Rongeurs
Imagerie non invasive de l’inflammation myocardique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une ouverture du thorax provoquant une ischémie du cœur, une prise de sang à la queue puis des injections d'un agent d'imagerie sous anesthésie à deux et sept jours, pour vérifier si cet agent visualise l'inflammation cardiaque après infarctus. Le porteur indique une mortalité chirurgicale d'environ 20 %, qu'il place dans la fourchette basse de la littérature. Les animaux sont tués pour des analyses post-mortem, le porteur affirmant que la réponse inflammatoire ne peut être évaluée qu'in vivo.
Objectifs
L’infarctus du myocarde induit une réponse inflammatoire qui est nécessaire à la cicatrisation. Cette inflammation peut cependant parfois avoir un effet délétère. C’est le cas lors de la reperfusion du territoire ischémique qui s’accompagne d’une forte production de radicaux libres, de l’activation du complément, de neutrophiles et de macrophages. Ce phénomène est dénommé en anglais « ischaemia-reperfusion-injury » et il peut avoir pour conséquence une augmentation de la taille du territoire infarcie. Des thérapies visant à moduler la réponse inflammatoire, soit en la stimulant soit en l’inhibant selon le contexte et la fenêtre temporelle, sont donc à l’étude. Un agent d’imagerie permettant de visualiser de manière non invasive la réponse inflammatoire dans le post infarctus permettrait de mieux appréhender sa cinétique, et d’évaluer des thérapies ciblant celle-ci. L’agent d’imagerie de l’inflammation qui va être évalué dans ce contexte a déjà fait ses preuves chez la souris pour l’imagerie des plaques d’athéromes qui se développent dans la paroi des artères, ainsi que pour l’évaluation de l’inflammation hépatique. Il est en cours d’évaluation clinique pour l’imagerie de l’athérosclérose. L’objectif ici est donc de déterminer s’il est suffisamment spécifique et sensible pour permettre la visualisation de l’inflammation du muscle cardiaque dans le contexte du post-infarctus. Si oui, il pourra être utilisé dans le cadre de la recherche ou de la pratique clinique pour évaluer cette inflammation et pour tester de nouvelles thérapies. Cela ouvrira également la voie à l’exploration d’autres pathologies caractérisées par de l’inflammation du muscle cardiaque telles que l’endocardite, la myocardite, ou le rejet de greffe.
Bénéfices attendus
L’agent d’imagerie étudié fait a déjà fait ses preuves pour l’imagerie de l’athérosclérose et il fait actuellement l’objet d’un essai clinique pour cette application. La cible de cet agent d’imagerie (VCAM-1) est exprimée dans d’autres pathologies caractérisées par des phénomènes inflammatoires. Evaluer le potentiel de cet agent d’imagerie dans d’autres contextes physiopathologiques tels que le post-infarctus du myocarde permettra donc potentiellement d’étendre son champ d’applications diagnostiques. Cela permettra également de disposer d’un outil de recherche pour tester de manière non invasive des traitements ciblant la réponse inflammatoire.
Procédures
Les animaux subiront une unique procédure chirurgicale (
Impact sur les animaux
La procédure a été classée en sévère du fait de la chirurgie et de l’induction d’une ischémie myocardique. Toutefois, le modèle est bien maitrisé par le laboratoire en charge de sa réalisation. Ainsi, la taille de l’infarctus est bien contrôlée, et le vide pleural correctement réalisé. De ce fait la mortalité associée à la procédure chirurgicale se trouve dans la fourchette basse de ce qui est classiquement reporté dans la littérature (20%). Une médication et des points limite adaptés permettent de prendre en charge efficacement la douleur et le stress.
Devenir
A l’issu de la procédure les animaux seront mis à mort. En effet, des analyses post-mortem seront nécessaires pour caractériser la réponse inflammatoire et la distribution de l’agent d’imagerie à une échelle cellulaire et tissulaire.
Remplacement
La réponse inflammatoire dans le post-infarctus ne peut être évaluée qu’in vivo. Toutefois, l’agent d’imagerie a été préalablement entièrement caractérisé et validé in vitro sur protéine recombinante et sur cellules. Sa spécificité et sensibilité pour lier sa cible exprimée par des cellules endothéliales ont ainsi été préalablement démontrées in vitro.
Réduction
Le design de l’étude a été conçu de sorte à réduire le nombre d’animaux. En effet un faible effectif sera utilisé pour évaluer la faisabilité de la méthode lors d’une étude pilote, et l’étude principale ne sera réalisée que si cette première étude est concluante. Par ailleurs l’imagerie non invasive permet de suivre la réponse inflammatoire sur un même animal au cours du temps, est ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe avec enrichissement du milieu de vie adapté à l’espèce. Une médication et des points limites adaptés au modèle permettront de réduire le stress et la souffrance. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie volatile.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle de référence, avec le rat, pour l’étude du post-infarctus chez le petit animal. L’agent d’imagerie évalué est un fragment d’anticorps reconnaissant la protéine de souris et la protéine humaine, mais pas la protéine de rat. De ce fait l’espèce retenue est la souris, et plus particulièrement la souche c57Bl/6J fréquemment utilisée dans la recherche cardiovasculaire. Des souris c57Bl/6J adultes seront utilisées afin de se rapprocher du contexte clinique.
Délivrance intracérébrale d’un médicament par ultrasons chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
300 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Elles reçoivent une injection intraveineuse de particules, une séquence d'ultrasons puis un traceur, avant une perfusion intracardiaque terminale, pour établir une preuve de concept d'une délivrance de médicaments dans le cerveau par ultrasons. Le porteur décrit le stress lié à la contention et à l'anesthésie et une hypothermie limitée par une couverture chauffante. Il indique avoir mené des essais in silico et in vitro et conclut que le modèle animal ne peut être remplacé à cette étape.
Objectifs
Etablir la preuve de concept de l’efficacité d’une nouvelle stratégie de délivrance intracérébrale de médicaments par ultrasons.
Bénéfices attendus
Validation de notre nouvelle stratégie ultrasonore de délivrance intracérébrale de médicaments
Procédures
Procédure 1 : Evaluation de la capacité de la séquence ultrasonore US1 et des particules P1 à accumuler un traceur vasculaire, le bleu d’Evans, dans le cerveau : 1- Injection intraveineuse de particules P1 – anesthésie gazeuse – 80 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 30 s 2- Application de la séquence ultrasonore US1 – anesthésie gazeuse – 80 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 5 min 3- Injection intraveineuse d’une solution de bleu d’Evans – 80 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 30 s 4- Perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde – 160 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 20 min Procédure 2 Evaluation de la capacité des séquences ultrasonores US1 et US2, et des particules P1 et P2 à accumuler un fluorophore, DiD, dans le cerveau 1- Injection intraveineuse de particules P2 – anesthésie gazeuse – 40 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 30 s 2- Co-injection intraveineuse de particules P1 et P2 – anesthésie gazeuse – 80 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 30 s 3- Application de la séquence ultrasonore US2 – anesthésie gazeuse – 40 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 5 min 4- Application de la séquence ultrasonore US1 – anesthésie gazeuse – 40 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 5 min 5- Application des séquences ultrasonores US1 et US2 – anesthésie gazeuse – 20 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 5 min 6- Perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde – 140 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 20 min
Impact sur les animaux
Le stress est minimisé par l'implication d'un personnel qualifié à l'expérimentation animale (niveau concepteur). Les souris sont facilement stressées, la contention nécessaire à l’induction de l’anesthésie rajoute une source de stress supplémentaire. Les animaux, après la phase d’acclimatation, seront habitués à être sortis de leur cage. Les nuisances ou effets indésirables des procédures 1 et 2 seront évalués par le personnel de zootechnie et par les responsables de l’étude. La respiration, la température et le poids seront mesurés.
Devenir
Procédures 1 et 2 : A la fin de l’étude, une perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde et un prélèvement du cerveau sera réalisé.
Remplacement
Dans une première approche expérimentale, nous avons réalisé des expériences in-silico et in-vitro dont les résultats sont particulièrement encourageants et nécessitent d'être validés in-vivo. Par conséquent, à cette étape du projet, le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle d'étude in-vitro ou in silico.
Réduction
Grâce à un plan d’expérience, les groupes contrôles et expérimentaux seront constitués de 20 souris (10 mâles et 10 femelles). Nous réaliserons une étude statistique pour déterminer si notre nouvelle stratégie ultrasonore permet une accumulation efficace du bleu d’Evans et du DiD dans le cerveau (Puissance de test : Two-way ANOVA, 80%, Seuil de risque : 0.05).
Raffinement
Les souris seront hébergées en présence d'un objet d'enrichissement (morceaux de carton et/ou tube plastique) en groupe. Les souris sont facilement stressées, la contention nécessaire à l’induction de l’anesthésie rajoute une source de stress supplémentaire. Les animaux, après la phase d’acclimatation, seront habitués à être sortis de leur cage. Afin de limiter l’hypothermie induite par l’anesthésie générale, principale nuisance des procédures 1 et 2, les souris seront placées sur une couverture chauffante pendant ces procédures.
Choix des espèces
Dans la littérature, les stratégies de délivrance intracérébrale de médicaments par ultrasons sont réalisées chez la souris Balb/c de 6 semaines environ pour un poids de 20 g.
Evaluation de l’impact de la prédation sur le sommeil du rat et validation d’un nouveau dispositif d’enregistrement sous cutané et autonome.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
10 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de deux heures pour implanter des électrodes et un dispositif d'enregistrement sous la peau, reste isolé cinq semaines, puis est exposé à des odeurs et images de chats pour provoquer un stress de prédation. Le porteur reconnaît que l'isolement prive l'animal de son comportement social et que la présence simulée d'un prédateur induit "probablement" un stress, objet même de l'étude. Ce projet préliminaire vise à obtenir des données pour une demande de financement, et les animaux sont tués pour analyser leur cerveau et les tissus entourant l'implant.
Objectifs
Ce projet utilisant un nombre réduit d’animaux (n=10) est une demande préliminaire à une demande ANR jeune chercheur. Il a pour but de valider la fonctionnalité et la pérennité d’un système d’enregistrement électrophysiologique, la tolérance de l’animal à l’implantation sous cutanée du dispositif dans une durée de 30 jours maximum. Il aura également pour but d’exposer le rat à un contexte de prédation, uniquement sous réserve d’une totale cicatrisation des plaies et de scorage de suivis nuls. Cette expérience permettra de récolter des données préliminaires de sommeil simulant l’exposition à un contexte de prédation le plus écologique possible. Ces données serviront de base à une resoumission de projet à l’ANR en mars 2022. L’objectif global de l’ANR est de comprendre comment la prédation (l'un des principaux facteurs de sélection naturelle) a façonné le phénotype et l'évolution du sommeil. En effet, l’omniprésence du sommeil dans le règne animal suggère qu'il est essentiel à la survie, cependant, le sommeil et ses sous-états restent mal compris. Les animaux exposés à la prédation doivent être plus vigilants pour augmenter leur chance de survie, cependant quand ils dorment ils sont potentiellement plus vulnérables car moins sensibles à leur environnement. Le sommeil constitue donc un comportement extrêmement risqué pour de nombreuses espèces. Pour cette raison, la pression de prédation a été proposée comme explication de la diversité des habitudes de sommeil observées chez les mammifères et autres animaux. Une variabilité de certaines caractéristiques du sommeil, telles que sa durée quotidienne chez les paresseux, les quantités relatives de sommeil paradoxal et sommeil lent chez les rats, la durée quotidienne de sommeil chez les rats, le sommeil unihémisphérique chez les canards et la fragmentation du sommeil chez les colombes, a pu être corrélée indirectement avec une pression de prédation. Cependant, aucune étude n'a testé expérimentalement (sur des animaux élevés en laboratoire ou sauvages) comment les phénotypes du sommeil à plusieurs niveaux (physiologie, activité cérébrale, métabolisme et comportement) sont affectés par la pression de prédation, et si les processus associés à cette interaction sont plastiques (régulé par les effets environnementaux) ou génétiques et donc héréditaires. C’est le but de du projet ANR, qui se basera sur l’étude du sommeil de populations de rats sauvages ayant grandi avec ou sans prédation.
Bénéfices attendus
Outre l’obtention de données préliminaires qui permettront grandement d’augmenter les chances de financement, ce projet permettra le développement d’une méthodologie d’enregistrement complet du sommeil des animaux en conditions semi-naturelles. En effet, le développement d’un implant sous cutané, miniature, de grande autonomie, dédié au sommeil ouvre de nouvelles perspectives pour une meilleure compréhension des animaux en veillant à leur bien être puisqu’ils ne seront plus équipés de câble et pourrons même être, à terme, stabulés en groupe. C’est une vraie amélioration d’un point de vue qualité et quantité des données acquises, permettant ainsi de répondre à des questions plus complexes tout en limitant le nombre d’animaux. Enfin, étudier l’effet de la prédation sur le sommeil permet aussi de comprendre le lien entre stress/peur et sommeil, deux états étroitement liés et source de nombreux troubles chez l’homme.
Procédures
Les 5 animaux seront isolés durant les 5 semaines prévues pour la procédure. Ils subiront une anesthésie générale pour une intervention chirurgicale consistant à implanter des électrodes pour les enregistrements des paramètres physiologiques (activités cérébrales, musculaires, oculaires, cardiaques et température) et un dispositif autonome sous cutané de récolte des données physiologiques pendant 40 jours. La durée de l'intervention chirurgicale durera 2 heures maximum. Après 15 jours de récupération et validation de la tolérance à l'implant sous cutané et 1 semaine pour ceux ayant un implant externe, les animaux seront exposés au protocole de prédation pendant 1 semaine (à raison de 2 fois 3 heures par jour).
Impact sur les animaux
Ils subiront d’abord une anesthésie générale pour une chirurgie implantatoire (pose d’électrodes pour les enregistrements électrophysiologiques du sommeil et d’un implant sous cutané au niveau dorsal pour enregistrer le sommeil en autonomie totale). La procédure chirurgicale de la pose des électrodes est maitrisée. Le caractère novateur de ce projet d’un point de vue expérimental sera la présence d’un implant sous cutané dont la taille a été réduite au maximum (1cm x 4cm x 1.5cm et 15g) et rendu biocompatible (encapsulation en silicone). Ceci pourra donc entrainer une gêne pour l’animal. C’est d’ailleurs ce que nous chercherons à évaluer et à éviter grâce à un suivi quotidien des animaux et à l’optimisation de notre implant. Enfin, si l’aspect implantation sous cutané est validé et ne pose aucun problème aux animaux, durant les 15 jours de récupération, ils seront exposés individuellement et de façon périodique pendant une semaine des stimuli olfactifs et visuels provenant de chats. Bien que les animaux soient en totale sécurité dans leur cage dotée d’un abri, ils vont ressentir probablement un stress dû cette présence. C’est d’ailleurs aussi tout l’objet du projet, évaluer l’impact de ce stress sur leur sommeil. Enfin, dans l'intérêt de leur bonne récupération, l'obtention de résultats reproductibles en éliminant toute interférence provoquée par l'effet groupe, les rats seront isolés durant les 5 semaines de la procédure. Ils n'auront donc pas la possibilité d'exprimer leur comportement social durant cette procédure.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure. Bien que rendu biocompatible, il sera nécessaire d'évaluer le degré de tolérance de l'implant sous cutané. Pour cela, l'implant sous cutané sera retiré. Les données d'enregistrements seront récoltées et les tissus environnants seront prélevés pour effectuer une analyse histologique qui nous indiquera le degré éventuel d'inflammation provoqué par sa présence. De plus, il sera primordial de prélever le cerveau des animaux et d'analyser histologiquement les potentielles structures cérébrales impactées par le contexte de prédation et les perturbations attendues du sommeil.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer le modèle animal dans le cadre de ce projet qui s’intéresse à la réponse complexe d’un organisme. Le rat est le modèle idéal de par sa taille, sa disponibilité et l’étendu des connaissances que nous avons déjà sur sa physiologie.
Réduction
En augmentant la quantité des paramètres collectés nous réduisons le nombre d’expérience et donc le nombre d’animaux. Par ailleurs, dans le cadre de ce projet, le nombre a été limité au strict minimum (5 animaux avec implant sous cutané et 5 avec implant externe) pour permettre la validation du dispositif et la collecte de données préliminaires. De plus, nos connaissances et notre maitrise en chirurgie implantatoire sur cette espèce nous permet de prévoir un nombre d'animaux minimal. A noter que ces effectifs ne seront pas utilisés dans leur totalité si nous sommes capable d'enregistrer la totalité des expériences prédation avec les animaux avec implant. L'objectif global est recolter des données de sommeil en contexte de predation sur 4 animaux au total et de valider la fiabilité de l'implant sur deux animaux (car sa tolérance a déja été validée sur deux animaux pendant 30 jours) cf DAP V6.
Raffinement
En développant un implant sous cutané, nous permettons à l’animal de se déplacer librement et d’exprimer toute la complexité de son comportement. Ce projet préliminaire s'inscrit d'ailleurs dans un projet futur plus large, qui nous permettra d'enregistrer des animaux en milieu semi naturel donc hautement enrichi. L’enregistrement de plusieurs paramètres physiologiques et cérébraux permet aussi en une expérience d’accumuler beaucoup d’information qui aurait nécessité plusieurs dispositifs parfois filaires auparavant et donc plus gênant pour l'animal.
Choix des espèces
Ce projet est préliminaire et permettra, une fois validé expérimentalement, d’utiliser le dispositif d’enregistrement dans le cadre d’un futur projet de plus grande envergure sur des rats sauvages en milieu naturel. Le rat est suffisamment gros pour supporter notre instrumentation et son sommeil est très bien connu en laboratoire. Par ailleurs c’est une espèce invasive. Il est donc disponible facilement à l’état sauvage. Il a aussi colonisé différent milieu plus ou moins exposé à la prédation, il est donc un modèle de choix pour notre projet. De plus, le sommeil est un état complexe. L’objectif de l’étude est de déterminer quelle part de son expression est influencée par la prédation (rythme, physiologie, mouvement, position, localisation, activité cérébrale). Des rats adultes de 4 mois seront utilisés pour ce projet. Les animaux devront d’une part avoir un âge avec unepleine maturité cérébrale et, d'autre part, une taille et un poids suffisants (400g environ) afin de supporter l’implant sous cutané.
Le rôle de PRL2 dans la lymphangiogenèse
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
436 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes, des nouveau-nés et des adultes reçoivent des injections de tamoxifène, et une partie subit une chirurgie de prélèvement d'un fragment de peau du dos, pour étudier le rôle d'une protéine dans la formation des vaisseaux lymphatiques. Le porteur indique une euthanasie immédiate en cas de saignement péritonéal, de mort des embryons dans l'utérus ou de nouveau-nés délaissés. Les animaux sont mis à mort pour prélever plusieurs tissus, le remplacement étant écarté au motif que le développement embryonnaire ne se reproduit pas in vitro.
Objectifs
Le projet vise à caractériser le rôle d'une protéine phosphatase dans la lymphangiogenèse (la formation des vaisseaux lymphatiques) afin de comprendre les mécanismes de la formation des vaisseaux lymphatiques. Ce projet se divise en deux axes : (1) Déterminer si notre protéine d'intérêt est impliquée dans la lymphangiogenèse pendant le développement embryonnaire et à quel stade précisément. (2) Déterminer si cette protéine est impliquée dans la lymphangiogenèse chez l’adulte dans un contexte de cicatrisation de tissue.
Bénéfices attendus
La lymphangiogenèse est un sujet de recherche relativement récent et bien qu’il y ait des avancées majeures dans la compréhension de ce processus, beaucoup d’aspects restent encore à être étudier, notamment le rôle des régulateurs intracellulaires dans la formation des vaisseaux lymphatiques. Parmi ces régulateurs, nous avons principalement des protéines kinases et des protéines phosphatases. Dans ce projet, nous proposons d’étudier une protéine phosphatase qui a déjà un effet modulateur dans le développement vasculaire sanguin. Le système vasculaire sanguin et lymphatique ayant des mécanismes similaires, nous pensons que cette phosphatase aurait également un rôle régulateur sur la formation des vaisseaux lymphatiques. Les résultats préliminaires in vitro montrent que notre phosphatase d’intérêt a un effet sur la prolifération et la migration des cellules endothéliales lymphatiques, mais également sur la formation de structure tubulaire par ces cellules. Ceci suggère que cette phosphatase pourrait donc avoir un rôle dans la régulation de la lymphangiogenèse. Si cela est aussi observé in vivo, ce projet nous permettra d’ajouter un nouveau régulateur dans le processus et également une meilleure compréhension du rôle des phosphatases dans la lymphangiogenèse. La lymphangiogenèse est un processus important pour le bon fonctionnement de l’organisme et un dérèglement de ce processus entraîne souvent le développement ou l’aggravation d’une pathologie comme par exemple les lymphoedèmes ou les métastases. Ainsi, tout régulateur de la lymphangiogenèse peut devenir une cible thérapeutique pour activer ou inhiber la formation des vaisseaux lymphatiques afin de prévenir ou de guérir les pathologies. Par exemple, dans le cas des cancers avec un risque de métastase, les deux voies les plus probables pour les cellules tumorales sont les vaisseaux sanguins et lymphatiques. Donc, en inhibant la formation de ces vaisseaux à la périphérie de la tumeur, le risque de métastase diminue. Ainsi, l’utilisation d’un inhibiteur de lymphangiogenèse comme adjuvant, comme les anti-angiogéniques, pourrait améliorer le traitement des cancers. Or, pour inhiber la lymphangiogenèse, il est nécessaire de comprendre le mécanisme de formation des vaisseaux pour pouvoir cibler les régulateurs. Dans notre cas, notre phosphatase d’intérêt pourrait devenir une cible pour inhiber la formation des vaisseaux lymphatiques.
Procédures
Un total de 108 femelles gestantes recevront deux injections intrapéritonéales d’hydroxytamoxifen sur deux jours consécutifs (E9-E10, E11-E12 ou E13-E14) et seront euthanasiées à E18. Un total de 208 nouveaux-nés recevront également 2 injections intrapéritonéales d’hydroxytamoxifen à P1 et P3 et seront anesthésiés à P7. 120 souris entre 8 et 10 semaines recevront 3 injections intrapéritonéales de tamoxifen par semaine pendant 2 semaines. Chaque injection intrapéritonéale prend moins d'une minute par souris. Les souris injectées avec du tamoxifen subiront par la suite une chirurgie de 5 minutes pour un prélèvement de peau de 8 mm de diamètre sur le dos. Durant la chirurgie, elles seront sous anesthésie générale (isoflurane), sous anesthésie locale cutanée (crème Anesderm 5%) et sous analgésique (buprénorphine). Ces souris recevront ensuite une application quotidienne de vaseline (moins d'une minute par application) et seront ensuite suivies pendant une vingtaine de jours avant d’être euthanasiées. Les injections d'hydroxytamoxifen et de tamoxifen servent à induire l'extinction d'expression de notre protéines d'intérêt dans les cellules composant les vaisseaux lymphatiques.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, nous croiserons deux lignées de souris différentes afin d'obtenir une nouvelle lignée de souris avec une délétion spécifique de notre protéine phosphatase dans les cellules endothéliales lymphatiques. Au laboratoire, nous travaillons également avec une lignée de souris ayant une délétion ubiquitaire d'expression de notre protéine phosphatase et également une lignée de souris ayant une délétion spécifique de notre protéine phosphatase au niveau des vaisseaux sanguins et lymphatiques. Aucun phénotype délétère n’a été observé chez ces deux lignées lors de l'extinction d'expression de la protéine. De ce fait, la lignée de souris que nous établirons pour projet ne devrait pas présenter de phénotype dommageable. Cependant, l’apparence et le comportement des animaux seront tout de même observés pour prévenir d’un quelconque phénotype dommageable. En cas de cachexie, de prostration, de tremblements ou d’autre comportement anormal, l’animal sera immédiatement sacrifié. La création de cette lignée de souris sera suivie et validée par la SBEA.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus nécessaires aux analyses visant à déterminer la formation des vaisseaux lymphatiques. Les vaisseaux lymphatiques forment un réseau vasculaire dans le corps entier des animaux. Ainsi plusieurs tissus seront récupérés sur l'animal (oreille, diaphragme, mésentère et peau).
Remplacement
Le projet vise à caractériser le rôle d'une protéine phosphatase dans la lymphangiogenèse (formation des vaisseaux lymphatiques), autant au niveau développemental que chez l’adulte. Ceci nécessite donc l’utilisation d’un modèle in vivo car il n’est pas possible de reproduire les conditions de développement embryonnaire et de cicatrisation in vitro. Le développement embryonnaire est un processus complexe où chaque étape est importante pour que la suivante puisse commencer. La formation des vaisseaux lymphatiques suit également cette logique et chaque étape importante a déjà été lié à un stade de développement particulier chez l'embryon de souris. Ainsi, le modèle murin nous permet d'étudier le rôle de notre protéine à des étapes précises de la formation des vaisseaux lymphatiques. La formation des vaisseaux lymphatiques implique également des interactions complexes avec d'autres cellules de l'organisme, comme les cellules immunitaires dans le cas d'une cicatrisation. Or ces interactions celulle-cellule sont difficile à reproduire car tous les mécanismes ne sont pas encore décrit.
Réduction
Pour être statistiquement significatif et scientifiquement irréprochables, nous utiliserons 10 souris de chaque génotype/expérience. Expériences répétées 4 fois (1 expérience pour ajuster les protocoles et 3 expériences pour prouver la reproductibilité des résultats). Nos génotypes d’intérêt premier sont les souris avec une délétion inductible de notre protéine et les souris sans délétion inductible. Nous aurons aussi des animaux contrôle secondaire pour vérifier que le gène d'induction de la délétion n'a pas d'effet seul. Si aucun effet n’est observé lors des 2 premières expériences, nous exclurons ces souris par la suite pour réduire le nombre d’animaux. Nous avons optimisé nos croisements pour n’obtenir que les génotypes d’intérêt à chaque portée, ce qui est d’autant plus important lors de nos expériences au stade embryonnaire et post-natal, où le génotype n'est pas connu, pour limiter le nombre d’animaux. Nous ferons des croisements séparés pour les souris contrôle secondaire, afin de pouvoir les exclure facilement si nécessaire. Nombre maximal d’animaux estimé = 436. Les études statistiques seront réalisées grâce à un test ANOVA afin de comparer les différents groupes génotypiques entre eux dans chaque expérience.
Raffinement
Une surveillance d’une grande attention sera faite après chaque geste expérimental. Pour les injections intrapéritonéales, 10 minutes d’observation et une vérification 1h après. En cas d’inconfort ou de souffrance, l’animal sera tout de suite pris en charge par les soigneurs et sacrifié si son état est trop grave. En cas de saignement au niveau de la cavité péritonéale, l’animal sera immédiatement sacrifié. Pour les femelles gestantes, en cas de mort intra-utérine des embryons la femelle sera immédiatement euthanasiée. Pour les nouveaux-nés, s’ils ne se nourrissent plus ou sont mis à l’écart, ils seront euthanasiés. Dans le cas des tests de cicatrisation, un analgésique et un anesthésiant local seront utilisés en plus de l’anesthésie générale lors de la chirurgie et les souris seront placées sur un tapis chauffant. Suite à la chirurgie, de la vaseline sera appliquée quotidiennement pour couvrir la plaie et la maintenir humide. Pour ne pas influencer les résultats, l’utilisation d’un désinfectant ne se fera qu’en cas d’infection ou de suppuration. Si l’état de l’animal s’aggrave et sans amélioration après traitement, il sera sacrifié. Les cages seront enrichies en accord avec la procédure expérimentale. Des tunnels seront présents dans chaque cage. Pour les femelles gestantes ou avec des petits, il y aura un enrichissement de la litière en copeaux et des accessoires de nidification. Pour les animaux en cicatrisation, les cages seront aménagées pour que chaque animal soit isolé, mais avec un contact visuel et olfactif avec son congénère. Pour toutes les procédures expérimentales, il y aura un suivi quotidien des animaux et chaque changement physique ou comportemental sera noté sur une fiche de suivi hebdomadaire. Tout comportement anormal grave comme la prostration ou des tremblements entraînera l’euthanasie immédiate de l’animal. Pour des changements plus légers, l’avis d’un vétérinaire sera demandé et une décision sera prise en concertation avec le vétérinaire, les soigneurs et le responsable du projet pour définir la meilleure prise en charge de l’animal. Les soins seront toujours effectués par les mêmes expérimentateurs pour réduire le stress des animaux et tout le personnel de l’animalerie impliqué dans ce projet a les compétences et l’expérience nécessaire pour la partie expérimentale. Au cours du projet, nous nous maintiendrons informer des possibles améliorations de raffinement adaptables à nos procédures.
Choix des espèces
Le projet vise à caractériser le rôle d'une protéine phosphatase dans la lymphangiogenèse, autant au niveau développemental que chez l’adulte. Ceci nécessite donc l’utilisation d’un modèle in vivo car il n’est pas possible de reproduire ces conditions in vitro. Par des tests fonctionnels in vitro, nous avons déjà établi que la diminution d’expression de notre protéine dans les cellules endothéliales lymphatiques formant les vaisseaux impacte les processus biologiques essentiels à la lymphangiogenèse. Afin de confirmer l’importance de cette protéine phosphatase dans la formation des vaisseaux lymphatiques, nous voulons donc passer à un modèle murin avec une délétion spécifique de la protéine dans les cellules endothéliales lymphatiques. La lignée de souris de notre projet sera obtenue par le croisement de deux lignées déjà existantes et cette lignée permettra de déléter spécifiquement notre protéine phosphatase au niveau des vaisseaux lymphatiques. Ce modèle nous permettra ainsi d’étudier le rôle de notre protéine dans la formation des vaisseaux lymphatiques, aussi bien au niveau développemental que chez l’adulte. Les procédures au niveau dévelopemental impliquent 2 injections d’hydroxytamoxifen à des femelles gestantes au stade embryonnaire E9-E10, E11-E12 ou E13-E14. Ces stades de développement correspondent à différentes étapes importantes de la formation du système vasculaire lymphatique : formation des sacs lymphatiques, développement des vaisseaux collecteurs et formation des valves. Les embryons seront récupérés à E18 pour analyse du réseau lymphatique. Pour le développement vasculaire lymphatique post-natal, des nouveaux-nés recevront 2 injections d’hydroxytamoxifen, à P1 et à P3, et seront sacrifiés à P7. Pour définir le rôle de notre protéine phosphatase dans la lymphangiogenèse chez l’adulte, nous utiliserons des souris âgées entre 8 et 10 semaines pour les expériences de cicatrisation. Cela nous assure une cicatrisation optimale de la plaie avec un système immunitaire performant pouvant induire la lymphangiogenèse.
Un modèle murin d’étude de la réparation de l’ADN dans le développement du cerveau
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
522 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes subissent sous anesthésie une chirurgie de 30 à 45 minutes pour introduire un marqueur fluorescent dans les embryons par électroporation, afin d'étudier des lésions programmées de l'ADN dans le cerveau en développement. Le porteur indique des injections d'analgésiques avant et après l'opération et une surveillance quotidienne, avec euthanasie en cas d'atteinte de points limites. Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organes, et le porteur affirme que ces questions ne peuvent s'étudier que sur le mammifère "in toto".
Objectifs
Les cassures de l’ADN sont des lésions génomiques très toxiques qui interviennent lors du développement du système nerveux central. Des mécanismes puissants de réparation de ces lésions évitent l’instabilité génétique qu’elles pourraient engendrer. La mauvaise réparation de ces lésions est à la base de nombreuses pathologies chez l’homme comme certaines maladies neurodégénératives, des déficits immunitaires sévères et le développement de cancers. Chez l’animal, les formes les plus sévères de déficit de réparation des lésions de l'ADN se traduisent par une létalité embryonnaire tardive consécutive à la mort des neurones. Plusieurs facteurs impliqués dans diverses voies de réparation des dommages à l'ADN ont été identifiés à partir de l’analyse de situations pathologiques chez l’homme et analysés dans des modèles animaux d’invalidation génique afin d’en mieux comprendre la fonction. L'objectif du présent projet est d'identifier les raisons de la létalité embryonnaire de certaines lignées de souris déficientes en voie de réparation de l'ADN. Nous émettons l'hypothèse que certains dommages programmés de l'ADN dans le cerveau en développement sont à la base du phénotype. Nous projetons de générer une lignée de souris mutantes incapables de générer ces lésions et d'évaluer si ce fonds génétique peut sauver la létalité embryonnaire des animaux déficients en réparation de l'ADN. De plus nous produirons une souris reportrice pour suivre les cellules dans lesquelles interviennent ces lésions programmées.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est la détermination de la fonction des lésions programmées de l’ADN dans les phases précoces du développement du cerveau. Cette fonction est jusqu'à présent inconnue. Cette étude nous permettra alors de mieux comprendre la mort cellulaire neuronale et la létalité embryonnaire qui en découle chez les animaux porteurs d'anomalies de la réparation de l'ADN. In fine, cette étude participera à la compréhension de maladies génétiques de l'enfant caractérisées par des anomalie du développement, l'existence de microcéphalies ainsi que le développement de tumeurs cérébrales et les mécanismes de vieillissement accéléré.
Procédures
Pour l'analyse in vivo des lésions programmées de l’ADN, des embryons à E12.5 ou 14.5 recevront par électroporation in utero (en une seule intervention et sous anesthésie générale) des souris femelles gestantes un marqueurs fluorescent de ces dommages . La chirurgie dure entre 30 et 45 min selon le nombre d’embryons avec 45 min comme durée maximum.
Impact sur les animaux
Les souris avec un défaut de réparation de l'ADN ont un phénotype dommageable connu ; une létalité embryonnaire. Nous n’envisageons pas de phénotype dommageable des deux lignées mutantes faisant l’objet de ce dossier. L’analyse des lésions de l’ADN dans le cerveau par l'introduction intra-embryonnaire d'un marqueur fluorescent peut présenter quelques nuisances liées à l'expérimentation. Afin de minimiser ces nuisances, les souris placées sur une plaque chauffante reçoivent une anesthésie générale ainsi que des injections sous-cutanées d'analgésiques en pré- et post-opératoire. Un gel ophtalmique est également utilisé pour éviter un dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance. Une grille d'évaluation des animaux est mise en place. Une injection d'analgésique ou l'euthanasie de l'animal sont envisagées en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure pour prélèvement d'organes et analyses phénotypiques
Remplacement
Les questions scientifiques que nous posons ne peuvent être étudiées qu’in vivo ou ex vivo, sur des cerveaux prélevés sur des embryons. Il s’agit ici d’études sur le développement du cortex cérébral, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère in toto. En effet, le développement du cortex des mammifères et son fonctionnement ultérieur sont de mieux en mieux caractérisés chez la souris et aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de ces processus dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part.
Réduction
Notre expérience préalable sur ce type de modèles animaux avec défaut de réparation de l'ADN nous montre que les phénotypes, lorsqu’ils sont dommageables (létalité́ embryonnaire, baisse de viabilité́ avant sevrage ou déficit immunitaire), sont en général suffisamment importants et homogènes pour être statistiquement significatifs sur de faibles cohortes. Selon le calcul de puissance effectué sous G*Power (puissance de 0.8 et une p-value de ≤0.05), l'évaluation du caractère dommageable nécessite 65 animaux pour la lignée Pgbd5 KO, 289 animaux pour les croisements de Pgbd5 sur fonds génétiques XRCC4 ou PAXX/Xlf KO et 65 animaux pour la lignée reportrice. L’analyse statistique sera réalisée par un test non-paramétrique Mann-Whitney de comparaison de fréquences.
Raffinement
Un des phénotypes dommageables possible des animaux par ailleurs viables étant un déficit immunitaire plus ou moins sévère, ils seront obtenus et maintenus en portoirs ventilés, en zone EOPS afin de minimiser leur exposition à des agents pathogènes. Un suivi quotidien permettra de s’assurer que les animaux ne développent pas de signes cliniques d’infection. Devant un état moribond du pelage, une voussure ou prostration sévère ou un amaigrissement important laissant supposer une telle infection ou un mal-être général, les animaux seront systématiquement euthanasiés. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (coton, bâton, tunnel) avec eau et nourriture ad libitum et en groupe social avant et après la procédure. Lors de la procédure #2 la litière utilisée dans la cage est spécifique pour les animaux opérés et permet de diminuer le risque d'infection de la cicatrice. La nourriture ainsi qu’un gel hydrique sont placés directement dans la litière pour une meilleure accessibilité. Lors des actes chirurgicaux, les souris placées sur une plaque chauffante sont anesthésiées (Isoflurane, induction : 3%, maintien : 2%) et reçoivent des injections sous-cutanées (seringues 27G, volume injecté de 5µl/g) d'analgésiques en pré́- (Buprenorphine 0,05μg/g) et post-opératoire (Kétoprofène 5μg/g). La couverture antalgique du kétofene dure 36h post opération. Un gel ophtalmique est également utilisé pour éviter un dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance. Une grille d'évaluation des animaux est mise en place. Une injection d'analgésique ou l'euthanasie de l'animal sont envisagées en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle pour mener les études sur le développement du cerveau, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme. En effet, seuls les Mammifères présentent un néocortex organisé en couches inversées. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce pour la réalisation du projet tels que des anticorps pour les immuno-marquages. L'analyse des phénotypes dommageables éventuels se fait sur des femelles gestantes pour la létalité embryonnaire et sur des animaux nouveau-nés de la naissance jusqu'au sevrage pour la baisse de viabilité. L'analyse in vivo des lésions programmées de l’ADN est effectuée sur des embryons à E12.5 et E14.5. Les embryons sont ensuite analysés à E16.5 et E18.5 après activation du marqueur fluorescent.
Etude de la fonction de la protéine CKIP1 dans les microglies de souris EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections d'un composé (tamoxifène) cinq jours de suite, avant prélèvement du cerveau, pour étudier le rôle d'une protéine dans les cellules immunitaires du cerveau. Le porteur décrit l'inconfort comme lié aux injections répétées, sans détailler d'autre suivi que le poids et un scorage de posture et de toilettage. Il s'agit d'une recherche fondamentale dont les bénéfices annoncés restent la connaissance générale et une cible pharmacologique "potentielle".
Objectifs
Les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central façonnent les réseaux de neurones au cours du développement. Chez l’adulte elles participent à la surveillance et l’entretien du cerveaux en éliminant les cellules mortes ou inutiles. Dans le cerveau sain, les cellules immunitaires ont une morphologie complexe caractérisée par des prolongements ramifiés en perpétuelles mouvements. Ces mouvements sont importants car grâce à eux les cellules peuvent explorer le cerveau à la recherche de dysfonctionnements. Il se trouve que dans la plupart des pathologies du cerveau le mouvement de ces prolongements s’arrêtent et il est difficile de savoir si l’arrêt de ces mouvements est une cause ou une conséquence de la pathologie. De plus les mécanismes cellulaires contrôlant ces mouvements sont pour la plupart inconnus. Il est donc important de comprendre le fonctionnement de ces mouvements et leur rôle exact pour mieux comprendre leurs impacts sur les pathologies du cerveau. Nous avons identifié une molécule exprimée par ces cellules immunitaires qui pourrait être impliquées dans ces mouvements, nous proposons de la supprimer pour étudier les effets sur le fonctionnement des cellules et la réponse cellulaire lors d’une inflammation mimant une pathologie. Ce projet a deux objectifs principaux. 1) Caractériser le rôle de cette protéine dans la physiologie des cellules immunitaires du cerveau. 2) Etudier les répercussions de l’invalidation de la protéine sur la neuro-inflammation, et le fonctionnement du cerveau. Ces expériences nous permettront de mieux comprendre la fonction de cette protéine mais également de d’appréhender le rôle que jouent les cellules immunitaires aux cours des pathologies du système nerveux central.
Bénéfices attendus
Il s’agit d’un projet de recherche fondamentale dont les résultats bénéficieront à la connaissance générale du système nerveux central tant chez l’homme que l’animal, et permettront de mieux comprendre les interactions entre le système nerveux central et le système immunitaire. Les résultats attendus de cette recherche permettront de mieux comprendre les processus cellulaires conduisant aux pathologies neurodégénératives du système nerveux central et aux troubles engendrés par l’auto-immunité. Il permettra surtout de mieux comprendre les voies de signalisations associées à notre protéine d’intérêt et d’en faire une potentielle cible pharmacologique.
Procédures
Une Injections IP de tamoxifene sur 5 jours consécutifs/ animal. Chaque injection se fait en 30 secondes max/animal. Prélèvement de tissus sur des animaux morts (432).
Impact sur les animaux
Inconfort lié à l’injection répétée de tamoxifène
Devenir
Mise à mort pour récolter les tissus et faire des analyses morphologique et transcriptomiques
Remplacement
Il s’agit d’un projet de recherche fondamental visant à étudier le rôle d’une protéine jusqu’alors inconnue. Les expériences réalisées dans ce projet ne peuvent donc pas être modélisées. Nous travaillons sur des cultures de cellules primaires provenant d’animaux nouveaux nés ou réaliserons des études histologiques sur des cerveaux de souris pour obtenir nos données.
Réduction
Les lots et procédures ont été élaborés de manière à optimiser les groupes contrôles et à éviter la redondance. Les effectifs ont été déterminés à l’aide d’un test statistique de puissance. La significativité sera déterminée à l’aide de test ANOVA ou non paramétrique si la normalité des échantillons n’est pas obtenue. Il s’agit de travaux originaux jamais réalisés à notre connaissance dans la littérature.
Raffinement
Afin de limiter le nombre d’expériences et l’inconfort lié aux expériences in vivo, nous avons développé un modèle de culture dans lequel la morphologie de nos cellules d’intérêt est préservée. Ceci nous permettra de limiter l’utilisation de souris entière pour réaliser nos expériences. De façon générale le bien-être des animaux sera évalué de façon quotidienne. Les souris seront observées dans leurs cages pendant plusieurs minutes puis pesées. L’évaluation se fera selon un scorage établi (posture, poids, toilettage) de sorte à identifier les points limites.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris comme modèle car couramment utilisée au laboratoire. Les souris permettent d’avoir recours à des animaux transgéniques. Il existe une abondante littérature sur le fonctionnement synaptique chez la souris ce qui évitera de reproduire certaines expériences pour valider notre modèle. Pour la culture cellulaire les animaux seront âgés de 2 à 5 jours lors des injections stomacales de tamoxifène et de 10 jours lors de la mise en culture. Cet âge permet d’obtenir une résistance suffisante aux conditions d’hypoxie et d’ischémie des cellules rencontrées lors de la mise en culture et une maturation suffisamment avancée pour obtenir des cellules ramifiées. Les expérimentations in vivo seront réalisées sur des animaux adultes âgés de 6-10 semaines.
Imagerie non invasive de l’inflammation myocardique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie d'ouverture du thorax provoquant un infarctus du cœur, puis des injections d'un agent d'imagerie sous anesthésie à deux et sept jours, pour vérifier si cet agent visualise l'inflammation cardiaque. Le porteur indique une mortalité liée à la chirurgie d'environ 20 %, qu'il situe dans la fourchette basse de la littérature. Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem, et le porteur affirme que la réponse inflammatoire ne peut être évaluée qu'in vivo.
Objectifs
L’infarctus du myocarde (muscle cardiaque) induit une réponse inflammatoire qui est nécessaire à la cicatrisation. Cette inflammation peut cependant parfois avoir un effet délétère. Des thérapies visant à moduler la réponse inflammatoire, soit en la stimulant soit en l’inhibant selon le contexte et la fenêtre temporelle, sont donc à l’étude. Un agent d’imagerie permettant de visualiser de manière non invasive la réponse inflammatoire permettrait de mieux appréhender sa cinétique, et d’évaluer des thérapies ciblant celle-ci. L’agent d’imagerie de l’inflammation qui va être évalué dans ce contexte a déjà fait ses preuves chez la souris pour l’imagerie de lésions qui se développent dans la paroi des artères, ainsi que pour l’évaluation de l’inflammation du foie. Il est en cours d’évaluation clinique. L’objectif ici est donc de déterminer s’il est suffisamment spécifique et sensible pour permettre la visualisation de l’inflammation du muscle cardiaque dans le contexte du post-infarctus. Si oui, il pourra être utilisé dans le cadre de la recherche ou de la pratique clinique pour évaluer cette inflammation et pour tester de nouvelles thérapies. Cela ouvrira également la voie à l’exploration d’autres pathologies caractérisées par de l’inflammation du muscle cardiaque telles que le rejet de greffe.
Bénéfices attendus
L’agent d’imagerie étudié fait a déjà fait ses preuves pour l’imagerie de lésions des artères et il fait actuellement l’objet d’un essai clinique pour cette application. La cible de cet agent d’imagerie est exprimée dans d’autres pathologies caractérisées par des phénomènes inflammatoires. Evaluer le potentiel de cet agent d’imagerie dans d’autres contextes physiopathologiques tels que le post-infarctus du myocarde permettra donc potentiellement d’étendre son champ d’applications diagnostiques. Cela permettra également de disposer d’un outil de recherche pour tester de manière non invasive des traitements ciblant la réponse inflammatoire.
Procédures
Les animaux subiront les conséquences de la chirurgie. A J2 et J7 les animaux recevront une injection intraveineuse d’un agent d’imagerie suivi d’une anesthésie volatile de courte durée (
Impact sur les animaux
La procédure a été classée en sévère du fait de la chirurgie et de l’induction d’une ischémie myocardique. Toutefois, le modèle est bien maitrisé par le laboratoire en charge de sa réalisation. Ainsi, la taille de l’infarctus est bien contrôlée, et le vide pleural correctement réalisé. De ce fait la mortalité associée à la procédure chirurgicale se trouve dans la fourchette basse de ce qui est classiquement reporté dans la littérature (20%). Une médication et des points limite adaptés permettent de prendre en charge efficacement la douleur et le stress.
Devenir
A l’issue de la procédure les animaux seront mis à mort. En effet, des analyses post-mortem seront nécessaires pour caractériser la réponse inflammatoire et la distribution de l’agent d’imagerie à une échelle cellulaire et tissulaire.
Remplacement
La réponse inflammatoire dans le post-infarctus ne peut être évaluée qu’in vivo. Toutefois, l’agent d’imagerie a été préalablement entièrement caractérisé et validé in vitro sur protéine recombinante et sur cellules. Sa spécificité et sensibilité pour lier sa cible exprimée par des cellules endothéliales ont ainsi été préalablement démontrées in vitro.
Réduction
Le design de l’étude a été conçu de sorte à réduire le nombre d’animaux. En effet un faible effectif sera utilisé pour évaluer la faisabilité de la méthode lors d’une étude pilote, et l’étude principale ne sera réalisée que si cette première étude est concluante. Par ailleurs l’imagerie non invasive permet de suivre la réponse inflammatoire sur un même animal au cours du temps, est ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe avec enrichissement du milieu de vie adapté à l’espèce. Une médication et des points limites adaptés au modèle permettront de réduire le stress et la souffrance. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie volatile.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle de référence, avec le rat, pour l’étude du post-infarctus chez le petit animal. L’agent d’imagerie évalué est un fragment d’anticorps reconnaissant la protéine de souris et la protéine humaine, mais pas la protéine de rat. De ce fait l’espèce retenue est la souris.
Etude de l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques dans des modèles murins de tumeurs solides ou hématologiques
- Recherche appliquée
- Cancers
20 750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance qui vont de léger à sévère, la grande majorité (19 100) en gravité sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau ou dans une veine, des injections répétées de candidats médicaments par de multiples voies et des prélèvements de sang au sinus rétro-orbital, pour évaluer des immunothérapies visant les cellules NK. Le porteur indique que les greffes peuvent provoquer perte de poids, nécrose, ulcération, difficulté à respirer et cachexie, des points limites déclenchant la mise à mort. Les bénéfices pour les patients, rémission ou espérance de vie accrue, restent renvoyés au conditionnel, tandis que le remplacement est écarté au motif qu'un candidat médicament exige une preuve de concept sur "animal entier".
Objectifs
Chaque année, environ 18 millions de cancers sont diagnostiqués à travers le monde, responsables de plus de 9 millions de décès. Les approches pour le traitement du cancer ont profondément évolué ces dernières années et l’immunothérapie représente aujourd’hui une approche thérapeutique prometteuse dans ce domaine. Sa particularité n’est pas de cibler les cellules tumorales comme les autres stratégies thérapeutiques (chimiothérapie, radiothérapie etc) mais d’aider à restaurer le bon fonctionnement du système immunitaire du patient pour l’induire à reconnaitre et détruire les cellules tumorales. Avec l’approbation de ces immunothérapies par les autorités réglementaires et leur introduction dans l’arsenal thérapeutique des oncologues depuis 2010, de nombreux patients ont pu bénéficier d’effets spectaculaires de traitements par immunothérapie. Cependant, malgré le succès de ce type d’approches pour une partie des malades, une majorité d’entre eux ne retire qu’un bénéfice limité des molécules actuellement disponibles. Ce constat force à la recherche de nouvelles stratégies pour induire une réponse immune contre le cancer arborant des modes d’actions différents, efficaces ou pouvant se combiner et améliorer l’efficacité des molécules déjà utilisées. L’immense majorité de ces nouvelles voies de traitement cible les cellules lymphocytes T de l’immunité adaptative. Notre laboratoire travaille sur des immuno-thérapies innovantes basées sur les cellules Natural Killer (NK), qui sont clés de la réponse immunitaire anti-tumorale. En effet, les cellules NK peuvent directement et rapidement reconnaître et tuer les cellules tumorales. En outre, grâce à leur production de cytokines, elles peuvent induire une réponse spécifique et durable via notamment l’activation de lymphocytes spécifiques. Ce projet sera utilisé dans les phases précoces de développement de nouvelles immunothérapies au sein de la société. Il détaille un schéma général précis qui sera communément utilisé pour tous les nouveaux traitements qui seront ultérieurement évalués afin de mettre en évidence l’efficacité de ces nouvelles approches dans des modèles de tumeurs solides ou hématologiques. Ce projet a donc pour objectif de valider le concept thérapeutique antitumoral de nouveaux traitements ayant la capacité de booster le système immunitaire (et en particulier les cellules NK) pour lutter contre le cancer.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont importants. Si ce projet permet d’identifier un nouveau médicament contre le cancer, alors le bénéfice à moyen et long terme pour les patients sera considérable. En effet, depuis 2004, le cancer est la première cause de mortalité prématurée en France, devant les maladies cardiovasculaires. On estime que 3,8 millions de personnes vivent en France aujourd'hui avec un diagnostic de cancer (données ARC pour 2018). L’approche pour le traitement du cancer a profondément évolué ces dernières années. Jusqu’alors, les traitements de références étaient la chirurgie et la radiothérapie pour des cancers très localisés, la chimiothérapie pour des cancers plus diffus et les thérapies ciblées pour des cancers ayant des mutations génétiques particulières. Malgrè ces traitements, plus de 150 000 patients meurent d’un cancer chaque année. Le besoin médical en thérapies innovantes et efficaces est donc considérable. L’immunothérapie est aujourd’hui une nouvelle approche thérapeutique qui a permis une avancée majeure dans le traitement du cancer. Notre approche vise à cibler les cellules NK du système immunitaire inné, qui sont des acteurs majeurs de la réponse anti-tumorale, pour in fine stimuler le système immunitaire du patient contre le cancer. Le projet présenté ici vise à évaluer l’efficacité de nouvelles stratégies immunothérapeutiques visant ou utilisant les cellules NK dans le modèle murin. S’ils s’avèrent efficaces, ces nouveaux médicaments seront ensuite testés en phases cliniques chez des patients. Les bénéfices pour les patients seraient la rémission, l’augmentation de l’espérance de vie et/ou une meilleure qualité de vie.
Procédures
Injection de cellules tumorales : Injection sous-cutanée (Procédure 2) ou injection intra-veineuse (Procédure 3). Toutes les souris de la procédure seront injectées. Injection dans le flanc d’animaux vigiles (procédure 2) ou dans la veine caudale d’animaux vigiles (procédure3). Une injection par souris. Pour l’étude de la réponse mémoire, un nombre restreint de souris sera ré-injecté avec des cellules tumorales dans le flanc opposé (procédure 2) ou dans la veine caudale (procédure 3), 2 à 6 mois après la première injection. Dans ces 2 procédures, injection des cellules tumorales avec des aiguilles 30G 1/2, volume ≤100 µL pouvant aller jusqu’à 200 µL si cellules de grosse taille ou grand nombre de cellules. Injection des nouveaux candidats médicaments (Procédures 1, 2 & 3) : La méthode et la fréquence d’injection sera définie pour chaque nouveau traitement, suivant sa stabilité, sa concentration et sa biodistribution prédite. a. Injection intra-veineuse, dans le sinus rétro-orbital d’animaux anesthésiés par voie gazeuse (isoflurane). Aiguille 30G 1/2, V≤100 µL et jusqu’à 200 µL si la concentration du composé trop faible. Maximum une injection/œil /semaine ; b. Injection intra-péritonéale dans des animaux vigiles. Aiguille 26G ou 30G 1/2, V≤400 µL, maximum 5fois/semaine ; c. Injection sous-cutanée intra-scapulaire dans des animaux vigiles. Aiguille 26G ou 30G 1/2, V≤200 µL, maximum 5fois/semaine ; d. Injections per os d’animaux vigiles avec sondes de gavage, V≤200 µL, maximum 5fois/semaine ; e. Injection intra-tumorale dans souris anesthésiées par voie gazeuse (isoflurane). Aiguille 30G 1/2, V≤100 µL, maximum 5fois/semaine. Prélèvement poumons et organes (Procédure 3, uniquement si injection de cellules « transparentes ») après surdosage chimique par une injection IP de 300-360 mg/kg de kétamine + 30-40 mg/kg de xylazine, aiguille 26G, sur un animal anesthésié par voie gazeuse (isoflurane)). Prélèvement de sang (Procédures 1, 2 & 3) : au sinus rétro-orbital sur animaux anesthésiés par voie gazeuse (isoflurane). V
Impact sur les animaux
Les gestes réalisés sur les animaux dans les procédures 1, 2 et 3 toutes les procédures bien que répétés et/ou multiples, sont de gravité modérée. Cependant, les modèles de greffes sous-cutanée ou intra-veineuse de cellules tumorales réalisées lors des procédures 2 et 3 peuvent induire une incidence sur le bien-être de l’animal : Les modèles de greffe en SC (procédure 2) peuvent induire une incidence significative sur le bien-être ou l’état général de l’animal se traduisant par une perte de poids, une nécrose importante et/ou saignement et/ou ulcération et/ou inflammation très importante, une tumeur altérant la mobilité des animaux, signes d’isolement ou posture de dos voûté et/ou prostration et/ou difficulté à respirer (dyspnée) et/ou cachexie (affaiblissement profond de l’organisme). Des points limites précoces sont appliqués sur ces modèles pour réduire au maximum les douleurs/souffrances/anxiété des animaux. Les modèles de greffe en IV (procédure 3) peuvent induire une incidence significative sur le bien-être ou l’état général de l’animal se traduisant par une perte de poids, signes d’isolement ou posture de dos voûté et/ou prostration et/ou difficulté à respirer (dyspnée) et/ou cachexie (affaiblissement profond de l’organisme). Des points limites précoces sont appliqués sur ces modèles pour réduire au maximum les douleurs/souffrance/anxiété des animaux. Les nouveaux traitements testés dans ce projet peuvent, également, induire une toxicité transitoire dans les jours suivant leur administration qui peut se traduire par une perte de poids transitoire, un poil piqué et une diminution d’activité. Cette toxicité ne dure que quelques jours (inférieure à 8 jours) et les animaux reviennent à leur état « normal » rapidement. Une attention particulière sera portée aux animaux en phase de perte de poids afin de réduire au maximum les douleurs/souffrance/anxiété des animaux. Les gestes réalisés sur les animaux de la procédure 4 sont de gravité légère. Aucune incidence significative sur le bien-être ou l’état général ne devrait être observée.
Devenir
Les animaux de la procédure 1, ayant subit un nombre répété de gestes techniques (injection et prélèvement), seront sacrifiés afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux et éviter tout effet indésirable. Les animaux des procédures 2 et 3 seront sacrifiés lors de l’atteinte des points limites afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux et éviter tout effet indésirable. Les animaux n’atteignant pas les points limites à la fin de la procédure expérimentale mais ayant été greffé avec des cellules tumorales seront sacrifiés afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux et éviter tout effet indésirable. Dans les procédures 1, 2 et 3, les animaux exclus et les animaux dédiés au prélèvement d’organes/sang pour expérimentations ex-vivo seront euthanasiés avant l’atteinte des points limites. Les animaux de la procédure 4 seront sacrifiés immédiatemment après le prélèvement de sang.
Remplacement
Evaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à réactiver le système immunitaire implique d’être dans un système biologique complexe qui rassemble tumeur, environnement tumoral et système immunitaire. Compte tenu de l’interaction étroite entre ces différents systèmes, qu’il n’est pas possible de reproduire in vitro, il est nécessaire d’obtenir des preuves de concept sur animal entier dans le processus de développement de candidats médicaments. Le remplacement des animaux est donc impossible.
Réduction
Les effectifs d'animaux nécessaires seront réduits au minimum selon la règle des 3R. Les lots de souris ont été définis par analyse statistique prédictive de taille de populations, basée sur les tests qui seront appliqués aux données collectées : test statistique de rang non paramétrique one-way ANOVA, Mann Whitney, student t-test non-apparié (en présumant que les données des lots que l’on compare suivent des lois normales de même variance) et test de survie (test Log-rank). D’après ces analyses prédictives, il faudra des lots de 20 souris pour pouvoir obtenir des résultats exploitables dans les études de pharmacodynamie (procédure 1) et des lots de 5 à 12 souris pour les études d’efficacité et de réponse mémoire (procédures 2 et 3). Des lots de 5 à 10 souris seront nécessaires pour les expériences visant les études ex-vivo des procédures 2 et 3 (histochimie, RTqPCR, cytométrie en flux). Quand nous utiliserons de nouveaux modèles de tumeurs, des mises au point seront effectuées afin de déterminer combien de cellules devront être injectées par souris (3 doses seront testées). Cela requièrera 10 souris par groupe. Pour réduire le nombre de souris utilisées, si plusieurs composés candidats ayant le(s) même contrôle(s) doivent être testés dans la même expérience, les groupes contrôles communs ne seront réalisés qu’une seule fois. Pour les études in vitro de la procédure 4, des lots de 15 souris seront nécessaires pour obtenir des données significatives. Ces nombres de souris représentent un compromis entre sensibilité et robustesse statistique suffisante. Les données obtenues pour chaque paramètre sur des animaux traités pourront être comparées aux données obtenues sur des animaux ayant reçu un traitement placebo et/ou traitement de référence et permettre ainsi l’évaluation précise de l’efficacité de nouveaux candidats médicaments. Pour l’utilisation des souris transgéniques, animaux mâles et femelles d’âges différents pourront être utilisés, afin de réduire le nombre d’animaux générés.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 5 jours sera respectée à la réception des animaux. Les animaux seront hébergés maximum 5 par cage avec 2 enrichissements de milieu au minimum. Dans la mesure du possible, aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage en cours d’expérimentation, sinon un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Dans la mesure du possible, des aiguilles 30G 1/2 seront utilisées pour toutes les injections. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale (gazeuse à l’isoflurane) et les volumes ainsi que les fréquences de prélèvement suivront les recommandations du CEEA et de la SBEA (cf. Annexe01). Le poids des animaux sera suivi une fois par semaine. Certains nouveaux candidats médicaments peuvent induire une perte de poids transitoire des animaux intervenant généralement entre 1 à 8 jours après le traitement. Lorsqu’une perte de poids sera initiée (10% de perte de poids), les souris seront pesées 3 fois par semaine. Dès l'atteinte de 15% de perte de poids, les animaux seront pesés quotidiennement. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. Au-delà de 15% de perte de poids, il sera ajouté de la nourriture humidifiée ou gélifiée, au fond de la cage, afin de faciliter l’accès à la nourriture aux animaux. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement, aspect des tumeurs) sera suivi lors des mesures de poids ou de volume tumoraux (classiquement deux fois par semaine). S’il se dégrade (yeux plissés, oreilles rabattues, prostration, isolement) mais ne nécessite pas son sacrifice, la surveillance des animaux sera réalisée tous les deux jours. Dans le cas d’un modèle agressif, les souris seront surveillées quotidiennement. Si une tumeur commence à montrer des signes de nécrose modérée (inflammation importante et/ou croute), les souris seront surveillées tous les deux jours. Dans le cas d’un modèle agressif avec signe de nécrose modérée, les souris seront surveillées quotidiennement. Les points limites relatifs à la perte de poids, à l’apparence et au comportement des animaux, à l’aspect et aux volumes des tumeurs sont des critères qui justifieront le sacrifice des animaux Les prélèvements sanguins de la procédure 4 seront réalisés sous anesthésie générale (gazeuse à l’isoflurane) avec une injection de buprénorphine. Les souris seront euthanasiées immédiatement après le prélèvement.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies et l’activation du système immunitaire. Des modèles murins de tumeurs solides et hématologiques sont à disposition dans différentes souches de souris. Enfin, le modèle murin est un modèle de choix de par l’existence de souris immuno-déficientes et de souris génétiquements modifiées qui nous permettront de disséquer le rôle de nos nouveaux traitements sur le système immunitaire (souris transgéniques déficientes en cellules NK, par exemple). Les animaux utilisés dans le cadre de ces études auront un âge minimal de 7 semaines, âge auquel le système immunitaire est décrit comme mature.
Etudes des propriétés intrinseques des neurones néocorticaux chez trois modèles transgéniques (souris) de maladie neurodéveloppementale
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 216 souris issues de trois lignées transgéniques censées reproduire des troubles neurodéveloppementaux vont être utilisées, certaines pour quatre heures d'enregistrement de l'activité cérébrale sous anesthésie, d'autres pour sept jours de tests comportementaux, à raison de vingt minutes par jour. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré ou se déroulent sous anesthésie sans réveil. À l'issue, 540 souris sont gardées en vie pour de futures expériences, les autres sont tuées, une partie encore sous anesthésie pour prélever leur cerveau, une autre au CO2. Les tests, censés mesurer l'anxiété et la réaction aux sons et au toucher, ne sont pas nommés, et le porteur écrit qu'un traitement des défauts sensoriels "a le potentiel d'améliorer d'autres symptômes" de ces troubles.
Objectifs
Les troubles neurodéveloppementaux (TN) touchent environ 1 enfant sur 60. Les facteurs génétiques, ainsi que les facteurs environnementaux, jouent un rôle important dans l'étiologie de ce trouble complexe. Certains TN se caractérisent par des déficiences en matière de communication et d'interaction sociale ainsi que par des comportements stéréotypés répétitifs. Les personnes atteintes de ce trouble présentent souvent une réponse inappropriée aux stimuli sensoriels. Cette sensibilité anormale peut avoir un impact dévastateur sur leur vie quotidienne (par exemple, incapacité à porter certains vêtements, à tolérer le bruit ou la lumière dans un centre commercial ou une école) et peut entraîner des inégalités dans l'accès à l'éducation, etc. A ce jour, il n'existe aucun traitement permettant d'améliorer la vie de ces personnes. L'objectif de notre projet actuel est de mieux comprendre les processus neurobiologiques qui sous-tendent les défauts de traitement de l'information sensorielle dans les modèles murins de la TN. Nous effectuerons des enregistrements cérébraux et des tests comportementaux afin de tester la capacité de molécules potentiellement thérapeutiques à corriger les défauts de traitement sensoriel dans le cerveau.
Bénéfices attendus
Notre projet s'attaque à des défis importants pour comprendre la base neurobiologique de l'expérience sensorielle atypique dans les TN (et sa remédiation). Les innovations particulières de notre approche sont (1) l'utilisation d'un système cérébral qui est hautement conservé entre les souris et les humains, fournissant ainsi un système modèle idéal pour les études translationnelles. (2) Nous utilisons une approche thérapeutique basée sur un mécanisme, soutenue par de solides données préliminaires et publiées et par la génétique humaine. Notre proposition aborde un certain nombre de défis importants en suspens dans la recherche sur les TN, y compris la pertinence de développer des approches expérimentales comparables dans les modèles de recherche humains et rongeurs, et le rôle critique des caractéristiques sensorielles altérées dans les TN. De plus, comme les caractéristiques sensorielles sont fortement déterminantes pour d'autres symptômes des TN, toute approche thérapeutique ciblant le traitement atypique de l'information sensorielle a le potentiel d'améliorer d'autres symptômes de ce trouble.
Procédures
Nous effectuerons des enregistrements cérébraux sur des souris anesthésiées qui recevront une analgésie tout au long de l'expérience pour gérer toute douleur. La durée de cette expérience sera de 4 heures. Nous effectuerons des tests comportementaux pour observer l'anxiété des souris et leur réaction aux sons et au toucher. Les souris seront manipulées et habituées avant ces tests comportementaux. Les tâches comportementales seront effectuées pendant 7 jours, à raison de 20 minutes maximum par jour.
Impact sur les animaux
Après avoir transférer les animaux vers l'animalerie expérimentale, une période d'acclimatation d'au moins 5 jours est observée avant le début de la procédure. Durant cette période, les animaux sont surveillés quotidiennement par l'expérimentateur et/ou les zootechniciens de l'animalerie. Pour atténuer les conséquences du stress lié à ce transfert, de la nourriture humide sera disponible (placée sur le sol de la cage). En cas de faiblesse ou de très petits animaux, les soins seront également complétés par des " packs de gel " et une surveillance renforcée sera mise en place (avec pesée des animaux si nécessaire). Surveillance quotidienne, fourniture de matériaux pour la construction du nid, et hébergement dans une cage collective sera fait pour réduire, éviter et atténuer toute forme de souffrance des animaux de la naissance à la mort.
Devenir
À la fin de la procédure 1, les souris seront gardées en vie pour des expériences ultérieures afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans les études futures. A la fin de la procédure 2, les souris seront euthanasiées humainement alors qu'elles sont encore sous anesthésie et leur cerveau sera collecté pour un examen morphologique des neurones. A la fin de la procédure 3, ces souris seront euthanasiées humainement par inhalation de CO2 par une personne formée et selon les méthodes réglementaires approuvées par la DDPP.
Remplacement
Le modèle animal est absolument nécessaire pour reproduire la complexité des interactions neuronales nécessaire pour le traitement de l’information sensorielle qui demande un système intact. Le remplacement par les méthodes in vitro ou in silico n’est pas possible à ce jour. Cependant, certaines expériences préliminaires visant à tester le potentiel des nouvelles molécules thérapeutiques seront réalisées in vitro avant l'application de ces molécules chez l’animal.
Réduction
Pour les enregistrements cérébraux, notre strategie d’experimentation nous permet d’effectuer une analyse précoce de nos donnees au fur et a mesure et de modifier la taille d’echantillon si besoin. Pour les tests comportementaux, la taille de nos échantillons est similaire à celle suggérée par d'autres études similaires. Nous ne pouvons pas utiliser les mêmes souris dans les groupes non traités, administrés avec le véhicule et administrés avec le traitement, car cela aurait pour conséquence que les mêmes souris subissent chaque test comportemental plusieurs fois, ce qui pourrait confondre nos résultats comportementaux, comme cela a été rapporté dans plusieurs études précédentes. Il s'agit d'une considération particulièrement importante dans nos tests, car nous examinerons l'accoutumance sensorielle, qui pourrait être gravement affectée par la répétition des mêmes tests sur les souris plusieurs fois. Nous suggérons toutefois d'effectuer des tests pilotes pour vérifier ce point. De plus, nous ne pouvons pas réutiliser les souris comportementales de la procédure 1 de cette APAFiS car elles auront reçu le traitement. Cependant, les souris non traitées de ce groupe seront utilisées pour les tests pilotes mentionnés ci-dessus.
Raffinement
Avant expérimentation: Surveillance quotidienne et vérification de l’état de l’animal (posture, comportement, vivacité, état de pelage). Pendant les enregistrements cérébraux: Le séance d'enregistrement se fait sous anesthésie générale. Le mélange anesthésique utilisé a une action analgésique. Un crème ophtalmique (ocrygel) est appliqué aux yeux. L'animal est maintenu sur tapis chauffant. Durant la séance d’enregistrement la température de l’animal est contrôlée grâce à une sonde rectale. Pour les enregistrements longs: injection s.c. d'une solution physiologique (0.9% NaCl) Réduire au maximum l’angoisse : Hébergement de manière à correspondre aux besoins de l’animal – mise à disposition du matériel pour la construction d’un nid.
Choix des espèces
Ce modèle (la souris) a été choisi car les rongeurs ont un système sensoriel très développé et sont considérés comme une espèce modèle pour les études concernant le traitement de certains types d'informations sensorielles. De plus, la souris est actuellement la seule espèce de mammifère dont il est possible de modifier le génome en routine pour créer des modèles de maladies humaines. 28 à 48 jours (procédure 1 et 2) : Justification : Conformément aux études précédentes réalisées, des animaux âgés de 28 à 48 jours seront utilisés. De 9 à 16 semaines d'âge (procédure 3) : Justification : Conformément aux études précédentes, les tests comportementaux de la procédure 3 seront réalisés sur des souris adultes (âgées de 9 à 16 semaines).
Etudes d’efficacité d’un médicament vétérinaire par suivi de la réponse immune : évaluation chez des espèces alternatives
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Cochons d'Inde : 50
Hamsters dorés : 50
Souris, cochons d'Inde et hamsters dorés remplacent ici les chiens, les chats et les chevaux dans des études d'efficacité de médicaments vétérinaires. 150 rongeurs, 50 de chaque espèce, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués en fin d'étude après une prise de sang terminale, ou plus tôt s'ils atteignent un point limite. Ils reçoivent le produit, puis des prises de sang suivent leur réponse immunitaire pendant des études qui peuvent durer jusqu'à cinq mois, et une partie des souris sert à produire des anticorps comme réactifs de laboratoire. Le porteur justifie ce choix par le souci d'utiliser "les espèces les moins susceptibles de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse", sans dire sur quoi repose ce classement.
Objectifs
Le projet consiste à immuniser des rongeurs (espèces modèles) avec un vaccin dans le but de : - Evaluer l’efficacité d’un vaccin par suivi de la réponse immune chez l’animal. - Produire, chez la souris, des anticorps monoclonaux ou du sérum polyclonal en tant que réactifs de laboratoire
Bénéfices attendus
Les études d’efficacité permettent de connaitre le niveau de réponse immunitaire induit par le vaccin chez l’animal grâce à des paramètres évalués par des analyses de laboratoires.
Procédures
Après l’administration du produit selon les recommandations établies, les paramètres cliniques (état général, poids, température…) et la réponse immune sont suivis (prélèvements sanguins). En fonction de la bibliographie et des connaissances acquises sur les produits, les conditions d’administration du produit (site et voie d’administration, doses, nombre d’injection, et intervalle entre les injections) sont optimisées. Ces études sont encadrées selon les exigences de la Directive Européenne 2010/63/UE, de la Pharmacopée Européenne, de guidelines (dont VICH, EMEA) et d’autres exigences spécifiques à chaque pays. La finalité de ce projet est de mettre sur le marché des médicaments vétérinaires présentant un risque minimal et de permettre aux propriétaires de disposer des meilleurs traitements pour leurs animaux tout en réduisant l’impact des maladies infectieuses sur les populations. La durée des études peut aller jusqu’à 5 mois et dépend de l’objectif de l’étude, du type de produit étudié et de l’avancement du projet (étapes de recherche amont ou développement).
Impact sur les animaux
La contention peut être une contrainte pour l'animal. Celle-ci doit être adaptée pour que la technique soit la plus rapide et moins douloureuse et traumatisante possible. L’administration du produit et les prélèvements sanguins peuvent occasionner un stress et une douleur légère de quelques minutes
Devenir
Les animaux font l’objet d’un prélèvement sanguin terminal et sont euthanasiés en fin d’étude. Dans des cas exceptionnels, pendant l’étude, si l’animal atteint les points limites, il est euthanasié.
Remplacement
Il est nécessaire d’utiliser des animaux vivants car l’efficacité par suivie de la réponse immune doit être évaluée sur l’animal. De même, la production de sérum polyclonal ou d’anticorps monoclonaux nécessitent l’utilisation de l’animal. Lorsque cela est possible, une première étape dans le projet de développement d’un produit consiste à tester in vitro différents candidats. Ceci permet une première sélection de ces derniers, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Une série de tests analytiques permet de garantir un certain niveau de sécurité pour les animaux recevant le produit. Un recueil d’informations est aussi apporté par la bibliographie lorsque cela est possible.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux à inclure est très souvent une exigence réglementaire. En amont, lors des phases recherche, les effectifs sont évalués au plus juste (analyse statistique, historique, définition des objectifs…) de façon à minimiser le nombre d’animaux utilisés en limitant le risque d’études non conclusives.
Raffinement
Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique des animaux est prévue dans le but de limiter leur stress et de stabiliser leur état physiologique. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Une anesthésie de l’animal est réalisée lors de certains prélèvements. Les conditions d’hébergement varient selon l’espèce et l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Tous les animaux sont hébergés en groupe et des enrichissements adaptés au milieu sont mis en place. La Structure du Bien Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie des animaux.
Choix des espèces
Ces études sur rongeurs sont des modèles alternatifs pour les études sur chien, chat et cheval. Les chiffres sont donc basés sur l’expérience (études antérieures et bibliographie) et les référentiels du modèle canin, félin et équin. Cette utilisation s’applique dans le cadre des 3R afin d’utiliser les espèces les moins susceptibles de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l’angoisse ou de subir des dommages durables en préservant l’objectif scientifique et la qualité du résultat. D’autant que l’efficacité d’un produit par suivi de la réponse immune ne peut pas être testées in vitro. La production de sérum polyclonal ou d’anticorps monoclonaux chez la souris est un modèle de référence largement reconnu dans la bibliographie. Les procédures utilisant des rongeurs sont réalisées après le sevrage (dès 21 jours). Les caractéristiques de ces animaux sont bien connues à cet âge ; il s’agit de l’âge qui offre une meilleure sensibilité pour le modèle. Ces animaux sont communément utilisés à cet âge (bibliographie, données fournisseurs agréés).
Évaluation préclinique de l’Accident de Décompression : injection post-plongée de nanocapsules contenant de la perfluorodécaline.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
76 rats Wistar vont être utilisés, tous les survivants tués à l'issue, dans des procédures que le porteur lui-même classe en gravité sévère. Chaque rat, cathéter posé dans la veine caudale, est maintenu en contention pendant une plongée hyperbare simulée de 83 minutes puis observé une heure, épisode décrit comme provoquant une douleur et une angoisse sévères, pour tester des nanocapsules d'oxygène contre l'accident de décompression. Le porteur indique qu'un analgésique est administré avant la plongée sans modifier l'apparition des symptômes, dont la paralysie fait partie du tableau clinique. Il affirme que l'accident de décompression ne peut être induit et étudié que chez l'animal, faute de marqueur biologique validé.
Objectifs
L’accident de décompression (ADD) représente le risque le plus grave chez les plongeurs subaquatiques professionnels et de loisir, mais concerne aussi toutes les personnes soumises à des modifications de la pression ambiante (patients et personnels des chambres hyperbares, pilotes, astronautes, ouvriers tunneliers…). Ses manifestations vont de la simple démangeaison jusqu’à la paralysie définitive ou, à l’extrême, au décès. Or, environ un tiers des personnes accidentées conserve des séquelles invalidantes malgré les traitements actuels. Il est donc nécessaire d’améliorer l’efficacité du traitement de cette pathologie. L’administration intraveineuse de solutions de perfluorocarbone (PFC) a montré son efficacité chez des modèles animaux (rongeurs et miniporcs). Ce transporteur d’oxygène est potentiellement efficace dans le traitement de nombreuses pathologies dont l’ADD. L’encapsulation du PFC dans des nanocapsules d’albumine (Albumin-derived perfluorodecalin-containing nanocapsules, A-PFC-N) offre des perspectives prometteuses. Ces préparations présentent une faible toxicité autorisant des applications thérapeutiques ; de plus, l’enveloppe d’albumine, soluble à la fois dans l’eau et les lipides, ne provoque pas de réaction immunitaire. Enfin, ces capsules sont stables en solution et peuvent être administrées par voie intraveineuse. Un travail récent a montré l’intérêt des A-PFC-N sur un modèle murin d’ADD en réduisant l’apparition des ADD. Aujourd’hui, notre objectif est de tester l’efficacité des A-PFC-N dans la prévention secondaire de l’accident de décompression chez un modèle murin d’ADD. Nous projetons ainsi d’appliquer ce traitement expérimental non plus en préventif, comme précédemment, mais après une plongée simulée, afin de se rapprocher des conditions susceptibles de se produire chez l’humain.
Bénéfices attendus
A court terme, les bénéfices de ce projet portent sur l’étude de l’efficacité des nanocapsules d’albumine contenant de la perfluorodécaline en traitement secondaire de l’ADD. Nous allons pouvoir confirmer ou infirmer ce que nous avions déjà observé en comparant les différents groupes. A moyen terme, si les résultats sont confirmés positivement, une étude clinique pourra être envisagée pour le traitement secondaire de l’ADD chez l’humain. A long terme, les bénéficiaires seront tous les personnels susceptibles d’être atteints d’ADD.
Procédures
Tous les animaux (n=76) sont soumis à deux actes pendant la procédure. Dans un premier temps, pour chaque animal, un analgésique sera administré 1 heure avant la plongée simulée, avant qu'une anesthésie gazeuse ne soit réalisée. Puis, l'animal sera placé dans un tube de contention et un cathéter veineux souple sera implanté dans la veine caudale latérale. L'ensemble de ces gestes dure 10 minutes au maximum. Puis, toujours sous l’effet de l'analgésique et vigile, les 76 animaux seront maintenus en contention pendant le protocole hyperbare, qui est une procédure sévère et dure 83 minutes au maximum. A l'issue de la plongée simulée, tous les animaux recevront immédiatement, via le cathéter veineux, une injection dont le contenu est différent entre les groupes que nous avons constitués. Ils seront alors extraits du tube de contention et une observation stricte de l’évolution des symptômes sera réalisée pendant une heure à l’aide de la table de suivi de soin. Enfin, à l’issue de la période d’observation de 60 min, tous les animaux vivants seront anesthésiés et mis à mort.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont : le stress généré par la mise en place du cathéter au niveau de la veine latérale caudale (intensité légère, durée 3 heures) ; le stress généré par le maintien du rat dans un tube de contention (intensité modérée, durée 2 heures) ; l’angoisse lors de l’injection de nos nanocapsules (intensité légère et durée maximale de 2 minutes) ; la douleur et l’angoisse lors de la plongée simulée et lors de la période d’observation de l’apparition des symptômes pendant une heure post-plongée (Intensité sévère, durée maximale deux heures) ; le stress généré par la préhension et l’injection de l'anesthésique à l'issue de la période d'observation (intensité modérée, durée maximale 2 minutes).
Devenir
A l’issue de la période d’observation de la plongée simulée, tous les animaux survivants seront mis à mort. Nous prélèverons du sang, des tissus, les organes d'intérêt pour des analyses multiples (Histologie des tissus prélevés, dosages biochimiques des paramètres inflammatoires, détermination des activités enzymatiques) afin de déterminer si notre traitement est efficace.
Remplacement
Les expérimentations cliniques induisant des accidents de décompression ne sont envisageables que chez l’animal. Chez l’humain, le risque d’ADD est quantifié à partir de la quantité de bulles veineuses circulantes, or les données récentes montrent clairement que cette mesure est très insuffisante. Par ailleurs, en l’absence de marqueur biologique validé de l’ADD, les approches in vitro ne peuvent être mises en œuvre que sur des échantillons de tissus prélevés sur des animaux préalablement soumis à des décompressions génératrices d’accidents de décompression. De même, les modèles cellulaires, par ailleurs utilisés au laboratoire, permettent d’étudier les effets de la pression ambiante, mais ne sont pas applicables à l’étude de l’ADD. Le remplacement n’est donc pas possible dans cette étude.
Réduction
Le nombre d’animaux dans chaque groupe (4 groupes de 15 animaux) correspond à l'effectif minimal pour assurer une puissance statistique de 0,8 au risque alpha = 0,05. Plusieurs variables sont analysées : - la proportion d’animaux souffrant d’un accident de décompression, en relation avec le traitement pharmacologique, - la gravité de l’ADD et son évolution en relation avec le traitement pharmacologique - les paramètres biologiques d’intérêt, déterminés à partir de dosages biologiques dans les tissus prélevés. Les paramètres suivant une loi normale sont comparés à l’aide d’une ANOVA à 1 facteur suivie de tests post-hoc (Dunnett contre un groupe témoin, en l’occurrence le groupe “contrôle NaCl” pour l’incidence et la gravité de l’ADD). Si la distribution normale n’est pas respectée, les différences entre groupes sont analysées à l’aide d’une ANOVA non paramétrique (Kruskall Wallis). En ce qui concerne la procédure expérimentale N°1, dès lors que le profil de plongée simulée est validé, la procédure s’arrête. Si des rats ont déjà été livrés, ils intègrent la procédure expérimentale n°2.
Raffinement
A partir de l’âge de 10 semaines et jusqu’à 12 semaines, âge d’entrée dans la procédure, les rats sont habitués à l’usage d’un tube de contention quotidiennement et de manière progressive. Ils sont manipulés tous les jours par des personnes formées et habituées à travailler avec des rats de laboratoire. On commence par 5 minutes de contention le premier jour puis on augmente progressivement la durée jusqu’à 2 heures. Une heure avant la plongée simulée, un antalgique est injecté par voie sous-cutanée afin de diminuer la douleur pendant les injections des nanocapsules et la période d’observation sans modifier l’évolution des symptômes. L’implantation d’un cathéter souple au niveau de la veine latérale caudale est réalisée sous anesthésie gazeuse. L’angoisse lors de l’injection de nos nanocapsules est légère et ne dure que 2 minutes après la sortie du caisson hyperbare, cela relève davantage de la contention à laquelle les rats sont déjà habitués pendant la période d’habituation au maintien dans un tube de contention. L’appréciation de la survenue d’un ADD à l’issue du protocole hyperbare ne peut se faire que sur des animaux vigiles et dont le comportement n’est pas modifié par d’autres facteurs que la présence d’ADD. C’est un accident grave mais certains animaux survivent et ne présentent aucun symptôme. La grille que nous utilisons pour évaluer la gravité de l’ADD est un outil robuste avec des critères fiables. Dans cette étude l’évolution de l’ADD sera appréhendée en fonction de sa gravité sur 60 minutes. C’est le temps nécessaire pour observer et s’assurer que les traitements sont efficaces ou pas. Puis les animaux seront mis à mort. Le point limite est la convulsion, seul critère qui conduira systématiquement à l’arrêt de la procédure avant les 60 minutes d’observation.
Choix des espèces
Les animaux utilisés dans ce projet sont des rats Wistar. Il s’agit d’un modèle utilisé couramment au laboratoire et lors de notre première étude concernant les nanocapsules de PFC. Chez ce modèle expérimental, nous possédons à la fois de nombreuses données biologiques concernant les effets d’expositions hyperbares et une bonne connaissance des symptômes d’ADD. Cette expertise acquise au cours des projets précédents permettra une meilleure gestion du projet et de ses résultats. Afin d’être certain d’avoir atteint le stade de «jeunes adultes», matures sexuellement, au moment de la plongée simulée dans le caisson hyperbare, tous les animaux sont âgés de 12 semaines pour qu’ils atteignent la masse corporelle de 450g environ (c’est ce paramètre le plus important dans notre projet).
Les troubles du métabolisme et leurs implications dans les fonctions cérébrales
- Enseignement supérieur
48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime, elles subissent un test de reconnaissance d'objet, une mesure d'oxygène cérébral sous anesthésie puis une perfusion intracardiaque, dans un projet dont l'objectif déclaré est de former des chercheurs à ces techniques. Le porteur affirme que l'expertise des instructeurs garantit un nombre d'animaux réduit et que la démonstration des gestes chirurgicaux justifie les effectifs. Il indique que l'étude des effets d'un régime sur la cognition est "essentielle" et exige un tissu cérébral intact et un animal conscient.
Objectifs
Notre institut se propose de former de nouveaux chercheurs sur les méthodes modernes qui permettent d'étudier les effets nocifs de l'obesité sur la fonction cérabral. Plusieurs études ont révélé les effets délétères de l’obésité sur le cerveau, elle est associée à un risque plus élevé de développer des troubles neurologiques comme la maladie d’Alzheimer. Actuellement, entre 70 et 80% des patients obèses présentent aussi une stéatose hépatique. Cette maladie représente aujourd’hui l’affection hépatique chronique plus courant et affecte 25% de la population. Il est prévu qu’elle devienne en 2030 la raison la plus fréquente de greffe hépatique. Des études récentes ont confirmé les effets nocifs de cette affection hépatique sur la fonction cérabral ainsi que sur la physiologie générale. Ces effets comprennent des changements comportementaux ( anxiété et dépression)voire des troubles neuropathologiques comme la neuroinflammation et l’hypoxie. Les altérations du métabolisme peuvent persister pendant de nombreuses années chez les patients. Au cours de cette periode, ils génèrent, lentement et silencieusement des lésions cérébrales qui s’aggravent à mesure que l'obésité persiste et que la maladie du foie progresse. Il reste aujourd’hui à étudier si ces altérations cérébrales négatives sont réversibles et si cette maladie chronique qui endommage le cerveau, le rende plus sensible au déclin cérébral lié à l’âge. Ces informations ne sont pas connues. Ce projet est conçu pour étudier les effets à long terme de l'obésité et de la stéatohépatite sur certains aspects de la fonction cérébrale et de la physiologie. Afin de répondre aux questions ci-dessus, nous utiliserons un modèle murin (souris C57BL6) d’obesité et de stéatose hépatique. Ce modèle suivra 26 semaines de régime riche en graisses, riche en fructose et riche en cholestérol (régime spécifique NASH). Un groupe d’animaux suivra un régime normal . Les techniques utilisées seront: 1. Un examen comportemental axé sur l'anxiété. 2. Une mesure de la pression partielle d'oxygène dans les tissus cérébraux effectuée par la fluorescente optique in vivo sur animal anesthésié. 3. L’imagerie confocale sur des tranches de cerveau. La durée de ce projet de formation est de 4 ans et nous utiliserons un nombre total de 48 souris sauvage C57BL/6J.
Bénéfices attendus
Les données obtenues devraient fournir les premières preuves sur la façon dont l'obésité et les maladies du foie associées peuvent affecter le cerveau à long terme. Ce projet a aussi pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche.
Procédures
- Régime Nash : 4 semaines. -Test de la reconnaissance de nouveaux objets : 2 seances de 5 minutes, 2 seances de 10 minutes. -Mesure de la pression partielle d'oxygène dans les tissus cérébraux effectuée par la fluorescente optique in vivo sur animal anesthésié : 15 minutes préparation, 60 minutes d'enregistrements. -Perfusion intracardiaque : 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les souris C57BL/6J soumises au régime spécifique NASH ont déjà été entièrement caractérisées par Taconic (https://www.taconic.com/mouse-model/diet-induced-nash-b6). Elles ne présentent aucun phénotype dommageable.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés. Les tranches de cerveau seront utilisées pour l'imagerie confocale.
Remplacement
L'utilisation d'animaux est essentielle car tous les systèmes du corps sont nécessaires pour étudier les altérations du métabolisme. Nous devons surveiller les effets systémiques et centraux d'un régime spécifique ainsi que son impact sur la cognition. Des modèles animaux in vivo sont nécessaires pour ces études car ils portent sur le rôle d'une maladie qui affecte différents organes (cerveau, foie, tissu adipeux). De plus, les tests de la fonction cognitive nécessitent une physiologie stable, un tissu cérébral intact et un état conscient.
Réduction
L’expertise de nos instructeurs sur ces modèles garantit que le nombre d'animaux utilisés est minimisé par une pratique toujours de haute qualité dès le départ. De même il est extrêmement important pour nos objectifs éducatifs de pouvoir démontrer et mettre en pratique les actes de préparation chirurgicaux, le nombre d'animaux sera donc adapté en conséquence. Ce chiffre permettra aux instructeurs de montrer les techniques et aux étudiants de faire les expériences.
Raffinement
Nos mesures mises en place pour réduire la douleur pendant les procédures expérimentales impliquent une induction et suivi de l'anesthésie, une mise en place d'analgésie, une installation tout au long des procédures chirugicales de contrôle de la température par tapis chauffant. Les souris seront placées en cage de 4-5 souris sur un rack ventilé, placé dans une salle d'hébergement. Un enrichissement de leur milieu (carrés de cellulose, maisons en papier mâché que les animaux peuvent utiliser pour se cacher et/ou ronger) permettra de favoriser les comportements d'exploration et d'empêcher le stress.
Choix des espèces
L'utilisation d'animaux est essentielle car tous les systèmes du corps sont nécessaires pour étudier les altérations du métabolisme. Nous devons surveiller les effets systémiques et centraux d'un régime spécifique ainsi que son impact sur la cognition. Des modèles animaux in vivo sont nécessaires pour ces études car ils portent sur le rôle d'une maladie qui affecte différents organes (cerveau, foie, tissu adipeux). De plus, les tests de la fonction cognitive nécessitent une physiologie stable, un tissu cérébral intact et un état conscient. Les souris soumises au régime spécifique NASH ont déjà été entièrement caractérisées par Taconic (https://www.taconic.com/mouse-model/diet-induced-nash-b6) et sont nécessaires dans cette étude car elles représentent étroitement la maladie humaine. Afin d'étudier le système neurovasculaire, nous avons besoin d'un système mature, nous utiliserons donc des souris d'au moins 3 mois.