Rongeurs

105 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie cérébrale sous anesthésie pour injecter un virus et implanter une fibre optique, puis un test de reconnaissance d'objet avec enregistrement de l'activité neuronale, avant une perfusion intracardiaque terminale. Le porteur décrit des souris invalidées pour un gène lié à l'autisme et à la déficience intellectuelle, et indique que la chirurgie peut causer œdème et douleur post-opératoire. Il affirme que ces procédures sont "essentielles" et qu'aucun modèle informatique des comportements complexes n'existe encore.

Objectifs

Le but de notre projet est d'étudier la contribution d'un gène muté dans le trouble du spectre autistique. Nous explorerons son rôle dans l'apprentissage et la mémoire. Nous analyserons l'activité des circuits neuronaux du cortex préfrontal par photométrie par fibre lors d'un test de reconnaissance d'objet chez des souris invalidées pour le gène d'intérêt comparées aux souris sauvages. Nous étudierons l'activité de différentes sous-populations neuronales impliquées dans la neurotransmission excitatrice et inhibitrice.

Bénéfices attendus

Ces expériences devraient permettre de déterminer le rôle du gène d'intérêt dans l'activité des circuits corticaux préfrontaux lors de la mémoire de reconnaissance, contribuant ainsi à mieux comprendre son implication dans l'autisme et la déficience intellectuelle. L'étude dans des modèles murins des conséquences neurobiologiques de l'absence des gènes mutés dans l'autisme et autres troubles neurodéveloppementaux est une étape clé dans la compréhension des mécanismes impliqués dans la pathogénèse de ces maladies, afin de permettre à terme de développer des approches thérapeutiques adaptés.

Procédures

Une procédure chirurgicale est effectuée sous anesthésie générale pour injecter dans le cerveau un virus exprimant un marqueur calcique fluorescent et implanter la fibre optique pour la photométrie par fibre. La durée de la chirurgie est de 30-40 min. Aucun phénotype dommageable n’est prévu suite à la procédure. Après une période de récupération de 3 semaines, les souris sont habituées pendant 3 jours (10 min, 2 fois par jour) à un champ ouvert où sera effectué le test de reconnaissance d'objet. Le jour du test, l'activité neuronale est enregistrée par photométrie par fibre pendant 15-20 min en état basal, puis pendant 10 min lorsque l'animal explore 2 objets identiques. L'animal est ensuite replacé dans sa cage et au but de 10 min, il est réintroduit dans le champ et l'activité neuronale est enregistrée pendant 10 min lorsqu'il explore un objet familier et un objet nouveau. Au total, la procédure dure 45-50 min. Après 2 jours de repos, les souris sont enregistrées à nouveau lors d'un deuxième test de reconnaissance d'objet (45-50 min). A la fin des expériences, les animaux subiront une perfusion intracardiaque avec un agent fixateur pendant 3 min, sous anesthésie profonde, afin de prélever le cerveau pour des analyses histologiques. Au total, la procédure de perfusion dure 10-15 min.

Impact sur les animaux

La chirurgie pour injecter le virus dans le cerveau et implanter la fibre optique peut causer un œdème localisé associé à une douleur post-opératoire passagère. Il existe un risque faible d'infection suite à la chirurgie et l'implantation de la fibre optique. La manipulation par l'expérimentateur et l'exposition à un environnement nouveau lors du test comportemental peuvent engendrer un léger stress chez les souris. Les souris mâles logées dans la même cage peuvent parfois se battre et être blessées.

Devenir

Tous les animaux injectés avec le virus et utilisés dans les expériences de photométrie par fibre (n=105) seront perfusés avec un agent fixateur à la fin des expériences, afin de prélever le cerveau pour des analyses histologiques.

Remplacement

Nos travaux nécessitent l’utilisation de rongeurs puisque nous étudions des mécanismes pathologiques complexes associés à l’autisme et la déficience intellectuelle tels que des déficits cognitifs et l'activité des circuits neuronaux intacts. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont donc essentielles pour mieux comprendre les conséquences de l'inactivation du gène d'intérêt dans le cerveau. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux plutôt que des sujets humains. De plus, il n’existe pas encore de modèle computationnel des comportements complexes animaux.

Réduction

Nous utiliserons au maximum 105 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux au strict nécessaire afin d’obtenir des résultats robustes statistiquement dans ce type d'expériences. Pour cela, le nombre d’animaux doit se situer entre 12-15 par condition étudiée. En effet, la variabilité interindividuelle élevée observée lors des tests comportementaux, y compris le test de reconnaissance d'objet, nécessite de groupes de taille relativement élevée. La taille des groupes est déterminée sur la base de la littérature scientifique et notre propre expérience dans ce type d'analyses. Les données seront analysées à l'aide de tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Dans le cadre du raffinement de l’expérimentation animale, les protocoles utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de douleur possible. L’injection stéréotaxique de virus et la pose de fibres optiques sont réalisées sous anesthésie totale et locale pendant la chirurgie et un analgésique est administré en péri-opératoire. Les animaux sont observés quotidiennement par une personne compétente. Toute souris qui montre des signes de mauvaise santé engendrant une souffrance selon des points limites préétablis, est exclue du protocole et euthanasiée. Les souris sont hébergées à raison de 4 animaux par cage dans une animalerie de stabulation (température 19–21°C, cycle jour–nuit 12h–12h), avec accès libre à l’eau et aux croquettes. La stratégie d’enrichissement consiste à ajouter un nid des lanières de papier Kraft. La litière est changée tous les 7 jours pour éviter le stress. Une semaine avant le test de reconnaissance d'objet, les souris sont manipulés quotidiennement par l'expérimentateur pendant 5 min afin de les habituer et réduire le stress. De plus, les souris sont exposées au champ ouvert plusieurs fois avant le test de reconnaissance d'objet, d'abord en groupe et ensuite individuellement, afin de réduire le stress engendré par l'environnement nouveau. 48 h de repos sont réservées entre les procédures comportementales.

Choix des espèces

Le système nerveux de la souris présente des analogies avec celui de l’être humain. De plus, ce rongeur constitue un modèle de choix bien caractérisé pour les études neurobiologiques et comportementales en rapport avec l'autisme et autres troubles neurodéveloppementaux. Enfin, on a accès à des souris transgéniques afin d’étudier le rôle des gènes d’intérêt, ce qui permet d’aborder leur fonction dans le cerveau de manière intégrée, dans l’organisme vivant. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (2-6 mois). L'autisme étant un trouble qui persiste toute la vie, nous avons choisi d'étudier les conséquences de la perte du gène chez l'adulte, une fois que l'ensemble du système nerveux est développé.

96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées pendant 115 jours au dioxyde de titane, additif alimentaire E171, avec gavages et prélèvements de fèces réguliers, pour évaluer ses effets sur l'intestin et le métabolisme. Le porteur affirme attendre un léger surpoids, une perméabilité et une inflammation intestinales, et présente le recours à l'animal comme "difficilement remplaçable" pour reproduire les échanges entre organes sur une longue durée. Il indique que les résultats doivent aider industriels et autorités à décider du maintien de l'autorisation du E171.

Objectifs

Les particules minérales manufacturées sont abondantes dans les produits de la vie quotidienne (cosmétiques, textiles, matériaux de construction), dont l’alimentation. Parmi ces particules, le dioxyde de titane (TiO2) est un additif alimentaire utilisé comme colorant/opacifiant et agent de brillance dans les confiseries, les aliments transformés, les sauces et le glaçage. En Europe, l'utilisation du TiO2 alimentaire (référencé E171) est autorisée sans établissement d'une dose journalière acceptable. L'autorité européenne de sécurité sanitaire des aliments (EFSA) a estimé les niveaux d'exposition journalière au E171 entre 0,9 et 10,4 mg/kg de poids corporel (p.c)/jour chez l’enfant et entre 0,3 et 6,8 mg/kg p.c/j chez l’adulte. Face à ces niveaux élevés de consommation, les conséquences pour l’homme d'une exposition chronique aux particules de TiO2 soulèvent des questions de santé publique. Les craintes vis-à-vis de cet additif composée de particules micro- et nanométriques reposent sur des effets génotoxiques, de stress oxydant et inflammatoires des nanoparticules de TiO2 observés sur cellules intestinales. Cependant, la toxicité orale du TiO2 est encore peu étudiée et les autorités sanitaires ont conclu à la nécessité de tests pour évaluer les risques pour la santé des additifs alimentaires contenant des nanoparticules, particulièrement avec le E171. Dans les pays occidentaux, l'augmentation de la prévalence de l'obésité associée à des désordres métaboliques suggère des facteurs de risque liés au mode de vie. Parmi ces facteurs, l'ingestion chronique de particules inorganiques a été proposée. Le but de ce projet est d'étudier le lien entre l'exposition orale chronique au E171 et l'apparition et/ou l'aggravation de désordres métaboliques et intestinaux.

Bénéfices attendus

Outre l'apport de données inédites sur les effets d'une ingestion de TiO2 alimentaire sur le développement de désordres intestinaux et métaboliques, ce projet aidera les parties prenantes et les industriels dans leur décision de maintenir ou non l'autorisation et l'utilisation du E171 dans les aliments. Ce projet pourrait également permettre d'établir un lien potentiel entre facteurs environnementaux (ici ingestion d'additif alimentaire) et augmentation exponentielle dans les pays occidentaux de désordres métaboliques. En conclusion, ce projet fournira des données précieuses pour l'évaluation des risques chez l'Homme d'une exposition au TiO2 alimentaire.

Procédures

Les animaux seront soumis à un gavage avec du Dextran-FITC à J94 pour évaluer la perméabilité intestinale et à un gavage avec du glucose à J108 pour réaliser le test de tolérance au glucose. Des prélèvements de fèces seront réalisés tout au long de l'expérimentation (1 fois toutes les deux semaines).

Impact sur les animaux

Il est attendu que les animaux exposés au E171 développent un léger surpoids accompagné d'une perméabilité inestinale, d'une inflammation intestinale a bas bruit ainsi que d'une intolérance au glucose. Toutefois ces désordres intestinaux et métaboliques devraient être d'une intensité inférieure a celle observé lors d'un traitement des animaux avec un régime riche en graisse. Nos données préliminaires n'indiquent aucune altération de comportement et de prise alimentaire chez les animaux exposés au E171 incorporé aux croquettes à la dose testé dans cette étude.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de réasliser différents prélèvements de tissus sur l'animal en fin d'expérience.

Remplacement

Le projet étudie les effets du E171 (nanomatérieux alimentaires) après une période d'exposition chronique de 115 jours. De plus, l'étude portera sur les impacts sur l'axe microbiote-intestin-foie. Aucun modèle alternatif ne permet de recréer tous les dialogues inter-organes sur une période aussi longue. Le recours à l'animal est donc nécessaire et difficilement remplaçable par des modèles in vitro ou ex-vivo.

Réduction

Les régulations attendues, principalement concernant les tests de tolérance au glucose peuvent être assez fines. Ainsi, chaque groupe expérimental sera donc constitué de 12 souris pour que les résultats soient statistiquement exploitable, après analyse avec des tests statistiques adaptés. De plus, les procédures de notre projet seront réalisées 2 fois pour pouvoir générer suffisamment d'échantillons pour nos différents end points.

Raffinement

Pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l'angoisse infligées aux animaux, la coupure effectuée au niveau des queues de souris nécessaire pour la mesure de perméabilité intestinale et le test de tolérance au glucose seront réalisé sous analgésie locale. De plus, de l'enrichissement sera disposé dans les cages, sous la forme d'une maisonnette et de dispositif de nidification. Le bien-être des animaux sera assuré par une observation quotidienne et également par un suivi de poids et prise alimentaire hebdomadaire.

Choix des espèces

La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier le microbiote et l’intestin. Les souris utilisées seront âgées de 5 semaines afin de faire des observations sur des souris adultes et matures.

402 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisées dans d'autres protocoles au sein de leur établissement d'origine. Elles reçoivent une implantation de tumeur cérébrale sous anesthésie puis une irradiation de 20 Gy fractionnée en deux séances par jour sur quatre jours, avec prélèvement de sang, pour comparer protonthérapie et rayons X sur la réponse immunitaire. Le porteur indique que les séances répétées peuvent baisser la fréquence respiratoire et entraîner une perte de poids, et que la chirurgie tumorale peut être douloureuse. Il affirme que l'étude du système immunitaire lié à une tumeur cérébrale ne se fait pas in vitro et qu'aucune espèce moins évoluée que la souris ne convient.

Objectifs

« La radiothérapie (RT) fait partie des traitements les plus utilisés chez les patients atteints de cancer. A l’heure actuelle, en France, 60% des patients diagnostiqués pour un cancer sont traités par RT. Pour les tumeurs du cerveau, la RT fait partie du traitement standardisé. Nous avons précédemment montré que l’irradiation aux rayons-X pouvait modifier le système immunitaire dans le cas des tumeurs du cerveau, notamment en augmentant la proportion de cellules associées à une progression tumorale et en diminuant la quantité de cellules anti-tumorales dans le sang. Contrairement à la RT conventionnelle qui utilise des rayons-X, la protonthérapie utilise des particules chargées plus lourdes et de haute énergie. Parce qu’elle peut déposer de façon précise des doses d’irradiation dans le tissu, la protonthérapie peut être utilisée pour : i) limiter les risques de toxicité en réduisant l’exposition du tissu sain, et ii) augmenter la dose déposée à la cible pour accroître le contrôle tumoral. Le premier objectif de cette étude est d’appréhender si la protonthérapie pourrait présenter des avantages par rapport aux rayons-X au niveau du système immunitaire anti-tumorale dans le cas d’une irradiation cérébrale. Le second objectif est de déterminer si la combinaison de la protonthérapie et de stratégies thérapeutiques ciblant le système immunitaire serait bénéfique pour le traitement des tumeurs du cerveau. »

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront d’améliorer les connaissances scientifiques sur les effets de la protonthérapie sur l’inflammation. De plus, cela permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques combinant la protonthérapie et l’immunothérapie (dont les tumeurs cérébrales sont très résistantes). Le projet scientifique global présente également une partie clinique dont le comité de proection des personnes a été accepté en décembre 2021. Les résultats du projet ci présent pourront ainsi être comparés aux données cliniques. Ainsi, l’ensemble de ces résultats pourra rapidement être adapté à la clinique dans le but d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de tumeurs cérébrales. Plus généralement, ce projet permettra d’appréhender en détail les relations entre la protonthérapie et les immunothérapies.

Procédures

Les animaux subiront plusieurs types d’interventions (irradiations, prélèvements sanguins, …). Les interventions spécifiques, leurs fréquences et leurs durées pour chaque animal sont détaillées en Annexe I. -Initiation du développement de la tumeur : L’implantation des tumeurs est réalisée sous anesthésies L’implantation dure quelques minutes et n’est réalisée qu’une seule fois. -L’irradiation du cerveau : alors qu’ils sont anesthésiés. L’irradiation est réalisée sous anesthésie générale. Lors de l’irradiation, une dose totale de 20Gy sera délivrée de manière fractionnée comme en clinique : 2.5Gy/séance avec deux séances par jour (espacées de 6h) sur 4 jours consécutifs. - Le prélèvement sanguin sera réalisée sur souris éveillée Ce prélèvement dure une minute et n’est réalisé qu’une seule fois/souris.

Impact sur les animaux

L’irradiation par elle-même n’induit pas de douleurs mais peut induire une diminution de la fréquence respiratoire en dessous de 30 respirations/min. Les répétitions bijournalières et ce sur 4 jours consécutifs peuvent également induire une perte de poids des animaux jusqu’à 10 jours après irradiation. Le prélèvement sanguin ne provoque pas de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal. La procédure chirurgicale pour l’établissement du modèle de tumeur cérébrale peut induire des douleurs. Le transport des animaux peut induire un stress surtout que cette étude.

Devenir

Tous les animaux de l'étude qui seront transportés dans notre EU pour les protocoles d'irradiation retournenront dans leur EU d'origine pour la poursuite des protocoles

Remplacement

L’évolution du système immunitaire et ce en lien avec la circulation sanguine cérébrale après un traitement ainsi que la formation et l’évolution de l’inflammation tumorale ne peuvent pas être évaluées in vitro. Les expériences in vivo sont absolument nécessaires pour étudier l’impact d’un traitement et tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Pour tester de nouvelles stratégies thérapeutiques qui pourraient être transposées à la clinique, on ne peut pas utiliser d’espèces moins évoluées que la souris. La souris présente un système immunitaire similaire à l’homme et nous disposons d’un modèle in vivo de tumeur cérébrale bien maitrisé dans le laboratoire qui récapitule plusieurs caractéristiques retrouvées chez les patients.

Réduction

Afin d’assurer une puissance statistique suffisante pour les analyses, le nombre d’animaux nécessaires / groupe prend en compte la variabilité entre les individus basée sur des expériences antérieures et des expériences préliminaires. Ce nombre d’animaux a été déterminé mathématiquement grâce à des logiciels statistiques adaptés afin de réduire au maximum tout en assurant une puissance statistique satisfaisante. Afin de réduire le nombre d’animaux au maximum, à chaque fin de protocole, les tissus (cerveaux, rates et ganglions lymphatiques) seront prélevés pour des études post-mortem.L’imagerie nous permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux en évitant des euthanasies à tous temps. »

Raffinement

Les animaux subiront une période d’habituation, d’acclimatation avant la radiothérapie. Les animaux subissent une anesthésie pendant l’irradiation. Les animaux sont surveillés tous les jours pendant toute la durée du protocole, weekend compris. Le poids des souris est suivi tous les 2-3 jours avant, pendant et deux semaines après l’irradiation. Pendant l’irradiation et la semaine suivante, les animaux disposent de croquettes humidifiées dans le fond de la cage ainsi que du complément alimentaire (DietGel Recovery) afin de limiter la perte de poid. Pour le modèle de tumeur, les animaux sont anesthésiés pendant la chirurgie. Après la chirurgie, les animaux sont surveillés tous les jours pendant le protocol, weekend compris. Les souris sont hébergées dans des cages avec 5 souris/cage dans un environnement enrichi (roues/cartons/bâtons à ronger). Le transport des animaux sera pris en charge par un transporteur agréé.

Choix des espèces

Les modèles tumoraux chez l’animal sont indispensables pour récapituler au mieux l’environnement des tumeurs qui se développent chez les patients. Nous utiliserons une souche de souris qui présente toutes les populations de cellules immunitaires et parce que le modèle de tumeur cérébral utilisé repose sur l’injection de cellules tumorales issues de cette souche. De plus, pour cette espèce et pour les cellules étudiées, tous les outils de caractérisation sont déjà validés. Les animaux seront agés de 7 semaines. Ce stade correspond à de jeunes adultes et est parfaitement adapté en termes de physiologie aux pathologies ciblées.

30 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales humaines puis des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant quatre semaines, pour tester des inhibiteurs d'EZH2 contre le carcinome à cellules de Merkel. Le porteur indique qu'aucune analgésie ne sera administrée afin de ne pas interférer avec les traitements, et qu'une perte de poids, une tumeur de plus d'un centimètre cube ou une ulcération déclenchent la mise à mort par élongation cervicale. Il affirme que le recours au modèle murin est "obligatoire" pour développer ces tumeurs.

Objectifs

Le carcinome a cellules de Merkel (CCM) est un cancer cutané rare et agressif survenant principalement chez le sujet âge de plus de 65 ans et le patient immunodéprimé (hémopathies, greffe d’organe, infection par le VIH). Son incidence, estimée à 1/100 000 par an, est en constante augmentation. La survie a 5 ans est estimée à 40%. Dans 80% des cas, le génome du Polyomavirus à cellules de Merkel (MCPyV) est intégré dans celui des cellules tumorales induisant alors l’expression de deux oncoprotéines virales (antigène grand T ; LT et antigène petit t ; st). Dans ce contexte, une étude récente menée au sein du laboratoire a permis de mettre en évidence l’induction de l’expression d’EZH2 (Enhancer of zest homolog 2), une histone méthyltransférase, par les oncoprotéines virales. Cette enzyme est impliquée dans l’agressivité et la prolifération tumorale d’autres cancers. De plus, une forte expression d’EZH2 a pu être confirmée au sein d’une cohorte de 96 patients présentant un CCM avec un niveau d’expression plus important dans les tumeurs MCPyV positives. L’effet des inhibiteurs d’EZH2 à déjà été démontré sur d’autre tumeurs solides. Dans ce contexte la cytotoxicité de deux de ces drogues a pu être démontrée au sein de notre laboratoire, in vitro sur des lignées cellulaires humaines de CCM. L’objectif de cette étude est d’évaluer in vivo, l'effet inhibiteur sur la croissance tumorale du GSK343 et du DZNeP dans un modèle murin de xénogreffe, maîtrisé dans le laboratoire, utilisant la lignée WaGa.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de valider dans un modèle pré-clinique l'utilisation d'inhibiteur d'EZH2 dans l'indication du carcinome à cellules de Merkel. Ces molécules pourraient potentiellement être utilisées chez l'Homme en complément de l'immunothérapie ciblant PDL1.

Procédures

Les souris recevront par voie sous-cutanée des cellules WaGa afin d'établir le modèle tumoral. Suite à leur inclusion, elles recevront quotidiennement par voie intrapéritonéale les deux molécules évaluées ou le véhicule pendant 4 semaines.

Impact sur les animaux

Chez l’Homme, le carcinome à cellules de Merkel est décrit comme non douloureux, néanmoins, toute dégradation de l’état de santé des animaux limites (aspect « piqué » du pelage, perte de poids de 20% et prostration des animaux, volume tumorale supérieur à 1cm3 ou apparition d’ulcération), conduira à leur mise à mort par élongation cervicale.

Devenir

L'évaluation de la masse finale des tumeurs impose la mise à mort de l'ensemble des souris.

Remplacement

Afin d’étudier l’impact du traitement sur la croissance tumorale, le test sur modèle murin est obligatoire

Réduction

Une seule dose de chaque traitement sera testée sur la base des résultats de cytotoxicité in vitro préalablement obtenus au laboratoire ainsi que des données de la littérature réduisant ainsi le nombre de souris utilisées. De plus, un test de Wilcoxon a permis de déterminer le nombre d'animaux nécéssaires.

Raffinement

Les souris seront hébergées avec un enrichissement social (5 souris de même sexe / cage) dans des cages enrichies avec des maisonnettes en plexiglas et du papier absorbant. Du fait du statut immunodéficient des souris, l’ensemble du matériel d’enrichissement, ainsi que l’aliment et l’eau de boisson seront stérilisés. Après les injections intra-péritonéales, les souris recevront sous forme de récompense des friandises (cacahuètes en coque, catalogue PLEXX). Aucun traitement d'analgésique ne sera administré afin d'éviter toute interférence avec les traitements testés.

Choix des espèces

Le seul modèle disponible de CCM étant des lignées humaines, l’utilisation d’un modèle murin immunodéficient est obligatoire afin de permettre le développement de tumeurs chez la souris. Les NOD/SCID sont un modèle de référence pour les xénogreffes de cellules humaines . 7 semaines incluant la semaine d’acclimatation d'une semaine. Stade physiologique : croissance

20 rats Wistar mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection dans la veine pénienne sous anesthésie puis deux prélèvements de sang, avant d'être mis à mort pour mesurer la toxicité d'un biomédicament destiné au carcinome à cellules de Merkel. Le porteur indique surveiller le pelage "piqué", une perte de poids de 20 % et une hausse des transaminases comme seuils déclenchant la mise à mort. Il présente l'étude comme une obligation réglementaire préalable à un essai clinique de phase I.

Objectifs

Le carcinome a cellules de Merkel (CCM) est un cancer cutané rare et agressif survenant principalement chez le sujet age de plus de 65 ans et le patient immunodéprimé (hemopathie, greffe d’organe, infection par le VIH). Son incidence, estimée a 1/100000 par an, est en constante augmentation. La survie a 5 ans est estimée a 40%. Au stade métastatique inopérable les cliniciens ont peu d’options thérapeutiques induisant une réponse tumorale durable. L’pression du CD56, glycoprotéine de surface impliquée dans l'adhésion cellulaire, a été observée dans 66% des cas de CCM confirmant le choix de cette cible thérapeutique. Un immunoconjugué (anticorps anti- CD56 couplé à la drogue MMAE) a été développé, l’Adcitmer, pour cibler spécifiquement le CD56 et induire la mort des cellules tumorales. L'évaluation in vitro de cette molécule a confirmé son effet cytotoxique sur les lignées de CCM. Pour finir, l'impact sur la croissance tumorale a été montré dans un modèle murin de xénogreffe utilisant une lignée humaine de CCM . L’objectif de cette étude est d’évaluer in vivo, la toxicité de l’Adcitmer chez le rat.

Bénéfices attendus

Le bénéfice premier attendu est d'obtenir la dose maximale tolérée afin de pouvoir proposer une fenêtre thérapeutique optimale pour un essai préclinique réglementaire puis un essai clinique de phase I.

Procédures

Les animaux seront injectés une seule fois dans la veine penienne puis deux prélèvements sanguins seront effectués à 4 et 21 jours post-injection de l'Adcitmer. L’injection dans la veine pénienne durera 5 min par animaux, le prélèvement sanguin durera 3 min également.

Impact sur les animaux

Après 21 jours ou en cas d’atteinte de points limites (aspect « piqué » du pelage, perte de poids de 20%, prostration des animaux ou augmentation des transaminases de 1,5 fois par rapport à la limite supérieur de la norme (normes pour le rat Wistar mâle : ASAT 93 +/- 20 UI/L et ALAT : 32 +/- 5 UI/L), les animaux seront sacrifiés afin d’observer l’impact de l’Adcitmer sur les rats traités versus les rats témoins. Le cœur, la rate, le foie et les poumons seront prélevés pour vérifier que le traitement n’a pas altéré la morphologie des organes. L’analyse histologique sera assurée par les pathologistes de l’équipe. Les critères de jugement de l’étude sont : - Une réduction significative du poids des animaux (une puissance de test supérieure à 80% avec un seuil de risque alpha de 0.05, un test U de Mann Whitney) - Un changement du comportement des animaux Ce protocole suit la règle des 3R : Réduction : Trois doses de traitement seront évaluées sur la base des résultats de réduction de la croissance tumorale préalablement obtenu chez la souris au laboratoire avec trois injections à 10mg/kg in vivo ainsi que des données de la littérature réduisant ainsi le nombre de rats utilisés. Raffinement : Les rats seront hébergés dans des cages enrichies avec des abris et du matériel de nidification et une plateforme. L’interaction avec les soigneurs aura lieu tous les jours pour les adapter aux contacts deux semaines avant le début de l’étude afin de réduire le stress lié aux manipulations. Afin de réduire le stress, les rats seront hébergés par paires. Remplacement : La molécule a été évaluée sur des cellules saines n’exprimant pas le CD56 in vitro et n’a pas montré de toxicité in vivo dans un model murin de xénogreffe de CCM. Cependant, une étude de toxicité in vivo est obligatoire afin d’étudier l’impact du traitement sur les organes et le comportement des animaux.

Devenir

La mise à mort de tous les animaux permettra d'évaluer la dose maximale tolérée afin de pouvoir proposer une fenêtre thérapeutique optimale pour un essai préclinique réglementaire puis un essai clinique de phase I.

Remplacement

La molécule a été évaluée sur des cellules saines n’exprimant pas le CD56 in vitro et n’a pas montré de toxicité in vivo dans un model murin de xénogreffe de CCM. Cependant, une étude de toxicité in vivo est obligatoire afin d’étudier l’impact du traitement sur les organes et le comportement des animaux.

Réduction

Trois doses de traitement seront évaluées sur la base des résultats de réduction de la croissance tumorale préalablement obtenu chez la souris au laboratoire avec trois injections à 10mg/kg in vivo ainsi que des données de la littérature réduisant ainsi le nombre de rats utilisés.

Raffinement

Les rats seront hébergés dans des cages enrichies avec des abris et du matériel de nidification et une plateforme. L’interaction avec les soigneurs aura lieu tous les jours pour les adapter aux contacts deux semaines avant le début de l’étude afin de réduire le stress lié aux manipulations. Afin de réduire le stress, les rats seront hébergés par paires.

Choix des espèces

Le modèle Wistar est un modèle de référence dans les études de toxicité des immunoconjugués. Les males ont été choisi pour injecter en intraveineuse dans la veine pénienne la molécule après une anesthésie. Ceci permet une meilleure réussite et reproductibilité des injections par rapport à la veine caudale. De plus, l’utilisation de sujets d’un même sexe permet de réduire la variabilité interindividuelle et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour observer un effet significatif. 8 semaines (incluant la semaine d’acclimatation). Stade physiologique : croissance.

300 souris vont être utilisées, tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intraveineuses déclenchant une colite chronique puis des injections de traitement, la maladie pouvant provoquer douleurs abdominales, isolement et perte de poids. Le porteur indique qu'un score clinique atteignant 8 sur deux jours consécutifs déclenche l'euthanasie, et que des souris sont tuées à différents temps pour analyser la réponse immunitaire. Il affirme qu'aucune méthode ne remplace un système immunitaire complet, ce qui rend selon lui l'animal "indispensable".

Objectifs

De nombreux mécanismes sont impliqués dans l’arrêt du processus inflammatoire engendré par le système immunitaire lors de la reconnaissance d’antigènes qu’ils soient étrangers (pathogènes extérieurs) ou propres à l’organisme (le soi). Les cellules myéloïdes qui sont une population du système immunitaire jouent un rôle très important dans ces mécanismes. Elles permettent pour certaines d’éteindre ce processus inflammatoire en phagocytant les cellules effectrices devenues alors inutiles sans créer d’inflammation elles-mêmes. Lors d’une inflammation chronique, il y a un déséquilibre entre l’activité des cellules effectrices et l’élimination de ces cellules par les cellules myéloïdes. Nous souhaitons examiner le potentiel de molécules sous la forme d’anticorps monoclonaux anti-protéine A ou anti-protéine B ciblant spécifiquement ces cellules myéloïdes à inhiber la réponse inflammatoire, qui diminuent notamment la sécrétion d’IL-12 et augmente la sécrétion d’IL-10 par les macrophages in vitro, et ce dans plusieurs maladies inflammatoires qui ne mettent pas en jeu les mêmes cellules effectrices.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre dévaluer le potentiel thérapeutique d'une toute nouvelle molécule ciblant un processus immunitaire découvert récemment. Il sera comparé à des traitements standards dans le but d'évaluer le bénéfice d'une telle stratégie et de bien caractériser les mécanismes mis en jeu dans les phénomènes biologiques liés à l'activité de la molécule.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections intraveineuses (pour induire la pathologie) dans tous les cas, à des injections intrapéritonéales pour les traitements. Il y aura éventuellement des prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés. La durée de l'acte en tant que tel ne durera pas plus de 5min et s'étalera sur 3 semaines comme indiqué dans le schéma protocolaire.

Impact sur les animaux

La colite chronique entraîne parfois des douleurs abdominales et un isolement des animaux concernés ainsi qu'une perte de poids. Un score clinique + un score pathologique lié à la colite seront réalisés pour maîtriser au mieux ces paramètres.

Devenir

Les animaux recevant des injections intrapéritonéales ou intraveineuses seront alors remis dans leur cage. A l'issu de certains axes, les animaux seront euthanasiés poru évaluer biologiquement la réponse immunitaire.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et donc rend indispensable l’utilisation d’animaux. Des études préliminaires sur des cellules ex vivo ont permis d’identifier une activité biologique du médicament et donc ont orienté les paramètres à évaluer lors de l’étude in vivo de la molécule.

Réduction

L’ensemble des animaux prévus ne sera pas utilisé selon les résultats observés sur un traitement curatif ou prophylactique. Seulement dans le cas de l’observation d’un effet, nous réaliserons ensuite des études pour déterminer les mécanismes mis en œuvre, notamment en euthanasiant des souris avant d’atteindre le point limite à différents temps après l’initiation de la pathologie. Enoutre, dans le but d'utiliser un nombre d'animaux cohérent avec une pertinence statistique, nous avons défini le nombre d'animaux par groupe de 10 animaux pour l’ensemble des groupes ainsi que l’ensemble des axes, ce qui permet d'interpréter de manière objective les résultats tout en utilisant un nombre réduit d'animaux.

Raffinement

Nous chercherons à obtenir dans un premier temps des différences significatives et reproductibles sur l’inflammation observée entre les groupes de souris. La douleur sera dans la mesure du possible évitée en euthanasiant les animaux si leur score clinique global atteint 8 sur deux jours consécutifs tel que décrit dans le tableau de score clinique général ou par injection d’analgésique dans le cas de morsure par exemple. Seulement dans le cas de l’observation d’un effet, nous réaliserons ensuite des études pour déterminer les mécanismes mis en œuvre, notamment en euthanasiant des souris avant d’atteindre le point limite à différents temps après l’initiation de la pathologie.

Choix des espèces

Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Les modèles d’inflammation dans ces souris autorisent une relevance pathologique satisfaisante en comparaison avec la réalité clinique. Adulte-8-10 semaines, car l’inflammation générée par le transfert de cellules pathogéniques est le plus homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse inflammatoire.

4 467 souris transgéniques vont être élevées comme modèle de sclérose latérale amyotrophique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles ne subissent aucune intervention dans l'élevage lui-même mais sont produites pour alimenter d'autres projets, transférées vers l'établissement expérimentateur ou euthanasiées à 100 jours si elles ne le sont pas. Le porteur affirme que la culture cellulaire ne permet pas d'appréhender la complexité du système moteur et que ce modèle est le plus utilisé pour cette maladie. Les animaux gardés jusqu'à 100 jours restent asymptomatiques, une surveillance quotidienne devant repérer d'éventuels tremblements ou faiblesses musculaires.

Objectifs

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une pathologie humaine létale et rare, dans laquelle on observe une dégénérescence et donc une disparition progressive des neurones du cortex moteur , du bulbe et de la corne antérieure de la moelle épinière. Ceci induit des paralysies pouvant toucher les muscles des membres ou de la sphère ORL (et conduire à un handicap sévère) et/ou une atteinte respiratoire (par paralysie du muscle diaphragmatique) qui est le plus souvent responsable de complication mortelle. Si la majorité des malades n'a aucune anomalie génétique, environ 5% des patients sont atteints d'une forme familiale notamment liée à des mutations sur le gène d'une protéine appelée la Super Oxyde Dismutase1 (SOD1). Dans l'objectif d'étudier les mécanismes de la maladie et de développer de nouveaux traitements, un modèle murin de cette maladie à été développé . Ces animaux contiennent une mutation dans le gène SOD1 et développe une pathologie dégénérative motrice pure qui possède beaucoup d'analogie avec la pathologie humaine. Cette lignée transgénique animale est, à ce jour, le modèle animal le plus utilisé pour la recherche sur la SLA. Notre objectif est de constituer un élevage de ces animaux qui seront utilisés pour différents projets de recherche. Un total de 4467 animaux est prévu pour l'ensemble des projets issus de cet élevage. Pour toutes ces recherches la règle des 3R sera strictement respectée. Ainsi le nombre d'animaux produit par cet élevage correspond très exactement à tous les projets de recherche qui ont été déclarés par les établissement expérimentateurs. Par ailleurs, les souris produites par l’élevage seront transmises à l’établissement expérimentateur avant l’apparition des symptômes de la maladie. Aucune douleur, souffrance ou angoisse n’est donc infligée aux animaux.

Bénéfices attendus

L'utilisation de modèles murins SOD1 G93A est nécessaire pour la recherche des mécanismes physiopathologiques de la SLA, ainsi que pour l'étude de molécules et de stratégies thérapeutiques nouvelles.

Procédures

Les animaux ne sont soumis a aucune intervention au seins de l’etablissement d’élévage. Ils seront transférés à l’etablissement expérimentateur à des âges dépendant des procédures expérimentales.

Impact sur les animaux

Tous les animaux sont euthanasiés à l'age de 100 jours s'ils ne sont pas transmis à l'établissement expérimentateur. Avant cet age, ils sont asympotmatique, toutefois les animaux sont surveillés quotidiennement dans le cas ou un symtpome précoce venait a apparaitre (tremblements ou faiblesses musculaires). Si un seul de ces symptomes se manifestait, le responsable du projet sera immediatement contacté pour décider s'il convient de transférer l'animal à l'etablissement expérimentateur ou s'il convient de l'euthanasier par inhalation de C02.

Devenir

Les animaux sont soit transférés vers l’établissement expérimentateur soit sacrifiés.

Remplacement

Aucune autre méthode comme la culture de lignées cellulaires ne permettent d'appréhender la complexité du système moteur et d'évaluer la pertinence thérapeutique de nouvelles molécules et son intérêt dans la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA).

Réduction

Le nombre d’animaux produit par cet élevage correspond au nombre d’animaux nécessaire pour entretenir l’élevage et pour réaliser les projets ayant fait l’objet d’une validation par le comité d’éthique. Le nombre d’animaux produit par l’élevage sera revue à la baisse en fonction de l’évolution de ces projets .

Raffinement

Les animaux seront placés dans des cages enrichies (carré de cellulose lab'nest ). Ils seront stabulés dans une animalerie thermorégulée avec hygrométrie contrôlée et cycle lumière inversé. L'accès à la nourriture et à l'eau sera ad libitum et un changement de litière sera effectué chaque semaine.

Choix des espèces

La souris SOD1 G93A est un modèle de choix afin de réaliser des études précliniques car c’est le modèle le plus couramment utilisé pour étudier la SLA et par conséquent c’est le modèle le plus caractérisé. Pour la reproduction les animaux seront utilisés entre 7 et 12,5 semaines pour les mâles et 7 et 24 semaines pour les femelles afin d'assurer une reproduction efficace.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale de cellules cancéreuses puis un gel associé à une chimiothérapie, avec un suivi tumoral par bioluminescence sous anesthésie jusqu'à douze séances, avant une ponction cardiaque terminale. Le porteur affirme observer rarement l'atteinte d'un point limite et décrit une maladie bien supportée, tout en surveillant la perte de poids qui déclenche une mise à mort sous 24 heures. Sur le remplacement, il indique que les essais in vitro ne reproduisent pas la complexité d'un "organisme vivant" et conclut à l'impossibilité de se passer de la souris.

Objectifs

La carcinose péritonéale est une situation médicale où le péritoine, qui est l’enveloppe qui entoure les organes de l’abdomen, se trouve recouvert de nodules de tumeur cancéreuse. Cette situation est un processus métastatique qui va conduire au décès du patient. La carcinose péritonéale est associée à un mauvais pronostic avec une survie médiane sans traitement de 5 mois. Le traitement à visée curative de la carcinose péritonéale repose sur la chirurgie de réduction tumorale qui a pour but de retirer toute la maladie macroscopique suivie de la chimiothérapie hyperthermique intrapéritonéale CHIP (c’est-à-dire le traitement d’une chimiothérapie chauffée à 43°C directement dans l’abdomen qui a pour but d’agir sur les nodules microscopiques). Ce traitement est très efficace, le taux de survie à 5 ans est alors de 45- 51%, avec une médiane de survie de 41 mois. Cependant, ce protocole comporte un risque important de mortalité et de morbidité. C’est pour cela que notre unité a choisi de s’intéresser à une alternative à ce traitement. Nous nous sommes intéressés à un gel associé à une chimiothérapie de contact pouvant être appliqué en postopératoire, qui aurait la capacité d’inhiber l’adhésion des cellules cancéreuses disséminées suite à de la résection de la tumeur primitive ou suite à n’importe quelle chirurgie abdominale. L’objectif de cette recherche est d’évaluer l’apport thérapeutique, soit pour une carcinose déjà présente, soit pour éviter (prophylaxie) qu’une carcinose ne se développe, de ce gel thermosensible qui va se gélifier à température de l’animal (il est liquide a température ambiante) et laisser diffuser sur quelques jours la chimiothérapie qui a été incluse avec celui-ci.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus seraient de trouver une alternative au traitement classique de la carcinose péritonéale et également l'utilisation de ce gel en prévention, donc avant l'apparition de la carcinose péritonéale.

Procédures

Les souris vigiles seront soumis à une injection de cellules cancéreuses en intrapéritonéale (1 fois 30 secondes) qui sera associée deux heure après à une injection en intrapéritonéale également de gel associé à une chimiothérapie (1 fois 30 secondes). Puis sous anesthésie, ils auront un suivi non invasif par bioluminescence pour suivre l'évolution tumorale (3 fois 20 minutes pour les bal/c; 12 fois 20 minutes pour les C57BL/6). A la fin de l'expérience elles auront une injection sous-cutanée de buprénorphine (1 fois 30 secondes) puis 30 minutes après elles seront sous anesthésie générale (isoflurane à 30%) pour réaliser un prélèvement intracardiaque de sang qui permettra une analyse post-mortem.

Impact sur les animaux

Les souris vont développer une carcinose péritonéale après une injection intrapéritonéale de cellules cancéreuses murines ovarienne ou colique. Nous avons une bonne expérience de nos modèles. Il est très rare d’observer une souris qui atteint un point limite. Les souris supportent très bien la maladie et la fin de l’expérience arrive avant que la maladie ne se développe de trop. De plus, le suivi par bioluminescence nous permet d’arrêter l’expérience avant que la progression tumorale soit trop importante. Les points limites observés sont souvent corrélés ensemble avec une perte de poids de l’animal. Si cela devait se produire, l’animal serait mis à mort dans les 24h. Aussi, nous devons confirmer si ce gel pourrait induire une toxicité. Aussi, les doses de chimiothérapie ne seront pas toxiques non plus; la chimiothérapie étant au contact du gel.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à J14 ou à 12 semaines post-injection des cellules CT26-luc ou ID8-luc respectivement par ponction cardiaque puis dislocation cervicale sous anesthésie générale. Ce sera un prélèvement total de sang pour des analyses post mortem; mais aussi de tissus sains pour être analysés par le service d’anatomopathologie.

Remplacement

Nous ne pouvons remplacer le modèle murin car pour tester un éventuel traitement (gel) les expérimentations in vitro ne permettent pas de représenter la complexité d’un organisme vivant.

Réduction

En dessous de 7 animaux par groupe, du fait des variations de nos modèles, en nombre de nodules ou vitesse de propagation de la maladie il y a trop peu de données pour avoir un résultat solide. Compte tenu de notre expérience sur le modèle et de la variabilité observée, un nombre minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire. En cas de groupe contrôle régulier nous nous autorisons à diminuer le nombre à 5 en acceptant pour faire les analyses scientifiques de pooler deux groupes contrôles. Ce sont des règles de bonne pratique pour toutes expériences en oncologie sur l’animal, utilisant des xenogreffes. Aussi, nous allons utiliser un seul groupe de souris contrôle pour 3 groupes de traitement. Cela permettra de diminuer le nombre d'animaux.

Raffinement

Le projet n’inclut pas d'interventions douloureuses et les animaux seront observés quotidiennement. Lors du suivi de la croissance tumorale par bioluminescence, les animaux seront sous anesthésie générale gazeuse (isoflurane à 1%) et avant l'intervention finale (ponction cardiaque) les animaux recevront une injection d'analgésie (Buprénorphine - 0,1mg/kg) et seront ensuite sous anesthésie générale (isoflurane à 3%). Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids, le comportement (yeux fermés, dos voûté, isolement), l’apparence physique (automutilation, plaies) et la gêne pour se déplacer qui seront notifiés dans un cahier de suivi des animaux 2 fois par semaine. De plus, le suivi par bioluminescence nous permet d’arrêter l’expérience avant que la progression tumorale soit trop importante. Les souris seront hébergées en portoir ventilé avec alimentation standard classique Harlan 20.16) et eau stérile ad libitum. Cycle nycthéméral 12h jour/12h nuit Température : 22°C Aussi, les souris disposeront d’enrichissement tels que maison rouge, nids en papier kraft ou buchette de bois à ronger pour leur permettre d’exprimer tout le comportement social normal d’une souris et ainsi améliorer leurs conditions d’hébergements. En cas d’atteinte des points limites, ils seront alors exclus de l'expérience dans les 24heures.

Choix des espèces

Il s’agit de souris femelles immunocompétentes (BALB/c ou C57BL6). Ces types de souris sont utilisés largement dans la recherche en cancérologie pour sa capacité d’incrémenter l’incidence tumorale après injection des cellules cancéreuses. Les souris seront utilisées à l’âge de 7-8 semaines pour ne pas interagir avec les processus de vieillissement et pour qu’elles ne soient pas trop jeunes pour supporter la chimiothérapie.

620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par perfusion transcardiaque, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit des injections virales par stéréotaxie et l'implantation d'une fibre optique ou d'une électrode, puis est mis à jeun pour être motivé lors de tâches cognitives sous imagerie cérébrale. Le porteur invoque la déclaration de Bâle et affirme qu'aucune lignée cellulaire ne reproduit le cerveau intact. Les bénéfices annoncés pour la schizophrénie ou l'autisme relèvent de perspectives de recherche fondamentale.

Objectifs

Des preuves expérimentales de plus en plus nombreuses indiquent que le dysfonctionnement du cortex préfrontal est à l'origine de déficiences cognitives et d'autres symptômes de la schizophrénie, de l'autisme, de la dépression, de la douleur chronique et d'autres troubles. Cependant, nous ne comprenons pas comment les circuits du cortex préfrontal fonctionnent normalement ni comment ils se dérèglent dans ces troubles. Nos objectifs sont 1) de caractériser les schémas anormaux d'activité des circuits qui peuvent se produire dans le cortex préfrontal et contribuer aux symptômes de ces troubles, et 2) d'identifier les mécanismes tels que la neuromodulation, la connectivité synaptique, les oscillations cérébrales, etc. qui contribuent aux schémas d'activité normaux et pathologiques. Nous espérons que ces études nous permettront d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces troubles. Ce projet se subdivise en 2 objectifs : 1. Analyser la dynamique neuronale et 2. l’importance fonctionnelle d’interneurones spécifiques pendant des comportements dépendant du cortex préfrontal in vivo.

Bénéfices attendus

Les maladies du cerveau ont des répercussions majeures sur la santé des individus, leur autonomie, leur éducation, leur emploi, leur mobilité et leurs relations personnelles, ce qui représente un lourd fardeau social et économique. Il est d'une importance fondamentale de comprendre les propriétés de base qui régissent la force, la gamme dynamique, l'étendue spatiale, la localisation anatomique et les composants moléculaires des connexions synaptiques entre des types de neurones spécifiques formant un réseau neuronal dans des états normaux et pathologiques. Plus précisément, on pense que le dysfonctionnement du cortex préfrontal est à l'origine de déficiences cognitives et d'autres symptômes de la schizophrénie, de l'autisme, de la dépression, de la douleur chronique et d'autres troubles. Cependant, nous ne comprenons pas comment les circuits du cortex préfrontal fonctionnent normalement ni comment ils se dérèglent dans ces troubles. Nos objectifs sont 1) de caractériser les schémas normaux et anormaux d'activité des circuits qui peuvent se produire dans le cortex préfrontal et contribuer aux symptômes de ces troubles, et 2) d'identifier les mécanismes tels que la neuromodulation, la connectivité synaptique, les oscillations cérébrales, etc. qui contribuent aux schémas d'activité normaux et pathologiques. Nous espérons que ces études nous permettront d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces troubles. Grâce à l'utilisation de souris génétiquement modifiées, nous serons en mesure de cibler des types de cellules et des réseaux spécifiques afin de fournir un cadre physiopathologique permettant de comprendre les maladies du cerveau.

Procédures

Procedure 1 : Imagerie calcique in vivo avec ou sans enregistrement électrophysiologique d'animaux éveillés se déplaçant librement pendant des tâches cognitives. Cette procédure utilisera 300 souris transgéniques, toutes les souris subiront insertion de gènes dans des souris adultes en utilisant des vecteurs viraux injectés par stéréotaxie (pour 30-40 minutes par animal), implantation de fibre optique pour imagerie et/ou d'un electrode (pour 30 minutes d’intervention), imagerie calcique in vivo et enregistrement de l’activité électrophysiologie sur des animaux libres de leurs mouvements s’il y a une electrode pendant la tâche de flexibilité cognitive (pour 1 à 3 heures d’intervention), et perfusion transcardiaque pour fixation de tissus. Procedure 2 : Stimulation in vivo avec ou sans enregistrement électrophysiologique d'animaux éveillés et libres de leurs mouvements pendant des tâches cognitives. Cette procédure utilisera 320 souris transgéniques, toutes les souris subiront insertion de gènes dans des souris adultes en utilisant des vecteurs viraux injectés par stéréotaxie (pour 30-40 minutes par animal), implantation de fibre optique pour imagerie et/ou d'un electrode (pour 30 minutes d’intervention), in vivo calcium imagerie et enregistrement de l’activité électrophysiologie sur des animaux libres de leurs mouvements s’il y a une electrode pendant la tâche de flexibilité cognitive (pour 1 à 3 heures d’intervention), et perfusion transcardiaque pour fixation de tissus. Ces expériences peuvent impliquer des injections IP de substances pharmacologiques, la mise à jeun des animaux pour les motiver associée à une tache comportementale (6 jours; n = 300)

Impact sur les animaux

En général, toutes les interventions sont bien tolérées par l'animal et n'affectent pas le phénotype général de la souris. Concernant la chirurgie des implants les nuisances comprennent douleur post opératoire, risque potentiel d’infection et de perte de l’implant. En ce qui concerne les expériences comportementales, les nuisances peuvent inclure stress de la msie à jeun associés à l’isolement et, stress de la manipulation.

Devenir

Procedure 1: Nous enregistrerons l'activité du cerveau de souris (300 souris) éveillées liée à des comportements normaux ou pathologiques. Procedure 2 : Nous manipulerons l'activité du cerveau de souris éveillées (320 souris) liée à des comportements normaux ou pathologiques. Ces expériences nécessitent des analyses anatomiques post-mortem (localisation anatomique des implants, injection de virus, expression de différents gènes). Il est donc nécessaire de prélever le cerveau. Dans ce but, tous les animaux seront mis à mort après fixation par perfusion transcardiaque.

Remplacement

Il n’y a pas d’autres alternatives à l’utilisation d’animaux pour ces expériences, car des modèles adéquats du circuit cortical contenant le nombre, les types et la localisation appropriés de récepteurs dans les réseaux excitateurs et inhibiteurs ne sont pas disponibles. L'objectif de nos expériences est de découvrir les actions des gènes, des neuromodulateurs et des médicaments sur les circuits neuronaux dans le cerveau intact. Il s'agit d'une question empirique qui nécessite l'examen de circuits intacts pour y répondre. Il n'existe aucune lignée cellulaire qui récapitule avec précision la physiologie des neurones des animaux, et comme nos expériences étudient les interconnexions entre les neurones qui se produisent dans le cerveau intact, ces expériences ne seraient pas possibles avec la culture cellulaire. De plus, il n'existe aucun modèle remplaçant l'utilisation d'animaux qui permettrait d'étudier les phénomènes comportementaux et cognitifs proposés ici. Les procédures expérimentales maximiseront donc le bien-être des animaux en appliquant les principes de remplacement, de réduction et de raffinement. Plus précisément, le remplacement partiel/relatif des animaux sera exercé par la mise en œuvre de plusieurs techniques employées à partir d'un seul animal (c'est-à-dire l'imagerie calcique in vivo et les enregistrements électrophysiologiques) afin de maximiser la collecte de données.

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (n = 620) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Le nombre d'animaux utilisés dans les procédures sera réduit en effectuant différentes procédures sur un seul animal : les animaux seront implantés pour l'électrophysiologie et la photométrie par fibre simultanément, ou l'électrophysiologie et l'optogénétique simultanément afin de maximiser les mesures longitudinales multiples sur le même animal. Nos compétences chirurgicales permettront également de réduire le nombre de victimes chez les animaux et de minimiser les dommages durables. Toutefois, les avantages de la réutilisation des animaux seront mis en balance avec les effets négatifs sur leur bien-être, en tenant compte de l'expérience de toute une vie de l'animal. En outre, notre expertise dans l'entraînement des souris à la tâche de flexibilité cognitive réduira également la variabilité et, dans une large mesure, les nombres globaux nécessaires pour obtenir une signification statistique dans les cohortes. Enfin, notre choix de la taille de l'échantillon est basé sur des études précédentes et est cohérent avec ceux généralement employés dans le domaine. La taille de chaque groupe sera déterminée par l'utilisation de tests statistiques appropriés, y compris le calcul de puissance. La taille réelle de l'échantillon, et donc la signification statistique, dépendra de la variabilité de la lecture biologique. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Toutes les mesures visant à atténuer ou à minimiser la douleur, la souffrance, l'angoisse ou les dommages durables subis par l'animal seront prises. Les protocoles expérimentaux ont été affinés en faisant appel aux pratiques vétérinaires les plus modernes et en prévoyant des périodes de récupération pour réduire le stress et la souffrance des animaux. Plus précisément, la souffrance des animaux est évitée ou réduite au minimum. La douleur et/ou la détresse des animaux seront, le cas échéant, réduites par la sédation, l'analgésie, l'anesthésie ou tout autre moyen approprié pour réduire la douleur ou la détresse, conformément aux pratiques vétérinaires reconnues. Cette action respectera les principes de la déclaration de Bâle (www.basel-declaration.org), qui défend l'idée que les expérimentations animales dans la recherche fondamentale et appliquée doivent être planifiées et réalisées avec un soin extrême et qui contribue à fournir à la société des informations ouvertes et transparentes sur les expérimentations animales.

Choix des espèces

Les propriétés de base des microcircuits neuronaux chez la souris sont similaires à celles d’autres mammifères. Les approches expérimentales multiples réalisées chez la souris permettent une analyse complète allant du comportement jusqu’à l’activité d’un seul neurone. Les souris peuvent être génétiquement modifiées révélant ainsi la fonction de gènes spécifiques. Les phénotypes sont normaux, non dommageables. Les animaux reproducteurs sont maintenus au stade homozygote donc il n’y a pas la nécessité de les génotyper. Si jamais le besoin se crée, il consiste en un prélèvement de queue sur des animaux anesthésiés par isoflurane et marqués par un tatouage au niveau des phalanges avant sevrage. Pour les expérimentations des males transgéniques homozygotes sont croisées avec des femelles commerciales. En effet il est recommandé de réaliser les expérimentations sur des animaux hétérozygotes. Animaux adultes seront utilisés pour toutes le procedures. Toutes les procédures nécessitent des interventions chirurgicales qui ne peuvent être pratiquées que sur des animaux adultes. En outre, toutes les expériences seront réalisées chez des souris adultes, lorsque les circuits corticaux préfrontaux ont atteint un stade de maturation final. Nos animaux sont identifiables par tatouage des phalanges selon la nomenclature universelle. Aucun animal ne sera genotype pour ce projet.