritonéale et par l’inhibiteur par voie intraveineuse", et un prélèvement de sang par voie rétro-orbitale avant sacrifice par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Le traitement par un surdosage contrôlé de paracétamol entraine certes un inconfort des animaux mais il n’est pas accompagné de douleurs dans les 24h qui suivent son injection (actions antalgique et antipyrétique du paracétamol).

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie après la procédure n° 1 "Traitement par le paracétamol et les inhibiteurs" (soit 960 souris) ou la procédure n° 2 "Traitement par le paracétamol par voie intrapéritonéale et par l’inhibiteur par voie intraveineuse" (soit 128 souris). Tous les animaux (1088 souris) sont mis à mort après la procédure n°3 "Prélèvement du sang par voie rétro-orbitale" afin de prélever les différents organes (rate foie et reins) pour les analyses.

Remplacement

S’il est vrai que certaines questions peuvent être abordées grâce à la culture d’hépatocytes, celle posée dans notre projet cherche à identifier le rôle protecteur d’une molécule vis-à-vis d’une pathologie, l’intoxication au paracétamol qui implique un grand nombre d’évènements moléculaires et cellulaires. Cette pathologie est un processus complexe non modélisable in vitro. Enfin, cette étude préclinique est une étape pré-requise indispensable avant de futures études cliniques chez l’homme.

Réduction

Le nombre de souris engagées (1088) dans ces expériences a été réduit au minimum pour permettre une validation des résultats statistiques par des tests non paramétriques Kruskal-Wallis, Mann et Whitney et Spearman.

Raffinement

L’étude a été raffinée au mieux en privilégiant un traitement de courte durée permettant à la fois la mesure des paramètres d'évaluation de l'hépatite et limitant le développement de douleurs et malaise induits par le traitement. Enfin nous avons anticipé l’étude de tous les organes pertinents (3) qui permettront une étude complète de la pathologie et des molécules pour un maximum d’informations.

Choix des espèces

Cette espèce permet de modéliser ce qui se passe dans une pathologie sur des temps raccourcis à l’échelle de vie de cette espèce. Elle permet d’étudier les phénomènes en cinétique de la physiopathologie et de tester l’effet de petites molécules chimiques pour la prévention et/ou thérapie de la pathologie. Adulte de 9 semaines pour avoir des animaux avec une fonction hépatique normale et pour étudier une pathologie qui affecte surtout des adultes.

2 000 souris et hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le SRAS-CoV-2 par voie nasale sous anesthésie puis reçoivent des traitements ou des vaccins, l'infection étant létale chez la souris transgénique hACE2 avec atteinte du système nerveux central. Le porteur indique que la mise à mort est imposée par la gestion du risque lié à l'agent pathogène. Il présente cette recherche sur modèles animaux comme "essentielle" à la gestion de la crise sanitaire.

Objectifs

Depuis fin 2020, la COVID-19 évolue par vagues épidémiques et l’émergence de variants préoccupants de SRAS- CoV-2 requiert dans l’urgence de nouvelles données scientifiques. Dans ce contexte, l’apport de la recherche utilisant des espèces animales modèles est essentiel à la gestion de la crise sanitaire. De nouveaux besoins urgents de recherche sont apparus en lien avec l’apparition de formes symptomatiques longues de la maladie et l’émergence des variants préoccupants du SRAS-CoV-2. Le présent projet a pour objectifs (i) l’étude de la physiopathologie des infections à SRAS-CoV-2 et ses variants et ce, principalement, au niveau de l’épithélium respiratoire des rongeurs modèles de la COVID-19, (ii) une meilleure compréhension de la diffusion et de la multiplication du SRAS-CoV-2 et ses variants dans les tissus (immunité croisée, transmissibilité, réinfection) et (iii) l’évaluation de vaccins, en particulier muqueux, et d’approches thérapeutiques adaptés à l’évolution épidémiologique des infections à SRAS-CoV-2.

Bénéfices attendus

L’étude chez le rongeur des infections à SRAS-CoV-2 et des stratégies de prévention et/ou de contrôle est déterminante pour l’élaboration de stratégie de lutte contre la pandémie de COVID-19. Ce projet s’inscrit dans une démarche de sciences appliquées au domaine médical en lien avec les déclarations d’intérêt, d’urgence ou de priorité nationale du gouvernement et des organismes publics de recherche.

Procédures

L’inoculation de la souche virale est réalisée en 8 minutes, par voie nasale sous anesthésie à l’isoflurane, en prise unique. Les traitements (thérapeutiques ou vaccinaux) sont administrés en 2 minutes, par voie sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire à l’animal vigile. Le traitement par voie nasale est administré en 8 minutes sous anesthésie à l’isoflurane. Des analyses sérologiques seront réalisées au cours des essais vaccinaux. Tous les animaux seront prélevés au plus 3 fois lors de la phase d’immunisation : avant chaque vaccination (au maximum 2) et avant l’administration de la souche virale d’épreuve. Les prélèvements seront réalisés en 10 minutes, au sinus rétro-orbital sur animal anesthésié. Le volume de sang prélevé est de 100 à 300 μl selon l’espèce.

Impact sur les animaux

Dans les conditions expérimentales les plus défavorables, l’infection du hamster doré par le SRAS-CoV-2 se traduit par une perte de poids transitoire d’environ 10%. L’animal infecté contrôle l’expression pulmonaire de la maladie au bout du septième jour de l’infection. En revanche, dans les mêmes conditions, l’infection est létale chez la souris transgénique hACE2 à 7 jours post-infection avec une perte de poids et une infection du système nerveux central conduisant à une chute de l’activité motrice et des capacités respiratoires. Cette lignée de souris est la seule à ce jour qui présente une létalité. L’impact physiopathologique de l’infection des autres lignées de souris utilisées dans ce projet sera systématiquement évalué. Il a été observé que l’infection de souris non transgéniques pour hACE2 par la souche murinisée MACo3 entraîne des symptômes légers ou modérés.

Devenir

La mise à mort des animaux est requise au regard de la gestion du risque d’exposition de l’agent pathogène de groupe III utilisé dans cette procédure.

Remplacement

L’étude de la physiopathologie de l’infection ne peut être menée sans avoir recours à l’administration de l’agent pathogène à l’animal vivant. En revanche, les stratégies vaccinales et thérapeutiques sont validées préalablement sur des modèles d’infection utilisant des lignées cellulaires appropriées (cellules VeroE6 ou Calu3). L’effet du traitement antiviral sur la multiplication du SRAS-CoV-2 ainsi que le choix de l’antigène vaccinal sont ainsi entérinés par des analyses in vitro. Les essais vaccinaux et thérapeutiques sont ensuite réalisés chez l’animal dans les meilleures conditions possibles afin d’évaluer l'innocuité et l’efficacité du traitement.

Réduction

Les modèles d’infection à SRAS-CoV-2 chez les rongeurs sont validés et totalement maîtrisés. L’utilisation de la souche historique française dénommée D614G définit les conditions standard des protocoles expérimentaux auxquelles se réfèrent l’étude des variants préoccupants ou VoC. Nous disposons d’un protocole d’administration de souches virales présentant des conditions de Répétabilité et Reproductibilité satisfaisantes. La comparaison des traitements s’établit à l’aide de tests non paramétriques (Mann-Whitney).

Raffinement

Nous nous sommes employés à définir les conditions optimales d’hébergement des hamsters dorés. L’observation du comportement du hamster, d’une part, et l’adaptation des méthodes d’anesthésie, de contention et des gestes techniques à l’animal, d’autre part, garantissent une bonne prise en compte du principe de raffinement. Notre expérience du modèle souris a été également mise à profit pour aborder la question du raffinement : enrichissement et habituation de l’animal à la manipulation. La bonne connaissance du modèle infectieux sur lequel repose ce projet permet de limiter les souffrances ressenties par les animaux au cours des procédures expérimentales. Les hamsters sont hébergés individuellement et les souris par 5 dans des portoirs ventilés, avec à leur disposition du matériel de nidification (coton), des tunnels et des maisonnettes en carton ainsi que des bûchettes de bois à ronger.

Choix des espèces

Le hamster doré est naturellement sensible aux infections à SRAS-CoV-2 et représente un modèle de choix pour étudier la COVID-19. Ce modèle restitue naturellement la physiopathologie humaine de la COVID-19. Les signes cliniques sont transitoires, l’animal contrôlant naturellement l’infection. La souris transgénique K18 ou KI exprime le récepteur humain ACE2 au SRAS-CoV-2 et permet le développement clinique et virologique des infections à SRAS-CoV-2. La souris non transgénique pour hACE2 est sensible à l’infection par la souche murinisée MACo3 et présente l’avantage de pouvoir envisager l’emploi de souris génétiquement modifiée pour un gène d’intérêt (surexpression ou suppression) nécessaire à l’exploration des mécanismes biologiques impliqués dans la susceptibilité ou la défense de l’hôte vis-à-vis de l’infection virale. Les animaux utilisés dans ce projet seront des hamsters ou des souris de 6 à 8 semaines d’âge. Mais des hamsters plus âgés (> 6 mois) pourraient être enrôlés dans des études spécifiques selon l’évolution des connaissances.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'injection dans le cerveau puis l'implantation d'une micro-LED sur le crâne, avant des tests moteurs et des injections de L-dopa destinées à reproduire les mouvements anormaux des patients parkinsoniens. Le porteur indique que le modèle provoque hypoactivité, perte de poids et mouvements involontaires, qu'il décrit comme non douloureux. Il affirme qu'aucune simulation informatique ne reproduit la physiopathologie cérébrale et sa traduction comportementale.

Objectifs

Ce projet a pour but de tester le potentiel thérapeutique d'une méthode peu invasive de stimulation du cerveau dans la maladie de Parkinson. Le traitement symptomatique de la maladie de Parkinson repose sur la substitution de la dopamine manquante par la L-Dopa. Cependant, après plusieurs années sous L-Dopa, les patients développent des complications motrices : les dyskinésies (mouvements anormaux involontaires). Une alternative thérapeutique non médicamenteuse peut alors être proposée à certains patients: la stimulation cérébrale profonde à haute fréquence du noyau subthalamique (HFS-STN), un des noyaux des ganglions de la base. Il s’agit d’un traitement neurochirurgical symptomatique très efficace, mais qui présente l’inconvénient majeur d’être invasif et de ne profiter qu’à une minorité des patients du fait de critères d’éligibilité stricts (environ 10%). Certains types de neurones dans le cortex moteur sont activés par la HFS-STN, et la stimulation directe de ces neurones par la lumière (grâce à une fibre optique implantée dans le cerveau) dans des souris transgéniques parkinsoniennes permet de reproduire partiellement les effets bénéfiques de la HFS-STN sur les symptômes moteurs dans un modèle murin de la maladie de Parkinson. Ces résultats ouvrent une nouvelle voie thérapeutique moins invasive que la stimulation cérébrale profonde, donc pouvant potentiellement bénéficier à plus de patients. Dans cette étude, nous optimiserons cette voie thérapeutique chez des souris modèle de la maladie de Parkinson sur deux axes : 1) en mettant au point une méthode d'activation neurones moins invasive : illuminer à travers le crâne à la place d'insérer une fibre optique dans le cerveau 2) en comparant les effets de la stimulation sur de nouvelles localisations pour sélectionner celle qui induit les meilleurs effets bénéfiques sur les symptômes parkinsoniens.

Bénéfices attendus

Cette étude s'insère dans un projet plus large de mise au point de techniques alternatives à la stimulation cérébrale profonde dans la maladie de Parkinson. En effet cette technique est très invasive et ne peut donc bénéficier qu'à environ 10% des patients. Certains types de neurones du cortex moteur, activés par la stimulation cérébrale profonde, constituent des cibles thérapeutiques plus superficielles donc moins invasives. La stimulation par la lumière de ces neurones améliore les symptômes moteurs dans un modèle de la maladie de Parkinson chez la souris, mais nécessite l'insertion d'une fibre optique dans le cerveau. Cette étude permettra de tester et mettre au point une méthode moins invasive de stimulation par la lumière des neurones du cortex : à travers le crâne intact.

Procédures

Les souris du lot de mise au point subiront 1 chirurgies d'injection cérébrale sous anesthésie générale de courte durée (

Impact sur les animaux

Les souris utilisées pour la mise au point technique et dans le groupe contrôle non parkinsonien n'auront que peu d'effets indésirables : en effet, les lignées transgéniques utilisées n'ont pas de phénotype dommageable, et toutes les mesures sont prises pour prendre en charge la douleur péri-opératoire. Pour les souris modèles de la maladie de Parkinson, nous nous attendons à diminution de l'activité et une perte de poids durant les deux premières semaines, pendant lesquelles elles bénéficieront d'un suivi renforcé pour minimiser au maximum les nuisances. Après stabilisation, ces souris présenteront également des modifications à long terme du comportement moteur (légère hypoactivité, asymétrie de l'usage des membres). Ces modifications sont inhérentes au modèle parkinsonien, et nécessaires pour tester les effets bénéfiques de la stimulation, et ne causent pas de douleur. Après induction des dyskinésies (mouvements anormaux involontaires), les souris présenteront temporairement après chaque injection des mouvements involontaires (rotations, posture tournée d'un côté, tics des pattes et tics faciaux). Là aussi ces nuisances sont non douloureuses et nécessaires pour pouvoir tester les effets bénéfiques de la stimulation dans les conditions les plus proches de celles vécues par les patients parkinsoniens.

Devenir

Il est nécessaire de mettre à mort les animaux dans toutes les procédures pour pouvoir effectuer une vérification histologique des aires corticales ciblées et du modèle parkinsonien.

Remplacement

Pour étudier le bénéfice des stimulations proposées sur les symptômes moteurs de la maladie de parkinson, il est nécessaire d'utiliser des animaux produisant un comportement moteur (et modèles de cette maladie). Aucune méthode de simulation informatique ne permet de récapituler la complexité de la physio-pathologie cérébrale, et encore moins sa traduction comportementale. Les structures cérébrales étudiées ne sont pas présentes chez les invertébrés.

Réduction

Trois conditions sont testées sur les mêmes animaux (Parkinson, et 2 états dyskinétiques) pour réduire le nombre total d'animaux utilisés.

Raffinement

Toutes les mesures sont prises pour minimiser les nuisances subies par les souris: une anesthésie et analgésie appropriée lors des chirurgies, un suivi post-opératoire quotidien et adapté tout au long de l'utilisation des animaux, et renforcé dans le cas des modèles de la maladie de Parkinson (maintien au chaud, nourriture appétante et hypercalorique, surveillance et maintien de l'hydratation, analgésique selon nécessité), pendant tout le temps nécessaire à la stabilisation (en général 2 semaines). Les souris sont hébergées dans une animalerie agréée et disposent de matériel d'enrichissement (coton pour faire des nids, petites maisons ou tubes pour se cacher).

Choix des espèces

Il est nécéssaire d'utiliser un modèle animal mammifère pour obtenir des résultats potentiellement transposables à l'Homme, car les structures étudiées ne sont pas présentes, ou sont organisées différement chez les autres vertébrés (et absentes chez les invertébrés). Parmi les modèles animaux mammifères, nous utilisons le modèle souris qui permet l'utilisation de lignées transgéniques nécessaires à cette étude. adulte : il est nécessaire d'étudier l'effet de la stimulation cérébrale sur un animal dont le cerveau est complètement développé

605 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie de la tête leur injecte de la collagénase pour provoquer une hémorragie cérébrale, suivie d'IRM, de tests de score neurologique et de force d'agrippement, puis d'une perfusion intracardiaque létale pour prélever le cerveau. Le porteur indique que le modèle peut entraîner des pertes d'équilibre, une faiblesse musculaire, une désorientation et une perte de poids. Il précise que le projet fait l'objet de financements industriels et affirme qu'aucune méthode alternative n'apporterait le même niveau d'information.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester cinq stratégies thérapeutiques dont leurs mécanismes d’action est susceptible d’agir sur différentes phases de l’hémorragie : la phase aigüe (24h) pour limiter la lésion et la phase inflammatoire qui s’installe les jours suivants. L’effet de nos cinq stratégies thérapeutiques seront évalués en utilisant un modèle d’AVC hémorragique chez le rat par gavage (per-os), par administration intrapéritonéale (i.p) ou bien par injection directe sur le site hémorragique pour chaque traitement. Nous chercherons également à comparer l’effet de ces stratégies thérapeutiques à 2 doses différentes afin de déterminer laquelle permet d’obtenir une réduction du déficit sensorimoteur ainsi que du volume hémorragique.

Bénéfices attendus

Ce projet fait l’objet de plusieurs financements industriels afin d'étudier de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant la réduction du déficit sensorimoteur, limiter la lésion ainsi que l’inflammation causé par un saignement cérébral. Chez l’homme, les hémorragies intracérébrales spontanées (HICS), non traumatique, résulte d’une irruption importante de sang dans le parenchyme cérébral, suite à une rupture de micro-vaisseaux. Cette étude pourra mettre en évidence de nouvelles stratégies thérapeutiques pharmacologiques dans la lutte contre ce type d’AVC hémorragiques, n’ayant aujourd’hui aucun traitement de référence permettant de réduire les effets délétères d’un hématome sur le parenchyme cérébral.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin de pouvoir injecter de la collagénase, provoquant ainsi une hémorragie dans le cerveau. Cet act chirugical durera 15 minutes. Pour les groupes traités par injection directement sur le site hemorragique, une seconde pipette sera insérée au même endroit ou la collagénase a été injectée, 20 minutes post-AVC. Cet acte durera 6 minutes. A J+1 et J+14, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 8 minutes et suiveront une série de test comportementaux s'étalant de J+1 à J+22 post hémorragie. La mesure du score neurologique durera 10 minutes. En prenant compte des temps de récupération, la mesure de la force d’agrippement durera entre 25 et 30 minutes. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au coeur. Un prélèvement de sang par ponction cardiaque sera réalisé avant perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant prélèvement. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements. Les procédures douloureuse (chirurgie, perfusion transcardiaque) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une couverture analgésique.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC hémorragique à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire. L'hémorragie cérébrale provoque une désorientation au moment du réveil post-chirurgical. Les fonctions motrices peuvent également être altérées durant les premières heures après l'hémorragie. Nous pouvons nous attendre à déceler sur certains animaux des signes de complications et de détresse postchirurgicales tels qu'une absence de réaction aux stimuli, une inactivité de l'animal dans sa cage ou encore une perte de poids suite à un arrêt de la prise alimentaire. Les situations précédemment citées définissent nos points limite à appliquer pour ce projet. Nous surveillerons à ce qu'ils ne soient pas dépassés. Lors de l'administration des traitements par voie intrapéritonéale, la contention et l'injection peuvent engendrer un stress et une douleur. Un acte rapide réalisé avec du matériel adéquat par du personnel compétent limite drastiquement cette douleur et le traumatisme provoqué.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo qui fait suite aux nombreuses validations réalisées in vitro, et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que de tester ces stratégies thérapeutiques chez l'animal. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que le rat est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, le rat est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC hémorragique ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. Le nombre d’animaux utilisés est fixé à 10 rats par groupe (+ 10%), ce qui nous permettra de déceler des différences significatives. Ainsi, nous concilions le nombre minimum d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique.

Raffinement

Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les rats seront en groupes sociaux avec un ou plusieurs enrichissements (sizzle-dri kraft, alpha-dri et buchette en bois), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi biquotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. L'expérimentateur ou l'animalier pèsera chaque animal et veillera à ce que les points limites ne soient pas dépassés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. La température corporelle de l’animal est maintenue à 37.5°C grâce à un système de couverture chauffante, et une couverture isothermique sur son dos limite les pertes de chaleur. Chaque site d’incision de peau fait appel à une tonte préalable du pelage, puis à une désinfection à la Chlorexidine et enfin l’application d’une analgésie locale. Lors de la phase de réveil, les animaux seront placés dans une cage individuelle chauffée à 28°C pendant 2 heures avant d’être remis en cage par 2. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Le rat (Rattus norvegicus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l’hémorragie intracérébrale. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines soit un poids de 300g. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’hémorragie.