Rongeurs

216 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à neuf injections dans l'abdomen puis développent un cancer de la prostate avant d'être disséquées pour étude de la prostate. Le porteur présente l'étude comme un projet pilote destiné surtout à mettre au point le protocole expérimental. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la cinétique et la complexité des lésions précancéreuses.

Objectifs

Afin de mieux comprendre l’évolution des cancers de la prostate (CaP), ce projet pilote ,utilisant des lignées de souris génétiquement modifiées, vise à déterminer le protocole expérimental pour identifier les populations cellulaires qui prolifèrent dans les lésions précancéreuses présentant des mutations et une cinétique similaires que celles trouvées chez l’Homme.

Bénéfices attendus

ce projet pilote déterminera le protocole expérimental permettant d'identifier les populations cellulaires qui prolifèrent dans les lésions précancéreuses.

Procédures

Les souris subiront au maximum 9 injections intra-péritonéales espacées de 1 à 10 mois, soit 1 injection quotidienne en intra-péritonéales pendant 5 jours de tamoxifène dans un premier temps, et 1 injection quotidienne d'EdU pendant 4 jours au temps de cinétique choisi. Aucune autre intervention n'est prévue.

Impact sur les animaux

Les souris transgéniques injectées développeront des cellules tumorales qui évolueront en cancer de la prostate (CaP). De plus, une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d’injection pour éliminer tout risque d’infection (pas de zone rouge autour de la zone ou de présence de pus).

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure 1 et 2 afin d'être disséqués pour l'étude de la prostate.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Afin de différencier les rôles de différentes molécules pouvant être impliquées dans le développement du CaP, l’ensemble du projet va nécessiter l'utilisation de 2 lignées de souris différentes soit 216 animaux. Ce nombre d'animaux nous permettra d'obtenir des conclusions statistiquement significatives. Par ailleurs, des études préliminaires in vitro et des études pilotes pour identifier le protocole efficace ont été réalisées afin d’éliminer certaines hypothèses et de mieux définir les expériences à effectuer sur les modèles in vivo.

Raffinement

Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé, est inactif après stimulation, ou si les points d'injections présentent des signes d'infection ou d'inflammation il sera retiré de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Si le cas est plus grave (blessure importante par exemple), l'animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un animal qui a un système immunitaire largement décrit dans la littérature et qui est proche de l’humain avec une immunité innée et adaptative, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. De plus, les souris qui seront utilisées expriment les mêmes protéines que l’homme, ce qui permet de générer les mutations les plus fréquemment identifiées dans le CaP humain. L’ensemble de ces résultats nous permettra d’étudier au plus près l’évolution des lésions de CaP afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les animaux utilisés seront adultes, de 8 semaines à plus d'un an afin de faire une cinétique en fonction de l'âge.

16 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de vecteurs viraux puis des injections quotidiennes d'immunosuppresseurs pouvant s'étaler sur seize semaines, avec des prélèvements de sang répétés, l'immunosuppression pouvant provoquer des infections opportunistes et une perte de poids. Ce criblage sert à préparer une thérapie génique destinée à des enfants atteints d'une maladie osseuse rare. Le porteur décrit la souris comme une "espèce inférieure" servant à trier vecteurs et traitements avant des essais sur primates, qu'il présente comme le "modèle de prédilection".

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un programme plus large qui inclut un projet déjà en cours dans le même établissement utilisateur. L’objectif du programme est de développer des traitements pour différents types de dysplasies du squelette, notamment la dysplasie spondyloépiphysaire congénitale (SEDc), la collagénopathie de type 2 la plus fréquente. La SEDc est une dysplasie osseuse génétique qui cause une forme rare de nanisme chez l'être humain (1 naissance sur 100 000). Elle est caractérisée phénotypiquement par une petite taille avec un raccourcissement du tronc et du cou, induisant un risque important d'instabilité au niveau des vertèbres cervicales pouvant provoquer une paralysie. Les patients souffrent également d'anomalies au niveau de la rétine et d’une perte d'audition. Cette pathologie est due à des mutations perte de fonction dans le gène du collagène de type 2. L’objectif de ce projet est d’identifier un traitement immunosuppresseur pouvant être utilisé en combinaison avec un traitement de thérapie génique pour différents types de dysplasies squelettiques. Les traitements de thérapie génique basés sur l’utilisation de vecteurs viraux peuvent induire des réponses immunitaires pouvant réduire l’efficacité du traitement (diminution du niveau d’expression du gène d’intérêt ou élimination des cellules transduites) et empêcher la ré-administration efficace de ce dernier (réponse mémoire dirigée contre le vecteur viral). Il est donc nécessaire d’inhiber de façon transitoire les mécanismes impliqués dans les réponses immunitaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à la fois d’identifier la ou les constructions de vecteurs viraux les moins immunogènes, et la stratégie d’immunosuppression la plus efficace entrainant le moins de complications. Ces résultats, combinés à ceux d’un autre projet en cours permettront d’identifier, chez la souris, la combinaison vecteur viral / immunosuppression la plus efficace et la moins toxique. Ces étapes de pré-sélection chez la souris permettront de diminuer le nombre de sujets dans les futures études sur animaux supérieurs (type primates) aux caractéristiques plus proches de celles de l’Homme. Le bénéfice final du projet est de développer des traitements (combinaison thérapie génique / Immunosuppression) pour différents types de dysplasies du squelette, notamment la dysplasie spondyloépiphysaire congénitale (SEDc), la collagénopathie de type 2 la plus fréquente.

Procédures

Les animaux seront soumis à une ou deux injections de vecteurs viraux par voie intraveineuse ou intrapéritonéale, et de multiples injections d’immunosuppresseurs par voie intrapéritonéale. Ces dernières se feront sur une durée maximum de 16 semaines (injections IP quotidiennes sur un maximum de 21 jours consécutifs ou injections hebdomadaires sur un maximum de 16 semaines). Les animaux seront également soumis à des prélèvements répétés de sang (toutes les semaines, ou toutes les deux semaines sur une durée maximale de 16 semaines) dans la mesure du possible (effectués sur des animaux d’un mois minimum). Ces prélèvements s’effectueront sous anesthésie au niveau de la veine mandibullaire en alternant chaque côté. Des prélèvements de sang terminaux seront également effectués sous anesthésie sur tous les animaux par la voie rétro-orbitale.

Impact sur les animaux

Aucun effet indésirable n’est attendu suite à l’injection de vecteurs viraux (résultats obtenus dans le cadre d’un précédent projet). Les souris sous immunosuppresseurs présenteront un système immunitaire éteint. Elles seront ainsi plus sujettes à des infections opportunistes et aux complications qui pourraient en découler. En cas d’infection, les souris pourraient être sujettes à des pertes de poids ou des signes d’inactivité.

Devenir

Toutes les souris utilisées au sein de ce projet seront mises à mort par dislocation cervicale, asphyxie au CO2 ou injection intrapéritonéale d’une dose létale de pentobarbital sodique (de type Euthasol 140 mg/kg ou Euthoxin 500 mg/kg). La mise à mort est nécessaire afin de récupérer un ensemble d’organes (rate, foie, moelle osseuse, plaques de croissance…) pour évaluer à la fois la biodistribution des vecteurs viraux testés, mais aussi l’effet du traitement (vecteur viral et immunosuppresseur) sur la réponse immunitaire cellulaire.

Remplacement

Globalement, la construction des vecteurs viraux et l’optimisation de ces derniers se sont faites et continuent à se faire en se basant sur des publications scientifiques, et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés. Les différents vecteurs viraux produits sont précédemment testés in vitro afin de valider leur capacité à transduire efficacement des cellules modèle (HEK293). Si la transduction n’est pas efficace, le vecteur ne sera pas sélectionné pour les études in vivo. Une importante recherche bibliographique a été effectuée afin d’identifier des traitements immunosuppresseurs d’intérêt, d’autant plus sachant que la patientèle sera constituée en totalité d’enfants. Il est très difficile de valider une stratégie d’immunosuppression par des tests in vitro sachant que cela nécessite la présence d’un système immunitaire complet et fonctionnel. Certains immunosuppresseurs seront tout de même évalués à l’aide des tests in vitro mentionnés précédemment afin de confirmer qu’ils n’impactent pas la capacité des vecteurs à transduire efficacement les cellules modèles.

Réduction

Le juste nombre d’animaux a été calculé de manière à réduire le nombre minimum d’animaux par lot, tout en produisant des résultats statistiquement significatifs et robustes. De manière à répondre aux exigences de réduction, nous allons utiliser des groupes contrôles en commun chaque fois que cela est possible. Globalement, un ensemble de 8 animaux par groupe sera suffisant pour comparer de manière significative les niveaux d’anticorps et les réponses cellulaire induites. En effet, l’utilisation d’outils statistiques (calcul de puissance de test et de taille d’échantillons, https://biostatgv.sentiweb.fr/?module=etudes/sujets#) permet de définir un nombre minimal d’animaux de 8 par groupe, en considérant un seuil de significativité (p

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe à maximum 5 par cage et par sexe dans une pièce à température et hygrométrie contrôlées avec un cycle jour/nuit de 12h. Chaque cage sera soumise à un enrichissement du milieu de type tige en papier, un igloo et une buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les malocclusions des incisives. Les souris sous immunosuppresseurs présenteront un système immunitaire éteint. Elles seront ainsi plus sujettes à des infections opportunistes et aux complications qui pourraient en découler. L’hébergement des animaux en zone SPF (Specific Pathogen Free) dans des cages ventilées, l’utilisation de hottes de change, ou de hotte à flux laminaire pour les expérimentations, et l’apport d’aliments irradiés, permettront de réduire ces risques au minimum. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima deux fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée (observation et pesée quotidienne) et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et mis à mort dans les 24 heures avec l’accord du directeur d’étude et/ou d’un vétérinaire

Choix des espèces

Afin d’identifier une combinaison vecteur / immunosuppression applicable en clinique chez l’homme, il est important de la valider au préalable au sein d’un modèle animal. En effet le système immunitaire fonctionne au travers de mécanismes complexes qu’il est impossible de reproduire fidèlement en dehors d’un organisme vivant. Les primates non humains représentent le modèle de prédilection de par son anatomie proche de celle de l’Homme. Il est cependant impossible de cribler autant de paramètres différents (vecteur, dose, immunosuppresseur, dose, fréquence) chez cette espèce. Nous allons avoir besoin d’une espèce inférieure, i.e. la souris, pour cribler les vecteurs mais aussi les traitements immunosuppresseurs pertinents. Étant donné que les destinataires finaux du traitement seront des enfants, l’efficacité du traitement combinatoire thérapie génique + Immunosuppresseur devra être confirmé chez un modèle de souris d’âge similaire, soit des souris juvéniles (1 à 22 jours). Les études qui consistent à évaluer la cinétique de la réponse immunitaire (Procédure n°1), cribler les différents traitements immunosuppresseurs (Procédure n°2) et évaluer l’efficacité d’une seconde injection de vecteur viral (Procédure 3) seront réalisées sur des animaux adultes âgés de 5 à 8 semaines. Étant donné que les destinataires finaux du traitement seront des enfants, l’efficacité du traitement combinatoire thérapie génique + Immunosuppresseur devra être confirmé chez un modèle de souris d’âge similaire, soit des souris juvéniles avec des traitements allant de la naissance jusqu’à un âge de 4 mois maximum (procédures n°4 et 5).

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe d'un million de cellules tumorales dans la glande mammaire sous anesthésie, puis est tuée par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque entre 3 et 28 jours plus tard, pour étudier l'influence des fibres nerveuses sur le cancer du sein. Le porteur indique que les cellules mises en co-culture avec des neurones peuvent donner des tumeurs plus volumineuses voire des métastases. Sur le remplacement, il décrit un test de co-culture in vitro déjà mis au point mais affirme qu'il ne reproduit pas la complexité de l'organe, d'où le recours aux souris.

Objectifs

Les cancers du sein sont la première cause de décès liés au cancer dans le monde occidental chez la femme. Dans ce cancer l'environnement autour des cellules cancéreuses joue un rôle crucial. Récemment, un nouvel élémentde cet environnement tumoral a été identifié : les prolongements des neurones (axones) du système nerveux périphérique. S’il est maintenant clairement établi que certaines cellules de l'environnement tumoral influencent la progressiondu cancer, le rôle des cellules nerveuses et notamment des fibres nerveuses infiltrant les tumeurs reste mal compris. Nous proposons donc d’étudier l’influence du système nerveux dans le développement des cancers du sein. Ainsi, le but de ce projet est de mieux comprendre le rôle de l’innervation au sein des tumeurs mammaires et de caractériser les interactions entre les projections nerveuses et les cellules tumorales. Nos données in vitro ont montré que les cellules cancéreuses de cancer du sein de souris co-cultivées avec des neurones étaient capables de proliférer plus rapidement que les cellules cancéreuses cultivées seules. Nous souhaitons donc à travers ce projet valider ce résultat chez la souris. Dans un premier temps, nous étudierons le développement tumoral d’une implantation dans la glande mammaire de cellules cancéreuses de souris ayant été au préalable en co-culture pendant 6 jours avec des neurones. Nous utiliserons comme contrôle des cellules tumorales ayant été en culture seules 6 jours avant implantation. Afin d’étudier la cinétique du développement tumoral, nous procéderons à des euthanasies au bout de 3, 7, 14 et 28 jours (ou atteinte d’un point limite). Pour finir, dans une deuxième et dernière procédure, nous souhaitons vérifier que le caractère pro-tumoral des cellules cancéreuses est bien dû à la présence des neurones. Pour cela, nous induirons une mort des neurones en traitant nos cellules avec une drogue en co-culture avant l’implantation dans la glande mammaire. Nous utiliserons comme contrôle des cellules cancéreuses ayant été en culture seules 6 jours avant implantation et traitées avec la drogue induisant la mort neuronale. Afin d’étudier la cinétique du développement tumoral, nous procéderons à des euthanasies au bout de 3, 7, 14 et 28 jours (ou atteinte d’un point limite).

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet va donc identifier de nouvelles interactions entre les neurones et les cellules cancéreuses applicables dans la lutte contre les cancers. A ce jour, les thérapies couramment utilisées en clinique ciblent principalement les cellules tumorales (chimiothérapie) et, plus récemment, le microenvironnement tumoral en visant les vaisseaux sanguins de la tumeur. L’identification des mécanismes à l’origine du dialogue entre les neurones et les cellules cancéreuses sera une avancée majeure pour le traitement des cancers et pourra déboucher vers de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de lutter contre le développement de la tumeur primaire mais aussi des métastases.

Procédures

Les souris reçoivent une injection de 1 000 000 de cellules tumorales implantées avec une seringue à insuline (29 G) au niveau de la glande mammaire sous anesthésie générale (induction à 5% isoflurane pendant une minute, et maintien au masque à 2.5% isoflurane d’environ 2-3 minutes, temps nécessaire à l’injection des cellules dans la glande mammaire).

Impact sur les animaux

La lignée de cellules cancéreuses utilisée est issue d’un carcinome mammaire spontané apparu chez la souris femelle, et est décrite comme peu agressive et non métastatique. En effet, ces cellules ne sont pas capables de sortir du site d’injection primaire et le volume tumoral moyen à 28 jours n’excède pas 1cm3. Aucune métastase n’est donc détectée dans les poumons, le foie et les ganglions lymphatiques 7 semaines après implantation. Dans nos procédures, nous nous limiterons à 28 jours post implantation afin de limiter au maximum la souffrance animale. Cependant, nos données in vitro montrent que la co-culture de ces cellules avec des neurones sympathiques augmente les capacités oncogéniques des cellules tumorales. Il est donc possible que les cellules cancéreuses ayant été en co-culture soient plus agressives et donnent donc des tumeurs plus volumineuses ainsi que des métastases. Dans nos procédures, nous utiliserons une fiche de score adaptée et nous nous limiterons à 28 jours post implantation afin de limiter au maximum la souffrance animale.

Devenir

Dans l’ensemble des procédures, les euthanasies seront réalisées par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque. En effet, nous procéderons à une euthanasie par dislocation cervicale dans un premier temps car nous souhaitons effectuer des tests de prolifération et d’invasion in vitro ainsi que des coupes fines du tissu avec des marqueurs spécifiques afin de visualiser la tumeur ou les métastases possibles sur le foie et les poumons. Ces expérimentations sont toutes compatibles avec une euthanasie par dislocation cervicale. Dans un deuxième temps, nous souhaitons réaliser une description plus précise des phénomènes observés lors de notre étude, nous devons donc travailler sur des tissus dont la structure morphologique et l’organisation cellulaire sont parfaitement conservées. Pour cela, une perfusion intracardiaque sous anesthésiant est préconisée suivie d’une exsanguination induisant la mort de l’animal. La technique de perfusion intracardiaque est détaillée dans chacune des procédures. Pour les animaux ayant ateint un point limite, l'euthanasie se fera par dislocation cervicale.

Remplacement

Nous avons mis au point un essai in vitro de co-culture de cellules cancéreuses et de neurones qui permet de récapituler le mieux possible les interactions entre neurones et cellules cancéreuses. Nous avons observé que la croissance des fibres nerveuses déclenche une augmentation de l'invasion et de la prolifération des cellules cancéreuses. Même si nous avons exploité au maximum les données in vitro, nos co-cultures ne récapitulent pas la complexité́ de l’organe. En effet, une tumeur se développe par l’interaction des cellules cancéreuses avec leur environnement tumoral très complexe constitué de cellules immunitaires, de vaisseaux sanguins, de fibroblastes ect… La culture in vitro des cellules tumorales avec uniquement un seul constituant du microenvironnement tumoral (ici, les neurones) ne reproduit donc en aucun cas un développement tumoral physiologique d’où notre recours aux animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux est choisi afin d’obtenir une taille d’effet d’intérêt avec un nombre de souris minimum. Le nombre de souris se justifie par la taille moyenne des tumeurs 28 jours après implantation des cellules tumorales.

Raffinement

Dans le respect de la réglementation européenne, les animaux seront manipulés dans le calme ,4/cages, avec une alternation jour/nuit de 12h, eau et nourriture à volonté. Chaque cage est enrichie (maisonnette en carton, carrés de coton). Les cages sont séparées des élevages pour un suivi adapté. La période d’acclimatation suite à la livraison des souris sera de 5 jours, à la fin de laquelle les souris recevront les cellules tumorales. L’injection des cellules tumorales est réalisée sous anesthésie générale. Le suivi sera effectué 3 fois par semaine et évalué via la grille de score associés à des critères de mal-être . Un score cumulé limite entrainera la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

Nous souhaitons étudier le rôle des fibres nerveuses dans le développement tumoral du cancer du sein. Dans cette optique, nous souhaitons utiliser le modèle d’implantation de cellules tumorales dans la glande mammaire. Le modèle murin est un excellent modèle pour élucider ces mécanismes car il présente de grandes similitudes génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. Ce modèle est un outil puissant et couramment utilisé dans l’étude des cancers du sein. Les implantations de cellules tumorales seront réalisées sur des souris âgées d’au moins 8 semaines, âge auquel la glande mammaire est mature/formée. Dans les nos 2 procédures les prélèvements des tumeurs sur les souris se feront à 3, 7, 14 et 28 jours après implantation des tumeurs. En effet, afin d’étudier le comportement des cellules tumorales co-cultivées avec les neurones, il est nécessaire de regarder à différents temps du développement tumoral. Ainsi nous pourrons mieux comprendre comment les cellules tumorales deviennent plus agressives lorsqu’elles sont en contact avec les neurones et déceler des mécanismes qui s’opèrent au début du développement.

16 270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent un modèle d'une maladie osseuse rare avec atteinte rénale, reçoivent des injections de vecteurs lentiviraux, des prélèvements de sang et d'urine et une biopsie d'oreille, puis sont toutes tuées pour analyse des organes, pour une preuve de concept thérapeutique. Le porteur annonce un bénéfice "certain à long terme" pour les patients, formulé au conditionnel, face à ce nombre très élevé d'animaux mobilisés d'emblée. Il affirme le recours au modèle animal "inévitable" malgré des tests menés in vitro et une recherche bibliographique.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer une nouvelle approche thérapeutique pour une maladie osseuse avec troubles renaux associés. En effet, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif pour cette maladie. Les seules approches thérapeutiques actuellement utilisées sont des approches palliatives et seulement pour certains symptômes de la maladie notamment les problèmes rénaux associés.

Bénéfices attendus

Ce projet va nous permettre de faire la preuve de concept chez l’animal d’une approche thérapeutique pour cette maladie. Il s’agit d’une maladie rare sévère pour laquelle à l’heure actuelle il n’existe aucune approche thérapeutique. Dans le cas où cette approche fonctionnerait cela nous permettrait de continuer le développement dans le but d’apporter un jour un traitement efficace pour les patients. Il s’agit donc d’un bénéfice certains à long terme pour ces patients.

Procédures

Les animaux sont soumis à des injections de vecteurs lentiviraux (30 secondes), ainsi que des prélevements de sangs (5 minutes) et d'urine (30 minutes). Les prélèvements de sang sont sur animal anesthésié et un animal aura maximum de 3 prélèvements dans sa vie. Les prélèvements d'urine se font sur animal non anesthésié et un maximum de 6 prélèvements sera fait Les animaux auront également une biopsie d'oreille pour savoir s'ils sont porteur de la maladie (20 secondes).

Impact sur les animaux

Le modèle de souris utilisé dans ce projet présente les signes cliniques caractéristiques de la maladie. En effet, ces animaux sont de plus petite taille et présentent un poids inférieur par rapport aux souris non malades de même âge. Cependant les chercheurs ayant générés ce modèle ne rapportent aucun problème pour ces animaux à se mouvoir ou à s’alimenter. Les souris ont également une altération de la fonction rénale et une ostéoporose associée à une destruction partielle des os des pattes chez la souris malade. Toutes ces altérations sont caractéristiques de la pathologie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. En effet, le projet nécessite d'étudier la structure des organes afin de vérifier l'efficacité du traitement testé et cela ne peut se faire que sur animal euthanasiés.

Remplacement

Globalement, la production du traitement et l’optimisation se fait et continue à se faire en se basant sur des publications scientifiques, et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés sur cellules. Une importante recherche bibliographique a été effectuée afin d’identifier les cellules atteintes lors de la pathologie et ainsi développer un traitement le plus ciblé possible. Cependant l’utilisation du modèle animal de la maladie est inévitable afin de déterminer le bénéfice thérapeutique ainsi que d’évaluer les potentiels effets toxiques du traitement.

Réduction

Le juste nombre d’animaux a été calculé de manière à réduire le nombre minimum d’animaux par lot, tout en produisant des résultats statistiquement significatifs et robustes. De manière à répondre aux exigences de réduction, nous allons utiliser des groupes contrôles en commun chaque fois que cela est possible. Globalement, un ensemble de 10-12 animaux par groupe sera suffisant pour valider l’efficacité d’un traitement. Ce modèle étant un nouveau modèle de souris, il est possible que ce nombre soit amené à changer au cours des études et des différents résultats obtenus. Ce nombre est basé sur nos expériences passées avec différents modèles animaux de maladies osseuses.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe à maximum 5 par cage. Chaque cage contient une tige en papier, un igloo et une buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les malocclusions des incisives. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima trois fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et euthanasiés dans les 24 heures.

Choix des espèces

Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant de la maladie, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie, et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs. Ce modèle de souris est pertinent car il a été construit pour mimer la pathologie et en effet, les auteurs du papier original démontrent bien que les principales caractéristiques de la pathologie sont retrouvées. Les animaux seront utilisés de la naissance jusqu’à environ 52 semaines maximum afin de pouvoir caractériser chacune des étapes du développement de la pathologie.

616 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par voie intranasale, sous anesthésie, par les bactéries Pseudomonas aeruginosa ou Staphylococcus aureus, puis tuées par dislocation cervicale six à quarante-huit heures plus tard pour prélèvement d'organes, afin d'étudier le rôle d'une protéine, la cochline, dans la réponse immunitaire. Le porteur indique que l'infection provoque douleur, fièvre et perte de poids pendant la durée de l'expérience. Il juge l'utilisation d'animaux "essentielle" car l'étude ne peut être menée sur des lignées cellulaires.

Objectifs

La résistance aux antibiotiques est un enjeu mondial majeur dans le traitement contre les infections bactériennes. Stimuler le système immunitaire de l'hôte représente une alternative prometteuse afin de diminuer l'antibiorésistance. Les mécanismes endogènes contrôlant l'immunité antibactérienne restent insuffisamment compris, en partie parce que les protéines potentiellement impliquées dans une telle régulation restent peu étudiées. Un exemple est la cochline, protéine de la matrice extracellulaire. Il a récemment été décrit que la protéine circulante cochline (codée par le gène Coch) augmente la réponse innée de l'hôte contre deux bactéries Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus. L’absence de cochline entraîne un défaut de contrôle de la propagation bactérienne au site d’infection (poumon) et sa dissémination dans l’organisme (sang, rate), et une diminution de la survie des souris à ces modèles infectieux. L’absence de cochline est associée à une diminution du recrutement de cellules immunitaires innées. Il a aussi été montré que l'administration de cochline recombinante limite la colonisation bactérienne de lésions cutanées dans un modèle murin d’épidermolyse bulleuse. Ainsi, le ciblage de la « voie cochline » présente un fort potentiel thérapeutique contre les infections bactériennes dans le contexte de l’accroissement des antibiorésistances.

Bénéfices attendus

A court terme, le projet consiste à décrire de façon très complète les défauts de la réponse immunitaire dans les souris transgénique n’exprimant pas la cochline suites aux infections bactériennes. Ce projet permettra donc la caractérisation complète et détaillée de « la voie cochline ». A plus long terme, le ciblage de la voie cochline pourra apporter une option thérapeutique innovante visant à augmenter la réponse de l’hote notamment lors d’infections bacteriennes résistantes aux antibiotiques.

Procédures

Les animaux seront pesés (vigile), identifiées par marquage caudal au feutre (vigile) puis traités pour limiter la souffrance avec du paracétamol dans l’eau de boisson 12h avant infection puis pendant tout le temps de l’expérience (vigile). Les animaux seront alors anestésiés par injection intrapéritonéal (vigile) pendant une dizaine de minutes au cours desquelles ils seront infectés en intranasal avec les bactéries Pseudomonas Aeruginosa ou Staphylococcus Aureus Newman. Après 6h-48h suivant les expériences, les souris seront mises à mort par dislocation cervicale (vigile) ou injection intrapéritonéale (vigile) pour prélèvement de différents organes et échantillons post-mortem

Impact sur les animaux

Douleur induite par une infection bactérienne pulmonaire, fièvre, perte de poids, activité et mobilité réduite. Ces effets dureront au maximum 48h (temps d’expérince le plus long avant mise à mort)

Devenir

Chaque procédure nécéssitant l’analyse sur des organes vitaux (poumon, rate) les souris devront être mises à mort à la fin de chaques procédures.

Remplacement

L'utilisation d'animaux est essentielle pour la réalisation du projet car il requiert l'analyse du système immunitaire et d'un point de vue mécanistique, l'étude ne peut être conduite sur des lignées cellulaires immortalisées.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire a été réduit au maximum afin que la taille de l'échantillon permette de dégager des résultats statistiquement fiables sur des souris mâles et femelles. Ainsi pour limiter le nombre de souris utilisées, nous réaliserons les procédures expérimentales préliminaires avec 4 souris par groupes pour déterminer, à l’aide d’un calcul de puissance, le nombre adéquat de souris pour les autres procédures. Pour les procédures expérimentales de détermination de la dose infectieuse , nous ne testerons pas toutes les doses proposées en même temps mais testerons en premier 2 doses et testerons ensuite des doses à la hausses ou à la baisse parmi celles proposées en fonction des résultats préliminaires obtenus. Pour les procédures d'expérimentations les nombres indiqués correspondent au maximum. Les nombres de souris par groupe seront revus à la baisse en fonction des résultats des procédures préliminaires permettant des calculs de puissance. De plus les résultats des groupes contrôles négatifs (sans infection) pourront être utilisés pour les différentes procédures.

Raffinement

Nous avons optimisé les procédures expérimentales pour réduire au maximum l'inconfort et le stress subis par les animaux. En particulier, nous avons mis en place une surveillance adaptée lors des procédures afin de ne jamais induire un dépassement de point limite de souffrance. Afin de limiter la douleur lors de l’infection intranasale, nous anesthésierons les souris par injection intrapéritonéale (dans l’abdomen). Pour limiter la douleur post-infection nous administrons par voie orale via l’eau de boisson du paracétamol (doliprane 2.4% à 0.6mL/L) qui sera maintenu pendant toute la durée de l'expérimentation. Afin de limiter le mal-être et l'angoisse des animaux, nous mettrons en œuvre des mesures d'acclimatation de 5 jours après leur arrivée en zone d'hébergement, et nous maintiendrons au maximum les groupes sociaux.

Choix des espèces

Le rôle de cochline dans la réponse immune a été établi par 4 publications utilisant la souris. Utiliser le modèle souris nous permettra donc de ne pas répéter des expériences inutiles en étudiant la littérature existante, et de comparer aisément nos résultats avec ceux de nos confrères afin de progresser plus rapidement. De nombreux anticorps spécifiques reconnaissant les marqueurs du système immunitaire murins nous permettent de faire des études sur ce modèle. Les animaux auront entre 5 et 8 semaines de vie à leur arrivée en zone expérimentale. Après une semaine d'acclimatation, ils entreront en procédure. Nous travaillons avec des souris adultes pour nous affranchir d'éventuels problèmes d'immaturité du système immunitaire lié au développement.

500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur mammaire ou une injection de cellules tumorales dans la veine caudale, une chimiothérapie et jusqu'à six cycles de thérapies dites innovantes, avant une exsanguination terminale par ponction intracardiaque, pour étudier la réponse immunitaire au cancer du sein après traitement. Le porteur décrit une tumeur à croissance rapide pouvant provoquer nécrose, ulcérations cutanées et hémorragies douloureuses. Il juge une étape in vivo "nécessaire" pour se rapprocher de la clinique humaine.

Objectifs

L’objectif du projet est d'évaluer l'impact de la chimiothérapie conventionnelle sur la réponse antitumorale, particulièrement la réponse du système immunitaire sur des tumeurs mammaires murines implantées chez des souris, au niveau du site primaire et des métastases, afin de caractériser des acteurs moléculaires pertinents pouvant être cibler par une thérapie innovante. Le projet global consiste à étudier la réponse du carcinome mammaire et de son environnement immunitaire après chimiothérapie dans un modèle syngénique murin immunocompétent comparé un modèle immunodéficient afin de définir : 1. L’efficacité de la chimiothérapie sur la tumeur initiale et le développement autonome des métastases incluant la caractérisation du programme de mort déclenchée dans les cellules tumorales sensibles et notamment la voie cGAS/STING 2. le remaniement du microenvironnement tumoral qu’il induit, particulièrement au niveau immunitaire (immunité innée et adaptative) locale (tumeur primaire) et systémique (métastases, ganglion de drainage, sang) 3. la nature des clones tumoraux qui résisteront au traitement 4. la réponse immunosuppressive locale qui a permis l’établissement des métastases 5. les stratégies thérapeutiques ciblant les acteurs de mort cellulaire et de réponse anti-tumorale immunitaire pouvant amplifier les effets de la chimiothérapie en diminuant les cellules lui échappant

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de participer au rétablissement d’une réponse immunitaire antitumorale locale et/ou systémique efficace grâce à la caractérisation et au ciblage des voies de signalisation participant à l’échappement tumoral entre la tumeur et son microenvironnement immunitaire. L’évasion immunitaire dont bénéficie la tumeur repose sur des processus intrinsèques à la tumeur ou sur sa capacité à corrompre l’environnement tissulaire dans lequel elle évolue et l’effet cytotoxique direct d’une chimiothérapie efficace modifie l’équilibre initial. A court et moyen terme, il va donc être important de déterminer le type de mort que les cellules tumorales vont déclencher sous l’effet de la chimiothérapie, et la nature des signaux d’alarme libérés dans l’espace tumoral ainsi que leur cinétique de sécrétion. Ces signaux de nature variée (incluant métabolites, cytokines, acides nucléiques, vésicules, organites...) influent sur les autres cellules tumorales ou immunitaires au niveau local ou systémique, contribuant à l’adaptation de la tumeur, du système immunitaire et finalement à la récidive de la maladie. Ceci va permettre de générer des données biologiques intégrant le caractère inflammatoire et/ou immunomodulateur de la mort cellulaire induite par le traitement anticancéreux au niveau de la tumeur primitive (ou sa maladie résiduelle quand une exérèse a été pratiquée) ou des métastases associées. A moyen et long terme, ceci permettra d’identifier les processus cytotoxiques qui seront capables de favoriser une réaction immunitaire antitumorale locale et systémique, en l’associant éventuellement avec les approches d’immunothérapie actuellement en cours de développement.

Procédures

Chaque animal de l’étude recevra : • une allogreffe tumorale au niveau 4e coussinet mammaire après incision cutanée et sous anesthésie générale (durée : 20 minutes) avec exérèse tumorale chirurgicale sous anesthésie générale 1é jours plus tard (durée : 20 minutes) o u une injection intraveineuse de cellules tumorale dans la veine caudale sans allogreffe associée (durée : 5 minutes) • 3 injections de chimiothérapie par voie intra-péritonéale sur animal vigile (durée : 2 minutes) • Administration d’une ou de plusieurs thérapies innovantes (jusqu’à 6 cycles par animal) par voie intra-péritonéale ou per os/gavage sur animal vigile ou sous anesthésie générale (durée : 2-5 minutes) • 5 séances de bioluminescence après anesthésie générale et injection intra-péritonéale de Luciférine (durée : 30 minutes) • Une exsanguination terminale par ponction intra-cardiaque sous anesthésie générale injectable juste avant la mise à mort (durée : 15 minutes)

Impact sur les animaux

Le modèle 4T1 est un modèle de cancer mammaire montrant une croissance tumorale rapide et une extension métastatique précoce notamment au niveau du poumon dans les premiers stades puis au niveau de divers organes ensuite (foie, os, rate, cerveau). La croissance de la tumeur et des ses métastases peut provoquer des effets indésirables sur les animaux recevant cette lignée. Tout d’abord au niveau local d’implantion de la tumeur primaire (dans le coussinet mammaire de la 4e mamelle), l’animal peut subir une nuisance mécanique de la tumeur par son volume pouvant compliquer sa mobilité et son activité. La tumeur primaire, par sa croissance rapide, peut montrer une nécrose centrale par hypoxie, associée à des remaniements cutanés ulcératifs et hémorragiques entraînant une douleur pour l’animal. Ces nuisances au niveau du site local seront réduites par l’exérèse précoce (J12) de la tumeur et seront absentes dans le modèle métastatique par injection de cellules tumorales dans veine cave caudale. Au niveau des différents sites métastatiques, on peut observer des difficultés fonctionnelles de(s) différent(s) appareil(s). Notamment au niveau du poumon, une dyspnée peut être observée, due à la présence mécanique des métastases et/ou à la présence d’un hydrothorax ainsi qu’au niveau de la moelle osseuse avec des fractures spontanées par présence mécanique de la masse dans le fût osseux. De manière plus générale, l’animal peut être touché par des signes plus généraux de mauvais état général comme la perte de poids et d’appétit ainsi qu’une hypothermie persistente. Des observations et examens cliniques seront réalisés très régulièrement afin de mettre en lumière les animaux montrant des signes cliniques atteignant des points limites pour leur administrer un analgésique en cas de signes de douleur (opioïdes) ou procéder à une mise à mort anticipée.

Devenir

Dans le cas d’une allogreffe tumorale (Procédure 1), la tumeur sera analysée par une séance de Bioluminescence puis sera traitée par une séance de chimiothérapie -avec ou sans traitement innovant- avant l’exérèse de sa tumeur. Dans le cas d’une injection intraveineuse de cellules tumorales (Procédure 2), l’animal subira seulement une injection dans la veine caudale des cellules 4T1 sans chimiothérapie néo-adjuvante ni exérèse tumorale. Ensuite, dans tous les cas (Procédures 1 et 2), les animaux recevront 4 séances d’analyse par bioluminescence et 3 séances de chimiothérapie -avec ou sans traitement innovant-. A la suite de la dernière séance d’analyse par bioluminescence, l’animal sera laissé endormi pour une exsanguination précédent la mise à mort.

Remplacement

Le projet s’intéresse à la caractérisation des mécanismes d’échappement tumoral au système immunitaire, notamment dans la niche métastatique. Il est très compliqué de mimer in vitro une implantation métastatique ectopique complexe dans un terrain pulmonaire riche en divers éléments micro-environnementaux comme notamment les acteurs locaux de l’immunité innée et acquise. Une étape in vivo est donc nécessaire afin de se rapprocher au plus près des conditions de clinique humaine, afin d’observer finement les mécanismes d’action des cellules tumorales et immunitaires dans la niche tumorale. Toutefois, avant implantation in vivo dans la souris, la lignée 4T1-Luc2 sera étudiée in vitro dans sa réponse aux traitements et dans les caractéristiques de résistance à ce dernier. Les prélèvements obtenus par l’expérience in vivo seront analysés ex vivo afin d’en tirer des acteurs moléculaires pertinents qui seront validés, in vitro, sur cultures cellulaires ou organoïdes, puis ciblés par des molécules afin de retourner au modèle in vivo murin dans un dernier temps.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombres d’animaux utilisés, le personnel est formé aux outils statistiques appliqués à l'expérimentation animale (planification, randomisation et analyse) par l’utilisation de traitements statistiques des données (ANOVA, Bartlett,…). Les protocoles d’injection et d’exérèse du modèle 4T1, issus de la bibliographie, sont validés et robustes permettant une prise tumorale optimale sur l’ensemble des individus de la cohorte, limitant l’utilisation d’animaux dont les prélèvements se révèlent non analysables. L’ensemble du protocole expérimental sera précisément défini en amont afin de limiter les biais de non homogénéité entre lots de souris. L’expression par la lignée 4T1 de la luciférase facilite une quantification précise de la croissance tumorale et de l’extension métastatique, réduisant donc le nombre d’animaux pour atteindre des résultats statistiquement significatifs. Elle permet aussi un suivi cinétique non invasif des masses et donc sans sacrifice à différents temps de lots d’animaux. Le personnel collaborera avec d’autres équipes, notamment dans le partage des animaux (les animaux disponibles devenus trop âgés pour la greffe ou de sexe masculin) et dans le partage des données notamment par la mise en commun des données et des expertises analytiques.

Raffinement

Le bien-être des animaux de l’étude sera particulièrement porté à l’attention du personnel qui veillera aux meilleures conditions d’hébergement possible, notamment via un maintien des groupes sociaux (3-4 animaux par cage) et l’enrichissement de l'habitat (frisottis de papier ajoutés aux cages). La gestion du stress des animaux sera maximisée, par une contention la plus rapide et la moins fréquente possibles. Différents lieux accueilleront les animaux pour un distanciation maximale entre les lieux d’hébergement, de soins et de sacrifice. Enfin, la douleur des animaux utilisés sera fréquemment monitorée par un examen clinique des animaux tous les 2-3 jours (et tous les jours en fin d’expérimentation) afin de déterminer le plus précocément possible les points critiques chez un animal et d’adapter le protocole d’analgésie (c.f. Annexe 5).

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour ces essais : - modèle 4T1 de cancer du sein décrit précisément dans la bibliographie pour les souris immunocompétentes Balb/c - concordance du modèle 4T1 murin avec les observations cliniques chez les patientes femmes atteints d'un carcinome mammaire et sur son évolution métastatique - Similitudes de la physiologie et de la taille du génome entre la souris et l'homme - l'organisme murin évolue rapidement (courte durée de vie) et permet des analyses compatibles avec les impératifs de progrès thérapeutiques à apporter en clinique humaine -certaines souches sont génétiquement modifiées, permettant la création de modèles tumoraux particuliers (absence du système immunitaire pour mettre en lumière le rôle de ce dernier dans l’échappement au traitement des cellules tumorales). Les animaux utilisés ont un âge qui varie entre 6-8 semaines à leur inclusion dans le protocole. En effet, la prise tumorale est dépendante de l'imprégnation hormonale : plus elle est précoce et prolongée, plus le taux de prise de greffe est important. Dans le cas des modèles 4T1, elle est estimée à proche de 100% dans ses conditions chez les souris immunocompétentes d'après la bibliographie existante. De plus, le temps de latence estimé avant prise tumorale est de 2-3 semaines et les métastases sont détectables à partir de 4-5 semaines : les souris auront atteint l'âge adulte, un âge où elles pourront supporter le développement de la tumeur.